KR20110084539A

KR20110084539A - Ｃｈｋ1을 억제시키는데 유용한 화합물

Info

Publication number: KR20110084539A
Application number: KR1020117013801A
Authority: KR
Inventors: 프랑신 에스. 파로우즈; 리안 코트스워드 홀콤브; 라메쉬 카사; 스티븐 스콧 마이어스
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2011-07-25
Also published as: JO2886B1; JP2012512249A; SG172222A1; IL213160A; TW201029994A; RS52739B; CL2011001463A1; HRP20130167T1; CY1113930T1; WO2010077758A1; AU2009333433B2; MX2011006603A; UA101998C2; ZA201103946B; PL2379532T3; ECSP11011136A; CA2746423C; IL213160A0; PT2379532E; BRPI0922468A2

Abstract

본 발명은 Chk1을 억제시키며, 암을 치료하는데 유용한 아미노피라졸 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다.

Description

ＣＨＫ1을 억제시키는데 유용한 화합물{COMPOUNDS USEFUL FOR INHIBITING CHK1}

본 발명은 Chk1을 억제시키며, 데옥시리보핵산 (DNA) 복제, 염색체 분리, 또는 세포 분열에 결함이 있는 것을 특징으로 하는 암을 치료하는데 유용한 아미노피라졸 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물에 관한 것이다.

Chk1은 DNA 손상 체크포인트 신호 전달 경로에서 Atm 및/또는 Atr로부터 하류에 존재하는 단백질 키나제이다. 포유동물 세포에서 Chk1은 이온화 방사선 (IR), 자외선 (UV) 광, 및 히드록시우레아를 비롯한, DNA 손상을 유발하는 작용제에 대한 반응으로 인산화된다. 포유동물 세포에서 Chk1을 활성화시키는 상기와 같은 인산화는 Atr에 의존한다. Chk1은 S기 및 G2M에서의 정지에 이르게 되는 Atr 의존성 DNA 손상 체크포인트에서 중요한 역할을 한다. Chk1은 보통은 사이클린 E/Cdk2를 탈인산화시키는 이중-특이성 포스파타제인 Cdc25A를 인산화시키고 불활성화시킴으로써 S기를 거쳐 진행되는 것을 중단시킨다. Chk1은 또한 사이클린 B/Cdc2 (이는 또한 Cdk1로도 공지되어 있다)를 탈인산화시키는 이중-특이성 포스파타제인 Cdc25C를 인산화시키고 불활성화시킴으로써 G2와 유사분열 사이의 경계에서 세포 주기 진행을 정지시킨다 (문헌 [Fernery et al., Science, 277: 1495-7, 1997]). 상기 두 경우에서, Cdk 활성의 조절이 세포 주기 정지를 유도하여 DNA 손상 또는 복제되지 않은 DNA의 존재하에서 세포가 유사분열로 진입하지 못하게 된다.

Chk1에 대한 각종 억제제가 보고되어 있다. 예를 들어, WO 05/066163, WO 04/063198, WO 03/093297 및 WO 02/070494를 참조한다. 추가로, 일련의 아미노피라졸 Chk1 억제제가 WO 05/009435에 개시되어 있다.

그러나, DNA 손상 작용제의 증강제로서 효과적으로 작용할 수 있는, 세포 주기 체크포인트에 대해 효능이 있는 억제제인 Chk1 억제제가 요구되고 있다. 본 발명은 Chk1에 대해 효능이 있는 억제제인 신규한 아미노피라졸 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 조직 배양 음성 대조군 생체내에서 DNA 손상 작용제를 사용하여 이루어지는 치료에 의해 유도되는 Chk1 매개성 세포 주기 정지를 강력하게 폐기시킨다. 추가로, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 또한 Chk2를 억제시키는데, 이는 암 치료에 유익할 수 있다. 추가로, 특정의 다른 키나제, 예컨대, CDK1의 억제가 부족하면, 바람직하지 못한 효과를 최소화시킴으로써 치료학적 이익을 얻게 될 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 Chk1 억제에 의존하는 기전에 의해 암 세포의 세포 증식을 억제시킨다.

본 발명은 Chk1의 길항제인, 신규한 아미노피라졸 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 상기 신규한 화합물은 안전하고 효과적인 암 치료법에 대한 요구를 충족시켜 줄 수 있다.

본 발명은 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 바람직한 실시양태는 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 포름산 염, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 디히드로겐 클로라이드 염 및 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 메탄술폰산 염, 및 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물이다.

특정 실시양태로서, 본 발명은 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴인 화합물을 제공한다.

본 발명은 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴의 포름산, 디히드로겐 클로라이드, 및 메탄술폰산 염을 제공한다.

본 발명은 또한 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물인 화합물을 제공한다.

본 발명은 2θ±0.02 = 12.64, 21.25, 및 26.15에서 피크를 갖는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, 결정질 형태의 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물을 제공한다.

본 발명은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 조합된 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 또한 암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 이온화 방사선을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 또한 치료법이 이온화 방사선과 함께 이루어지는 조합 요법을 포함하는 것인, 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 조합 요법 치료법이 동일 환자에게 본 약제를 투여하는 것 및 하나 이상의 다른 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는 것인, 조합 요법에 의해 이루어지는 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 용도를 제공한다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 이온화 방사선을 제공한다. 추가로, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 화학요법제를 제공한다.

본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 이온화 방사선을 제공한다. 추가로, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물, 및 화학요법제를 제공한다.

본 발명은 약제가 이온화 방사선과 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여되는 것인, 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 용도를 제공한다.

본 발명은 약제가 또한 화학요법제를 포함하거나, 약제가 화학요법제와 함께 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여되는 것인, 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 용도를 제공한다.

본 발명은 암 치료에서 이온화 방사선과 함께 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다.

본 발명은 암 치료에서 화학요법제와 함께 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 제공한다.

본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료학적 성분과 함께 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 화학요법제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴, 및 탁솔로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 기술된 방법 및 용도의 바람직한 실시양태를 제공한다. 본원에 기술된 방법 및 용도의 바람직한 실시양태는 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암, 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.

본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 호변이성질체 형태로서 존재할 수 있다. 호변이성질체 형태로 존재하는 경우, 그 각각의 형태 및 그의 혼합물이 본 발명에서 주시된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 발명은 실시예 3의 화합물의 제약상 허용되는 염 뿐만 아니라, 실시예 3의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유리 염기의 용매화물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 실시예 3의 화합물의 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 염 및 그의 제조 방법의 예는 당업계에서 통상적인 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use", VCHA/Wiley-VCH, (2002)]; [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; 및 [Bastin et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)])을 참조한다.

제약상 허용되는 염 이외에도, 다른 염이 본 발명에 포함된다. 이들은 화합물의 정제에서, 또는 다른 제약상 허용되는 염의 제조에서 중간체로서의 역할을 할 수 있거나, 또는 확인, 특징 규명 또는 정제에 유용하다.

본원에서 사용되는 바, "환자"라는 용어는 인간 또는 비인간 포유동물을 지칭한다. 더욱 특히, "환자"라는 용어는 인간을 지칭한다.

"치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")이라는 용어는 증상, 질병, 병증, 또는 질환의 진행 또는 중증도를 저속화시키거나, 방해하거나, 정지시키거나, 조절하거나, 완화시키거나, 또는 가역화시키는 것을 포함하는 과정을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 환자에게 단일 또는 다회 용량으로 투여되었을 때, 진단시 또는 치료시 환자에 바람직한 효과를 제공하는 것인, 단독으로 또는 이온화 방사선 또는 화학요법제와 함께 조합되는, 본원에 기술된 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 양 또는 용량을 의미한다. 유효량은 다수의 인자들, 예컨대, 포유동물 종; 그의 크기, 연령, 및 일반적인 건강 상태; 필요할 경우, 다른 작용제의 공-투여; 포함된 특정 질환; 상기 질환의 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여 방식; 투여되는 작용제의 생체이용성에 관한 특징; 선택된 투여 요법; 임의의 동시 약물 투약의 사용; 및 다른 관련 환경을 고려함으로써 당업계의 숙련자로서의 주치 진찰 전문 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 어느 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되서는 안되지만, 20-150 mg/㎡가 본원에 기술된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 유효량을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "조합 요법"이라는 용어는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물과 화합요법제를 별개로, 동시에, 또는 순차적으로 투여하는 것을 의미한다. 추가로, "조합 요법"이라는 용어는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물과 이온화 방사선을 별개로, 동시에, 또는 순차적으로 투여하는 것을 의미한다.

실시예 3의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 제약 조성물의 일부로서인 투여용으로 제형화될 수 있다. 그 자체로서, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제와 함께 조합하여 실시예 3의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물을 포함하는 제약 조성물은 본 발명의 중요한 실시양태이다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing (1995)]를 참조한다.

본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 그를 생체이용가능하게 만드는 임의의 경로에 의해, 예를 들어, 경구 및 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 경구적으로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 경피적으로, 국소적으로, 비내로, 직장내로, 협측으로 등의 방법으로 투여될 수 있다. 별법으로, 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물은 주입에 의해 투여될 수 있다. IV 주입이 바람직한 투여 경로이다.

본원에서 사용되는 바, 하기 용어들은 명시된 의미를 갖는다: "BCA"는 비신코닌산을 지칭하고; "boc 또는 t-boc"를 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "BSA"는 소혈청 알부민을 지칭하고; "CPMS"는 1분당 계수를 지칭하고; "DIAD"를 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "DPBS"는 둘베코 인산염-완충처리된 염수를 지칭하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민 테트라아세트산을 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "FBS"는 우태아 혈청을 지칭하고; "HEPES"는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "PBS"는 인산염-완충처리된 염수를 지칭하고; "PBST"는 인산염-완충처리된 염수 트윈-20(Tween-20)을 지칭하고; "PI"는 프로피듐 요오다이드를 지칭하고; "RNAase"는 리보뉴클레아제 A를 지칭하고; "SDS"는 도데실황산나트륨을 지칭하고; "RT"는 실온을 지칭하고; "TBS"는 트리스(Tris)-완충처리된 염수를 지칭하고; "TBST"는 트리스-완충처리된 염수 트윈-20을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TR-FRET"는 시간 분해 형광 에너지 전이를 지칭하고; "트리스"는 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄을 지칭하고; "트리톤-X(Triton-X)"는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르를 지칭하고; "트윈-20"은 폴리소르베이트 20을 지칭한다.

하기 검정을 통해 얻은 결과는 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물이 Chk1 억제제, Chk2 억제제로서, 및 항암제로서 유용하다는 증거를 입증한다. 본원에서 사용되는 바, "IC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 일으키는 상기 작용제의 농도를 지칭하며, "EC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 반응의 50%를 일으키는 상기 작용제의 농도를 지칭하는 것이다.

Chk1 생화학적 검정

TR-FRET 검정을 사용하여 화합물이 Chk1의 생화학적 활성에 미치는 효과를 측정할 수 있다. 상기 검정에서는 키나제, 형광-표지된 기질, 및 ATP의 반응으로부터 형성된 인산화된 생성물을 검출하기 위해 테르븀-표지된 항체가 사용되었다. 항체가 인산화된 기질에 결합하게 되면, 수용자 신호 (플루오레세인) 대 공여자 신호 (테르븀)의 비로 계산되는 TR-FRET 값은 증가하게 된다.

96-웰 ½-면적의 검은색 폴리스티렌 플레이트 (코스타(Costa), 카탈로그 번호 3694) 중에서 키나제 반응 (25 ㎕ 반응 부피)을 수행하였다. ATP를 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 최종 반응 조건은 50 mM HEPES (pH 7.5), 0.005% (v/v) 트리톤™ X-100, 2 mM DTT, 2 mM MgCl₂, 104 nM 플루오레세인-PKC 기질 (인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 PV3506), 30 μM ATP, 1.5 nM 활성 Chk1 효소 (밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 14-346), 4% (v/v) DMSO 및 실시예 2의 화합물의 일련의 희석액 (1:3의 일련의 희석액, 20 μM에서 출발, 10 포인트)이었다. ATP를 첨가한 후, 반응물을 75분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 2.1 nM Tb-pSer 항체 (인비트로겐, 카탈로그 번호 PV3574) 및 10 mM EDTA를 함유하는 25 ㎕의 TR-FRET 희석 완충액 (인비트로겐 #PV3574)을 첨가함으로써 종결시켰다. 켄칭된 반응물을 60분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 필터가 있는 퍼킨엘머(PerkinElmer)로부터 앤비젼(Envision) 플레이트 판독기를 사용하여 Ex340nm, Em495nm 및 Em520nm 파장에 대한 TR-FRET를 측정하였다.

IC50 측정을 위해서 각 플레이트 상에서 수행된 대조군으로부터의 TR-FRET 비를 사용하여 각 농도에 대한 억제율(%)을 계산하였다. 이어서, 액티비티베이스(ActivityBase) 4.0을 사용하여 10-포인트 화합물 농도 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 피팅하였다. 작성된 곡선으로부터 절대 IC50 값을 계산하였다. 실시예 2의 화합물을 본 검정으로 측정한 바, <0.001 μM의 IC50을 갖는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 화합물이 효능이 있는 Chk1 억제제인 것으로 입증되었다.

Chk2 생화학적 검정

TR-FRET 검정을 사용하여 화합물이 Chk2의 생화학적 활성에 미치는 효과를 측정할 수 있다. 상기 검정에서는 키나제, 플루오레세인-표지된 기질, 및 ATP의 반응으로부터 형성된 인산화된 생성물을 검출하기 위해 테르븀-표지된 항체가 사용되었다. 항체가 인산화된 기질에 결합하게 되면, 수용자 신호 (플루오레세인) 대 공여자 신호 (테르븀)의 비로 계산되는 TR-FRET 값은 증가하게 된다.

96-웰 ½-면적의 검은색 폴리스티렌 플레이트 (코스타, 카탈로그 번호 3694) 중에서 키나제 반응 (25 ㎕ 반응 부피)을 수행하였다. ATP를 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 최종 반응 조건은 50 mM HEPES (pH 7.5), 0.005% (v/v) 트리톤™ X-100, 2 mM DTT, 2 mM MgCl₂, 104 nM 플루오레세인-PKC 기질 (인비트로겐, 카탈로그 번호 PV3506), 30 μM ATP, 2.5 nM 활성 Chk2 효소 (밀리포어, 카탈로그 번호 14-347), 4% (v/v) DMSO 및 실시예 2의 화합물의 일련의 희석액 (1:3의 일련의 희석액, 20 μM에서 출발, 10 포인트)이었다. ATP를 첨가한 후, 반응물을 75분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 2.1 nM Tb-pSer 항체 (인비트로겐, 카탈로그 번호 PV3574) 및 10 mM EDTA를 함유하는 25 ㎕의 TR-FRET 희석 완충액 (인비트로겐 #PV3574)을 첨가함으로써 종결시켰다. 켄칭된 반응물을 60분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 필터가 있는 퍼킨엘머(PerkinElmer)로부터 앤비젼(Envision) 플레이트 판독기를 사용하여 Ex340nm, Em495nm 및 Em520nm 파장에 대한 TR-FRET를 측정하였다.

IC50 측정을 위해서 각 플레이트 상에서 수행된 대조군으로부터의 TR-FRET 비를 사용하여 각 농도에 대한 억제율(%)을 계산하였다. 이어서, 액티비티베이스 4.0을 사용하여 10-포인트 화합물 농도 데이터를 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 피팅하였다. 작성된 곡선으로부터 절대 IC50 값을 계산하였다. 실시예 2의 화합물을 본 검정으로 측정한 바, 0.0047 μM의 IC50을 갖는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 화합물이 효능이 있는 Chk2 억제제인 것으로 입증되었다.

Chk1 자가인산화 세포 기반 검정

Chk1의 억제제는 DNA 손상 반응이 활성화되어 있는 세포에서 상기 단백질이 기질을 인산화시키는 키나제 활성을 방해할 것이다. Chk1에 대한 쉽게 검출될 수 있는 기질은 Chk1 그 자신 위의 자가인산화 부위인 세린 296 위치이다. Chk1 상의 세린 296의 인산화 양, 및 Chk1 단백질 키나제의 활성 수준을 간접적으로 측정하기 위해 하기 면역블롯 검정을 사용할 수 있다. HeLa 세포 (ATCC로부터 구입)를 10% (v/v) 열 불활성화된 FBS (기브코™), 1 x MEM 비필수 아미노산 (기브코™), 1 x 피루브산나트륨 (기브코™)으로 보충된 L-글루타민 (기브코™)을 포함하는 얼스 염 (인비트로겐) 함유 MEM 중에서 배양하고 600 ㎕의 MEM 배양 배지 (상기)에서 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 1 x 10⁵개의 세포를 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 및 95%-100% 습도하에서 인큐베이션시켰다. 배양 배지 중 4 μM 독소루비신 (시그마(Sigma)) 스톡 16 ㎕를 각각의 적절한 웰에 첨가하여 최종 농도 100 nM의 독소루비신을 제조하였다. Chk1 억제제 화합물을 첨가하기 전에 플레이트를 추가의 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 화합물을 100% DMSO 중에 10 mM으로 가용화시킨 후, 40% (v/v) DMSO 중에 2 mM으로 희석시킨 후, 배양 배지 + 4% (v/v) DMSO를 사용하여 100 μM으로 희석시켰다. 이어서, 100 μM 내지 0.005 μM 범위에 걸쳐 화합물의 일련의 희석액 (1:3)을 제조하였다. 화합물 스톡 66 ㎕를 플레이트 중 적절한 웰에 첨가하여 최종 DMSO 농도가 0.4% (v/v) 및 최종 화합물 농도 범위가 1 μM 내지 0.0005 μM 사이가 되도록 만들었다. 플레이트를 추가의 2시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨 후, 세포 용해물을 제거하고, 프로세싱시켰다. 이어서, 플레이트로부터 배지를 제거하고, 각 웰을 0.5 ml의 빙냉 DPBS (기브코™)로 1회 세척하고, 액체 모두를 제거하고, 남은 방법을 위해 플레이트를 얼음 위에 놓았다. 포스파타제 억제제 (시그마) 및 프로테아제 억제제 (로슈 다이어그노스틱스(Roche Diagnostics))를 함유하는 세포 추출 완충액 (인비트로겐)으로 구성된 빙냉 용해 완충액 75 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 10분 경과 후, 각각의 웰을 스크랩핑하고, 용해물을 얼음 상의 1.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 넣었다. 각 용해물을 수/빙조 중에 현탁시키면서, 플레이트 컵혼 초음파 발생 장치 (미소닉스(Misonix))를 사용하여 45초 동안 초음파처리하였다. 각 샘플 50 ㎕를, 25 ㎕의 4 x 램라이(Laemmli) 샘플 완충액 (240 mM 트리스-HCl (pH 6.8), 40% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루, 8% w/v SDS 및 20% (v/v) 베타-메르캅톨 에탄올)을 함유하는 0.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 넣고, 5분 동안 95℃에서 가열하고, -80℃에서 냉동 보관하였다. 남은 용해물은 단백질 농도 측정 (BCA™ 단백질 검정 키트, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 사용하였다. 샘플 완충액 중 각각의 세포 용해물 5 ㎍씩을 E-페이지(E-Page) 96 웰 겔 (인비트로겐)에 가하고, 제조사의 설명서에 따라 전기영동시켰다. 당업계에서 잘 이해되고 있는 것과 같은 방법에 따라 단백질을 겔로부터 임모빌론-P(Immobilon-P) 막 (밀리포어)으로 전기이동시켰다 [Towbin et al., 1979]. 상기 막을 간단하게 10 mM 트리스/HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 및 0.05% (v/v) 트윈 20 (TBST)으로 세정하고, 1시간 동안 25℃에서 TBST/5% (v/v)의 재구성된 카네이션(Carnation)® 인스턴트 우유 중에 침지시켰다. 막을 5분 동안 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 세척한 후, 24시간 동안 4℃에서 토끼 항-포스포Chk1 (세린 296) (세포 시그날링(Cell Signaling))의 적절한 희석액을 포함하는 TBST/5% (w/v) BSA 중에 침지시켰다. 막을 5분 동안 25℃에서 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 세척한 후, 2시간 동안 25℃에서 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP; 아머샴(Amersham))에 접합된 당나귀 항-토끼 IgG를 함유하는 TBST/5% 우유 중에 침지시켜 자가인산화된 Chk1 단백질을 검출하였다. 막을 5분 동안 25℃에서 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 다시 세척하였다. 막에 고정화된 항원-항체-리포터 접합체는 화학 발광 이미저 (후지필름(Fujifilm))를 사용하여 제조사가 권고한 대로 수퍼 시그날 웨스턴 펨토 HRP-검출 시약(Super Signal Western Femto HRP-detection reagent) (피어스(Pierce))으로 검출하였다. "토탈 랩(Total Lab)" 소프트웨어 (논리니어 다이나믹스(Nonlinear Dynamics))를 사용하여 포스포-Chk1 (ser296) 밴드 강도를 계산하였다. 독소루비신 유도성 Chk1 자가인산화의 억제율(%)은 하기 식을 사용함으로써 계산하였다: 억제율(%) = (샘플 포스포Chk1 밴드 강도 - 독소루비신이 사용되지 않은 음성 대조군 포스포Chk1 밴드 강도)/(독소루비신 양성 대조군 포스포Chk1 밴드 강도-독소루비신이 사용되지 않은 음성 대조군 포스포Chk1 밴드 강도) x 100. 실시예 2의 화합물을 본 검정으로 측정한 바, <0.0005 μM의 EC50을 갖는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 화합물이 효능이 있는 Chk1 억제제인 것으로 입증되었다.

독소루비신-유도성 G2M 체크포인트 폐기 HeLa 세포-기반 어큐멘 ( Acumen ) 검정

Chk1 억제제는 토포이소머라제 II 억제제인 독소루비신으로 처리된, p53-마이너스 종양 세포에서 G2M DNA 손상 체크포인트를 무력화시킬 것이다. G2M 체크포인트 폐기 측정은 세포가 G2M 체크포인트를 통과하여 유사분열로 진입한 후에 발생되는, 세린 10 상에서의 히스톤 H3의 인산화에 관해 이루어진다. 하기와 같은 고도의 콘텐트 영상화 검정을 사용하여 세포에서의 히스톤 H3의 인산화를 측정할 수 있다. HeLa 세포 (ATCC로부터 입수)를 10% (v/v) FBS로 보충된 MEM 배지 (기브코™) 중에서 배양하고, 웰당 부피 100 ㎕로, 폴리 D-리신 코팅된 투명한 바닥의 검은색 플레이트 (BD 바이오코트(BD Biocoat) 카탈로그 번호 3504640)에 웰당 2,000개의 세포로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 18-24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 (37℃, 5% CO₂ 및 상대 습도 95%) 인큐베이션시켰다. 최초 인큐베이션 후, 625 nM 독소루비신을 함유하는 20 ㎕의 기브코™ MEM 배지 10% FBS를 플레이트 중 적절한 웰에 첨가하여 최종 농도가 125 nM이 되도록 만들었다. 세포를 G2M 체크포인트에서 정지시키기에 충분한 시간인 24시간 동안 플레이트를 인큐베이터로 복귀시켰다. 그 다음날, 세포를 실시예 2의 화합물로 처리하였다. 실시예 2의 화합물을 100% DMSO 중에 10 mM으로 가용화시킨 후, 4% (v/v) DMSO-MEM 중 50 μM에서 출발하여 10 x 스톡으로 희석시켰다. 이어서, 50 μM에서부터 0.39 μM 범위에 걸쳐 화합물의 일련의 희석액 (1:2)을 제조하였다. 화합물 스톡 13 ㎕를 플레이트 중 적절한 웰에 첨가하여 0.4%의 최종 DMSO 농도, 및 5 μM 내지 0.039 μM 범위의 최종 화합물 농도를 얻었다. 플레이트를 추가의 7시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨 후, 고정시키기 위해 제거하였다. 각 웰로부터 액체를 주의하여 제거하고, 100 ㎕의 프레퍼(PREFER)™ 고정제 (아나테크(Anatech) LTD. 카탈로그 번호 414)를 첨가하였다. 플레이트를 20분 동안 실온에서 유지시키고, 고정제를 제거한 후, 10분 동안 DPBS (기브코™ 카탈로그 번호 14040) 중 100 ㎕/웰의 0.1% (v/v) 트리톤® X 100 (피어스 카탈로그 번호 28314)을 첨가함으로써 세포를 투과가능하게 만들었다. 용액을 제거하고, 웰당 100 ㎕ DPBS로 플레이트를 2회에 걸쳐 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 50 μg/mL RNAase (리보뉴클레아제 A, 시그마 카탈로그 번호 R-6513)를 함유하는 100 ㎕의 DPBS를 첨가하였다. RNAase 용액을 제거하고, 토끼 항-pHH3 (ser10) (UBI 카탈로그 번호 06-570) + 1% (w/v) BSA (기브코™ 카탈로그 번호 15260)로 이루어진 1:500 희석액을 함유하는 50 ㎕의 RNAase 용액을 각 웰에 첨가함으로써 세린 10에서 인산화된 히스톤 H3 (pHH3)의 존재 여부를 위해 세포를 염색하였다. 플레이트를 실링하고, 밤새도록 4℃에서 유지시켰다. 웰당 100 ㎕ DPBS로 각각의 플레이트를 2회에 걸쳐 세척함으로써 1차 항체를 제거하고, DPBS + 1% (w/v) BSA 중 알렉사(Alexa) 염료 488 (인비트로겐 카탈로그 번호 A11008)에 커플링된 염소 항-토끼 IgG의 1:750 희석액 50 ㎕로 대체하였다. 1시간 동안 실온에서 플레이트를 알루미늄 호일로 덮은 상태로 두어 빛으로부터 보호하였다. 100 ㎕ DPBS로 플레이트를 다시 2회에 걸쳐 세척하고, 100 ㎕의 15 nM 프로피듐 요오다이드 (PBS를 사용하여 원액으로부터 1:100 희석액으로 제조된 것, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) 카탈로그 번호 P3566)로 대체하였다. 검은색 실(seal)로 플레이트를 실링하여 플레이트를 빛으로부터 보호하였다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이션시켜 핵을 염색시켰다. 488 nm 여기 (TTP 랩테크 LTC(TTP LABTECH LTC))를 사용하여 어큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER)™ 레이저-주사 형광 마이크로플레이트 세포측정기로 플레이트를 스캐닝하여 pHH3 및 DNA 함량 (2N, 및 4N 포함)을 측정하였다. pHH3 양성 세포는 알렉사 488로부터의 519 nm에서의 평균 강도에 의해 확인하였다. 프로피듐 요오다이드/DNA로부터의 655-705 nm에서의 전체 강도를 사용하여 개별 세포 및 세포 주기에서의 소집단 (2N 세포, 4N 세포)을 확인하였다. 각 집단에 대한 최종 판독값은 전체 세포(%)로 정규화시켜 pHH3(%), 2N(%) 및 4N(%)이라는 최종 검정 출력값을 산출해냄으로써 결정되었다. 이어서, 최대 농도 100 nM의 억제제 대조군 화합물로 세포를 처리함으로써 100% 활성을 결정하여 각 화합물의 최종 활성(%)을 측정하였다. 0% 활성은 화합물 처리를 하지 않은 것에 기초하였다. 액티비티 베이스™, 엑셀 피트를 사용하여 4 파라미터 로지스틱 피트, 방정식 205의 사용으로 곡선을 피팅함으로써 상대 EC50을 측정하여 100%의 최대 (max) 대조군 값에 대해 상대적인 pHH3(%)을 측정하였다. 실시예 2의 화합물을 본 검정으로 측정한 바, 0.0105 μM의 EC50을 갖는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 화합물이 G2M DNA 손상 체크포인트를 무력화시킬 것이라는 것이 입증되었다.

EC _tfs (2배 감작화 ) 검정

Chk1의 억제제는 S기내 체크포인트를 폐기시켜 겜시타빈 (또는 다른 세포독성제)의 항증식 활성을 강화시킴으로써, 이를 통해 DNA 손상을 지속시키고, 증가시킨다. DNA 손상 이후 계속적으로 종양 세포를 증식시킬 수 있는 능력은 세포가 그의 DNA를 복제할 수 있는 능력을 측정함으로써 검정할 수 있다. 이러한 검정에서는 세포가 DNA 손상을 수복시킬 수 있는 기회를 획득한 이후 세포가 그의 DNA를 복제시킬 수 있는 능력을 평가한다. 상기 검정에서, 세포를 겜시타빈으로 처리한 후, 실시예 2의 화합물로 처리하였다. 회복기가 경과한 후, S기 동안 방사성 티미딘을 DNA 내로 도입할 수 있는 능력에 관하여 세포를 검정하였다. EC_tfs 파라미터는 Chk1 억제의 부재하에서 상기 검정으로 측정된 겜시타빈의 GI90 농도를 ½ 만큼 감소시키는데 필요한 Chk1 억제제의 농도 측정치이다. HT-29 세포(ATCC로부터 입수함)를 RPMI 1640 + (기브코™) 10% (v/v) 열 불활성화된 FBS 중에서 성장시켰다. 이들 세포를 코닝 코스타(Corning Costar) 96-웰 조직 배양 플레이트 상에 웰당 1.3 x 10³개의 세포로 플레이팅하였다. 세포를 플레이팅한 후, 조직 배양 플레이트를 45분 동안 실온에서 유지시킨 후, 37℃로 복귀시켰다. 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 겜시타빈을 첨가하였다. 겜시타빈을 첨가하기 이전에, 모든 웰로부터 배지를 제거하고, 웰당 150 ㎕씩 RPMI 배지로 대체하였다. 인산염 완충처리된 염수 중에서 10 mM로 겜시타빈 스톡을 제조하였다. 겜시타빈 희석액을 RPMI 배지 중 4 x 농도로 제조하고, 웰당 50 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 겜시타빈의 최고의 최종 농도는 80 μM이었고, 4배 단계로 희석시켰다. 2시간 경과 후, 겜시타빈 함유 배지를 웰로부터 제거하고, 웰당 150 ㎕씩 새로운 RPMI 배지로 대체하였다. 실시예 2의 화합물 (DMSO 중 10 mM)을 먼저 DMSO 중에서 2,000 x 최종 농도로 희석시킨 후, RPMI 배지에서 1:500으로 희석시켜 웰에 첨가하기 위한 4 x 스톡을 생성하였다. 50 ㎕ 부피만큼 첨가하였다. 5,000 nM에서 출발하여 2배 단계로 화합물을 희석시켰다. 실시예 2의 화합물 첨가 후 24시간이 경과하였을 때, 흡인에 의해 억제제를 함유하는 배지를 제거하고, 웰당 200 ㎕씩 새로운 RPMI 배지로 대체하였다. 실시예 2의 화합물 제거 후 72시간이 경과하였을 때, 삼중수소 티미딘 표지화를 개시하였다. ³H-티미딘 (NET 027X001, 퍼킨엘머, 비활성 20 Ci/mmol)을 완전 RPMI 중에서 1:20으로 희석시켜 0.05 mCi/mL의 농도를 얻었다. 상기 용액 20 ㎕를 각 웰에 첨가함으로써 1 μCi/웰의 ³H-티미딘을 수득하였다. 세포를 22시간 동안 표지화하였다. ³H-티미딘을 함유하는 배지를 웰로부터 철저히 제거하였다. 이어서, 플레이트를 수시간 동안 -20℃에서 냉동시켰다. 도입된 ³H-티미딘을 함유하는 DNA를 수거하기 위해 플레이트를 수분 동안 해동시킨 후, 0.1 N NaOH를 웰당 120 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 회전자 상에서 천천히 혼합하면서, 각각의 플레이트를 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 필터메이트 196 하비스터(Filtermate 196 Harvester) (퍼킨엘머)로 DNA를 수거하고, 96-웰 유니필터(Unifilter) GF/C 플레이트 (퍼킨엘머 #6005174) 상에서 수집하였다. 그 위에 세포가 표지되어 있는 조직 배양 플레이트의 웰을 물 (5x)로 세척하였다. 유니필터 플레이트 막을 웰당 추가의 4.5 mL (3 x 1.0 mL 및 최종적으로 1.5 mL로 세척)로 세척하였다. 이어서, 유니필터 플레이트를 적어도 6시간 동안 37℃에서 건조시켰다. 각각의 필터 플레이트 바닥을 백실(Backseal) 접착 시트 (퍼킨엘머)로 실링하고, 50 ㎕/웰의 마이크로신트(MicroScint)-20 (퍼킨엘머)을 첨가하였다. 이어서, 탑실(Topseal) 투명 접착 시트 (퍼킨엘머)를 사용하여 각각의 플레이트를 실링하였다. 웰당 1분씩 탑카운트(Topcount) 섬광 계수기 (퍼킨엘머) 상에서 플레이트를 계수하였다. 분석 및 플롯팅을 위해 분당 ³H-티미딘 계수 (cpm)를 프리즘(Prism) (그래프패드(GraphPad))으로 전송하였다. 실시예 2의 화합물의 각 농도에 대한 겜시타빈 용량 반응을 측정하였다. 이를 수행하기 위해, cpm을 정규화하고, 100% 도입은 겜시타빈 부재하에서의 실시예 2의 화합물의 농도에 대한 평균 cpm으로서 설정하고, 도입 없음 (100% 억제)은 cpm = 0 (분당 계수 = 0)으로서 설정하였다. 프리즘에서 데이터를 플롯팅하기 위해, 겜시타빈 농도를 로그 값으로 전환시키고, 비선형 회귀에 의해 용량-반응 곡선을 피팅하였다. 최상 피트도 최하 피트도 한정하지 않았다. EC_tfs 값은 0.3 nM이었다. 추가로, 3 nM의 실시예 2의 화합물은 HT29 결장 암종 세포에서 겜시타빈의 EC50을 37 nM에서 5 nM으로 7배 감소시켰다. 실시예 2의 화합물의 작용은 또한 증식 억제율(%)을 겜시타빈의 경우인 52%로부터 조합물인 경우의 73%로 증가시켰다. 단독으로, 3 nM의 실시예 2의 화합물은 HT29 세포 증식에 대해 효과를 거의 발휘하지 못했다.

Chk1 생체내 표적 억제 검정

Calu-6 세포 (ATCC)를 성장 배지 (10% (v/v) 열 불활성화된 FBS (기브코™), 1 x MEM 비필수 아미노산 (기브코™), 1 x 피루브산나트륨 (기브코™)으로 보충된, L-글루타민 (기브코™)을 포함하는 얼스 염 (인비트로겐) 함유 MEM) 중에서 배양하고 증식시켰다. 세포를 수거하고, 인산염 완충처리된 염수로 2회에 걸쳐 세척하고, 성장 배지 (무혈청) 중에서 1 x 10⁶개의 세포를 동량의 BD 매트리겔(Matrigel)™ 매트릭스 (뉴저지주 프랭클린 소재의 BD 바이오사이언스(BD Bioscience))와 혼합한 후, 사전에 방사선 조사된 (4.5 Gy) 누드 마우스 (비흉선 누드, 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 할란(Harlan)으로부터 입수)의 옆구리에 피하로 주사하였다. 이식 (종양 크기 = 150-200 ㎣) 후 15일째에 매일 염수 중에서 새로 제조된 겜시타빈 (일리노이주 레이크포리스트 소재의 호스피라(Hospira))을 150 mg/kg의 용량으로 복강내 경로에 의해 동물에게 투여하였다. 6시간 경과 후, 메탄 술폰산/20% 캡티솔(Captisol) (캔자스주 오버랜드 파크 소재의 사이덱스(CYDEX)) 몰비로 제조된 실시예 2의 화합물을 15 mg/kg으로부터 출발하여 하향으로 용량을 달리하면서 정맥내 경로에 의해 동물에게 투여하였다. Chk1 억제제 투약 후 2시간이 경과하였을 때 동물을 희생시키고, 종양을 수거하고, 포스파타제 억제제 (시그마) 및 프로테아제 억제제 (로슈 다이어그노스틱스)를 함유하는 빙냉 세포 추출 완충액 (인비트로겐 카탈로그 번호 FNN0011) 중에서 프로세싱하였다. 15초 동안 고 강도로 설정된 모터구동식 조직 균질기 (파워젠 (Powergen) 700)를 사용하여 냉 15 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브 중 1.5-2.0 mL의 용해 완충액 중에서 종양을 프로세싱하였다. 샘플을 얼음 상에서 유지시키면서, 25 게이지 바늘이 장착된 1 mL짜리 주사기를 통해 4회에 걸쳐 용해물을 뽑아냈다. 이어서, 0.35 mL의 종양 용해물을, 0.15 mL의 4 x 램라이 샘플 완충액 (240 mM 트리스-HCl (pH 6.8), 40% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루, 8% w/v SDS 및 20% (v/v) 베타-메르캅톨 에탄올)을 함유하는 1.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 넣었다. 이어서, 샘플을 혼합하고, 5분 동안 95℃에서 가열하고, 미소닉스 3000 플레이트 혼 초음파 발생 장치 상에서 고강도를 사용하여 1분 동안 초음파처리하였다. 이어서, 웨스턴 블롯에 의해 표적 억제를 평가하기 위하여 샘플을 얼음 상에서 보관하거나, -80℃에서 보관하였다. 남은 용해물은 단백질 농도 측정 (BCA™ 단백질 검정 키트, 써모 사이언티픽)에 사용하였다. 샘플 완충액 중 각각의 종양 용해물 5 ㎍씩을 E-페이지 96 웰 겔 (인비트로겐)에 가하고, 제조사의 설명서에 따라 전기영동시켰다. 당업계에서 잘 이해되고 있는 것과 같은 방법에 따라 단백질을 니트로셀룰로스 프로트란 BA83 막(Nitrocellulose Protran BA83 membrane) (와트만(Whatman))으로 전기이동시켰다 (문헌 [Towbin et al., 1979]). 이어서, 세린 296 상에서 자가인산화된 Chk1 단백질을 측정하기 위해 막을 프로세싱하였다. 상기 막을 간단하게 물에 이어서, 10 mM 트리스/HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 및 0.05% (v/v) 트윈 20 (TBST)으로 세정하고, 1시간 동안 25℃에서 TBST/5% (v/v)의 재구성된 카네이션® 인스턴트 우유 중에 침지시켰다. 이어서, 막을 5분 동안 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 세척하였다. 16시간 동안 4℃에서 토끼 항-포스포Chk1 (세린 296) (세포 시그날링)의 적절한 희석액 중의 TBST/5% (w/v) BSA 중에 침지시켰다. 이어서, 막을 5분 동안 25℃에서 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 세척한 후, 2시간 동안 25℃에서 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP; 아머샴)에 접합된 당나귀 항-토끼 IgG의 적절한 희석액을 함유하는 TBST/5% 우유 중에 침지시켜 포스포-Chk1 (ser 296)을 검출하였다. 막을 5분 동안 25℃에서 TBST를 사용하여 4회에 걸쳐 다시 세척하였다. 막에 고정화된 항원-항체-리포터 접합체는 제조사가 권고한 대로 수퍼 시그날 웨스턴 펨토 HRP-검출 시약 (피어스)으로 검출하였다.

신호를 검출하고, 후지 LAS-4000(FUJI LAS-4000) 영상화 시스템을 사용하여 포착하였다. "토탈 랩" 소프트웨어 (논리니어 다이나믹스)를 사용하여 포스포-Chk1 (ser296) 밴드 강도를 계산하였다. 겜시타빈 유도성 Chk1 자가인산화의 억제율(%)은 하기 식을 사용함으로써 계산하였다: 억제율(%) = (샘플 포스포Chk1 밴드 강도- 평균 겜시타빈 (Max) 양성 대조군 포스포Chk1 밴드 강도)/(평균 음성 대조군 (Min) 포스포Chk1 밴드 강도-평균 겜시타빈 (Max) 양성 대조군 포스포Chk1 밴드 강도) x 100.

실시예 2의 화합물을 본 검정으로 측정한 바, 0.03 mg/kg의 Chk1 자가인산화에 대한 표적 조절 유효량 50 (TMED50)을 갖는 것으로 나타났다.

인간 종양 이종이식 모델

Calu-6 폐 및 HT-29 결장 종양 이종이식 효능 모델을 사용하여 생체내에서 Chk1 억제제가 종양을 사멸시킬 수 있는 능력에 대하여 측정할 수 있다. Calu-6 폐암 세포 (ATCC)를 성장 배지 (10% (v/v) 열 불활성화된 FBS (기브코™), 1 x MEM 비필수 아미노산 (기브코™), 1 x 피루브산나트륨 (기브코™)으로 보충된 L-글루타민 (기브코™)을 포함하는 얼스 염 (인비트로겐) 함유 MEM) 중에서 배양하고, HT-29 결장암 세포 (ATCC)는 성장 배지 (10% FBS (기브코™)로 보충된 맥코이스(McCoy's) 5A 배지 (기브코™)) 중에서 배양하고 증식시켰다. 세포를 수거하고, 인산염 완충처리된 염수로 2회에 걸쳐 세척하고, 성장 배지 (무혈청) 중에서 5 x 10⁶개의 세포 (HT-29) 또는 1 x 10⁶개의 세포 (Calu-6)를 동량의 BD 매트리겔™ 매트릭스 (뉴저지주 프랭클린 소재의 BD 바이오사이언스)와 혼합한 후, 누드 마우스 (CD-1 nu/nu (매사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 랩스(Charles River Labs)로부터 입수))의 옆구리 내로 피하 주사하였다. 이식 (150-200 ㎣) 후 약 16일째에 겜시타빈을 매일 염수 중에서 새로 제조하여 60 mg/kg의 용량으로 복강내 경로에 의해 동물에게 투여하였다. 24시간 경과 후, 메탄 술폰산/20% 캡티솔 (캔자스주 오버랜드 파크 소재의 사이덱스) 몰비로 제조된 실시예 2의 화합물을 정맥내 경로에 의해 동물에게 투여하였다. 휴식일이 지난 후, 3주기 더 수행하기 위해 투약을 반복하였다 (Q3Dx4, Chk1 억제제 오프셋 +24시간). 각각의 투여군은 9마리의 동물로 구성되었다. 처리 과정 동안 매주 2회에 걸쳐 수행된 종양 부피 측정을 통해 종양 반응을 측정하였다. 종양 성장 억제 (TGI)는 비히클로 처리된 대조군의 평균 종양 크기로부터의 화합물 처리군의 평균 종양 크기의 감소율(%)로서 계산하였다. 실시예 2의 화합물을 단독 투여 및 겜시타빈과 조합하여 투여하였을 때, 이들은 HT-29 및 Calu-6 종양 이종이식 모델, 둘 모두에 있어서 탁월한 용량 의존성 항-종양 활성이 있는 것으로 입증되었는데, 여기서, 종양 성장 억제는 겜시타빈만을 단독으로 투여한 경우보다 6배까지 증가한 것으로 나타났다.

단일 작용제의 유효 투약

Calu-6 폐 이종이식 효능 모델을 사용하여 생체내에서 Chk1 억제제가 종양을 사멸시킬 수 있는 능력에 대하여 측정할 수 있다. Calu-6 폐암 세포 (ATCC)를 상기 기술된 바와 같이 배양하였다. 세포를 수거하고, 인산염 완충처리된 염수로 2회에 걸쳐 세척하고, 성장 배지 (무혈청) 중에서 1 x 10⁶개의 세포 (Calu-6)를 동량의 BD 매트리겔™ 매트릭스 (뉴저지주 프랭클린 소재의 BD 바이오사이언스)와 혼합한 후, 누드 마우스 (CD-1 nu/nu (매사추세츠주 윌밍턴 소재의 찰스 리버 랩스로부터 입수))의 옆구리 내로 피하 주사하였다. 이식 (150-200 ㎣) 후 약 16일째에 실시예 2의 화합물을 15 mg/kg (피하로 (SC), 하루에 2번씩 (BIDx5 휴식 2일) x 3 주기로 투여하였다. 처리 과정 동안 매주 2회에 걸쳐 수행된 종양 부피 측정을 통해 종양 반응을 측정하였다. 5일째 BID 스케줄 (15 mg/kg)로 투여된 실시예 2의 화합물은 앞서 기술된 겜시타빈 + 실시예 2의 화합물 조합 스케줄보다 우수한 성장 억제 작용을 하였다. 완전한 종양 퇴행은 신속하고 지속적으로 일어났다.

단층 증식 및 세포독성 검정

Chk1 억제제의 효능에 관한 한가지 척도는 조절이 되지 않는 복제 기점의 활성화에 기인하여 일어나는 배양물 중 암 세포의 증식을 억제시킬 수 있는 그의 능력이다 (문헌 [Conti et al. Cell Cycle 6: 2760-2767, 2007]). 광범위한 종양 유형으로부터 유래된 세포주에서 Chk1 억제제 항증식 활성을 측정하는 것은 어떤 종양 유형이 Chk1 억제제를 사용하여 이루어지는 화학요법에 대해 임상적으로 반응할 수 있는지를 나타낸다. 하기 기술하는 세포 증식 검정은 독일 소재의 온코테스트, 게엠베하(Oncotest, GmbH)에서 수행하였다. 30개의 고형 종양 세포주는 13개의 상이한 종양 히스토타입으로부터 유래된 것으로서, 이들 각각이 1 내지 6개의 다른 세포주 (온코테스트, 게엠베하)를 대표하였다. 상기 세포주는 방광암, 뇌암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 신장암, 및 자궁체부암으로부터, 및 그뿐만 아니라, 흑색종 및 흉막 중피종으로부터 확립된 것이었다. 환자로부터 유래된 종양 이종이식편으로부터 모든 세포주를 온코테스트에서 확립시켰다 (문헌 [Roth et al. 1999]). 공여체 이종이식편의 기원은 문헌 [Fiebig et al. (Fieberg et al. 1992 and 1999)]에 기재되어 있다. 세포주를 통상적으로 매주 1회 또는 2회 계대접종하고, 20회 계대접종까지 배양물 중에서 유지시켰다. 10% (v/v) 우태아 혈청 (독일 쾰베 소재의 PAA) 및 0.1 mg/mL 겐타마이신 (독일 쾰베 소재의 PAA)으로 보충된 RPMI 1640 배지 중 5% CO₂를 포함하는 습윤 대기하에 37℃에서 모든 세포를 성장시켰다. 변형된 프로피듐 요오다이드 검정을 사용하여 이들 세포주에 대한 화합물의 세포독성 활성을 평가하였다. 간략하면, 트립신으로 처리하여 대수증식기의 배양물로부터 부착성 세포를 수거하고, 계수하고, 세포주에 의존하여 달리하는 세포 밀도로 (4,000-20,000개의 세포/웰) 96 웰의 바닥이 평평한 마이크로티터 플레이트에 플레이팅하였다. 세포가 부착되어 다시 대수 증식을 할 수 있도록 허용하는 24시간의 회복기가 경과한 후, 10 ㎕의, 배양 배지 (6개의 대조군 웰/플레이트) 또는 실시예 2의 화합물을 함유하는 배양 배지를 첨가하였다. 실시예 2의 화합물의 스톡액을 DMSO 중에서 1 mM의 농도로 제조하였다. 하기와 같이, 완전 RPMI 1640 세포 배양 배지를 사용하여 순차적으로 희석시켰다: 먼저, DMSO 스톡액을 1:22로 희석시켰다 (4.5% (v/v) DMSO 함유). 상기 용액을 사용하여 세포 배양 배지 중 일련의 희석액 (½ 로그 또는 2배)을 제조하였다. 최종 희석 단계 (1:15)를 위해, 10 ㎕/웰의 각각의 최종 화합물 용액을 직접 140 ㎕/웰 배양 배지에 첨가하였다. 최종 DMSO 농도는 ≤0.3% (v/v)였다. 실시예 2의 화합물을 10 포인트 농도 곡선에 3중으로 적용시키고, 4일 동안 처리를 계속하였다. 4일간의 처리 후, 배양 배지를 제거하고, 7 μg/mL PI 수용액 200 ㎕로 대체하였다. 활력 세포의 개수를 측정하기 위해, 세포를 냉동시켜 투과가능하게 만들었고, 이를 통해 화합물 처리 후 웰에 부착되어 있는 상태로 남아있던 세포들 모두는 사멸하게 되었다. 최종적으로, 사이토플루오르(Cytofluor) 4000 마이크로플레이트 판독기 (여기 λ= 530 nm, 방출 λ= 620 nm)를 사용하여 PI 형광을 측정함으로써 전체 생육성 세포의 개수를 측정하였다. 성장 억제는 시험군/대조군 x 100 (% T/C) 값으로 나타내었다. T/C 값에 기초하여, 비선형 회귀 (로그[억제제 농도] 대 반응 (% T/C))을 사용함으로써 상대 IC50 값을 측정하였다. 실시예 2의 화합물은 이들 종양 세포주 대다수의 성장을 억제시켰으며, EC50은 20 nM 미만이었고, 이를 통해 단일 작용제로서 광범위한 항암 활성의 효능이 있는 것으로 제안되었다.

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 상세히 설명하고, 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물의 전형적인 합성법을 나타내기 위해 제공된 것이다. 달리 명시하는 것을 제외하면, 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 켐드로우 울트라(ChemDraw Ultra)® 10.0 또는 11.0에 의해 제공된 것이다.

경로 A

제조예 1

5-이소티오시아네이토피라진-2-카르보니트릴

실온에서 THF (4 mL) 중의 티오겐포스 (1.86 g, 15 mmol) 용액을 CH₂Cl₂ (200 mL) 및 THF (25 mL) 중의 5-아미노피라진-2-카르보니트릴 (1.20 g, 10 mmol) 및 피리딘 (2 mL) 용액에 적가하였다. 3 h 동안 실온에서 반응 혼합물을 교반시켰다. 혼합물을 농축시키고, 조 생성물을 에틸아세테이트로 희석시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.

제조예 2

(tert-부틸 3-(2-아세틸-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트

실온에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (2.82 g, 14.0 mmol)를 THF (50 mL) 중의 tert-부틸 3-히드록시프로필카르바메이트 (2.45 g, 14.0 mmol), 1-(2-히드록시-6-메톡시페닐)에타논 (1.94 g, 11.7 mmol) 및 트리페닐포스핀 (3.66 g, 14.0 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 18 h 동안 교반시킨 후, 감압하에 용매를 제거하고, 조 생성물을 크로마토그래피 (헥산-에틸아세테이트: 0-60% 구배)하여 1.60 g의 표제 화합물을 수득하였다.

실시예 1

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 포름산 염

실온에서 THF 중 리튬 헥사메틸 디실라잔의 1 M 용액 (7.6 mL, 7.6 mmol)을 건조 THF (25 mL) 중 tert-부틸 3-(2-아세틸-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트 (1.08 g, 3.17 mmol)의 교반된 용액에 천천히 첨가하였다. 10 min 동안 교반시킨 후, THF (4 mL) 중의 5-이소티오시아네이토피라진-2-카르보니트릴 (0.510 g, 3.17 mmol)을 첨가하고, 계속하여 30 min 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 농축시키고,에탄올 (50 mL) 및 아세트산 (5 mL) 중에 다시 용해시킨 후, 히드라진 수화물 (2 mL)을 첨가하였다. 이어서, 생성된 반응 혼합물을 2 min 동안 120℃로 가열하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (100 mL)로 희석시키고, 에틸아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 유기성 부분을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 디클로로메탄 (50 mL) 중에 다시 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (10 mL)으로 처리하고, 15 min 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 제거하고, 정제용 HPLC를 사용하여 조 생성물 (1.20 g)을 정제하여 0.046 g의 표제 화합물을 수득하였다. LC-ES/MS m/z 366.1 [M+H]⁺.

경로 B

제조예 3

1-[2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐]에타논

플라스크를 THF 중 1-(2-히드록시-6-메톡시페닐)에타논 (30 g, 180.5 mmol), 탄산칼륨 (49.9 g, 361 mmol), 요오드화나트륨 (2.68 g, 18.1 mmol), 및 4-메톡시벤질클로라이드 (27.0 mL, 198.6 mmol)로 충전시키고, 밤새도록 혼합물을 환류 가열시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석시키고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 에틸아세테이트/헥산으로 이루어진 용리제를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제함으로써 백색 고체로서 32.51 g (57%)의 원하는 생성물을 수득하였다.

제조예 4

1-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-3,3-비스(메틸티오)프로프-2-엔-1-온

500 mL의 둥근 바닥 플라스크를 95% NaH (7.28 g, 288 mmol)로 충전시키고, 건조 DMSO (170 mL)를 첨가하였다. 생성된 불균질 혼합물에 건조 DMSO (60 mL) 중의 1-[2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐]에타논 (41.2 g, 144 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 10 min 동안 실온에서 교반시키고, 이때에 이황화탄소 (8.69 mL, 144 mmol)를 적가한 후, 즉시 요오드화메틸 (18.0 mL, 288 mmol)을 첨가하였다. 상기 두 물질을 주의하여 첨가하면서, 첨가하는 동안 열 및 가스가 방출되었다. 균질 용액을 18 h 동안 실온에서 교반시킨 후, 3 부피의 물을 천천히 부었다. 고체 생성물을 여과하고, 높은 진공하에서 건조시켜 오렌지색의 고체로서 표제 화합물을 수득하였다.

제조예 5

5-브로모-N-(5-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1H-피라졸-3-일)피라진-2-아민

5-브로모피라진-2-아민 (3.73 g, 21.4 mmol)을 THF (30 mL) 중에 용해시키고, -78℃로 냉각시켰다. 헥산 중의 n-부틸리튬 (10.32 mL, 23.5 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 min 동안 저온에서 교반시킨 후, 천천히 실온으로 가온시키고, 추가로 1시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 0℃로 다시 냉각시키고, 캐뉼러를 통해 THF (50 mL) 중의 1-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-3,3-비스(메틸티오)프로프-2-엔-1-온 (8.39 g, 21.4 mmol) 용액을 첨가하였다. 용액은 균질성이 되었고, 이를 15 min 동안 실온에서 교반한 후, 10 h 동안 환류 가열시켰다. 이어서, 용액을 실온으로 냉각시키고, 감압하에 용매를 제거하였다. 고체 잔류물을 EtOH (150 mL) 중에 용해시키고, 빙초산 (1.3 mL, 23.5 mmol)을 첨가하였다. 히드라진 수화물 (5.25 mL, 107 mmol)을 첨가하고, 용액을 추가로 8 h 동안 환류시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 진공에서 농축시켰다. 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/MeOH)에 의해 정제하여 5.76 g (74%)의 갈색 고체를 수득하였다.

제조예 6

2-(3-(5-브로모피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페놀

5-브로모-N-(5-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1H-피라졸-3-일)피라진-2-아민 (3.1 g, 6.43 mmol)을 MeOH (100 mL) 중에 용해시켰다. 20 min 동안 HCl 가스를 반응 혼합물을 통해 통과시켜 버블링시켰다. 혼합물을 2 h 동안 교반시키고, 감압하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 3:1 클로로포름/이소프로판올 (100 mL) 중에 다시 용해시키고, NaHCO₃ 포화 용액 (100 mL)과 혼합하였다. 층을 분리하고, 수성층을 에틸아세테이트 (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 농축시키고, 메탄올로 연화 처리시켜 1.5 (64%)의 갈색 고체를 수득하였다.

제조예 7

tert-부틸 3-(2-(3-(5-브로모피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트

실온에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (1.73 mL, 8.76 mmol)를 THF (50 mL) 중 tert-부틸 3-히드록시프로필카르바메이트 (0.83 mL, 4.83 mmol), 2-(3-(5-브로모피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페놀) (1.59 g, 4.38 mmol) 및 폴리스티렌 트리페닐포스핀 (5.91 g, 8.76 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 45 min 동안 교반시킨 후, 반응물을 여과하고, 감압하에 용매를 제거하였다. 생성된 잔류물을 크로마토그래피하여 (메탄올/CH₂Cl₂) 1.27 g (54%)의 황색 고체를 수득하였다.

제조예 8

tert-부틸 3-(2-(3-(5-시아노피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트

질소 흐름을 사용하여 DMF (10 mL) 중의 tert-부틸 3-(2-(3-(5-브로모피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트 (0.378 g, 0.730 mmol) 및 시안화아연 (0.10 g, 0.870 mmol) 용액에서 가스를 제거한 후, 80℃로 가열하였다. 반응물에 Pd(Ph₃P)₄ (0.080 g, 0.070 mmol)를 첨가하고, 밤새도록 혼합물을 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/MeOH)에 의해 정제하여 0.251 g (73%)의 표제 화합물을 수득하였다.

경로 C

제조예 9

(E)-5-(3-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1-(메틸티오)-3-옥소프로프-1-에닐아미노)피라진-2-카르보니트릴

공기 교반기 막대 및 패들, 온도계, 물 응축기 및 질소 버블러가 장착되어 있는 5 L 플랜지-목 플라스크에 수소화나트륨 (22.4 g, 560.1 mmol) 및 무수 THF (3 L)를 충전시켰다. 임의의 기포가 형성되는 것을 허용하면서 1.5 h 동안에 걸쳐 잘 교반된 혼합물에 2-아미노-5-시아노피라진 (67.0 g, 557.8 mmol)을 소량씩 첨가하였다. 끝까지 내부 온도를 22℃로 유지시켰다. 혼합물을 35 min 동안 교반시켰다. 이어서, 1-(2-메톡시-6-(4-메톡시-벤질옥시)-페닐)-3,3-비스-메틸술파닐-프로페논 (146.0 g, 373.9 mmol)을 1시간에 걸쳐 22℃에서 첨가하였다. 황색 현탁액을 45 min 동안 실온에서 교반시킨 후, 반응물이 적절히 환류될 때까지 열을 가하였다. 65℃에서 19 h가 경과한 후, 반응 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 이어서, 혼합물을 ½씩 둘로 나누고, 각각의 로트를 물 (2 L) 내에서 켄칭시키고, 에틸아세테이트 (2 x 1 L)로 추출하였다. 유기 추출물을 혼합하고 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 40℃에서 농축시켜 196 g의 황색/오렌지색 고체를 수득하였으며, 이는 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC-ES/MS m/z 463.2 [M+H]⁺.

제조예 10

5-(5-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴

공기 교반기 막대 및 패들, 온도계, 물 응축기 및 질소 버블러가 장착되어 있는 10 L 플랜지-목 플라스크에 (E)-5-(3-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1-(메틸티오)-3-옥소프로프-1-에닐아미노)피라진-2-카르보니트릴 (196 g, 423.8 mmol) 및 무수 에탄올 (3 L)을 충전시켰다. 질소하에서 히드라진 수화물 (41.0 mL, 838.7 mmol) 및 빙초산 (66.0 mL, 1.15 moles)을 상기 교반된 현탁액에 첨가하였다. 작은 발열이 관찰되었다. 황색 현탁액을 65℃까지 가온시켰다. 이어서, 가열을 중단하고, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. 혼합물을 질소 대기하에서 밤새도록 방치하였다. 여과하여 고체를 수집하고, 이를 새로운 에탄올로 세척하고, 45℃ 진공하에서 건조시켜 140 g (상기 2단계를 수행한 경우, 수율 87%)의 밝은 황색의 고체를 수득하였다. 생성물을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC-ES/MS m/z 429.2 [M+H]⁺.

제조예 11

5-(5-(2-히드록시-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴

공기 교반기 막대 및 패들, 온도계, 물 응축기, 및 가성 용해 기체 세척기로의 배출구가 장착되어 있는 10 L 플랜지-목 플라스크에 5-(5-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 (140 g, 326.76 mmol) 및 1,4-디옥산 중의 4 N 염화수소 (2500 mL, 10.0 mole) 용액을 충전시켰다. 1.5 h 동안 60-65℃에서 혼합물을 잘 교반시킨 후, 혼합물을 50℃로 냉각시켰다. 총 4 h이 경과한 후, 추가의, 1,4-디옥산 중 4 N의 염화수소 (1,000 mL)를 첨가하고, 65℃로 가열하면서 다시 계속하였다. 상기 온도에서 1시간 경과한 후, 가열을 중단하고, 교반시키면서 혼합물을 밤새도록 실온으로 냉각시켰다. 큰 소결 깔때기를 통해 통과시킴으로써 혼합물을 여과하였다. 수집된 고체를 신선한 1,4-디옥산으로 세척한 후, 간단하게 건조시켰다. 벌크 필터 케이크를 다시 10 L 플라스크로 복귀시키고, 물 (2 L) 및 에틸아세테이트 (3.5 L)와 함께 왕성하게 교반시켰다. 이어서, 진한 암모니아 (440 mL)를 첨가함으로써 혼합물을 알칼리성으로 만들었다. 용액을 여과한 후, 5 L 분별 깔때기로 옮겨 놓았다. 수성층을 분리하고, 에틸아세테이트 (0.5 L)로 다시 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 고체를 45℃ 진공에서 건조시켜 101.3 g을 수득하였다. 조 생성물을 가온 무수 테트라히드로푸란 (2.2 L) 중에 현탁시키고, 이소-핵산을 사용하여 습식으로 패킹된 실리카 패드 (1 kg) 상에 로딩하였다. 생성물을 에틸아세테이트로 용리시켰다. 합한 분획을 부분적으로 농축시키고, 여과하여 생성된 침전물을 수집하고, 이를 밤새도록 40℃ 진공에서 건조시켜 60.9 g을 수득하였다. LC-ES/MS m/z 309.2 [M+1]⁺.

제조예 12

tert-부틸 3-(2-(3-(5-시아노피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트

공기 교반기 막대 및 패들, 온도계, 균압 적하 깔때기, 및 질소 버블러가 장착되어 있는 5 L 플랜지-목 둥근 바닥 플라스크에 5-(5-(2-히드록시-6-메톡시-페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)-피라진-2-카르보니트릴 (47.0 g, 152 mmol) 및 무수 THF (1.2 L)를 충전시켰다. 교반된 현탁액을 질소하에서 0℃로 냉각시켰다. 큰 자기 교반 막대, 온도계, 질소 버블러가 장착되어 있는 별도의 2 L 3-목 둥근 바닥 플라스크에 트리페닐포스핀 (44.0 g, 168 mmol) 및 무수 THF (600 mL)를 충전시켰다. 교반된 현탁액을 질소하에서 0℃로 냉각시키고, 디이소프로필아조디카르복실레이트 (34.2 g, 169 mmol)를 첨가하자, 유백색 용액이 형성되었다. 3-4 min 경과 후, 무수 THF (100 mL) 중의 t-부틸-N-(3-히드록시프로필)-카르바메이트 (30.3 g, 173 mmol) 용액을 첨가하고, 혼합물을 3-4 min 동안 교반시켰다. 이어서, 0℃에서 5 min 동안에 걸쳐 상기 혼합물을 출발 물질의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물은 빠르게 검은색 용액이 되었고, 이를 실온까지 천천히 가온시켰다. 6.5 h이 경과한 후, 무수 THF (150 mL) 중의 PPh₃ (8 g), DIAD (6.2 g) 및 카르바메이트 (5.4 g)를 사용하여 상기와 같이 추가의 시약을 제조하였다. 혼합물을 반응 혼합물에 첨가하고, -5℃로 냉각시키고, 실온까지 가온시키기 위해 밤새도록 방치하였다. 진공에서 용매를 제거하였다. 생성된 점성 용액을 실리카 패드 상에 로딩하고, 생성물을 에틸아세테이트를 사용하여 용리시켰다. 메탄올을 사용하여 농축된 분획을 따로따로 연화 처리시키고, 여과하여 생성된 고체를 수집하였다. 메탄올 (400 mL)을 사용하여 다시 혼합된 고체를 연화 처리시킨 후, 여과하여 분리하고, 밤새도록 50℃ 진공에서 건조시켜 31.3 g의 원하는 생성물을 수득하였다. LC-ES/MS m/z 466.2 [M+1]⁺.

실시예 2

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 디히드로겐 클로라이드 염

공기 교반기 막대 및 패들, 온도계, 및 버블러가 부착된 공기 응축기가 장착되어 있는 5 L 플랜지-목 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 3-(2-(3-(5-시아노피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트 (30.9 g, 66.3 mmol) 및 에틸아세테이트 (3 L)를 충전시켰다. 기계를 사용하여 교반시킨 황색 현탁액을 10℃ 바로 아래로까지 냉각시켰다. 이어서, 빙조는 계속하여 적소에 배치한 상태하에서 강화 병(lecture bottle)으로부터의 염화수소를 15 min 동안 가스 유입관을 통해 통과시켜 왕성하게 버블링시켰다. 5 h 경과 후, 혼합물의 점도는 외관상으로도 뚜렷하게 증가되어 있었다. 여과하여 고체를 수집하고, 에틸아세테이트로 세척한 후, 밤새도록 60℃ 진공에서 건조시켜 30.0 g을 수득하였다.

실시예 3

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 디히드로겐 클로라이드 염 (3.0 g, 6.84 mmol)을 200 mL의 CH₂Cl₂ 중에 현탁시켰다. 1 N NaOH (200 mL, 200 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 5 h 동안 실온에서 질소하에 기계를 사용하여 교반시켰다. 여과하여 고체를 수집하고, 물을 사용하여 철저하게 세척하였다. 필터 케이크를 밤새도록 50℃ 진공에서 건조시켜 황색 고체로서 2.26 g (90%)의 유리 염기를 수득하였다.

실시예 4

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 메탄술폰산 염

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 (1.0 g, 2.74 mmol)을 MeOH (100 mL) 중에 현탁시켰다. 교반시키면서 MeOH 중 1 M의 메탄술폰산 용액 (2.74 mL, 2.74 mmol)을 혼합물에 적가하였다. 고체를 거의 완전하게 용해시키고, 초음파처리하고, 15 min 동안 교반시키고, 여과하고, 50 mL로 농축시켰다. 용액을 밤새도록 -15℃에서 냉각시키고, 여과하여 형성된 고체를 수집하였다. 고체를 밤새도록 진공 오븐에서 건조시켜 0.938 g (74%)의 황색 고체를 수득하였다.

경로 D

제조예 13

1-[2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐]에타논

1-(2-히드록시-6-메톡시페닐)에타논 (1300 g, 7.82 mol) 및 디메틸포름아미드 (10.4 L)를 22 L 플라스크에 첨가하고, 교반시켜 용액을 수득하였다. 탄산칼륨 (2,700 g, 19.54 mol)을 소량씩 첨가한 후, 적어도 30 min 동안 교반시켰다. 온도를 <30℃로 유지시키면서, 첨가 깔때기를 사용하여 4-메톡시벤질 클로라이드 (14700 g, 9.39 mol)를 2.5 h 동안에 걸쳐 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 35℃로 가온시키고, 상기 온도를 12 h 동안 유지시켰다. HPLC에 의해 반응 전환을 모니터링하고, 35℃에서 13 h 경과 후 종결될 것으로 간주되었다. 슬러리를 여과하고, 생성된 고체를 디메틸포름아미드 (1 L)로 세척하였다. 에틸아세테이트 및 물을 사용하여 여액을 추출하는 후처리 작업을 수행한 후, 농축시켜 왁스상의 황색 고체를 수득하였다. 상기 왁스상의 황색 고체에 메틸 t-부틸 에테르 (2.6 L)를 첨가하였다. 생성된 슬러리를 교반시켰다. 이제 자유 유동성 슬러리를 여과하고, 메틸 t-부틸 에테르 (1 L)로 세척하였다. 백색 고체를 진공에서 건조시켜 1,539 g (69%)의 표제 화합물 (mp 105-107℃)을 수득하였다.

제조예 14

질소 대기하에서 무수 DMSO (11.0 L) 중 리튬 tert-부톡시드 (602.4 g, 7.52 mol)의 혼합물에 1-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)에타논 (1000.0 g, 3.49 mol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30 min 동안 교반시키고, 내부 온도를 30℃ 아래의 온도로 유지시키면서, CS₂ (259 mL, 4.296 mol)를 1 내지 1.5 h 동안에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 적어도 1시간 동안 주변 온도에서 교반시킨 후, 내부 온도를 30℃ 아래의 온도로 유지시키면서, 요오도메탄 (1,000 g, 7.045 mol)을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30 min 내지 1시간 동안 주변 온도에서 교반시켰다. HPLC에 의해 반응 종결을 확인하였다. 생성된 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 물 및 에틸아세테이트를 사용하여 추출하는 후처리 작업을 수행하였다. 생성된 유기성 부분을 농축시켜 슬러리를 수득하고, 이를 여과하고, 에틸아세테이트 (1 L)에 이어서 메틸 t-부틸 에테르 (2 x 1 L)로 세척하였다. 분리된 고체를 진공 오븐 중 40℃에서 건조시킴으로써 1,057 g (77%)의 표제 화합물을 수득하였다. mp 93-94℃; ES/MS m/z 391.2 [M+1]⁺.

제조예 15

건조된 불활성 22 L 플라스크에 수소화나트륨 (159.2 g, 3.98 mol) 및 테트라히드로푸란 (10.4 L)을 첨가하였다. 혼합물을 5-15℃로 냉각시켰다. 첨가와 첨가 사이에 형성된 기포를 가라앉히면서, 그리고 온도를 10℃로 유지시키면서 30 min 동안에 걸쳐 5-이소시아노피라진-2-아민 (382.2 g, 3.18 mol)을 4부로 소량씩 첨가하여 수소 방출을 조절하였다. 온도를 15℃로 증가시키면서 혼합물을 15-90 min 동안 교반시켰다. 반응 혼합물에 1-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-3,3-비스(메틸티오)프로프-2-엔-1-온 (1,036 g, 2.65 mol)을 소량씩 충전시켜 기포 발생을 조절하였다. 생성된 슬러리를 15 min 동안 교반시켰다. 혼합물을 66℃에서 완만히 환류 가열시켰다. HPLC에 의해 반응 전환을 모니터링하였다. 반응 혼합물을 냉수 (14.2 L) 내에서 켄칭시킨 후, 에틸아세테이트를 사용하여 추출하는 후처리 작업을 수행하였다. 유기성 부분을 농축시켜 슬러리를 형성하고, 이를 여과하여 957 g (78%)의 표제 화합물을 수득하였다. mp 128-135℃; ES/MS m/z 463.2 [M+1]⁺.

제조예 16

20 L 용기 중에서 에탄올 (11.28 L) 및 아세트산 (318 mL, 5.545 mol)을 혼합하였다. 질소 퍼지하에 반응물을 표백 세척기로 배출시켰다. (E)-5-(3-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1-(메틸티오)-3-옥소프로프-1-에닐아미노)피라진-2-카르보니트릴 (940 g, 1.931 mol) 및 에탄올/아세트산 용액을 22 L 반응 플라스크에 첨가하였다. 생성된 갈색 슬러리에 히드라진 일수화물 (197 g, 3.935 mol)에 첨가하자, 약간의 발열이 일어났다. 생성된 황색 슬러리를 65-70℃로 천천히 가열하고, HPLC에 의해 모니터링하였다. 반응 지속 시간은 1시간 미만이었다. 진한 슬러리를 1-2 h 동안에 걸쳐 천천히 30℃ 미만의 온도로 냉각시켰다. 슬러리를 여과하고, 냉 에탄올로 세척하였다. 물질을 40℃에서 진공 건조시켜 (820 g, 99.1%) 표제 화합물을 수득하였다. mp 215-117℃; ES/MS m/z 429.2 [M+1]⁺.

제조예 17

5-(5-(2-히드록시-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-

카르보니트릴 디히드로겐 클로라이드 염

HCl 가스 발생을 조절하기 위해 하기의 모든 작용물을 가성 세척기 시스템으로 배출시켰다. 5-(5-(2-메톡시-6-(4-메톡시벤질옥시)페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 (1.24 kg, 2.89 mol) 및 디옥산 중 4 N HCl (26.06 kg, 99.28 mol)을 60 L 유리 반응기에 충전시켰다. 슬러리를 천천히 60-70℃로 가열하였다. HPLC에 의해 반응을 모니터링하였다. 9 h 경과 후, 반응이 종결되었는지 여부를 측정하였다. 갈색 슬러리를 20℃로 냉각시키고, 밤새도록 유지시켰다. 산성 반응 혼합물을 여과하고, 케이크를 에틸아세테이트 (7 L)로 세척하였다. 습식 케이크를 항량으로 진공 건조시켜 표제 화합물 (1,010 g, 보정 수율 91.84%)을 수득하였다. mp 225-228℃ (유리 염기); ES/MS m/z 309.2 [M+1]⁺.

제조예 18

5-(5-(2-히드록시-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 (618 g, 1.62 mol)를 테트라히드로푸란 (6.18 L, 10 부피) 중에서 슬러리화하고, 아세톤/빙조를 사용하여 -5 내지 0℃로 냉각시켰다. 트리에틸아민 (330 g, 3.25 mol)을 30-40 min 동안에 걸쳐 -5 내지 5℃에서 첨가 깔때기를 통해 첨가하였다. 생성된 슬러리를 60-90 min 동안에 걸쳐 -5 내지 5℃에서 교반시켰다. 불용성 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여과하고, 페놀 ((5-(2-히드록시-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴) 용액을 적절한 반응 용기 중에 수집하였다. 케이크를 THF (1.24 L)로 세정하였다. 필요할 때까지 페놀의 THF 용액을 15 내지 20℃에서 유지시켰다.

트리페닐포스핀 (1,074 g, 4.05 mol)을 THF (4.33 L) 중 실온에서 용해시켰다. 아세톤/빙조를 사용하여 투명한 무색의 용액을 -5 내지 5℃로 냉각시켰다. 온도를 10℃ 아래로 유지시키면서, 디이소프로필아조디카르복실레이트 (795 g, 3.89 mol)를 40-60 min 동안에 걸쳐 첨가 깔때기를 통해 적가하였다. 생성된 진한 백색의 슬러리를 다시 -5 내지 0℃로 냉각시켰다. tert-부틸 3-히드록시프로필카르바메이트 (717 g, 4.05 moles)를 최소량의 THF (800 mL) 중에 용해시켰다. 20-30 min 동안에 걸쳐 -5 내지 5℃에서 tert-부틸 3-히드록시프로필카르바메이트/THF 용액을 첨가 깔때기를 통해 시약 슬러리에 첨가하였다. 사용할 준비가 될 때까지 제조된 시약을 -5 내지 0℃ 빙조에서 교반시켰다.

제조된 시약 슬러리 (20%)를 15 내지 20℃에서 기질 용액에 첨가하였다. 남은 시약은 다시 빙조로 복귀시켰다. 기질 용액을 30 min 동안 주변 온도에서 교반시킨 후, HPLC를 위해 샘플링하였다. 시약의 또다른 대략 20% 정도의 부분을 기질에 첨가하고, 상기와 같이 주변 온도에서 교반시키고, 샘플링하였다. HPLC에 의해 반응 종결에 대해 모니터링하면서, 계속하여 시약을 첨가하였다. 반응이 종결된 반응물을 농축시키고, 가온 메탄올 (4.33 L, 50-60℃)로 연화 처리한 후, 빙조에서 냉각시켰다. 생성된 황색 침전물을 여과하고, 냉 MeOH (2 L)로 세정하고, 항량으로 건조시켜 544 g (72%)의 표제 화합물을 수득하였다: mp 214-216℃; ES/MS m/z 466.2 [M+1]⁺.

실시예 5

2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물 (화학 초록 명명법(Chemical Abstracts nomenclature))

30 L 반응기에서 아세톤 (21.5 L)을 사용하여 tert-부틸 3-(2-(3-(5-시아노피라진-2-일아미노)-1H-피라졸-5-일)-3-메톡시페녹시)프로필카르바메이트 (1,430 g, 3.07 mol)를 슬러리화하였다. 첨가 깔때기를 통해 적당히 유출시키면서 메탄술폰산 (1,484 g, 15.36 mol)을 첨가하였다. 슬러리를 1 내지 3 h 동안 약 52℃에서 환류 가온시키고, HPLC 분석에 의해 반응이 종결되었는지 여부를 모니터링하였다. 반응이 종결된 반응물을 4.5 h 동안에 걸쳐 환류로부터 15 내지 20℃로 냉각시켰다. 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노] 디메실레이트 염의 황색 슬러리를 여과하고, 아세톤 (7 L)으로 세정하고, 진공 오븐에서 건조시켰다.

디메실레이트 염 (1,608 g, 2.88 mol)을 물 (16 L) 중에서 슬러리화하였다. 수산화나트륨 (수성 50%, 228 g, 2.85 mol)을 슬러리에 천천히 부었다. 슬러리를 60℃로 가열하고, 1시간 동안 교반시켰다. 이어서, 4 h 동안에 걸쳐 16℃로 냉각시키고, 여과하였다. 아세톤 (4 L)을 사용하여 습식 필터 케이크를 세정하고, 40℃ 진공 오븐에서 항량으로 건조시킴으로써 833 g (94%)의 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물을 수득하였다. mp 222.6℃; ES/MS m/z 366.2 [M+1]⁺.

실시예 5a

2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물 (화학 초록 명명법)

하기 방법을 사용하여 조 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물을 정제하였다. 기술 등급의 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물 (1221 g, 2.55 mol)을 1:1 아세톤/물 (14.7 L)의 용매 혼합물 중에 슬러리화하였다. 혼합물을 50-55℃로 가온시킴으로써 고체를 용해시켰다. 50-55℃에서 0.22 μm 카트리지 필터를 통해 통과시키면서 용매를 연마 여과시켰다. 용액을 약 42-45℃의 시딩 온도로 천천히 냉각시키고, 시딩하였다. 이어서 30-60 min 동안에 걸쳐 계속하여 천천히 냉각시킴으로써 핵형성을 확인하였다. 묽은 슬러리를 3 h 동안에 걸쳐 38℃로부터 15℃로 냉각시켰다. 진공 증류를 설치하고, 아세톤을 110-90 mm 및 20-30℃에서 제거하였다. 혼합물을 14 h 동안에 걸쳐 30℃로부터 15℃로 냉각시키고, 2 h 동안 15℃로 유지시킨 후, 여과하였다. 재결정화된 물질을 19:1 물/아세톤 (2 L)에 이어서 물 (6 L)로 세정한 후, 40℃ 진공 오븐에서 항량으로 건조시킴으로써 1,024 g (83.9%)의 표제 화합물을 수득하였다. mp 222.6℃; ES/MS m/z 366.2 [M+1]⁺.

X선 분말 회절 (XRPD) 패턴은 CuKα 소스 (λ=1.54056 옹스트롱)가 장착되어 있고, 40 kV 및 40 mA에서 작동하며, 위치-민감형 검출기가 있는, 브루커 D8 어드밴스(Bruker D8 Advance) 분말 회절분석기 상에서 수득할 수 있었다. 0.6 mm의 발산 슬릿 및 10.39 mm의 검출기 슬릿과 함께, 스텝 크기 0.026° (2θ±0.02) 및 스텝 시간 0.3초를 사용하여 4° 내지 35° 사이 (°2θ±0.02)에서 각 샘플을 스캐닝하였다. 1차 및 2차 소예르(Soller) 슬릿은 각각 2°에 있고; 산란방지 슬릿은 6.17 mm이고; 공기 산란 싱크는 적소에 배치되어 있었다.

메틀러-톨레도(Mettler-Toledo) DSC 유니트 (모델 DSC822e) 상에서 시차 주사 열량법 (DSC)을 수행할 수 있었다. 핀홀이 있는 밀폐형 알루미늄 팬 중에서 샘플을 50 mL/분의 질소 퍼지하에 10℃/분으로 25℃로부터 350℃로 가열하였다. 메틀러 톨레도 TGA 유니트 (모델 TGA/SDTA 851e) 상에서 열중량 분석 (TGA)을 수행할 수 있었다. 핀홀이 있는 실링된 알루미늄 팬 중에서 샘플을 50 mL/분의 질소 퍼지하에 10℃/분으로 25℃로부터 350℃로 가열하였다.

DSC로부터 열적 프로파일을 통해 80-140℃에서는 약하고 광범위한 흡열 반응이 형성된 후, 222℃에서는 급격한 용융성 흡열 반응이 일어났고, 개시가 일어난 것 (225℃, 피크)으로 나타났다. 4%의 질량 손실은 25-140℃로부터의 TGA에 의한 것으로 간주되었다.

Claims

5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 상기 염의 용매화물.
제1항에 있어서, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴인 화합물.
제1항에 있어서, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 포름산 염인 화합물.
제1항에 있어서, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 디히드로겐 클로라이드 염인 화합물.
제1항에 있어서, 5-(5-(2-(3-아미노프로폭시)-6-메톡시페닐)-1H-피라졸-3-일아미노)피라진-2-카르보니트릴 메탄술폰산 염인 화합물.
제1항에 있어서, 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물인 화합물.
제1항에 있어서, 2θ±0.02 = 12.64, 21.25, 및 26.15에서 피크를 갖는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, 결정질 형태의 2-피라진카르보니트릴, 5-[[5-[-[2-(3-아미노프로필)-6-메톡시페닐]-1H-피라졸-3-일]아미노]모노메실레이트 일수화물인 화합물.
제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 조합된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염을 포함하는 제약 조성물.
암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염, 및 이온화 방사선을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
암 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염, 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
제12항에 있어서, 화학요법제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴, 및 탁솔로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암, 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에서 이온화 방사선과 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에서 화학요법제와 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 조합하여 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제18항에 있어서, 화학요법제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴, 및 탁솔로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도의 화합물 또는 염.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암, 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도의 화합물 또는 염.