KR20110101803A - 백두옹 추출물을 포함하는 항암제 부작용 억제용 조성물 - Google Patents

백두옹 추출물을 포함하는 항암제 부작용 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장 독성 억제용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장독성 억제용 조성물, 기존 항암제와 병용 투여하여 항암활성을 상승시키는 항암활성 증강용 조성물에 관한 것이다 .

Description

백두옹 추출물을 포함하는 항암제 부작용 억제용 조성물{Composition comprising extract of Pulsatillae Radix effective on suppression of adverse effects induced by anti-cancer drugs}
본 발명은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장 독성 억제용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장독성 억제용 조성물, 기존 항암제와 병용 투여하여 항암활성을 상승시키는 항암활성 증강용 조성물에 관한 것이다 .
최근 전체 사망원인 중 암으로 사망하는 원인은 4명 중 1명 꼴로 이는 계속 증가하는 추세에 있다. 이와 같이 사망원인의 대부분을 차지하는 암의 치료방법으로는 외과수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법등이 있다. 이 중에서 화학요법으로 사용되는 항암제는 암세포의 대사경로에 개입하여 DNA와 직접 작용하여 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나, 핵산 전구체의 합성을 방해하고, 세포의 분열을 저해함으로써 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 따라서 항암제는 투여시에 정상세포에도 치명적인 손상을 주어 골수조혈작용, 면역억제, 탈모, 설사, 위장장애, 간· 신장독성 등을 초래하므로 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.
현재까지 항암제는 암에 대한 특이적 선택성이 없어서 치료적 효과와 독성효과가 대부분 겹치는 특성을 보이며, 독성의 발생은 혈장 내에서 약물이 농축될 수 있는가 관련되어진다. 항암제 투여로 인한 독성은 골수 파괴로 인한 백혈구, 혈소판, 적혈구등의 혈구감소증, 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상, 난소와 고환에 대한 부작용으로 월경불순 및 남성불임의 원인, 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 부작용으로 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애 와 소화 장애, 설사증상, 세뇨관 괴사에 의한 신장독성, 신경계 장애로 발생하는 말초 신경염과 쇠약감, 혈관통증 및 발진 등의 혈관장애, 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다.
항암제로 사용하는 시스플라틴은 고환, 두경부, 난소, 자궁경부, 비소세포 종양 및 다양한 유형의 암을 포함한 악성 종양의 효과적인 화학요법 제제이다(Pala and Dong, 2008; Wang and Lippard, 2005). 그러나, 암 환자의 25~35%는 시스플라틴의 1회투여 후 급격한 신장기능의 저하를 경험한다(Luke et al., 1992). 신장기능의 가장 큰 부작용은 신장기능의 급격한 저하이다(Ries and Klastersky, 1986). 많은 연구에서 항염증제제나 항산화제가 시스플라틴으로 유발되는 신장독성에 효과가 있는 것으로 보고되었다 (Ajith et al., 2007; Fatima et al., 2007; Kuhad et al., 2007). 시스플라틴에 의해 유도되는 신장독성은 염증반응, 직접적 미세소관 독성, 혈관질환, 산화스트레스 등을 유발한다(Ramesh and Reeves, 2002). 염증반응은 시스플라틴으로 유발되는 신장독성의 중요한 기전을 제공한다(Davis et al., 2001). 최근 연구결과에서는 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-6 및 인터루킨-1β와 같은 염증유발인자들이 시스플라틴에 의해 발생하는 신장독성과 관련이 있다고 보고되었다(Faubel et al., 2007; Ramesh and Reeves, 2002, 2004).
가장 흔한 항암제 투여에 의한 부작용으로 구역, 구토가 있다. 항암제에 따라 오심, 구토를 일으키는 정도가 다양한데, 신장암 및 폐암에 많이 쓰이는 시스플라틴 투여로 인한 오심, 구토는 매우 심한 편에 속하며, 식욕부진 상태에서는 구토의 유발이 쉽게 일어나고, 특히 신장과 간장에 독성을 나타낸다. 다양한 항구토 약물이 임상증상에 따라 선택, 배합되어 항암요법 전후로 사용되고 있고, 다양한 경로, 다양한 시간대 투여로 구토를 성공적으로 조절할 수 있으나, 삶의 질을 많이 저하시키고 있다.
급성 및 지연구토의 억제를 위하여 사용되는 온단세트론(ondansetron)은 알러지반응, 불규칙한 심장박동, 근육경련, 몸을 움직일 수 없는 2차적 부작용을 유발하며, 메토클로프라미드(metoclopramide)는 신경과민, 호흡곤란, 불면증, 심장발작등의 부작용이 있으며, 디아제팜(Diazepam)은 기관지 통증, 발진, 환각 등의 부작용이 나타난다.
또한, 항암제 부작용 완화, 항암치료의 효능 증가, 암환자의 생존율 증가 및 삶의 질 향상 등 목적으로 다양한 항암치료 보조제가 사용되나, 항암치료 보조제 역시 2차적인 부작용을 유발한다. 항종양작용 및 면역증강작용이 뛰어난 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin) 등은 단백질 제제로서 가격이 비싸다는 단점이 있다. 요독성 예방을 위하여 사용하는 메스나(MesnaTM)는 메스꺼움, 구토, 식욕감소, 위장통증, 설사, 발열, 현기증 등의 부작용을 보이며, 자유기 청소작용을 하는 아민포스틴(AminfostineTM)은 항고혈압성 작용으로 인해 투여 후 24시간 이전에 연속적인 투여가 불가능하다.
한편, 백두옹(Pulsatillae Radix)은 전통적으로 염증, 감염, 세균성 이질 및 냉증과 같은 다양한 질병을 치료하는데 사용되어왔다. 특히, 백두옹은 염증성 질환에 효과적인데, 백두옹을 달인 물과 그의 활성 성분은 NO, ET-1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, E-셀렉틴 및 TXB의 분비를 억세하는 것으로 보고되었다(Hu et al., 2009a. b; Jin-Gwang Jung, 2001)
본 발명자들은 기존이 항암제 투여로 인한 부작용을 억제시키는 동시에 항암치료 보조제의 2차적인 부작용이 없는 천연 추출물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 백두옹 추출물이 시스플라틴을 포함하는 항암제의 부작용을 완화하여 신장을 보호하고 신장독성을 예방하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 백두옹(Pulsatillae Radix) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장 독성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 활성 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 백두옹(Pulsatillae Radix) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장 독성 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 '백두옹(Pulsatillae radix)'이란 미나리아제비과(Ranunculaceae)에 속하는 할미꽃(Pulsatilla Koreana) 또는 할미꽃의 뿌리를 말한다. 한방에서 백두옹은 청열, 양혈, 해독의 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 소염, 수렴, 지혈, 지사약으로서 열독성 혈리, 말라리아, 비출혈, 치출혈, 인종의 치료제로 사용되어 왔다. 그 꽃을 백두옹화라고 하여 학질, 두창을 치료하는데 사용하며, 그 잎을 백두옹옆이라고 하여 요슬통풍, 부종 및 심장통을 치료하는데 사용한다. 또한 백두옹을 물로 달인 액은 마에바성 적리균에 대한 항균작용이 있고, 트리코모나스에 대해 살충작용이 있는 것으로 보고되어 있다.
본 발명의 용어 '추출'이란 두 가지 이상의 물질이 섞여 있는 혼합물 속에서 특정한 물질을 용해할 수 있는 용매를 사용하여 성분을 분리해 내는 방법으로, 산-염기 혹은 킬레이트 생성 등의 화학반응을 이용하거나 혹은 단순히 용해도 차이만을 이용할 수도 있다. 고체에서 추출하는 경우를 고-액추출, 액체에서 추출하는 경우를 액-액추출이라 하며, 고-액추출을 침출이라 하기도 한다. 추출방법하는 방법에 따라 유지흡착추출법(온침법), 유지흡착추출법(냉침법), 유기용제추출법 및 초임계유체추출법(액화가스추출법)으로 분류할 수 있고 당업자의 선택에 따라 제한 없이 사용가능하다.
바람직한 일 실시태양으로 한약제의 유효성분을 얻는데 주로 사용하는 방법인 열수 추출법을 사용할 수 있으며 이는, 높은 온도의 물에서 한약제의 유효성분을 분리해 냄으로써 추출효율을 높이며, 유효성분의 추가적인 분리공정이 필요하지 않은 방법상의 이점이 있어서 편리하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 백두옹을 증류수에 가열하여 얻은 유효 성분을 동결건조한 후, 상기의 방법으로 획득한 파우더를 증류수에 일정 농도로 녹여 원심분리 후 백두옹 추출물의 유효성분이 포함된 상등액만을 취하여 멸균하고 생리식염수에 희석하는 방법으로 백두옹에서 유효성분을 분리하여 사용하였다.
본 발명의 용어 '항암제'란 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 화학요법제를 총칭하는 것으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하여 항암활성을 나타내는 약제를 의미한다.
항암제는 정상세포와 암세포간의 약에 대한 감수성의 차를 이용하여, 정상세포에 대한 독성은 비교적 적고, 암세포에 대해서는 보다 선택적으로 작용하지만, 정상세포도 어느정도의 손상을 받기 때문에 부작용이 나타나게 된다. 이는 항암제가 분열이 빠른 세포에는 어디라도 작용하는 성질이 있기 때문에 빨리 분열하는 암세포에만 작용하는 것이 아니라 역시 분열이 빠른 정상세포인 골수, 위장관, 모근세포도 항암제의 영향을 받게 된다. 따라서 이런 약의 공통된 부작용으로 일시적인 혈구감소, 구역질, 구토, 설사, 식욕감퇴, 탈모 등이 나타나게 된다. 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용기전에 따라 알킬화제, 대사길항제, 항생물질, 유사분열 억제제, 호르몬제 및 기타의 6개의 범주로 분류하고 있다. 바람직한 일 실시태양으로, 본 발명의 백두옹 추출물을 포함하는 추출물을 이용하여 신장독성 부작용을 일으키는 항암제의 종류의 예로는 토리셀, 아페니토, 수텐, 넥사바, 수텐트, 템시로리우스, 아바스틴, 크레아박스-알씨씨 또는 시스플라틴 등이 존재하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게 본 발명의 조성물은 시스플라틴 투여로 인한 신장독성의 부작용을 억제할 수 있다.
시스플라틴은 신장암을 치료하는 화학요법제로, 상기 약제는 세포 분열(cell division)을 저해함으로써 항암 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 종양 세포는 세포 증식이 조절되지 않고 계속적으로 일어나는 특성을 보이는데, 이와 같은 종양 세포의 세포 분열을 저해하는 시스플라틴을 처리하면 일부 암의 경우 종양 세포의 증식을 막아서 항암 효과를 기대할 수 있다. 어떤 경우에는 종양 세포의 증식 저해 뿐만 아니라 이미 존재하는 종양 세포의 크기까지 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 시스플라틴 등은 신장암을 치료하는데 사용되나 신장 독성 등 부작용을 일으킬 수 있다.
본 발명의 용어 '신장독성'이란 항암제의 투여 후 나타나는 부작용의 하나로 신장기능의 저하, 혈액내 요소 농도의 증가, 신장 내의 염증 유발인자들의 농도 증가 현상을 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 백두옹 추출물은 신장독성으로 나타나는 혈청 내의 크레아티닌 농도를 감소시키고, 혈액 내의 요소 농도를 낮추어 신장독성을 완화하는 것으로 확인되었으며, 발명의 백두옹 추출물을 사용하는 경우 시스플라틴으로 인해 유발되는 신장독성 현상으로 혈액내의 농도가 증가하는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 염증유발인자들의 농도를 낮추는 것을 확인하여, 본 발명의 조성물이 신장 독성을 억제할 수 있음을 확인하였다. 바람직하게 본 발명의 상기 조성물의 투여량은 1mg/kg 내지 1g/kg이며 1회 내지 수회에 나누어 복용할 수 있다. 본 발명의 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직한 투여 경로는 경구투여이다. 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 활성 증강용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 '항암활성 증강'이란, 본 발명의 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리함으로써, 항암제의 부작용으로 유발되는 신장독성의 증상을 완화시키거나, 항암제의 부작용은 감소시키면서 항암활성을 증가시키는 효과를 의미한다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 항암활성 증강용 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 함께 포함된 항암제의 부작용을 완화하여 항암제 자체의 항암활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 항암활성을 갖는 조성물에 포함되는 항암제로는 토리셀, 아페니토, 수텐, 텍사바, 수텐트, 템시로리우스, 아바스틴, 크레아박스-알씨씨 또는 시스플라틴 등이 있으며, 상기 예에 의해 항암제로 사용 가능한 성분의 종류가 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 백두옹 추출물과 병용 투여됨으로써 항암활성을 증가시킬 수 있는 항암제는 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 항암활성 증강용 조성물은 항암활성이 있는 항암제 성분을 포함하는 기능성식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하여, 상기 유형의 항암활성 증가용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강 식품으로는 본 발명의 백두옹 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있으나, 상기 예에 의해 제조 가능한 형태가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품은 추가적인 첨가제를 포함할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 바람직하게 상기 첨가할 수 있는 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼 및 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티 및 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터 및 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장 및 소스 등) 등에 본 발명의 백두옹 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 백두옹 추출물은 항암제 투여에 의한 부작용, 특히 시스플라틴의 투여로 인한 부작용인 신장독성을 억제하고, 기존 항암제와 병용 투여하더라도 항암 활성을 증강시킬 수 있어 항암제 및 항암제 부작용 억제제의 용도로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 백두옹 추출물이 크레아티닌 생산에 미치는 영향을 나타내는 그림이다. 항암제인 시스플라틴 투여 후 24, 48 및 72시간 째 혈청 내 크레아티닌 농도를 나타낸 것으로, 시스플라틴 만을 처리한 그룹과 백두옹 추출물을 같이 처리한 그룹을 비교한 결과 백두옹 추출물을 같이 처리한 그룹에서 72시간 후에 혈청 크레아티닌 농도가 급격히 감소하였다(n=4).
도 2는 백두옹 추출물이 혈액 내 요소 질소 생산에 미치는 영향을 나타내는 그림이다. 혈액 내 요소 질소(Blood urea nitrogen; BUN)의 양은 시스플라틴 투여 후 24, 48 및 72시간 째 측정하였고, 72시간 째 측정한 결과에서 시스플라틴 만을 처리한 그룹과 비교하여, 백두옹을 같이 처리한 그룹에서 혈액 내 요소 질소의 농도가 감소함을 확인하였다(n=4).
도 3은 시스플라틴을 처리한 그룹과 백두옹 추출물을 같이 처리한 그룹에서 생존률을 비교한 그림이다. 모든 마우스는 복강 주사로 시스플라틴을 1회 용량(20 mg/kg 체중) 투여하였고, 162시간 동안 관찰하였다. 백두옹을 처리한 그룹은 생리식염수를 처리한 그룹에 비해 더 오랜 시간 생존하는 것을 확인하였다. 생리식염수 처리한 그룹 대비 *P<0.05 (n=12).
도 4는 백두옹 추출물이 크레아티닌 생산에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 혈청 크레아티닌 농도는 시스플라틴 주입 후 72시간 째 측정하였고, 시스플라틴을 처리한 그룹에서는 혈청 크레아티닌 농도가 증가한데 반해, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서는 혈청 크레아티닌 농도가 감소하였다. (**)생리식염수를 처리한 그룹과 비교하여 혈청 크레아티닌 농도가 유의적으로 증가하였다(P<0.01, n=4).
도 5는 백두옹 추출물이 혈액 내 요소 질소 생성에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 혈액 내 요소 질소는 시스플라틴 투여 후 72시간 째 측정하였고, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서는 혈액 내 요소 질소 농도가 감소한 것에 반하여, 시스플라틴을 투여한 그룹에서는 혈액 내 요소 질소 농도가 증가하였다. (***)생리식염수를 처리한 그룹과 비교하여 혈액 내 요소 질소 농도가 유의적으로 증가하였다(P<0.001, n=4).
도 6은 백두옹 추출물이 염증반응을 촉진하는 사이토카인 TNF-α 생성에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 신장 조직에 시스플라틴을 투여하고 72시간이 지난 후 사이토카인의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 시스플라틴을 처리한 그룹과 비교하여, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서 TNF-α의 발현 수준이 감소하였으며, 이는 시스플라틴만을 처리한 그룹과 비교하였을 때 농도가 유의적으로 감소하였다(*)(P<0.05, n=4).
도 7은 백두옹 추출물이 염증반응을 촉진하는 사이토카인 IL-1β 생성에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 신장 조직에 시스플라틴을 투여하고 72시간이 지난 후 사이토카인의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 시스플라틴을 처리한 그룹과 비교하여, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서 IL-1β의 발현 수준이 낮은 것을 확인하였으며, 이는 시스플라틴만을 처리한 그룹과 비교하였을 때 농도가 급격히 감소하였다(**)(P<0.01, n=4).
도 8은 백두옹 추출물이 염증반응을 촉진하는 사이토카인 IL-6 생성에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 신장 조직에 시스플라틴을 투여하고 72시간이 지난 후 사이토카인의 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 시스플라틴을 처리한 그룹과 비교하여, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서 IL-6의 발현 수준이 감소하였으며, 이는 시스플라틴만을 처리한 그룹과 비교하였을 때 농도가 유의적으로 감소하였다(**)(P<0.01, n=4).
도 9는 백두옹 추출물이 신장의 조직학적으로 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 신장 조직을 시스플라틴을 투여하고 72시간이 지난 후 PAS로 염색하였다. (A) 생리식염수만을 처리한 그룹(saline); (B) 시스플라틴만을 처리한 그룹(cisplatin); (C) 시스플라틴을 처리하기 전 백두옹 추출물을 처리한 그룹(P. Radix).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예1: 실험에 사용한 마우스의 관리
Charles River korea (대한민국, 성남)에서 수컷 Balb/c (6 내지 8 주령, 체중 20 내지 25 g) 마우스를 구입하였다. 모든 마우스는 무균 상태, 12시간 명암주기로 관리되었으며, 실험 기간동안 음식물의 반입이 자유로운 조건에서 사육되었다. 본 연구는 경희대학교 동물실험 윤리위원회에서 승인되었다.
실시예 2: 백두옹 추출물 및 시스플라틴 준비
백두옹은 퓨리메드(대한민국, 서울)에서 구입하였다. 500 g의 백두옹을 1L의 증류수에 넣고 2시간 동안 가열하였다. 동결건조하여 16.95g의 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 증류수에 1 mg/ml의 농도로 녹이고, 300 X g, 10분, 4℃ 조건에서 원심분리하여 상등액(HSS)을 수득하였다. 상기 상등액을 0.20 ㎛ 포어 크기의 멸균된 필터로 여과하였다(Sartorius AG, Germany). 시스플라틴(cis-diammineplatinum II dichloride; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 은 1 mg/ml 생리식염수에 0.9%의 농도로 녹였다.
실시예 3: 백두옹 추출물 및 시스플라틴의 처리
마우스에 백두옹 추출물 300 mg/kg를 1회 경구투여로 3일동안 투여하였다. 대조군은 PBS(Phsphate buffered saline)만을 투여하고, 3일 후 시스플라틴 1회 용량(25 mg/kg 체중) 또는 같은 양의 생리식염수를 복강주사를 통해 주입하였다. 시스플라틴 투여 72시간 후에 마우스를 희생시키고, 상기 마우스에서 조직학 및 신장 사이토카인 어레이 분석을 하였다.
생존률을 확인하는 실험에서는 백두옹 추출물을 처리한 그룹 및 시스플라틴을 처리(20 mg/kg 체중)한 그룹을 162시간 동안 관찰 하였다.
실시예 4: 신장 기능의 평가
마우스에 시스플라틴을 처리한 후 24, 48 및 72시간이 경과한 후 혈액 샘플을 채취하였다. 신장의 기능은 FUJI DRI-CHEM 3500i (FUJI PHOTO FILM .LTD, Japan)를 이용하여 혈액 내 요소 질소의 양 및 혈청 내 크레아티닌 농도를 측정하여 분석하였다.
실시예 5: 신장의 사이토카인 측정
시스플라틴 투여 후 염증을 유발하는 사이토카인의 활성을 확인하기 위하여, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 단백질의 농도를 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay; BD biosciences, USA)를 이용하여 측정하였다. 얼린 신장조직을 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, Inc. Korea)을 이용하여 균질화하였고, 20분간 얼음에서 반응시킨 후, 1,300 rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 수득하여 신장의 염증 유발 사이토카인 측정에 이용하였다. 각각의 상등액에 포함된 단백질의 농도를 BCATH 단백질 정량 키트(Thermo scientific, USA)를 이용하여 결정하였다. 사이토카인의 단백질 농도를 전체 단백질 농도로 정정하였으며, 그 결과를 pg/mg으로 나타냈다.
실시예 6: 조직학적 검사
신장 조직의 염증 유발 정도를 확인하기 위하여, 각각의 그룹의 모든 살아있는 마우스를 72시간 째 에테르를 이용하여 안락사시켰다. 신장 조직을 파라핀으로 포매 후 4% 포름알데히드에서 고정하였고, 5㎛ 크기의 절편으로 잘라서 과요오드산과 헤마톡실린으로 염색하였다.
실시예 7: 통계적 분석
모든 결과는 평균 ± S.E.M 값으로 나타내었다. 유효값은 평균 ± S.E.M값을 의미하며, 실험군과 대조군의 유의적인 차이는 스튜던트 t-검정(student's t-test)으로 측정하였고, P값이 0.05보다 작은 경우는 차이가 유의적이다.
실험결과
1: 백두옹 추출물이 신장 기능에 미치는 영향
시스플라틴 1회 투여량을 주사하고 72시간 경과 후 혈청 내 크레아티닌 농도는 백두옹 추출물을 처리한 그룹과 비교하여 시스플라틴을 처리한 그룹에서 유의적으로 증가하였다(도 1). 시스플라틴 주사하고 72시간 경과 후 혈액 내 요소 질소 농도는 시스플라틴을 처리한 그룹과 비교하여 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서 또한 현격하게 감소하였다(도 2).
2: 백두옹 추출물이 시스플라틴 투여 후 생존률에 미치는 영향
백두옹을 전처리한 그룹과 시스플라틴을 처리한 그룹 모두 1회 투여량(20 mg/kg 체중)의 시스플라틴을 투여하고 162시간동안 관찰하였다. 시스플라틴 투여 후 132시간 째, 대조군의 모든 마우스가 사멸하였다. 반면, 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서는 12마리 중 3마리가 생존하여 25%의 생존률을 나타내었다(도 3). 상기 두가지 결과에 의해, 마우스에서 백두옹 추출물을 전처리하는 경우 시스플라틴 투여 후에 생존률을 높임을 알 수 있다.
3: 72시간 째 백두옹 추출물이 시스플라틴에 의해 유발되는 신장독성에 미치는 영향
시스플라틴의 1회 투여량을 투여한 후 72시간 째에 혈청 내 크레아티닌은 백두옹 추출물을 처리한 그룹과 비교하여 시스플라틴을 처리한 그룹에서 유의적으로 증가하였다(도 4). 또한 시스플라틴을 투여한 후 72시간 째에 혈액 내 요소 질소 농도는 시스플라틴만을 처리한 그룹과 비교하여 백두옹 추출물을 처리한 그룹에서 눈에 띄게 감소하였다(도 5).
4: 백두옹 추출물이 시스플라틴에 의해 유도된 염증 유발 사이토카인에 미치는 영향
시스플라틴에 의해 손상된 신장에서 생성되는 염증유발 인자들을 확인하기 위하여, 시스플라틴 투여 후 72시간 째에 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인의 농도를 측정하였다(모두 pg/mg 단백질로 나타냈다). 시스플라틴을 처리한 마우스 군에서는 시스플라틴 투여 후 72시간 째에 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 농도가 증가하였다. 그러나, 백두옹 추출물을 전처리한 마우스 군에서는 신장 내 이러한 염증 유발 인자들의 발현이 감소하였다(도 6,7 및 8).
5: 백두옹 추출물이 신장 조직에 미치는 영향
신장 조직의 염증 정도를 측정하기 위해, 신장을 시스플라틴 투여 후 72시간 째에 파라핀에서 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 5-㎛로 절편화 한 후 과요오드산과 헤마톡실린으로 염색한다. 백두옹을 처리한 군에서 시스플라틴을 처리한 군보다 미세소관 손상과 사구체 손상 정도가 적었다(도 9).
이러한 결과는, 본 발명의 백두옹 추출물이 시스플라틴 등 항암제가 일으킨 신장 독성을 완화 또는 예방할 수 있음을 시사하는 결과이다.

Claims (7)

  1. 백두옹(Pulsatillae Radix) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항암제 투여로 인한 신장 독성 억제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 신장독성 억제용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항암제는 토리셀, 아페니토, 수텐, 넥사바, 수텐트, 템시로리우스, 아바스틴, 크레아박스-알씨씨 및 시스플라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 신장 독성 억제용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 백두옹 추출물은 백두옹을 열수추출한 형태인 것인 신장 독성 억제용 조성물.
  5. 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항암 활성 증강용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항암활성 증강용 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것인 항암활성 증강용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 항암제는 토리셀, 아페니토, 수텐, 넥사바, 수텐트, 템시로리우스, 아바스틴, 크레아박스-알씨씨 및 시스플라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 항암활성 증강용 조성물.
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