KR20160099792A

KR20160099792A - 사판칼콘을 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160099792A
Application number: KR1020150021847A
Authority: KR
Inventors: 한만덕; 정의길; 한국일; 남궁우; 김완종
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2016-08-23

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 사이토카인 활성억제제를 포함한다. 상기 사판칼콘은 소목 추출물의 클로로포름 분획층에서 분리된 것일 수 있고, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용으로 효과가 우수하여, 약학조성물 또는 건강기능식품 등의 식품조성물로 활용될 수 있다.

Description

사판칼콘을 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS COMPRISING SAPPANCHALCONE}

본 발명은 사판칼콘을 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 뼈의 보호하고 류마티스 관절염의 예방과 치료 활성을 가지는 천연물 유래 단일 추출물의 약학적 또는 건강기능식품적인 용도에 관한 것이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)은 대표적인 자가면역성 질환으로 활액막의 염증으로 인한 관절의 부종과 동통이 대표적인 증상으로, 진행하면 관절 연골, 뼈, 관절 주위 조직의 파괴로 관절의 강직이나 변형이 나타난다(대한 정형외과학회. 정형외과학. 서울:최신의학사. 2001:123-31, 175-89.1). 류마티스 관절염은 관절이나 건(힘줄)의 활막에 비세균성 염증 반응이 만성적으로 나타나며, 이로 인해 활막이 증식되고 활액의 양이 증가하여 관절의 부종과 동통을 초래하는 질환이다. 류마티스 관절염의 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으나, 자가면역반응이 이 질환의 만성화와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 염증성 매개체들과 사이토카인(cytokine)의 국소적인 방출과 함께 T 세포가 중요한 역할을 하여 결과적으로 관절을 파괴하는 지속적인 자가면역반응으로, 류마티스 관절염에서 나타나는 주요 증상은 피로, 무력감, 동통 등이며, 관절염이 진행되면서 발열 및 체력쇠약을 동반한다. 또한, 염증이 일어난 관절 부근에 근육강직(muscle atrophy)과 근육경축(muscle spasm)이 나타나 관절의 움직임에 나쁜 영향을 준다.

일반적으로 류마티스 관절염에 대한 소염, 진통 작용을 위해 사용되는 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)은 주로 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘 (prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내며, 그 중 인도메타신(indomethacin)과 페닐부타존(phenylbutazone)의 경우 다른 NSAIDs에 비해 강력한 항염증 효과를 가지고 있지만 많은 부작용을 동시에 갖고 있다. 이런 NSAIDs에 비해 스테로이드 제제는 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나며 환자에게 쾌감을 주는 약물로 알려져 있으나, 이미 널리 알려진 것처럼 이 약물은 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 쿠싱(Cushing) 증후군, 부신부전증, 정신 기능장애 등을 일으키는 것으로 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라, 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의를 요하며, 가능하면 금해야 하는 약물인 것으로 알려져 있다. 이처럼 합성 항염증제는 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 앞서 언급한 바와 같이 효력이 강하면서도 비교적 부작용이 적은 항염증제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.

의약품 시장에서 합성의약품은 단일치료제로서의 한계가 있고 합성의약품 신약개발에 대해서도 고비용과 장기간의 개발소요기간이 드는 단점이 있어서 천연물 유래 물질에 관심을 갖고 있으며, 천연물유래 물질들은 오랜 경험과 안정성을 이유로 천연물 신약개발소재로, 그리고 기능성 식품 또는 식품 첨가물 소재로 그 활용도가 증가하고 있다.

소목(Caesalpinia sappan L.)은 콩과에 속하는 심재를 말린 것을 말하며 홍목, 소방목이라 불린다. 서식지는 중국, 대만, 인도네시아, 말레이시아 등에 분포하며 연중 채집이 가능하다. 목재는 단단하고, 심재는 밝은 적색으로 약용으로 사용되며, 나무껍질과 열매에는 색소가 있어서 적색 염료로 이용되기도 한다. 소목의 심재는 페놀성 화학물, 정유, 배당체, 지방산 에테르 등의 성분으로 구성되어 있다. 소목은 전통적으로 한방에서는 어혈로 인한 타박손상, 월경통, 월경폐색, 현훈, 출산 후 각종 증상에 사용해 왔고, 아시아 국가에서 월경과다, 냉대하 및 당뇨합병증의 질병의 치료를 목적으로 사용된다. 또한, 소목추출물은 암치료와 관련하여 세포사(apoptosis) 유도 기능도 있는 것으로 알려졌다(특허공개번호 제10- 2000-0047082호).

본 발명의 목적은 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 사이토카인 활성억제제를 포함하여, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용으로 활용 가능한 약학조성물, 이를 포함하는 건강기능식품 등 식품조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 상기 사이토카인 활성억제제를 포함하여 류마티스 관절염 환자 등의 골밀도를 증가시킬 수 있는 약학조성물 또는 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 사이토카인 활성억제제를 포함한다.

상기 사이토카인 활성억제제는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제 또는 감소시키는 것일 수 있다.

상기 사판칼콘은 소목의 심재(heartwood) 건조물로부터 얻은 냉침추출물로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품조성물은 사판칼콘 또는 이의 식품으로 허용되는 염을 함유하여 류마티스 관절염 질환의 예방 또는 완화, 또는 뼈 보호 기능을 갖는 것일 수 있다.

상기 식품조성물은, 대퇴골, 경골, 종골, 지골 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뼈의 골밀도를 증가시키는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 사이토카인 활성억제제를 포함한다.

상기 사판칼콘(sappanchalcone)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 본 발명에서 확인한 류마티스 관절염의 예방 또는 치료 활성을 갖는다.

상기 사판칼콘은, 콩과 식물인 소목(Caesalpinia sappan L.)의 추출물로부터 분획된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 소목 추출물은 소목의 심재(heartwood)를 건조, 분쇄한 후 냉침하여 얻은 추출물로부터 분획한 것일 수 있다. 상기 냉침은 상기 소목의 심재 건조물에 1 내지 20배의 부피를 갖는 유기용매를 가하여, 0 ℃ 내지 25 ℃에서 12 내지 24 시간 방치하는 과정으로 이루어질 수 있고, 상기 냉침은 동일한 소목 건조물에 대해서 1 내지 5회 반복하여 실시할 수 있다. 상기 유기용매는 알코올을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게 상기 알코올은 메탄올 일 수 있다.

상기 소목의 알코올 냉침 추출물은, 액체-액체 추출법을 이용하여 분획될 수 있다. 상기 액채-액체 추출법으로는 물과 유기용매를 상기 소목의 알코올 냉침 추출물에 넣고 혼합한 후 8 내지 24시간 동안 정치하는 방법으로 진행될 수 있으며, 상기 유기용매는 예를 들어 헥산일 수 있다. 상기 물과 유기용매를 활용한 액체-액체 추출법은 1 내지 5회 반복하여 실시될 수 있고, 이렇게 얻어진 유기용매층을 이후 클로로포름을 이용한 분획에 사용할 수 있다.

상기 유기용매층에 클로로포름을 첨가하여 교반한 후 8 내지 24시간 동안 정치하여 소목 알코올 냉침 추출물의 클로로보름 분획층을 얻을 수 있다. 이 클로로포름 분획층으로부터 크로마토그래피 등의 방법으로 상기 사판칼콘을 분리할 수 있고, 예를 들어 상기 사판칼콘은 상기 클로로포름 분획층의 0.6 내지 2.5 중량%의 양으로 분리될 수 있다.

상기 사판칼콘이 상기 클로로포름 분획층으로부터 분리될 때에 실리카겔에서 클로로포름와 메탄올 분획 후 세파텍스 충진물에서 메탄올에 의하여 정제될 수 있다.

상기 조성물에 포함되는 유효성분은 사판칼콘만으로 한정되는 것이 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염이라면 적용할 수 있으며, 예를 들어서 상기 사판칼콘의 약학적으로 허용되는 염은 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염일 수 있고, 예를 들어 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등의 유기산; 또는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등의 무기산에서 유래한 것일 수 있다.

상기 사이토카인 활성억제제는 상기 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제 또는 감소시키는 것일 수 있다. 상기 사이토카인 활성억제제는 상기 사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하여, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제 또는 감소시킬 수 있으며, 구체적으로 콜라겐으로 유도된 관절염 마우스 모델에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성 억제 활성을 보일 수 있다.

상기 약학 조성물은, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 통풍 관절염, 류마티스성 다발성 근육통 또는 류마티스 관절염 관련 질병의 예방 또는 치료 활성을 가질 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 허용되는의 의미는 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 예를 들어 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10 내지 1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 1회 또는 수회 반복 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품조성물은 사판칼콘 또는 이의 식품으로 허용되는 염을 함유하여 류마티스 관절염 질환의 예방 또는 완화 기능을 갖고, 뼈 보호 기능도 가질 수 있다. 상기 식품조성물은, 건강기능식품, 영양보조제, 건강식품, 또는 식품첨가물의 형태로 식품조성물로 활용될 수 있고, 기존의 건강기능식품과 따로 또는 복합제의 형태로 활용될 수 있다.

상기 사판칼콘의 추출 분리 방법 및 이의 염에 대한 설명은 위에서 사판칼콘을 소목 심재로부터 얻는 방법 및 약학적으로 허용되는 염에 대한 내용과 중복되므로 그 기재를 생략한다.

상기 식품조성물은 특히 관절염 환자에게 적용할 경우 대퇴골, 경골, 종골, 지골 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뼈의 골밀도 증가를 유도할 수 있어서 건강기능식품 또는 영양보조제로 활용도가 크다.

상기 식품조성물은 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 항염 효과 또는 골밀도 강화 활성이 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실과 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 이의 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 사판칼콘을 첨가하여 제조할 수 있다. 또, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 중 어느 하나의 형태로 건강보조식품으로 활용될 수 있으며, 껌, 차, 비타민 복합제 등에 포함되어 관절염 완화, 염증과 통증 완화 또는 골밀도 증가를 위한 식품으로 활용될 수 있다. 상기 식품조성물 중 상기 사판칼콘의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.

본 발명의 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 사판칼콘 또는 이의 염을 함유하여 사이토카인 활성억제제로서 기능하고, 류마티스 관절염을 예방 또는 치료한다. 또한, 본 발명의 식품조성물은 식물 유래 추출물에서 분획되는 단일 추출물인 사판칼콘 또는 이의 염을 함유하여 류마티스 관절염 질환의 예방, 완화 또는 뼈 보호 기능을 갖는다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 소목 추출물의 성분을 HPLC로 분석하여 머무름 시간을 확인한 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예 1에서 소목 추출물 성분의 양이온을 LCMS-IT-TOF을 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 소목 추출물 성분의 음이온을 LCMS-IT-TOF을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4은 본 발명의 실시예 1에서 추출한 소목 추출물 성분의 핵자기공명(1H-NMR) 분석 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예 2에서 실험한 생쥐들의 1차 면역접종 후 시간에 따른 몸무게 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 실험한 생쥐들의 1차 면역접종 후 시간에 따른 발두께 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2에서 실험한 생쥐들에게 복강주사 투여 시작 후 20일째 발 두께를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2에서 실험한 생쥐들의 1차 면역접종 후 시간에 따른 관절염 평가지수 결과이다.
도 9은 본 발명의 실시예 3에서 희생한 생쥐들의 경골의 골밀도를 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3에서 희생한 생쥐들의 대퇴부의 골밀도를 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 3에서 희생한 생쥐들의 종골의 골밀도를 측정한 결과이다.
도 12은 본 발명의 실시예 3에서 희생한 생쥐들의 지골의 골밀도를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 3에서 희생한 생쥐들의 골 부피, 골 표면적 등의 자료를 이용하여 해면골의 3차원 모델을 재구성하여 나타낸 자료(A)와 관절의 변형 정도를 확인할 수 있도록 측면 엑스레이 촬영 사진이다.
도 14는 본 발명의 실시예 3에서 TNF-α에 대한 사판칼콘 등의 효과를 시험한 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3에서 IL-1β에 대한 사판칼콘 등의 효과를 시험한 결과이다.
도 16는 본 발명의 실시예 3에서 IL-6에 대한 사판칼콘 등의 효과를 시험한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실험재료의 준비

실험에 사용한 유기용매는 메탄올 (Dae-Jung, 5558-4410, Korea), 헥산(Dae-Jung, 4081-4410, Korea), 클로로포름(Duksan, UN1888, Korea), 에틸아세테이트(Duksan, UN1170, Korea), 부탄올(Dae-Jung, 2074-4410, Korea)을 이용하였으며, Bovine type II collagen (Central Lab, Seoul, Korea), 완전프로인트항원보강제(complete Freund’s adjuvant, CFA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 불 완전프로인트항원보강제(incomplete Freund’s adjuvant, ICFA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 이용하여 수행하였다. 사이토카인(Cytokine)을 측정하기 위한 ELISA 키트는 TNF-α의 경우 Quantikine®Mouse TNF-α Immunoassay Kit(R&D systems, MTA00B, USA), IL-1β 키트의 경우 Quantikine®Mouse IL-1β Immunoassay Kit (R&D systems, ML800C, USA), IL-6 키트의 경우 Quantikine®Mouse IL-6 Immunoassay Kit (R&D systems, M6000B, USA)와 PGE2 키트의 경우 Quantikine®Mouse Prostaglandin E2 Immunoassay Kit(R&D systems, KGE004B, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.

실시예 1: 소목추출물로부터 사판칼콘의 분리 및 확인

1)소목 추출물의 제조

소목은 서울 경동시장에서 건조 상태로 판매되는 한약재 소목을 사용하여 추출, 분리 및 구조분석을 수행하였다. 소목을 멸균수를 이용하여 이물질 제거 후, 바람이 통하는 음지에서 5일간 건조하여 사용 하였다. 건조된 소목은 마쇄기를 이용하여 분쇄한 후 9 kg을 추출용기에 넣었다. 상기 추출용기에 넣은 분쇄 소목 부피의 3배량의 메탄올을 첨가하여 하룻밤 동안 4 ℃에서 냉침을 3회 반복하여 실시하였고, 소목메탄올추출액을 얻은 후 건조하여 분말화된 소목메탄올추출물을 얻었다.

분액깔때기에 상기 소목메탄올추출물 분말을 넣고, 여기에 물과 헥산을 소목메탄올추출물 분말 1을 기준으로 물 9 중량비, 헥산 10 중량비로 섞어서 제1혼합물을 제조하였다. 상기 제1혼합물을 12시간 동안 정치하여 헥산층과 물층이 분리되도록 하였고, 하층에 형성된 물층을 분리한 후, 상기 분리된 물층에 헥산을 위와 동일한 방법으로 첨가하여 3회 반복 추출하였고, 분리된 물층과 헥산층을 각각 얻었다.

위 과정에서 얻어진 물 층에 동일량의 클로로포름을 첨가한 후, 12시간 정치 후 클로로포름추출액을 분획하였고, 이를 동결건조하여 분말화된 클로로포름 분획물 7g을 얻었다.

이렇게 얻어진 클로로포름 분획물에서 활성성분인 사판칼콘을 실리카 겔 칼럼(200-300 메쉬)을 이용한 칼럼크로마토그래피 방법으로 분리하였다. 구체적으로, 위의 실리카 겔 칼럼에 클로로포름과 메탄올을 각각 20:1, 10:1, 1:1로 사용하여 활성분획 1 내지 4을 얻고, 여기에 세파텍스 LH-20과 메탄올을 이용하여 활성분획 1 및 2를 얻었다. 이렇게 얻어진 소목추출물은 이하 과정으로 사판칼콘 단일물질임을 확인하였으며, 위의 방법으로 제조한 소목추출물을 단일성분으로 이후 뼈보호 및 골관절염 예방 도는 개선용 조성물로 적용하였다.

2)소목 추출물의 성분분석

위의 1)에서 제조한 소목 추출물의 성분을 하기의 방법으로 분석하였다.

고속액체 크로마토그래피(HPLC) 분석

고속액체 크로마토그래피(HPLC)는 LC-20 시리즈인(Shimadzu corp. Tokyo, Japan)를 사용하였고, C18 컬럼(UG120; 250x4.6mm, 5?m, monitoredat 280nm), 25 ℃에서 메탄올 10 내지 100%로 1.25 %아세트산을 이동상으로 이용해 0.5 mL/min의 속도로 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1을 참조하면, 1)에서 제조한 시료의 머무름 시간(RT) 11.147로 나타났다.

액체크로마토그래프-이온트랩-시간비행형-질량분석기(LCMS-IT-TOF)를 이용한 분석

액체크로마토그래프-이온트랩-시간비행형-질량분석기(LCMS-IT-TOF, Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan)를 100 내지 500 m/z 범위에서 양이온 및 음이온을 스캔 하였으며, 검출 전압과 온도는 각각 1.60 V 과 4000C으로 하여 실험하였고, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 상기 도 2 및 도 3을 참조하면, 1)에서 제조한 시료의 양이온 및 음이온의 질량은 각각 287.0768 m/z과 285.0569 m/z으로 나타났다.

핵자기공명( ¹ H-NMR)분석

핵자기공명(¹H-NMR)은 JNM-LA400NMR (JeolLtd.,Tokyo,Japan)를 이용하여 400MHz에서 구조 분석 방법을 이용하여 위의 1)의 소목 추출물의 구조를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타냈다. 상기 도 4를 참조하면, 위에서 추출한 소목추출물은 핵자기공명(¹H-NMR)에서 2’-OMe: 6.44 (1H, dd, J=2.0, 8.6 Hz); H-5’: 6.51 (1H, d, J=2.0 Hz); H-3’; 6.78 (1H, d, J=8.0 Hz); H-5; 6.97 (1H, d, J=8.4 Hz); H-6: 7.10 (1H, d, J=2.0 Hz); H-2: 7.35 (1H, d, J=15.6 Hz) H-α; 7.48 (1H, d, J=15.6 Hz) H-b, 7.67 (1H, d, J=15.6 Hz) H-6’를 갖는 것을 확인할 수 있었고, 상기 도 4에 표시된 것과 같이 사판칼콘의 구조를 갖는다는 점을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 생쥐에서 소목추출물의 관절염 예방 및 경감 효과

1) 실험동물 및 실험방법

실험동물인 생쥐는 중앙실험동물에서 분양 받아 사용하였다. 동물실험은 순천향 실험동물윤리위원회의 승인에 따라 실행하였다(SCH13_08_03). 7주령의 DBA/1J 생쥐를 1주 동안 사육 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였고, 22.0±2℃, 1일 중 12시간은 200 내지 300 룩스(Lux)로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하는 동물 사육 조건에서 사육하였다. 생쥐의 식이는 고형사료(조단백질 20.5%; 조지방 3.5%; 조섬유 8.0%; 조회분 8.0%; 인 0.5%; 인 0.5%)와 물을 충분히 공급하였다.

생쥐는 각각 정상군(정상군, n=10) 관절염을 유발시킨 후 약물 처치를 하지 않은 음성대조군(대조군, n=10), 관절염을 유발시킨 후 사판칼콘 10 ㎎/kg을 매일 복강투여한 군(사판칼콘이군, n=10)과 양성대조군으로 메토트렉세이트(MTX) 3㎎/kg 3일에 한번 복강투여한 치료군(MTX군, n=10)으로 나누어 실험하였다.

또한, 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하고 유의성 검증은 SPSS (ver. 9 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 사후 검정(Tukey’s post-hoc) *p < 0.05을 실시하여 정산군과 대조군 간의 유의성을 표기하였다.

2) 콜라겐으로 관절염이 유도된 DBA/1J 생쥐에 투여 실험

이하의 방법으로 소목 단일 생약 추출물(사판칼콘)의 뼈 보호 및 골관절염 예방 및 개선 활성을 콜라겐으로 관절염이 유도된 DBA/1J 생쥐에 투여하여 확인하는 실험을 진행하였다.

관절염의 유도

콜라겐(Collagen) 유발 관절염(CIA)은 보바인 타입2 콜라겐(bovine Type Ⅱ collagen, Central Lab, Seoul, Korea)에 0.05 mol/L의 아세트산(acetic acid)과 완전프로인트항원보강제(complete Freund’s adjuvant, CFA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 혼합한 콜라겐혼합물 200 ㎍를 DBA/1J 생쥐의 꼬리부위에 피하 주사하고, 21일 후 IFA(incomplete Freund’s adjuvant, ICFA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 같은 방법으로 동량 혼합하여 피하주사로 2차 부스팅(boosting)하여 CIA 모델을 유발하고, 이하 실험에 적용하였다.

관절염 유도된 생쥐에서 사판칼콘의 효과

시간에 따른 생쥐의 몸무게 변화, 발두께 변화, 관절염 평가지수 등을 평가하여 사판칼콘의 효과를 평가하였다. 생쥐의 발두께 변화 측정을 위해 버니어켈리퍼스 (Ozaki, Tokyo, Japan)을 이용하여 ㎜ 단위로 발두께를 측정하였다. 또한, 관절염 지수(Arthritis Index)도 평가하였는데, 관절염 발생율(C.I.A)은 실험 기간 동안 관절 염증 증세를 보이는 생쥐수와 전체생쥐수의 백분율(%)로 나타내었고, 관절염 지수로 표현되는 각 관절의 염증 정도는 일주일에 3 내지 4번 관찰하였다. 관절염 지수는 다음과 같이 0부터 4까지 측정 하였다 (Hughes et al., 1994). 0: 정상상태; 1: 한곳의 발가락 혹은 관절에서 부종 및 홍반이 유발된 상태; 2: 하나 또는 두 개의 발가락 혹은 관절에서 부종 및 홍반이 관찰되는 상태; 3: 두 개 이상의 발가락 혹은 관절에서 부종 및 홍반이 관찰되며 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태; 4: 관절염에 의해 발가락 혹은 관절의 변형 또는 심한 강직상태가 관찰되며 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태. 따라서, 네발을 합하여 관절염 지수를 산출하였으며 따라서 16가 최대치가 된다.

정상군, 대조군, MTX군, 및 사판칼콘군의 생쥐들의 몸무게의 변화, 발두께의 변화, 복강주사 투여 시작 후 20일째 발 두께 사진, 관절염 평가지수의 변화를 각각 도 5, 도 6, 도 7, 및 도 8에 나타내었다.

상기 도 5를 참조하면, 생쥐의 체중은 25일째 감소하였고 정상군에 비해 나머지 3군에서는 유의성이 나타나지 않는 것으로 평가되었다. 또한, 도 6 및 도 7을 참조하면, 발 두께는 대조군에서 20일째 크게 증가하였으나, MTX군 및 사판칼콘군에서 대조군에 비해 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 사판칼콘이 뼈 보호 및 골관절염 예방 활성을 가진다는 점을 시사한다. 또한, 도 8을 참조하면, 대조군인 관절염이 유발된 생쥐의 관절염 평가지수는 최대치에 도달한 반면, MTX군과 사판칼콘군에서는 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 실시예 2의 생쥐에서 생화학검사 및 골밀도 측정

1) 생화학적 검사

생화학적 검사를 하기 위하여 복강주사 투여시작일로부터 20일이 지난 생쥐들의 혈액을 채취하여 상온에 30분 보관한 후 원심분리(3,000rpm, 10min)하여 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 넣은 후 혈청 내 AST (aspartate aminotransfease), ALT (alanine aminotransferase) 및 크레아티닌을 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하고 유의성 검증은 SPSS (ver. 9 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 사후 검정(Tukey’s post-hoc) *p < 0.05, #p < 0.05을 실시하여 정상군과 대조군 간의 유의성을 표기하였다.

생화학적 검사를 확인한 결과, 생쥐의 혈청 속 AST 및 ALT는 대조군에서 가장 높게 나타났으며, 사판칼콘군에서는 낮게 확인되었다. 크레아티닌은 정상군에 비해 높게 나타났지만 유의성은 없었다.

그룹 (n=10)	정상군	대조군	MTX군	사판칼콘군
AST(U/L)	127.50±29.10	172.50±30.51	142.23±30.17	120.00±55.00
ALT(U/L)	32.00±2.83	44.50±3.54^#	43.33±12.58	26.67±14.43
크레아티닌(mg/dL)	0.53±0.11	0.70±0.11	0.55±0.05	0.62±0.03

2) 미세단층촬영기 (micro-CT) 및 골밀도 측정

실험동물들의 골구조 변화를 측정하기 위해 CT 및 골밀도 측정 하였다.

복강주사 투여시작일로부터 20일이 지난 생쥐들을 희생시켜 대퇴골부터 지골까지 다리를 적출한 후 고해상 미세단층촬영기(SkySan 1172, Bruker, Belgium)를 이용하여 촬영하였으며, 경골과 대퇴골의 장골, 지골의 단층촬영은 20 ㎛ 의 간격으로 50번 촬영하였다. 각각 경골과 대퇴부, 종골, 지골의 골밀도를 측정하여 도 9 내지 12에 나타냈고, 골 부피(BV), 골 표면적(BS), 조직 전체 부피(TV)를 바탕으로 골의 부피와 조직 전체 부피의 비율(BV/TV), 골표면적과 골부피의 비율(BS/BV), 치밀골의 두께(Tb.Th.), 치밀골의 수(Tb.N), 치밀골의 구분(Tb.Sp), 프랙탈 차원의 분석 결과를 분석하여 하기 표 3에 나타내었다. 또, 이러한 자료들을 바탕으로 관절염 유발에 따른 생쥐의 지표를 분석하였고 해면골의 3차원 모델을 재구성하여 도 13에 나타내어 뼈의 구조적 변화를 관찰하였다.

또한, 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하고 유의성 검증은 SPSS(ver. 9 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 사후 검정(Tukey’s post-hoc) p < 0.05을 실시하여 정상군과 대조군 간의 유의성을 표기하였다.

그룹 ( n =10)	BV/TV(%)	BS/BV(mm)	Tb.Th(mm)
정상군	35.02±2.65	18.33±3.22	0.106±0.004
대조군	28.41±1.47^#	23.36±3.15^#	0.086±0.004^#
MTX군	33.38±3.12^#	19.71±2.71^#	0.102±0.003*^#
사판칼콘군	33.72±5.22	19.57±3.91	0.102±0.004*
그룹 ( n =10)	Tb.N(mm ^-1 )	Tb.Sp(mm)	프랙탈 차원
정상군	3.30± 0.23	0.20±0.03	2.49±0.021
대조군	3.32±0.74	0.22±0.05	2.39±0.071
MTX군	3.29±0.23*^#	0.20±0.04	2.46±0.052
사판칼콘군	3.30±0.39	0.20±0.03	2.437±0.031

상기 도 9를 참조하면, 콜라겐으로 관절염 유발 생쥐 경골의 대조군에서 현저하게 낮은 골밀도를 보였고 MTX군과 사판칼콘군에서는 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 도 10 내지 12를 참조하면, 대퇴부, 종골과 지골의 골밀도에서도 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또, 상기 도 13 및 상기 표 3을 참조하면, 정상군에 비해 대조군의 해면골 구조는 큰 왜곡을 나타났다는 점을 확인할 수 있으며, 사판칼콘군은 소폭 개선이 나타나 소주 구조 유지 및 관절염 예방에 적합하다는 점을 확인할 수 있었다. 상기 표 3을 참조하면, BV/TV은 대조군에서 정상군과 비교하였을 때 유의성 있게 낮게 나타났다. BS/BV는 대조군에서 높게 나타난 반면 Tb.Th는 정상군과 비교하였을 때 유의성 있게 가장 낮게 나타났다. Tb.N과 Tb.Sp는 정상군과 대조군과 유의성 없이 차이가 없었다. 프랙탈 차원은 대조군에서 낮게 나타났다.

모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하고 유의성 검증은 SPSS (ver. 9 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 사후 검정(Tukey’s post-hoc) *p < 0.05, #p < 0.05을 실시하여 정상군과 대조군 간의 유의성을 표기하였다.

3) 관절염의 염증성 매개체에 사판칼콘의 효과

관절염의 염증에 중요한 매개체인 TNF-α, 인터루킨-1 베타(IL-1β), 인터루킨 6(IL-6)에 대한 사판칼콘의 효과를 면역분석법 키트(R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 제조업체의 지침을 사용하여 측정하였고, 그 결과롤 도 14 내지 도 16에 나타냈다. 상기 도 14 내지 도 16을 참조하면, 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 인터루킨 6 (IL-6)는 대조군에서 유의성 있게 높게 나타났고, 사판칼콘군에서는 상당 수준 감소된다는 점을 확인할 수 있었다. 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하고 유의성 검증은 SPSS (ver. 9 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 사후 검정(Tukey’s post-hoc)**p < 0.001, *p < 0.05, ##p < 0.001, #p < 0.05을 실시하여 정상군과 대조군 간의 유의성을 표기하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

사판칼콘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 사이토카인 활성억제제를 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 사이토카인 활성억제제는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제 또는 감소시키는 것인, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 사판칼콘은 소목의 심재(heartwood) 건조물로부터 얻은 냉침추출물로부터 분리된 것인, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
사판칼콘 또는 이의 식품으로 허용되는 염을 함유하여 류마티스 관절염 질환의 예방 또는 완화, 또는 뼈 보호 기능을 갖는, 식품조성물.
제4항에 있어서,
상기 식품조성물은, 대퇴골, 경골, 종골, 지골 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뼈의 골밀도를 증가시키는 것인, 식품조성물.