BRPI0922468A2 - compostos úteis para inibição de chk1, seu uso, bem como composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS ÚTEIS PARA INIBIÇÃO DE CHK1, SEU USO, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece um composto aminopirazol, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato do sal, que inibe Chk1 e é útil no tratamento de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS- ' TOS ÚTEIS PARA INIBIÇÃO DE CHK1, SEU USO, BEM COMO COMPO- SIÇÃO FARMACÊUTICA". À A presente invenção refere-se a um composto de aminopirazol, ou umsaldomesmo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do sal, que inibe Chk1 e é útil para cânceres caracterizados por defeitos na replicagem do ácido deoxirribonucleico (DNA), segregação de cromossomas, ou divisão de célula.

Chk1 é uma proteína cinase que se encontra a jusante de Atm e/ou Atr na via de transdução de sinal do ponto de verificação lesionado do DNA.

Em células de mamíferos, Chk1 é fosforilado em resposta aos agentes que causam lesão de DNA incluindo radiação de ionização (IR), raio ultravio- leta (UV), e hidroxiuréia.

Esta fosforilação que ativa Chk1 em células de mamíferos é dependente de Atr.

Chk1 desempenha um papel no ponto de verificação da lesão de DNA dependente de Atr levando a interromper na faseSenaG2M.

Chk1 fosforila e inativa Cdc25A, a fosfatase de especifici- à. dade dual que normalmente defosforila ciclina E/Cdk2, suspendendo o pro- gresso através da fase S.

Chk1 também fosforila e torna Cdc25C inativa, a à fosfatase de especificidade dual que desfosforila ciclina B/Cdc2 (também conhecida como Cdk1) suspendendo o progresso do ciclo da célula na fron- teirade G2 e mitose (Fernery et al., Science, 277:1495-7, 1997). Em ambos Os casos, a regulagem da atividade de Cdk induz uma suspensão de ciclo de células para evitar que as entrem em mitose na presença da lesão do DNA ou DNA não reproduzido.

Vários inibidores de Chk1 têm sido reportados.

Ver por exemplo, WO 05/066163, WO 04/063198, WO 03/093297 e WO 02/070494. Em adi- ção, uma série de inibidores de Chk1 aminopirazo! é descrita em WO 05/009435. Entretanto, existe ainda uma necessidade de inibidores de Chk1 que são inibidores potentes dos pontos de verificação do ciclo das células que podem atuar eficazmente como potencializadores de agentes de lesão de DNA.

A presente invenção provê um novo composto de aminopirazol, ou sal do mesmo farmaceuticamente aceitável ou solvato do sal, que é um ini-

EEE SECR SAE SAE EEE EA SA SEE DRE SAAEASCAAARAAAASASS 2/42 bidor potente de Chk1. O composto, ou um sal do mesmo farmaceuti- ã camente aceitável, ou um solvato do sal, potencialmente anula uma inter- rupção do ciclo da célula mediado por Chki induzida pelo tratamento com i agentes de lesão de DNA em cultura de tecidos e in vivo.

Além do mais, o composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do sal, da presente invenção também provê inibição de Chk2, que pode ser benéfica para o tratamento de câncer.

Adicionalmente, a falta de inibição de certas outras proteínas cinases, como CDK1, pode prover um benefício tera- pêutico minimizando efeitos indesejáveis.

Além do mais, o composto, ou um saldo mesmo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do sal, da presen- te invenção inibe a proliferação de células de câncer através de um meca- nismo dependente da inibição de Chk1. A presente invenção provê um novo composto de aminopirazo|, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, que é um antagonista de Chk1. Tais novos compostos podem tartar a necessi- 2 dade de tratamentos de cancer seguros e eficazes.

A presente invenção prove um composto que é 5-(5-(2-(3- à aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal.

Moda- lidades preferidas são 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ilamino) pirazina-2-carbonitrila, sal de ácido 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6- metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila fórmico, cloreto de sal de dididrogênio 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ilamino) pirazina-2-carbonitrila e sal de ácido 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6- —metoxifenil)-IH-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila metanossulfônico, e monoidrato — de — 2-pirazinacarbonitrila, 9-I1[5-[-[2-(3-aminopropóxi)-6- metoxifenil]-1H-pirazol-3-ilJamino] monomesilato.

Como uma modalidade particular, a presente invenção provê o composto que é 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitriia.

A presente invenção provê o ácido fórmico, cloreto de di- hidrogênio, e sais de ácido metanossulfônico de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-

metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila. í A presente invenção também provê o composto que é monoidra- to de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil])-1H- Í pirazol-3-ilJamino] monomesilato.

A presente invenção provê monoidrato de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil]-1H-pirazol-3-ilJamino] monomesila- to em forma cristalina caracterizado por um padrão de difração de pó de raio X tendo picos em 20 + 0.02 = 12,64, 21,25, e 26,15.

A presente invenção provê uma composição farmacêutica com- preendendo 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção provê um método de tratar câncer, compre- endendo administrar para um paciente com necessidade do mesmo uma Y quantidade eficaz de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente a- ceitável, ou um solvato do sal. Em adição, a presente invenção também pro- vê um método de tratar câncer, compreendendo administrar para um pacien- te com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de 5-(5-(2-(3- aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal da mesma farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, e radi- ação de ionização. Além do mais, a presente invenção provê um método de tratar câncer, compreendendo administrar para um paciente com neces- sidade do mesmo uma quantidade eficaz de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6- metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mes- mo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do, e um agente de quimiote- rapia.

A presente invenção provê o uso de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6- —metoxifenil)-IH-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mes- mo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer. Além disso, a presente in-

venção provê o uso de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ' ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente a- ceitável sal, ou um solvato do, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em que o dito tratamento compreende a terapia de combinação com radiação de ionização. Além do mais, a presente invenção provê o uso de of 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilami- no) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitá- vel, ou um solvato do sal, para a fabricação de um medicamento para o tra- tamento de câncer por terapia de combinação em que o dito tratamento de terapia de combinação compreende a administração do dito medicamento e administração de um ou mais outros agentes de quimioterapia para o mes- mo paciente.

A presente invenção provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxife- nil)- 1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farma- ceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para uso em terapia. A pre- s sente invenção também provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H- pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuti- ' camente aceitável, ou um solvato do sal, para uso no tratamento de câncer. Adicionalmente, a presente invenção também provê 5-(5-(2-(3-aminopro- poxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, e radiação de ionização para uso em terapia. Além do mais, a presente invenção provê 5- (5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbo- nitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente, ou um solvato do sal, e um — agentede quimioterapia para uso em terapia.

A presente invenção provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-S6-meto- xifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para uso no tratamento de câncer. Além disso, a presente invenção também provê 5-(5-(2-(3- aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, e radi- ação de ionização para uso no tratamento de câncer. Além do mais, a pre-

sente invenção provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ' itamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente a- ceitável, ou um solvato do sal, e um agente de quimioterapia para uso no tratamento de câncer.

A presente invenção prove o uso de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6- metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mes- mo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento é para ser administradosimultaneamente, separadamente ou sequencialmente com radiação de ionização.

A presente invenção prove o usdo de 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)- B-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para a fabri- cação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medica- mento também compreende um agente de quimioterapia, ou é para ser ad- - ministrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um agente de quimioterapia. ' A presente invenção provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxi- fenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo far- —maceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação de ionização no tratamen- to de câncer.

A presente invenção provê 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxi- fenil)- 1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal do mesmo far- —maceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, para uso em combinação simultanea, separada ou sequencial com um agente de quimioterapia no tratamento of câncer.

A presente invenção provê uma composição farmacêutica com- preendendo 5-(5-(2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) —pirazina-2-carbonitrila, ou um sal da mesma farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável e, op- cionalmente, outros ingredientes terapêuticos.

Além do mais, a presente invenção provê modalidades prefe- . ridas dos métodos e usos como descrito aqui no presente, em que o agente de quiioterapia é selecionado do grupo consistindo em 5-fluorouracil, hidro- xiuréia, gencitabina, metotrexato, pemetrexado, doxorubicina, etoposide, cisplatina, e taxol. Modalidades preferidas dos métodos e usos descritos a- qui no presente são câncers selecionados do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer de pulmão, câncer de mama, melanoma, câncer de ovário, câncer pancreático, mesotelioma, câncer renal e câncer uterino.

O composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, da presente invenção, podem existir como formas tau- toméricas. Quando exite formas tautoméricas, cada forma e misturas das mesmas, são consideradas na presente invenção.

H . Nv n-N A menos que de outra maneira definido, esta invenção inclui sais farmaceuticamente aceitável do composto do exemplo 3 como também sol- vatos da base livre do composto do Exemplo 3 ou um sal do mesmo farma- ceuticamente aceitável. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" como usado aqui no presente, refere-se aos sais do composto do Exemplo 3. E- xemplos de sais farmaceuticamente aceitável e métodos para sua prepara- çãosão convenccionais na técnica. Ver por exemplo, Stahl! et a/., "Handbook of Pharmaceutical Sals: Properties, Selection and Use", VCHANiley-VCH, (2002); Gould, P.L., "Sal selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); and Bastin ef a/. "Sal Selection and Op- timization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entíties", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000).

Em adição aos sais farmaceuticamente aceitável, outros sais " são incluídos na invenção. Eles podem servir como intermediários na purifi- cação de compostos ou na preparação de outros sais farmaceuticamente i aceitáveis, ou são úteis para identificação, caracterização ou purificação.

Como usado aqui no presente, o termo "paciente" se refere a um mamífero ser humano ou não humano. Mais particularmente, o termo "paci- ente" se refere a um ser humano.

O termo "tratar" (ou "trata" ou "tratamento") se refere ao pro- cesso envolvendo uma diminuição, interrupção, suspensão, controle, redu- ção ou reversão do progression ou gravidade de um sintoma, distúrbio, con- dição ou doença.

Como usado aqui no presente, o termo "quantidade eficaz" se refere à quantidade ou dose do composto, ou um sal do mesmo farmaceuti- camente aceitável, ou um solvato do sal, da presente invenção, descrito aqui no presente, sozinho ou em combinação com radiação de ionização ou um - agente de quimioterapia que, mediante administração de dose única ou do- ses múltiplas para o paciente, provê o efeito desejado no paciente sob diag- : nóstico ou tratamento. Uma quantidade eficaz pode ser prontamente deter- minada pelo encarregado do diagnostico que está atendendo, como uma pessoa versada na técnica, considerando um número de fatores tais como a espécie do mamífero; seu tamanho, idade e saúde geral; a co-administração de outros agentes, se necessária; a doença específica envolvida; o grau ou gravidade da doença; a resposta do paciente individual; o composto particu- lar administrado; o modo de administração; as características de biodisponi- bilidade da preparação administrada; o regime de dose selecionado; o uso concomitante de quaisquer medicações; e outras circunstâncias relevantes. Embora não interpretado como limitando a presente invenção de maneira alguma, 20-150 mg/m? representa uma quantidade eficaz do composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, descri- tos aqui no presente. Como usado aqui no presente, o termo "terapia de combinação" se refere à administração separada, simultanea, ou sequencial do composto,

EEE EA SERRAS TRAD ERA C MA CASADA RENNES AEREAS REAR SEO 8/42 ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, da ii presente invenção e agente de quimioterapia. Além do mais, o termo "tera- pia de combinação" se refere à administração separada, simultânea ou se- | quencial do composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvatodosal, da presente invenção e radiação de ionização.

O composto do exemplo 3, ou um sal do mesmo farmaceuti- camente aceitável, ou um solvato do sal, podem ser formulados para admi- nistração como parte de uma composição farmacêutica. Como tal, compo- sições farmacêuticas compreendendo o composto do Exemplo 3, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, em combi- nação com um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceutica- mente aceitáveis, são uma modalidade importante da invenção. Exemplos de composição farmacêuticas e métodos para sua preparação são bem co- nhecidos na técnica. Ver, por exemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et a/., eds., 19" ed., Mack Publish- : ing (1995). O composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, . ou um solvato do sal da presente invenção, pode ser administrado por qual- quer via que o torne biodisponível, incluindo via oral e parenteral. Por exem- plo, o composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do sal, pode ser administrado oralmente, subcutaneamente, intra- muscularmente, intravenosamente, transdermalmente, topicamente, intrana- salmente, retalmente, bucalmente e similares. Alternativamente, o composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável ou um solvato do sal, po- de ser administrado por infusão. Infusão IV é a via de administração preferi- da.

Como usado aqui no presente, os termos a seguir têm os signifi- cados indicados: "BCA" se refere ao ácido bicincôninico; "boc ou t-boc" se refere a ferc-butoxicarbonila; "BSA" se refere a albumina de soro bovino; "CPMS" se refere à contagens por minutos; "DIAD" se refere à diisopropil azodicarboxilato; "DMEM" se refere à meio de eagle modificado por dulbec- co; "DMF" se refere à dimetitformamida; "DMSO" se refere à dimetilsulfoxide;

"DPBS" se refere à fosfato tamponado salino de Dulbecco; "DTT" se refere à 1 ditiotreitol; "EDTA" se refere à ácido tetracético de etilenodiamina; "EtoH" se refere à etanol; "FBS" se refere à soro bovino fetal; "HEPES" se refere à áci- Í do N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico; "MEM" se refere ao mio essencial mínimo; "MeOH" se refere à metanol; "PBS" se refere à fosfato tamponado salino; "PBST" se refere à fosfato tamponado salino Tween-20, "PI" se refere à iodeto de propidio; "RNAase" se refere à ribonuclease A; "SDS" se refere à sulfato de dodecil de sódio; "RT" se refere à temperatura ambiente; "TBS" se refere à tri-tamponado salino; "TBST" se refere à tri- —tamponado salino Tween-20; "THF" se refere à tetraidrofurano; "TR-FRET" se refere à transferência de energia fluorescente resolvida a tempo; "Tris" se refere à tri(hidroximetil) aminometano; "Triton-X" se refere à 4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenil-polietileno glicol toctilfenoxipolietoxietano! polietileno glicol terc-octilfenil éter; e "Tween-20" se refere à polissorbato 20. Os resultados dos ensaios a seguir demonstram evidência de . que o composto, ou um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável, ou um solvato do sal, da presente invenção é útil como um inibidor de Chk1, inibi- Í dor de Chk2 e como um agente anticâncer.

Como usado aqui no presente, "IC50" se refere à concentração de um agente que produz 50% da resposta “máxima inibitória possível para aquele agente e "EC50" se refere à concen- tração de um agente que produz 50% da resposta máxima possível para aquele agente.

Ensaio Bioquímico de Chk1 O efeito de compostos en atividade bioquímica de Chk1 pode ser determinado usando um ensaio de TR-FRET.

Neste ensaio, um anticor- po rotulado de terbio é usado para detectar produto fosforilado formado a partir de uma reação de cinase, substrato rotulado de fluoresceina e ATP.

O anticorpo liga ao substrato fosforilado, resultando em um aumento increase no valor de TR-FRET calculado como a proporção do sinal do aceptor (fluo- resceina) para o sinal doador (terbio). As reações de cinase (25 ul. volumes de reação) são realizadas em placas de poliestireno negro de meia área de 96- cavidades (Costa, catit

3694). Reações são iniciadas com a adição de ATP.

As condições finais de í reação são 50 mM HEPES pH 7,5, 0,005% (v/v) TRITONTY X-100, 2 mM DTT, 2 mM MgCl2, 104 nM substrato PKC de fluoresceíina (Invitrogen, catf Í PV3506), 30 uM ATP, 1,5 nM de enzima Chk1 ativav (Millipore, cattt 14- 346), 4% (vlv) DMSO e diluição em série do composto do Exemplo 2 (1:3 dediluição em série, iniciando a 20 starting UM, 10 points). Em seguida à a- dição de ATP, as reações são incubadas a temperatura ambiente por 75 mi- nutos, e depois terminadas com a adição de 25 ul. de tampão de diluição TR-FRET (Invitrogen tPV3574) contendo 10 mM de EDTA e 2,1 nM de anti- corpo Tb-pSer (Invitrogen, cattt PV3574). Reações resfriadas são incubadas a temperatura ambiente por 60 minutos, e depois TR-FRET é medido usan- do uma leitora de placa Envision de PerkinElmer com filtros para comprimen- to de onda de Ex340nm, Em495nm e Em520nm.

Para determinação de IC50, o percentual de inibição para cada concentração é calculado usando a proporção de TR-FRET dos controles V chegando a cada placa.

Os dados de concentração de composto de dez pontos são subsequentemente adaptados para uma equação logística de í quatro parâmetros usando ActivityBase 4.0. Valores absolutos de IC50 são calculados a partir da curva resultante.

O composto do Exemplo 2 é medido neste ensaio para ter um IC50 de <0.001 UM.

Isto demonstra que os com- postos da presente invenção são inibidores potentes de Chk1. Ensaio bioquímico de Chk2 O efeito de compostos na atividade bioquímica de Chk2 pode ser determinado usando um ensaio de TR-FRET.

Neste ensaio, um anticor- po rotulado de terbio é usado para detectar o produto fosforilado formado a partir da reação de cinase, substrato rotulado de fluoresceina e ATP.

O anti- corpo liga ao substrato fosforilado, resultando em um aumento no valor de TR-FRET calculado como a proporção do sinal aceptor (fluoresceína) para o sinal doador (terbio). As reações de cinase (25 ul. de columes de reação) são realiza- das em placs de poliestireno negro de meia áres de 96- cavidades (Costa, catff 3694). As reações são iniciadas com a adição de ATP.

As codições fi-

nais da reação são 50 MM HEPES pH 7,5, 0,005% (v/v) TRITONTY X-100, 2 õ mM DTT, 2 mM MgClk2, 104 nM de substrato de fluoresceina PKC (Invitro- gen, cat! PV3506), 30 uM ATP, 2,5 nM de enzima de Chk?2 ativa (Millipore, f catit 14-347), 4% (v/v) DMSO e diluição em série do composto do Exemplo 2 (1:3 diluição em série, iniciando a 20 uM, 10 pontos). Em seguida à adição de ATP, as reações são incubadas a temperatura ambiente por 75 minutos, e depois terminadas com a adição de 25 ul de tampão de diluição TR-FRET (Invitrogen XPV3574) contendo 10 mM EDTA e 2,1 anticorpo nM Tb-pSer (Invitrogen, catft PV3574). Reações resfraidas são incubadas a temperatura ambiente por 60 minutos, e depois medidas de TR-FRET usando leitora de placa Envision de PerkinElmer com filtros para comrprimento de onda de Ex340nm, Em495nm e Em520nm.

Para a determinação de IC50, o percentual de inibição para cada concentração é calculado usando a proporção de TR-FRET a partir dos con- troles funcionando em cada placa.

Os dados de concentração de composto E de 10 pontos são subsequentemente ajustados pra um equação logística de quatro parâmetros usando ActivityBase 4.0. Valores absolutos de IC50 são : calculados a partir da curva resultante.

O composto do Exemplo 2 é medido neste ensaio para ter um IC50 de 0,0047 UM.

Isto demonstra que os com- postos da presente invenção são inibidores potentes de of Chk2. Ensaio Baseado da Célula de Autofosforilação Chk1 Um inibidor de Chk1 impedirá a atividade de cinase da proteína de substratos de fosforilar em células em que a resposta da lesão do DNA foi ativada.

Um substrato facilmente detectável para Chk1 é um sítio de auto- fosforilação na própria Chk1, serina 296. O ensaio de immunoblot a seguir pode ser usado para medir a quantidade de fosforilação de serina 296 em Chk1 e indiretamente o nível de atividade da proteína cinase Chk1. As célu- las HelLa (compradas de ATCC) são culturadas em MEM w/ sais de Earle (Invitrogen) w/ L-glutamina (GibcoTY) suplementadas com 10% (v/v) de calor inativado FBS (Gibco"“), 1x MEM de aminoácidos não essenciais (GibcoT"Y), 1x piruvato de sódio (Gibco"“) e 1 x 10º células plaqueadas em 600 uL de meio de cultura MEM (acima) por cavidade de uma placa de cultura de célu-

las de 24 cavidades.

Células são incubadas por 24 horas a 37ºC, 5% de CO, " e 95%-100% de umidade.

Dezesseis ul de um 4 uM de estoque de doxoru- bicina (Sigma) em meio de cultura são adicionados para cada cavidade a- i propriada para fazer uma concentração final de 100 nM de doxorubicina.

Placas são retornadas para a incubadora por 24 horas adicionais antes da adição do composto inibidor de Chk1. Compostos são solubilizados a 10 mM em 100% de DMSO, depois diluídos para 2 mM em 40% (v/v) de DMSO e depois diluídos á 100 UM com meio de cultura mais 4% (v/v) de DMSO.

Subsequentemente diluições em série dos compostos (1:3) são preparadas sobre uma faixa de 100 uM a 0,005 UM.

Sessenta e seis ul de estoque de composto são adicionados nas cavidades apropriadas na placa para produ- zir uma concentração final de DMSO de 0,4% (v/v) e uma concentração de composto final variando entre1 uM e 0,0005 UM.

As placas são retornadas para a incubadora por um adicional de duas horas e depois removidas para lise e processamento das células.

O meio é depois removido da placa, cada . cavidade lavada uma vez com 0,5 ml! de resfriamento por gelo DPBS (Gib- co”), todo o líquido removido e a placa é colocada no gelo para o restante í do procedimento.

Para cada cavidade é adicionado 75 ul tampão de lise de resfriamento por gelo, consistindo em Tampão de Extração de Células (Cell Extraction Buffer) (Invitrogen) contendo inibidores de fosfatase (Sigma) e inibidores de protease (Roche Diagnostics). Depois de 10 minutos cada ca- vidade é fragmentada e o lisato transferido para dentro de um tubo micro- centrífugo de 1,5 mL de polipropileno no gelo.

Cada lisato é sonicado por 45 segundos com uma placa de sonicador (Misonix) de copo em forma de chifre —(cuphorn) enquato é suspensa em um banho de água / gelo.

Cinquenta OL de cada amostra é transferido em um tubo microcentrífugo de 0,5 mL de po- lipropileno contendo 25 ul. de 4x Tampão de Amostra Laemm!i (240 mM Tri- HCI, pH6.8, 40% de glicerol, 0,05% de bromofenol azul, 8% em peso/volume SDS e 20% (v/v) de beta-mercaptol etanol), aquecido a 95ºC por 5 minutos e armazenado congelado a -80ºC.

O lisato remanescente é usado para a de- terminação da concentração de proteína (kit de ensaio de proteína BCATY, Thermo Scientific). Cinco ug de cada lisato de célula no tampão de amostra é aplicado para um gel de 96 cavidades E-Page (Invitrogen) e submetido à ; eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.

Proteínas são eletro- transferidas do gel para a membrana Immobilon-P (Millipore) de acordo com |! os procedimentos bem compreendidos na técnica [Towbin et al., 1979]. A membrana é enxaguada brevemente com 10 mM de Tris/HCI pH 8,0, 150 mM NaCl e 0,05% (v/v) Tween 20 (TBST) e embebida por uma hora a 25 ºC em TBST/ 5% (v/v) de leite da ocasião Carnation& reconstituído.

A membra- naé lavada quatro vezes com TBST por cinco minutos, depois embebida a a 4ºC por 24 horas em TBST/ 5% (peso / volume) de BSA com uma diluição apropriada de Chk1 anti-fosfo de coelho (serina 296) (Sinalização de Célula). A membrana é lavada quatro vezes com TBST por cinco minutos a 25ºC e depois embebida a 25ºC por duas horas em TBST/ 5% de leite contendo uma diluição apropriada de IgG burrinho anti-coelho conjugado a peroxidase horseradish (HRP; Amersham) para detectar proteína Chk1 autofosforilada.

Amembrana é lavada novamente quatro vezes com TBST por cinco minutos : a 25ºC.

Conjugados de antigeno-anticorpo-reporter imobilizados na mem- brana são detectados com o regente de detecção-HRP Super Signal Wes- ' tern Femto (Pierce) como recomendado pelo fabricante, usando um forma- dor de imagem quimioluminescente (Fujifilm). As intensidade da faixa Fosfo- —Chki(ser296) são calculadas usando o programa "Total Lab" (Nonlinear Dy- namics). O percentual de inibição da doxorubicina induzida por autofosforila- ção de Chk1 é calculada usando a fórmula a seguir: % inibição = (intensida- de da faixa de amostra fosfoChk1 — intensidade da faixa de controle fosfo- Chk1 negativo de não doxorubicina) / (intensidade da faixa de controle fos- foChki de doxorubicina positivo - intensidade da faixa de controle fosfoChk1 negativo de não doxorubicina) x 100. O composto do Exemplo 2 é medido neste ansaio para ter um EC50 de <0.0005 JM.

Isto demonstra que os com- postos da presente invenção são inibidores potentes de Chk1. Ensaio de Acúmem Baseado em Célula de Anulação do Pon- tode Verificação G2M Induzido por Doxorubicina Um inibidor de Chk1 incapacitará o ponto de verificação de lesão deo DNA G2M DNA em p53-minus células de tumor tratadas com o inibidor de topoisomerase Il, doxorubicina.

Uma medição da anulação do ponto de ' verificação G2M é a fosforilação de histona H3 em serina 10 que ocorre de- pois que as células atravessam o ponto de verificação G2M e entram mitose. i O ensaio de formação de imagem de conteúdo alto a seguir pode ser usado para medir a fosforilação de histone H3 em células.

Células HeLa (compra- das de ATCC) são culturadas em Meio MEM (Gibco*“) suplementadas com 10% (v/v) de FBS e plaqueadas em 2000 células por cavidade em placas escuras de fundo claro revestidas de poli D-lisina (BD Biocoat Cat 3504640), 100 ul de volume por cavidade.

As placas são depois incubadas em uma incubadora de células por 18 a 24 horas (37ºC, 5% CO, e 95% de umidade relativa). Em seguida a incubação inicial, 20 ul de Gibco'y MEM Media 10% de FBS contendo 625 nM de doxorubicina são adicionados para as cavidades apropriadas das placas resultando em uma concentração dinal de 125 nM.

As placas são retornadas para a incubadora por 24 horas, sufici- ente para interromper as células no ponto de verificação G2M.

No dia se- - guinte as células são tratadas com o composto do Exemplo 2. O composto do Exemplo 2 é solublizado a 10 mM em 100% de DMSO e depois diluído : para um estoque 10X iniciando em 50 UM em 4% (v/v) de DMSO-MEM.

Subsequentemente diluições em série do composto (1:2) são preparadas em uma faixade 50 uM a 0,39 UM.

Treze ul de estoque de composto é adicio- nado para as cabidades apropriadas na placa para produzir uma concentra- ção final de DMSO de 0,4%, e uma faixa de concentração final de composto entre 5 uM e 0.039 uM.

As placas são retornadas para a incubadora para um adiconal de sete horas e depois removidas para fixação.

O líquido é cuida- —dosamente removido de cada cavidade e 100 uL de fixador PREFERTY (A- natech LTD.

Cat f414) é adicionado.

As placas são mantidas a temperatura ambiente por 20 minutos, o fixador removido, e as células são depois per- meabilizadas pela adição de 100 ul/cavidade de 0,1% (v/v) Triton& X 100 (Pierce Cat 28314) em DPBS (Gibco'"“ cat ft 14040) por 10 minutos.

A so- luçãoé removida e a placa lavada duas vezes com 100 ul. de DPBS por ca- vidade seguida pela adição de 100 ul de DPBS contendo 50 pg/ml de RNAase (Ribonuclease A, Sigma Cat % R-6513) por uma hora a temperatura ambiente.

A solução de RNAase é removida e as células manchadas para a ã presença de histona H3 fosforilado em serine 10 (pHH3) pela adição para cada cavidade de 50 ul de solução de RNAase contendo uma diluição de 1:500 coelho anti-pHH3 (ser10) (UBI Catff 06-570) mais 1% (em peso / vo- lume) de BSA (Gibco"" catff! 15260). As placas são lacradas e mantidas a 4ºC durante a noite.

O anticorpo primário é removido lavando cada placa duas vezes com 100 ul de DPBS por cavidade e recolocado com 50 ul de uma diluição de 1:750 de goat anti-rabbit IG acoplado ao corante Alexa 488 (Invitrogen cat! A11008) em DPBS mais 1% (em peso / volume) de BSA.

As placassão mantidas por uma hora a temperatura ambiente cobertas com papel laminado de alumínio para proteger da luz.

As placas são novamente lavadas duaas vezes com 100 uL por cavidade DPBS e recolocadas com 100 ul. de 15 nM de iodeto de propidio (1:100 de diluição com PBS da solu- ção original, Molecular Probes (Sondas Moleculares) catft P3566). As placas são lacradas com selo preto para proteger as placas da luz.

As placas são : incubadas por 30 minutos para colorir os núcleos.

As placas são escaneadas com ACUMEN EXPLORER'Y citômetros de microplacas de fluorescência É escaneadas a Laser usando 488nm de excitação (TTP LABTECH LTC) para medir pHH3 e conteúdo de DNA incluindo 2N, e 4N.

As células positivaas de pHH3 são identificadas por intensidade de meio a 519 nm de Alexa 488. À intensidade total a 655-705 nm de iodeto de propídio / DNA é usada para identificar células individuais e subpopulações em ciclo de células (2N céllu- las, AN células). A leitura final para cada população é determinada normali- zando para o % do total de células produzindo um débito de ensaio de %p- HH3,%2Ne%4N. 100% de atividade é depois determinada tratando as cé- lulas com a concentração máxima de um composto de controle de inibidor a 100 nM para determinar o % de atividade final de cada composto. 0% de atividade é baseado no tratamento do composto.

O EC50 relativo é determi- nado usando ACTIVITY BASETY, excel fit, adaptando a curva usando um ajuste de logística de quatro parâmetros, equação 205, para determinar o %pHH3 relativo ao controle máximo a 100%. O composto do Exemplo 2 é medido neste ensaio para ter um EC50 de 0,0105 UM.

Isto demonstra que os compostos da presente invenção incapacitarão o ponto de verificação de . lesão de G2M DNA.

Ensaio ECrrfs (Sensibilização de Duas Dobras) i Um inibidor de Chk1 pode potencializar uma atividade antiproli- ferativade gencitabina (ou outros citotóxicos) através da anulação do ponto de verificação da fase intra-S, resultando em lesão de DNA sustentada e aumentada.

A capacidade para a proliferação de células de tumor conti- nuada depois da lesão do DNA pode ser analisada determinando a capaci- dade das células para reproduzir seu DNA.

Este ensaio avalia a capacidade das células reproduzirem seu DNA depois das células terem tido uma opor- tunidade de reparar a lesão do DNA.

Neste ensaio, as células são tratadas com gencitabina, e depois com o composto do Exemplo 2. Em seguida ao período de recuperação, as células são ensaiadas para a capacidade de incorporar timidina radioativa no DNA durante a fase S.

O parâmetro de EC; é uma medida da concentração de um inibidor de Chk1 necessário para re- duzir pela metade da concentração de GI90 de gencitabina, medida neste ensaio na ausência de inibição de Chk1. Células HT-29 (obtidas de ATCC), , são criadas em RPMI 1640 mais (Gibco'"“) 10% (v/v) FBS inativado por ca- lor.

Essas películas são plaqueadas a 1,3 x 10º por cavidade em placas de cultura de tecido de 96 cavidades Corning Costar.

Depois de plaquear as células, as placas de cultura de tecido são mantidas a temperatura ambiente por 45 minutos, antes de retornar a 37ºC.

As placas são incubadas por 24 horas antes da adição de gencitabina.

Antes da adição de gencitabina, o meio é removido de todas as cavidades e recolocado com 150 uL por cavi- dadede meio RPM! fresco.

Estoques de gencitabina a 10 mM são prepara- dos em fosfato-tamponado salino.

Diluições de gencitabina foram prepara- das a 4x concentrações em meio de RPMI e adicionadas para cavidades a 50 uL por cavidade.

A concentração final mais alta de gencitabina usada é de 80 UM e diluições continuam por etapas de quatro vezes.

Duas horas mais tarde, gencitabina contendo meio é removida das cavidades e recolo- cada com 150 uL por cavidade de meio RPM! fresco.

O composto do Exem- plo 2 (10 MM em DMSO) é diluído primeiro em DMSO para 2000x concen-

trações finais, e depois diluído 1:500 em meio RPMI para gerar 4x estoques Ô para adição para as cavidades.

O volume de adição é de 50 uL.

As diluições do composto continuam por etapas de duas dobras, iniciando a 5000 nM.

Ô Vinte e quatro horas depois da adição do composto do Exemplo 2, o meio contendo inibidores é removido por aspiração e recolocado com 200 uL por cavidade de meio RPMI fresco.

Setenta e duas horas depois da remoção do composto do Exemplo 2, a rotulação de timidina triciada é iniciada.

H- timidina (NET 027X001, PerkinElmer, atividade específica Ci/mmol) é diluída 1:20 em RPMI completo para render uma concentração de 0,05 mCi/mL. 20 uL desta solução é adicionado para cada cavidade, rendendo 1 uCi/cavidade de ?H-timidina.

As células são rotuladas por vinte e duas horas.

O meio con- tendo ?H-timidina é completamente removido das cavidades.

As placas são depois congeladas a -20ºC, por diversas horas.

Para colher *H-timidina in- corporada contendo DNA, as placas são descongeladas por diversos minu- tos, e depois 120 ul por cavidade de 0,1 N NaOH é adicionado para cada k cavidade.

Cada placa é depois incubada a 37ºC, com mistura lenta em um rotador, por 10 minutos.

O DNA é colhido com um Filtermate 196 Harvester : (PerkinElmer) e coletado em Unifilter de 96 cavidades GF/C placas (Perki- nElmer H6005174). As cavidades da placa de cultura de tecido em que as células tinham sido rotuladas são lavadas com ága 5x.

As membranas da placa de Unifilter são lavadas com um adicional de 4,5 mL por cavidade (3 x 1,0 mL e finalmente uma lavagem de 1,5 mL). As placas Unifilter são depois secas a 37ºC por pelo menos 6 horas.

O fundo de cacda placa de filtro foi lacrado com uma folha adesiva Backseal (PerkinElmer), e as 50 uL/cavidade de MicroScint-20 (Perkin Elmer) é adicionada.

Cada placa é depois lacrada com uma folha de adesivo claro Topseal (PerkinElmer). As placas são con- tadas em um contador de cintilação Topcount (PerkinElmer), em 1 minuto por cavidade.

As contagens de H-timidina por minuto (cpm) são exportadas em Prism (GraphPad) para análise e plotagem.

Uma resposta de dose de gencitabina é determinada para cada concentração do composto do Exem- plo 2. Para fazer isto, a cpm é normalizada, estabelecendo 100% de incorpo- ração como a média de cpm para a concentração do composto do Exemplo

ERA ES CS CORDA E ENE CORES EEE ASAS ES STS MR ENO AAA SDS 18/42 2 na ausência de gencitabina e nenhuma incorporação (100% de inibição) Í como cpm = O (sem contagens por minuto). Para fazer a plotagem dos da- dos em Prism, as concentrações de gencitabina são transformadas para va- i lores de log, e as curvas de respostas de dose são ajustadas por regressão nãolinear.

Nem os ajustes do topo nem do fundo são forçados.

O valor de ECrs É 0,3 NM.

Além do mais, 3 nM do composto do Exemplo 2 diminui o EC50 da gencitabina 7-dobras de 37 nM para 5 nM em células de carcinoma de cólon HT29. A ação do composto do Exemplo 2 também aumenta a per- centagem de inibição de de 52 para gencitabina para 73 para a combinação.

Sozinhos, 3 nM do composto do Exemplo 2 tem pouco efeito sobre a prolife- ração de células HT29. Ensaio de Inibição Alvo de Chk1 in vivo Células Calu-6 (ATCC) são culturadas em meio de crescimento (MEM com sais de Earle (Invitrogen) com L-glutamina (Gibco'”") suplemen- tadas com 10% (v/v) de calor inativado FBS (GibcotY), 1x aminoácidos não . essenciais MEM (Gibco'”), 1x piruvato de sódio (Gibco'!“)) e expandidas.

As células são cohlidas e lavadas duas vezes com fosfato tamponado salino ' e 1 x 10º de células em meio de crescimeto (sem soro) são misturados com volume igual de matriz de BD MatrigelM (BD Bioscience, Franklin, NJ), de- pois injetadas subcutaneamente no flanco dos camundongos nús pré- irradiados (4,5 Gy) (nu atímico, de Harlan, Indianapolis, IN). No 15º dia de- pois do implante (tamanho do tumor = 150-200 mmº?), gencitabina formulada freca em salino (Hospira, Lake Forest, IL) diariamente é administrada para animais pela via intraperitoneal a uma dose det 150 mg/kg.

Seis horas mais tarde é administrado para os animais o composto do Exemplo 2 formulado ácido sulfônico de metano em proporção molar/20% de Captisol (CYDEX, Overland Park, KS) por via intravenosa variando a dose de 15 mg/kg para baixo.

Os animais foram sacrificados 2 horas após a dose de inibidor de Chk1, os tumores colhidos e imediatamente processados em tampão de res- friamento por gelo Cell Extraction (Invitrogen Cat XgFNNO011) contendo inibi- dores de fosfatase (Sigma) e inibidores de protease (Roche Diagnostics). Os tumores são processados em 1,5-2,0 mL de tampão de lisis em um tubo de

15 mL de polipropileno cônico resfriado usando um homogeinezador de teci- - do motorizado (Powergen 700) colocado para mais alto do quer 15 segun- dos. Com a amostra mantida no gelo, o lisato é retirado quatro vezes através í de uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 25. Em seguida, 0,35 mL delisatode tumor é transferido em um tubo microcentrífugo de polipropi- leno de 1,5 mL contendo 0,15 mL de 4x tampão de amostra Laemmli (240 mM Tris-HCI, pH6.8, 40% de glicerol, 0,05% de bromofenol azul, 8% em pe- so / voluma de SDS e 20% (v/v) de etanol beta-mercaptol). A amostra é dpois misturada e aquecida por 5 minutos a 95ºC e sonicada por um minuto usando energia alta em um sonicador de placa em forma de chifre Misonix

3000. As amostras são depois armazenadas em gelo, ou armazenadas a - 80ºC para avaliação da inibição do alvo por imobilização de proteína (wes- tern blot). O lisato remanescente é usado para a determinação de concen- tração de proteína (Kit de ensaio de proteína BCA'Y, Thermo Scientific). Cin- copugde cada lisato de tumor no tampão de amostra são aplicados para os : geis E-Page de 96 cavidades (Invitrogen) e submetidos à eletroforese de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas são transferidas para ' membrana de Nitrocellulose Protran BA83 (Whatman) de acordo com os procedimentos bem compreendidos na técnica [Towbin et al, 1979]. A membrana é depois processada para medir a proteina Chk1 autofosforilada em serina 296. A membrana é enxaguada brevemente com água, depois 10 mM de Tris/HCI pH 8,0, 150 mM de NaCl! e 0,05% (v/v) Tween 20 ( TBST) e embebida por uma hora a 25ºC em TBST/ 5% (peso/ volume) de leite do instante reconstituído Carnation&. A membrana é depois lavada quatro ve- zes com TBST por cinco minutos. A membrana é embebida a 4ºC por 16 horas em TBST/5% (peso/volume) de BSA em uma diluição apropriada de anti-fosfoChk1 de coelho (serina 296) (Sinalização de Célula). Em seguida, as membranas são lavadas quatro vezes cm TBST por cinco minutos a 25ºC e depois embebidas a 25ºC por duas horas em TBST/ 5% de leite contendo uma diluição apropriada do IgG de anti-coelho de burrinho conjugado para peroxidase horseradish (HRP; Amersham) para detectar fosfo-Chk1(ser 296). A membrana é lavada novamente quatro vezes com TBST por cinco minutos a 25ºC. Conjugados de antigeno-anticorpo-reporter imobilizados na . membrana são detectados com o reagente de detecção Super Signal Wes- tern Femto HRP- (Pierce) como recomendado pelo fabricante. i Signais são detectados e capturados usando o sistema de cria- çãodeimagem FUJI LAS-4000.

As intensidades da faixa de Phospho-Chk1(ser296) são calcu- ladas usando o programa "Total Lab" (Dinâmicas não Lineares). O percentu- al de inibição de gencitabina induzida por autofosforilação de Chk1 é calcu- lado usando a fórmula a seguir: % inibição = (amostra de intensidade de fai- xa fosfoChk1 — média de gencitabina (Max) intensidade de faixa de controle positivo de fosfoChk1) / (intensidade de faixa de controle negativo médio de (Min) fosfoChk1 — intensidade de faixa de controle positivo da média de gen- citabina (Max) de fosfoChk1) x100.

O composto do Exemplo 2 é medido neste ensaio para ter uma Dose Eficaz Modulatória Alvo de 50 (TMED50) para autofosforilação de Y Chk1 de 0,03 mg/kg. Modelos de Xenoenxertos de Tumor de Ser Humano ' A capacidade de inibidores de Chk1 para efetuar a morte do tu- mor pode ser determinada in vivo usando os modelos de eficácia de xeno- enxertos de pulmão Calu-6 e tumor de cólon HT-29. As células de câncer de pulmão Calu-6 (ATCC) são culturadas em meio de crescimento (MEM em- peso/ sais de Earle (Invitrogen) com L-glutamina (Gibco'“) suplementadas com 10% (v/v) de calor inativado FBS (Gibco"”), 1x aminoácidos não es- senciais MEM (GibcotY), 1x piruvato de sódio (Gibco'“)) e células de câncer de cólon HT-29 (ATCC) são culturadas em meio de crescimento, (meio 5A de McCoy (Gibco'“) suplementadas com 10% de FBS (Gibco'“)) e expandi- das. As células são colhidas e lavadas duas vezes co fosfato tamponado salino e 5 x 10º de células (HT-29) ou 1 x 10º de células (Calu-6) em meio de crescimento (sem soro) são misturadas com volume igual de matriz de BD Matrigel"M (BD Bioscience, Franklin, NJ), depois injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus (CD-1 nu/nu, de Charles River Labs, Wil- mington, MA). Cerca do 16º dia depois do implante (150-200 mmº), gencita-

bina é formulada fresca em salino diariamente e administrada para animais ' pela via intraperitoneal em uma dose de 60 mg/kg.

Vinte e quatro horas mais tarde é administrado o composto do Exemplo 2, formulado em proporção Í molar de Captisol ácido metano sulfônico /20% (CYDEX, Overland Park, KS) pelavia intravenosa.

Depois de um dia de descanso, a dosagem é repetida por mais 3 ciclos (Q3Dx4 com compensação de inibidor Chk1 +24 horas). Cada grupo de dose consiste em nove animais.

A resposta do tumor é de- terminada pela medição do volume do tumor realizada duas vezes por se- mana durante o curso do tratamento.

A inibição do crescimento do tumor (TGI) é calculada com o percentual de redução em média de tamanho de tumor de um grupo tratado com composto de um tamanho de tumor médio do grupo de controle tratado com o veículo.

O composto do Exemplo 2 do- sado sozinho e em combinação com gencitabina demonstra excelente ativi- dade anti-tumor dependendo da dose em ambos os modelos de xenoenxer- to, HT-29 e Calu-6, com até um aumento de seis vezes a inibição de cresci- E mento do tumor durante gencitabina sozinha.

Dosagem de Eficácia de Agente Único ' A habilidade dos inibidores Chk1 de afetar os destruidores de tumor pode ser determinada in vivo usando-se o modelo de eficácia do xe- —noenxerto de pulmão Calu-6. As células câncerígenas do pulmão Calu-6 (ATCC) são cultivadas como descrito acima.

As células são colhidas e lava- das duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e células (Calu- 6) de 1 x 106 no meio de crescimento (sem soro) são misturadas com volu- me igual da matriz BD Matrigel & (BD Bioscience, Franklin, NJ), em seguida injetadas de forma subcutânea no flanco do camundongo nu (CD-1 nu/nu, de Charles River Labs, Wilmington, MA). Mais ou menos 16 dias após o implan- te (150-200 mm3), o composto do Exemplo 2 é dosado em 15 mg/kg (de forma subcutânea (SC), duas vezes ao dia (BIDx5 descanso de 2 dias) x 3 ciclos.

A resposta do tumor é determinada pela medição do volume do tu- mor, efetuada duas vezes por semana durante o curso do tratamento.

O composto do Exemplo 2 dosado no dia 5 da tabela BID (15 mg /Kkg) propor- ciona inibição de crescimento superior à gencitabina mais o composto do

Exemplo 2 da tabela de combinação previamente descrita.

A regressão i completa do tumor é rápida e duradoura.

Proliferação de Monocamada e Ensaio de Citotoxicidade Ê Uma medição de potência de um inibidor Chk1 é a sua habili- dade de inibir a proliferação das células câncerígenas na cultura devido à ativação de origem da réplica descontrolada. (Conti et al.

Cell Cicle 6: 2760- 2767, 2007) A determinação da atividade antiproliferativa do inibidor Chk1 em linhagens celulares derivadas de uma ampla faixa de tipos de tumor é indicativa de que os tipos de tumor podem ser clinicamente responsivos à quimioterapia com inibidores Chk1. O ensaio de proliferação celular descrito a seguir é realizado com Oncoteste, GmbH na Alemanha.

Trinta linhagens celulares de tumor sólido são divididas a partir de 13 histotipos diferentes de tumor, cada um representeado por 1 a 6 linhagens celulares diferentes (On- cotest, GmbH). Eles são estabelecidos a partir do câncer de bexiga, cérebro, colo, estômago, fígado, pulmão, mama, ovário, pâncreas, rim e do útero, : bem como a partir do meloma e pleuramesotelioma.

Todas as linhagens ce- lulares são estabelecidas com Oncoteste de xenoenxerto de tumor derivado ' de paciente (Roth e outros1999). A origem dos xenoenxertos de doador é descrita por Fiebig e outros (Fieberg et al. 1992 e 1999). As linhagens celula- ressão migradas rotineiramente, uma ou duas vezes por semana e manti- das em cultura para até 20 migrações.

Todas as células são cultivadas a 37ºC em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 em um meio RPMI 1640 (PAA, Cólbe, Alemanha) suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal de bezerro (PAA, Cólbe, Alemanha) e 0,1 mg/ml. de gentamicina (PAA, Cóôlbe, Alemanha). Um ensaio de iodeto de propídio é usado para avaliar a atividade citotóxica dos compostos contra essas linhagens celulares.

Em suma, as células aderentes são colhidas das culturas de fase exponencial através da tripsinização, contadas e colocadas em placas de microtitulação de fundo plano com 96 poços em uma densidade celular dependendo da linhagem celular (4.000 - 20.000 células/poço). Após um período de recupe- ração de 24 horas para permitir que as células apresentem aderência e re- cuperem o crescimento exponencial, 10 ul do meio de cultura (cavidades de controle 6/lâmninas) ou de um meio de cultura que contém o composto do Ú Exemplo 2 é adicionado. Soluções de estoque do composto do Exemplo 2 : são preparadas em DMSO em uma concentração a 1 mM. As diluições sub- sequentes são feitas em um meio de cultura celular com RPMI 1640 comple- tocomo se segue: primeiro, a solução de estoque DMSO é diluída 1:22 (con- tendo 4,5% (v/v) DMSO). Usando-se essa solução, diluições em série (meio log ou 2 vezes) em um meio de cultura são feitas. Para a etapa final de dilui- ção (1:15), 10 ul/poço da solução do respectivo composto final solution são diretamente adicionados a 140 ul/poço do meio de cultura. A concentração final DMSO é < 0,3% (v/v). O composto do Exemplo 2 é aplicado em triplica- tas em uma curva de concentração de 10 pontos e o tratamento é continua- do por 4 dias. Após os 4 dias de tratamento, o meio de cultura é removido e substituído por 200 ul de uma solução aquosa PI de 7 ug/mL. Para calcular o número de células vitais, as células são permeabilizadas por congelamen- to, resultando na morte de todas as células que permaneceram presas na - poço após o tratamento com o composto. Por fim, a fluorescência PI é calcu- lada usando-se o leitor de microplaca Citofluor 4000 (excitação A= 530 nm, í emissão A=620 nm) para determinar o número total de células viáveis. À inibição de crescimento é expressa como valores de Teste/Controle x100 (% deT/C). Com base nos valores de T/C, os valores relativos de IC50 são de- terminados usando-se regressão não linear (logíconc. de inibidor] versus resposta (% de T/C)). O composto do Exemplo 2 inibe o crescimento da maioria dessas linhagens celulares de tumor com uma EC50 sob 20 nM, su- gerindo o potencial da ampla atividade anticâncer como um agente único.

As Preparações e os Exemplos a seguir são fornecidos para i- lustrar a invenção em outro detalhe e representear sínteses típicas do com- posto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato do sal. Os nomes dos compostos da presentee invenção são geralmente forne- cidos por ChemDraw Ultra& 10,0 ou 11,0, exceto quando de outro modo in- dicado.

Rota A Preparação 1

Stspiliotianatopiraaina-Cvarbonitita sn Dm É Uma solução de tiofosgênio (1,86 g, 15 mmols) em THF (4 mL) é adicionada em gotas em uma solução de 5-aminopirazina-2-carbonitrila (1,20 g, 10 mmolis) e piridina (2 mL) em CH2CI2 (200 mL) e THF (25 mL) à temperatura ambiente. A mistura de reação é agitada em temperatura am- biente por 3 h. A mistura é concentrada e o produto bruto é diluído com ace- tato de etila, filtrado e concentrado para produzir o composto do título. Preparação 2 3-(2-acetir-3-metoxifenôxi)propilcarbamato de terc-butila Age Azodicarboxilato de di-isopropila (2,82 g , 14,0 mmols) é adicio- nado a uma solução agitada de 3-hidroxipropilcarbamato de terc-butila (2,45 g, 14,0 mmois), 1-(2-hidróxi-6-metoxifenil)etanona (1,94 g , 11,7 mmolis) e - trifenilfosfina (3,66 g, 14,0 mmols) em THF (50 mL) em temperatura ambien- te. Após agitação de 18 h, o solvente é removido sob pressão reduzida e o produto bruto é cromatografado (hexano-acetato de etila: O — 60% de gradi- ente) para fornecer 1,60 g do composto do título. Exemplo 1 Sal de ácido 5-(5-(2-(3-Aminopropóxi)-S-metoxifenil)-1H-pirazol- 3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila fórmico Pl So n N N-N a

H o HCO,H

À Uma solução de hexametil dissilazano de lítio a 1 Mem THF (7,6 mL, 7,6 mmols) é adicionada aos poucos a uma solução agitada de 3-(2- acetil-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila (1,08 g , 3,17 mmolis)

TERRENA NAAS 25/42 em THF seco (25 mL) em temperatura ambiente.

Após misturar por 10 min, " a 5-isotiocianatopirazina-2-carbonitrila (0,510 g, 3,17 mmols) em THF(4 mL) é adicionada e a agitação é continuada por 30 min.

A mistura de reação é concentrada e redissolvida em etanol (50 mL) e ácido acético (5 mL), segui- Í 5 do pela adição de hidrato de hidrazina (2 mL). A mistura de reação resultan- te foi em seguida aquecida a 120ºC por 2 min.

A mistura de reação é em seguida resfriada em temperatura ambiente, diluída com água (100 mL), e extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). A parte orgânica é seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada.

O produto bruto é redissolvido em —diclorometano (50 mL) e tratado com ácido trifluoroacético (10 mL) e agitado em temperatura ambiente por 15 min.

O solvente é removido e o produto bruto (1,20 g) é purificado usando-se HPLC preparativa para fornecer 0,046 g do composto do título.

LC-ES/MS m/z 366,1 [M+H]+. Rota B Preparação 3 . 1-[2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi)fenilJetanona o O Eae Um frasco é carregado com 1-(2-hidróxi-6-metoxifenil)etanona (30 g, 180,5 mmols), carbonato de potássio, (49,9 g, 361 mmolis), iodeto de sódio (2,68 g, 18,1 mmols), e 4-metoxibenzilcloreto (27,0 mL, 198,6 mmolis) emTHFea mistura é aquecida em refluxo durante a noite.

A mistura é res- friada em temperatura ambiente, diluída com água e extraída com acetato de etila.

Os extratos orgânicos combinados são lavados com salmoura e secos sobre MgSO4 anidro, filtrados e concentrados.

O produto bruto é purificado através de cromatografia de sílica-gel com um eluente de acetato de etila/ —hexanos para produzir 32,51 g (57%) do produto desejado como um sólido branco.

Preparação 4 1-(2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi)fenil)-3,3-bis(metiltio)prop-2-en- 1-ona

FERE SSNNAAASOASAARNAASESSA 26/42 : o vs ID MeS À Um frasco de fundo redondo de 500 ml! é carregado com NaH a 95% (7,28 g, 288 mmols) e DMSO seco é adicionado (170 mL). À mistura heterogênea resultante é adicionada em gotas, 1-[2-metóxi-6-(4-metoxiben- Zilóxi) fenil] etanona (41,2 g, 144 mmols) em DMSO seco (60 mL). A mistura é agitadaàtemperatura ambiente por 10 min, em cujo tempo o dissulfeto de carbono é adicionado em gotas (8,69 mL, 144 mmols), seguido imediata- mente por iodeto de metila (18,0 mL, 288 mmols). Calor e gás se desen- volvem durante a adição de ambos reagentes sugerindo adição cuidadosa. À ! solução homogênea é agitada por 18 h à temperatura ambiente e a seguir derramada lentamente em três volumes de água. O produto sólido é filtrado ' e seco sob alto vácuo para dar o composto do título como um sólido laranja. Preparação 5 5-Bromo-N-(5-(2-metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-1H-pirazol-3- iNpirazin-2-amina N N Br o Nv Á v

H o a. 5-Bromopirazin-2-amina (3,73 g, 21,4 mmolis) é dissolvida em THF (30 mL) e resfriada até -78ºC. Uma solução de n-butil-lítio em hexano (10,32 mL, 23,5 mmols) é adicionada lentamente. A mistura de reação é agi- tada à temperatura baixa por 15 min e então aquecida lentamente à tempe- ratura ambiente e agitada por um adicional de uma hora. A mistura é resfria- da novamente até 0ºC e uma solução de 1-(2-metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi)

fenil)-3,3-bis(metiltio)prop-2-en-1-ona (8,39 g, 21,4 mmols) em THF (50 mL) 3 é adicionada por meio de uma cânula. A solução se torna homogênea e é agitada por 15 min à temperatura ambiente antes de ser aquecida até o re- i fluxo por 10 h. A solução é a seguir resfriada até a temperatura ambiente e o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo sólido é dissolvido em EtOH (150 mL) e ácido acético glacial (1,3 mL, 23,5 mmols) é adicionado. Hidrato de hidrazina (5,25 mL, 107 mmols) é adicionado e a solução é sub- metida ao refluxo por um adicional de 8 h. A mistura é resfriada até a tempe- ratura ambiente e concentrada sob vácuo. O produto é purificado por croma- tografia de sílica-gel (CH2CI2 / MeOH) para dar 5,76 g (74%) de um sólido marrom. Preparação 6 2-(3-(5-Bromopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenol o New an

AA

H . oH 5-Bromo-N-(5-(2-metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-1H-pirazol-3- ilpirazin-2-amina (3,1 g, 6,43 mmolis) é dissolvida em MeOH (100 mL). O gás de HCI é borbulhado através de uma mistura de reação por 20 min. À mistura é agitada por 2 h e solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo é redissolvido em clorofórmio / isopropanol a 3:1 (100 mL) e combi- nado com solução saturada de NaAHCO3 (100 mL). As camadas são sepa- radasea camada aquosa é extraída com acetato de etila (3 x 50 mL). As camadas orgânicas combinadas são concentradas e trituradas com metanol para dar 1,5 g (64%) de um sólido marrom. Preparação 7 3-(2-(3-(5-bromopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3- metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila

: RANA SAAE 28/42 “o " N Br QE!

H p o tes Azodicarboxilato de di-isopropila (1,73 mL, 8,76 mmols) é adi- cionado a uma solução de 3-hidroxipropilcarbamato de terc-butila agitada (0,83 mL, 4,83 mmois), 2-(3-(5-bromopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-i1)-3- metoxifeno!) (1,59 g, 4,38 mmols) e trifenilfosfina de poliestireno (5,91 g , 8,76mmols)em THF (50 mL) à temperatura ambiente. Após agitar por 45 min, a reação é filtrada, e o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo resultante é cromatografado (metanol/CH2CI2) para render 1,27 g (54%) de um sólido amarelo. Preparação 8 3-(2-(3-(5-cianopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenóxi) f propilcarbamato de terc-butila 28 : o Ra a Q ..

H o

ER Uma solução de 3-(2-(3-(5-bromopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5- iN)-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila (0,378 g, 0,730 mmol) e cianeto de zinco (0,10 g, 0,870 mmol) em DMF (10 mL) é desgaseificada com um fluxo de nitrogênio por uma hora e a seguir aquecido até 80ºC. À reação é adicionado Pd(Ph3P)4 (0,080 g, 0,070 mmol), e a mistura é aque- cida durante a noite. A reação é resfriada até a temperatura ambiente e con- centrada sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia de sílica-gel (CH2CI2/MeOH) para dar 0,251 g (73%) do composto do título. Rota C Preparação 9

(E)-5-(3-(2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-1-(metiltio)-3- | oxoprop-1-enilamino)pirazina-2-carbonitrila

NA f “o o LI CÊ se o Oy Um frasco de gargalo em flange de 5 litros equipado com uma haste e pá do agitador a ar, termômetro, condensador de água e borbu- —lhadorde nitrogênio é carregado com hidreto de sódio (22,4 g, 560,1 mmolis) e THF anidro (3 L). À mistura agitada no poço é adicionada 2-amino-5- cianopirazina (67,0 g, 557,8 mmols) em porções durante 1,5 h enquanto permitindo qualquer espumação. A temperatura interna permanece em 22ºC do começo ao fim. A mistura é agitada por 35 min. A seguir 1-(2-metóxi-6-(4- metóxi-benzilóxi)-fenil)-3,3-bis-metilsulfanil-propenona (146,0 g, 3739 f mmols) é adicionada a 22ºC durante uma hora. A suspensão amarela é agi- BR tada por 45 min à temperatura ambiente e a seguir o aquecimento é aplicado até que a reação esteja em um refluxo suave. Após 19 h a 65ºC, a mistura de reação é resfriada até 15ºC. A mistura é a seguir dividido em duas meta- dese cada lote é extinto em água (2 L) e extraído com acetato de etila (2 x 1 L). Os extratos orgânicos são combinados e lavados com salmoura, secos sobre Na2SO4 anidro, filtrados, e concentrados sob pressão reduzida a 40ºC para dar 196 g de um sólido amarelo/laranja o qual é usado na etapa a seguir sem purificação adicional. LC-ES/MS m/z 463,2 [M+H]+. Preparação 10 5-(5-(2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila

EEE

H o o”

Um frasco de gargalo em flange de 10 L, equipado com uma , haste e pá do agitador a ar, termômetro, condensador de água e borbu- lhador de nitrogênio, é carregado com (E)-5-(3-(2-metóxi-6-(4-metoxibenzi- ó lóxi) fenil)-1-(metiltio)-3-oxoprop-1-enilamino) pirazina-2-carbonitrila (196 g, 423,8 mmois)e etanol absoluto (3 L). À suspensão agitada sob nitrogênio é adicionado hidrato de hidrazina (41,0 mL, 838,7 mmols) e ácido acético gla- cial (66,0 mL, 1,45 mol). Um pequeno exoterma é notado. Uma suspensão amarela é aquecida até 65ºC. O aquecimento é a seguir descontinuado e a mistura de reação é deixada resfriar até a temperatura ambiente. A mistura é deixada descansar durante a noite sob uma atmosfera de nitrogênio. O sóli- do é coletado por filtração, lavado com etanol fresco, e seco em vácuo a 45ºC para dar 140 g (87% de rendimento para duas etapas) de um sólido amarelo brilhante. O produto é usado na etapa a seguir sem purificação adi- cional. LC-ES/MS m/z 429,2 [M+H]+. Preparação 11 . 5-(5-(2-Hidróxi-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) — pirazina-2- carbonitrila i Y N ho 9 No É é dE

H

OH Um frasco de gargalo em flange de 10 L equipado com uma has- te e pá do agitador a ar, termômetro, condensador de água, e saída para depuradores de gás de solução cáustica é carregado com 5-(5-(2-metóxi-6- (4-metoxibenzilóxi) fenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila (140 9, 326,76 mmols) e solução de cloreto de hidrogênio a 4 N (2500 mL, 10,0 mol) em 1,4-dioxano. A mistura é bem agitada a 60 — 65ºC por 1,5 h, a seguir a mistura é deixada resfriar até 50ºC. Após um total de 4 h, mais cloreto de hidrogênio a 4 Nem 1,4-dioxano é adicionado (1000 mL) e aquecimento até 65ºC retomado. Após uma hora nesta temperatura, o aquecimento é parado e a mistura deixada resfriar até a temperatura ambiente durante a noite com agitação. A mistura é filtrada através de um funil sinterizado grande. O sólido

ES Ao RNNES e es ERA Aa ENSAA EEE EEE CEEE ESA EE 31/42 coletado é lavado com 1,4-dioxano fresco e a seguir retirado seco breve- á mente. A torta de filtro em volume é retornada para o frasco de 10 L e vigo- rosamente agitada com água (2 L) e acetato de etila (3,5 L). A mistura é a Í seguir tornada alcalina pela adição de amônia concentrada (440 mL). A so- luçãoé filtrtadae a seguir transferida para um funil de separação de 5 L. À camada aquosa é separada e extraída novamente com acetato de etila (0,5 L). As camadas orgânicas combinadas são lavadas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas. O sólido é seco in vacuo a 45ºC para dar 101,3 g. O produto bruto é suspenso em tetra-hidrofurano a- —nidro quente (2,2 L) e carregado sobre uma almofada de sílica (1 kg) úmida acondicionada usando iso-hexano. O produto é eluído com acetato de etila. As frações combinadas são parcialmente concentradas e o precipitado resul- tante é coletado por filtração e seco em vácuo a 40ºC durante a noite para dar 60,9 g. LC-ES/MS m/z 309,2 [M+1]+, Preparação 12 p 3-(2-(3-(5-cianopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila - PA mo N-w % Q -N

H o na Um frasco de fundo redondo de gargalo em flange de 5 L equi- pado com uma haste e pá do agitador a ar, termômetro, funil de gotejamento porequalização de pressão, e borbulhador de nitrogênio é carregado com 5- (5-(2-hidróxi-6-metóxi-fenil)-1H-pirazol-3-ilamino)-pirazina-2-carbonitrila (47,0 g, 152 mmols) e THF anidro (1,2 L). A suspensão agitada, sob nitrogênio, é resfriada até 0ºC. Um frasco de fundo redondo de 3 gargalos de 2 L separa- do equipado com uma barra de agitação magnética grande, termômetro, e — borbulhador de nitrogênio é carregado com trifenilfosfina (44,0 g; 168 mmois) e THF anidro (600 mL). A solução agitada, sob nitrogênio, é resfriada até

OºC e di-isopropilazodicarboxilato (34,2 g; 169 mmols) é adicionado e uma ' solução leitosa é formada. Após 3-4 min, uma solução de t-butil-N-(3- hidroxipropil)-carbamato (30,3 g, 173 mmols) em THF anidro (100 mL) é adi- cionada e a mistura é agitada por 3-4 min. Esta mistura é a seguir adiciona- dadurante5minà suspensão agitada do material de partida a 0ºC. A mistu- ra de reação se torna uma solução escura rapidamente e é deixada aquecer lentamente até a temperatura ambiente. Após 6,5 h, mais reagentes são preparados como acima usando PPh3 (8 g), DIAD (6,2 g) e carbamato (5,4 g) em THF anidro (150 mL). A mistura é adicionada a uma mistura de rea- ção,resfriada até -5ºC e deixada aquecer até a temperatura ambiente duran- te a noite. O solvente é removido in vacuo. A solução viscosa resultante é carregada sobre uma almofada de sílica e produto é eluído com acetato de etila. As frações concentradas são trituradas separadamente com metanol e os sólidos resultantes são coletados por filtração. Os sólidos combinados são triturados novamente com metanol (400 mL) e a seguir isolados por fil- E: tração e secos em vácuo a 50ºC durante a noite para dar 31,3 g do produto desejado. LC-ES/MS m/z 466,2 [M+1]+. Í Exemplo 2 Sal de dicloreto de hidrogênio 5-(5-(2-(3-Aminopropóxi)-6- metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila 28 o Ra CS

H À 2HCI NH, Um frasco de fundo redondo de gargalo em flange de 5 L equi- pado com uma haste e pá do agitador a ar, termômetro, e condensador de ar com borbulhador fixado, é carregado com 3-(2-(3-(5-cianopirazin-2-ilamino)- 1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila (30,9 g, 66,3 mmols)e acetato de etila (3 L). A suspensão amarela agitada mecanica- mente é resfriada até bem abaixo de 10ºC. A seguir cloreto de hidrogênio de

EEE ERA ANE CRS ERA SEE CASA RARAS ESA 33/42 um pequeno cilindro de gás comprimido ("lecture bottle") é borbulhado vigo- . rosamente através de um tubo de entrada de gás por 15 min com um banho de gelo ainda no lugar.

Após 5 h, a mistura é engrossada de forma perceptí- í vel em aparência.

O sólido é coletado por filtração, lavado com acetato de etila ea seguir seco in vacuo a 60ºC durante a noite para dar 30,0 9. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 2,05 (m, 2H), 2,96 (m, 2H), 3,81 (s, 3H), 4,12 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 6,08 (br s, 3H), 6,777 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,782 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,88 (br s, 1H), 7,34 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 8,09 (br s, 1H), 8,55 (br s, 1H), 8,71 (s, 1H), 10,83 (s, 1H), 12,43 (br s, 1H). LC-ES/MS m/z 366,2 [M+1]r.

Exemplo 3 5-(5-(2-(3-Aminopropóxi)-S-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pi- razina-2-carbonitrila 7N o New SS dE . H o a.

Sal de dicloreto de hidrogênio de 5-(5-(2-(3-Aminopropóxi)-6- metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila (3,0 g, 6,84 mmolis) é suspenso em 200 mL de CH2CI2. NaOH a 1 N é adicionado (200 mL, 200 mmois). A mistura é agitada de forma magnética sob nitrogênio à tempe- ratura ambiente por 5 h.

O sólido é coletado por filtração e lavado completa- mente com água.

A torta de filtro é seca in vacuo a 50ºC durante a noite pa- ra dar 2,26 g (90%) da base livre como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,81 (m, 2H), 2,73 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,82 (s, 3H), 4,09 (t, J=6,2 Hz, 2H), 6,76 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 6,93 (br s, 1H), 7,31 (t J = 8,2 Hz, 1H), 8,52 (br s, 1H), 8,67 (s, 1H). LC-MS /ES m/z 366,2 [M+1]+. Exemplo 4 Sal de ácido 5-(5-(2-(3-Aminopropóxi)-B-metoxifenil)-1H-pirazol- 3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila metanossulfônico x N Jo - o HNw CS

Q N

H É À MsOH NH, 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-6-metoxifenil)- 1H-pirazol-3-ilamino) pi- razina-2-carbonitrila (1,0 g, 2,74 mmols) é suspenso em MeOH (100 mL). Uma solução de ácido metanossulfônico a 1 M em MeOH (2,74 mL, 2,74 —mmois)é adicionada à mistura em gotas em gotas com agitação. O sólido dissolve quase completamente e é submetido a ultrassom e agitado por 15 min, filtrado, e concentrado para 50 mL. A solução é resfriada durante a noi- te a -15ºC e o sólido que forma é coletado por filtração. O sólido é seco em um forno a vácuo durante a noite para dar 0,938 g (74%) de um sólido ama- relo 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,97 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,95 (m, : 2H), 3,79 (s, 3H), 4,09 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 6,753 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,766 (d, J=8,4 Hz, 1H), 6,85 (br s, 1H), 7,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,67 (br s, 3H), 8,49 " (br s, 1H), 8,64 (s, 1H), 10,70 (s, 1H), 12,31 (s, 1H). LC-ES/MS m/z 366,2 [M+1]+. Rota D Preparação 13 1-[2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil] etanona o Ox ago 1-(2-Hidróxi-6-metoxifenil) etanona (1300 g, 7,82 mois) e dimetil- formamida (10,4 L) são adicionadas a um frasco de 22 L e agitadas para obter uma solução. O carbonato de potássio (2700 g, 19,54 mol) é adiciona- do em porções, a seguir agitado por pelo menos 30 min. Usando um funil de agitação, cloreto de 4-metoxibenzila (14700 9, 9,39 mol) é adicionado em gotas durante 2,5 h à mistura enquanto mantendo a temperatura <30ºC. À mistura de reação é aquecida até 35ºC e aquela temperatura é mantida por

12 h.

A conversão da reação é monitorada por HPLC e considerada comple- ' ta após 13 h a 35ºC.

A pasta fluida é filtrada e os sólidos resultantes lavados com dimetilformamida (1 L). O trabalho de extração do filtrado com acetato ' de etila e água, seguido de concentração, forneceu um sólido amarelo cero- so Ao sólido amarelo ceroso é adicionado metil t-butil éter (2,6 L). A pasta fluida resultante é agitada.

A pasta fluida livre que escoa neste momento é filtrada e lavada com metil t-butil éter (1 L). O sólido branco é seco a vácuo rendendo 1539 gramas (69%) do composto do título.

Pf 105 — 107ºC.

Preparação 14 1-(2-Metóxi-S-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-3,3-bis(metiltio) prop-2- en-1-ona XY SMe fe) o | 3 A uma mistura de terc-butóxido de lítio (602,4 g, 7,52 mols) em DMSO anidro (11,0 L) sob uma atmosfera de nitrogênio é adicionada 1-(2- metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil) etanona (1000,0 g, 3,49 mois). A mistura resultante é agitada por 30 min e CS2 (259 mL, 4,296 mois) é adicionado lentamente durante 1 a 1,5 h enquanto mantendo a temperatura interna a- baixo de 30ºC.

Após agitar por pelo menos uma hora à temperatura ambien- te, iodometano (1000 g, 7,045 mois) é adicionado lentamente enquanto man- tendo a temperatura interna abaixo de 30ºC.

A mistura resultante é agitada à temperatura ambiente por 30 min até uma hora.

A conclusão da reação é confirmada por HPLC.

A mistura de reação resultante é resfriada, seguida por trabalho de extração com água e acetato de etila.

A porção orgânica re- sultante é concentrada para fornecer uma pasta fluida que é filtrada e lavada com acetato de etila (1 L), seguido por metil t-butil éter (2 x 1 L). O sólido isolado é seco a 40ºC em um forno a vácuo para fornecer 1057 g (77%) do

TERRA AAA EAN AAA MARCAR SACA, 36/42 composto do título. Pf 93 — 94º C; ES/MS m/z 391.2 [M+1]+. ' Preparação 15 (E)-5-(3-(2-Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi)fenil)-1-(metiltio)-3- oxoprop-1-enilamino) pirazina-2-carbonitrila

NA o eo OA se o O, A um frasco seco inerte de 22 L são adicionados hidreto de só- dio (159.2 g, 3.98 mol) e tetra-hidrofurano (10,4 L). A mistura é resfriada até 5 — 15ºC. 5-Isocianopirazin-2-amina (382,2 g, 3,18 mois) é adicionada em quatro porções durante 30 min para controlar a liberação de hidrogênio, permitindo reduzir a espumação entre as adições e mantendo a temperatura ] 10 a10ºC. A mistura é agitada por 15 — 90 min enquanto deixando a tempe- ratura aumentar até 15ºC. Uma mistura de reação é carregada com 1-(2- f metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi) fenil)-3,3-bis(metiltio) prop-2-en-1-ona (1036 9, 2,65 mol) em porções para controlar a espumação. A pasta fluida resultante é agitada por 15 min. A mistura é aquecida até um refluxo suave a 66ºC. A conversão da reação é monitorada por HPLC. A mistura de reação é resfria- da bruscamente em água resfriada (14.2 L) seguida por trabalho de extração com acetato de etila. A porção orgânica é concentrada para formar uma pas- ta fluida que é filtrada para fornecer 957 g (78%) do composto do título. Pf 128 — 135ºC; ES/MS m/z 463,2 [M+1]+. Preparação 16 5-(5-(2-Metóxi-B-(4-metoxibenzilóxi)fenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila

; H a : N-N Â À

L H o a Em um recipiente de 20 L são combinados com etanol (11,28 L) e ácido acético (318 mL, 5,545 mols). A reação é ventilada para um depura- dor de gás alvejante com uma purga de nitrogênio. (E)-5-(3-(2-Metóxi-6-(4- metoxibenzilóxi)fenil)-1-(metiltio)-3-oxoprop-1-enilamino)pirazina-2-carbo- —nitrila(940g,1,931 mol) e a solução de etanol/ácido acético são adicionadas a um frasco de reação de 22 L. À pasta fluida marrom resultante é adiciona- do mono-hidrato de hidrazina (197 g, 3,935 mol), resultando em um exoter- ma suave. A pasta fluida amarela resultante é levemente aquecida até 65 — 70ºC e monitorada por HPLC. A duração da reação é menos do que uma É 10 hora. A pasta fluida espessa é resfriada lentamente durante 1 — 2 h para - menos do que 30ºC. a pasta fluida é filtrada e lavada com etanol frio. O ma- terial é seco a vácuo a 40ºC rendendo (820 g, 99,1%) do composto do título. Pf 215 — 117ºC; ES/MS m/z 429,2 [M+1]+. Preparação 17 Sal de dicloreto de hidrogênio de 5-(5-(2-Hidróxi-6-metoxifenil)- 1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila N N Po o RN Â

EF

H º* Ha Todas as operações abaixo são ventiladas para um sistema de depurador de gás cáustico para controlar a gaseificação de HCl. 5-(5-(2- Metóxi-6-(4-metoxibenzilóxi)fenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila (1,24 kg,2,89mols)e HCl a 4 Nem dioxano (26,06 kg, 99,28 mois) são car- regados em um reator de vidro de 60 L. A pasta fluida é lentamente aqueci-

da até 60 — 70ºC. A reação é monitorada por HPLC. Após 9 h, a reação é ' determinada estar completa. A pasta fluida marrom é resfriada até 20ºC e mantida durante a noite. A mistura de reação ácida é filtrada e a torta é lava- | da com acetato de etila (7 L). a torta úmida é seca a vácuo até um peso constante para fornecer (1010 g, 91,84% do rendimento corrigido) do com- posto do título. Pf 225 — 228ºC (base livre); ES/MS m/z 309,2 [M+1]+. Preparação 18 3-(2-(3-(S-cianopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila x N Jo 9 Nm É Y CM -€

H o ee - 10 5-(5-(2-Hidróxi-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2- carbonitrila (618 g, 1,62 mol) é fluidizada em tetra-hidrofurano (6,18 L, 10 volumes) e resfriada até -5 a 0ºC com uma acetona/banho de gelo. Trietila- mina (330 g, 3,25 mois) é adicionada através de um funil de adição durante 30 — 40 min a -5 a 5ºC. A pasta fluida resultante é agitada a -5 a 5ºC por 60 —9O0min. O cloridrato de trietilamina insolúvel é filtrado e a solução de feno! ((5-(2-hidróxi-B-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrita) co- letada em um vaso de reação apropriado. A torta é enxaguada com THF (1,24 L). A solução de THF do fenol é mantida em 15 a 20ºC até ser neces- sário.

Trifenitfosfina (1074 g, 4,05 mois) é dissolvida à temperatura ambiente em THF (4,33 L). A solução incolor clara é resfriada com um banho de acetona/gelo até -5 a 5ºC. Di-isopropilazodicarboxilato (795 g, 3,89 mois) é adicionado em gotas através de um funil de adição durante 40 — 60 min, mantendo a temperatura abaixo de 10ºC. A pasta fluida branca espessa re- —sultante é resfriada novamente até -5 a 0ºC. 3-Hidroxipropilcarbamato de terc-butila (7179, 4,05 mois) é dissolvido em um mínimo de THF (800 mL). À atra SENNA escalas RENARESRNSANAANAAALENAANE AAA oa AESA. 39/42 solução de 3-hidroxipropilcarbamato de terc-butila / THF é adicionada, atra- Á vês de um funil de adição, durante 20 — 30 min em -5 a 5ºC à pasta fluida do reagente. O reagente preparado é agitado no banho de gelo a -5 a 0ºC até i estar pronto para o uso.

A pasta fluida do reagente preparada (20%) é adicionada à solu- ção do substrato em 15 a 20ºC. O reagente restante é retornado para o ba- nho de gelo. A solução do substrato é agitada à temperatura ambiente por 30 min, a seguir amostrados para HPLC. Uma segunda porção de aproxi- * madamente 20% do reagente é adicionada ao substrato, agitada à tempera- tura ambiente e amostrada como antes. A adição do reagente é continuada com o monitoramento quanto à conclusão da reação por HPLC. A reação concluída é concentrada e triturada com metanol quente (4,33 L, 50 — 60ºC) seguido pelo resfriamento em um banho de gelo. O precipitado amarelo re- sultante é filtrado, enxaguado com MeOH frio (2 L), e seco até o peso cons- tante para fornecer 544 g (72%) do composto do título. Pf 214 — 216ºC; : ES/MS m/z 466,2 [M+1]+. Exemplo 5 : Mornoidrato de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)- G-metoxifenil]-1H-pirazol-3-iljamino] monomesilato (nomenclatura Chemical Abstracts) Y no fá O NN ÍÂ á

H

P Q y * Me-S-OH o NH, HO 3-(2-(3-(5-cianopirazin-2-ilamino)-1H-pirazol-5-il)-3-metoxifenóxi) propilcarbamato de terc-butila (1430 g, 3,07 mol) é fluidizado com acetona (21,5 L) em um reator de 30 L. Ácido metanossulfônico (1484 g, 15,36 mois) é adicionado através de um funil de adição em um fluxo moderado. A pasta fluida é aquecida até o refluxo em cerca de 52ºC por 1a 3 he monitorada quanto à conclusão da reação pela análise de HPLC. A reação concluída é

FE EEE ERES ESCASSAS ERRADAS 40/42 resfriada do refluxo até 15 a 20ºC durante 4,5 h.

A pasta fluida amarela de . sal de dimesilato de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)-6- metoxifenil]-1H-pirazol-3-ilJamino] é filtrado, enxaguado com acetona (7 L) e | seco em um forno a vácuo.

O sal de dimesilato, (1608 9, 2,88 mol) é fluidizado em água (16 L). Hidróxido de sódio (aquoso a 50%, 228 g, 2,85 mols) é derramado lenta- mente na pasta fluida.

A pasta fluida é aquecida até 60ºC e agitada por uma hora.

Ela é a seguir resfriada até 16ºC durante 4 h e filtrada.

A torta de filtro úmida é enxaguada com acetona (4 L) e seca até o peso constante em um forno a vácuo a 40ºC para fornecer 833 g (94%) de monoidrato de 2- pirazinacarbonitrila, — 5-[15-[-[2-(3-aminopropoxi)-6-metoxifenil]-1H-pirazol-3- illamino] monomesilato.

Pf 222,6ºC; ES/MS m/z 366,2 [M+1]+. Exemplo 5a Monoidrato de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)- G6-metoxifenil]l-1H-pirazol-3-iljamino] monomesilato : (nomenclatura de Chemical Abstracts) Monoidrato de 2-pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)- ' 6-metoxifenil]-1H-pirazol-3-ilJamino] monomesilato bruto é purificado usando o procedimento a seguir" O grau técnico do monoidrato de 2- pirazinacarbonitrila, 5-[[5-[-[2-(3-aminopropoxi)-B-metoxifenil]-1H-pirazol-3- ilamino] monomesilato (1221 g, 2,55 mol) é fluidizado em uma mistura de solvente de 1:1 acetona/água (14,7 L). O sólido é dissolvido aquecendo a mistura até 50 — 55ºC.

A solução é filtrado refinado enquanto a 50 — 55ºC através de um filtro de cartucho de 0,220. A solução é resfriada lentamente atéatemperatura de semeadura de cerca de 42 — 45ºC e semeada.

O res- friamento lento é continuado durante os 30 — 60 min seguintes para confir- mar a nucleação.

A pasta fluida fina é resfriada de 38 a 15ºC durante 3 h.

Uma destilação a vácuo é ajustada e a acetona removida a 110 — 90 mm e 20 — 30ºC.

A mistura é resfriada de 30 a 15ºC durante 14 h, mantida a 15ºC por2h, ea seguir filtrada.

O material recristalizado é enxaguado com á- gua/acetona (2 L) a 19:1 e a seguir água (6 L) e seca até o peso constante em um forno a vácuo a 40ºC para fornecer 1024 g (83,9%) do composto do

ERASMO CENAS, 41/42 título.

Pf 222,6ºC; ES/MS m/z 366,2 [M+1]+. : Os padrões de difração em pó de raios X (XRPD) podem ser ob- tidos em um difratômetro de pó Bruker D8 Advance, equipado com uma fon- te de CuKa (2=1,54056 angstrom) operando a 40 kV e 40 mA com um dete- tor sensível à posição.

Cada amostra é escaneada entre 4º e 35º em º20 t 0,02 usando uma dimensão de etapa de 0,026º em 20 + 0,02 e um tempo de etapa de 0,3 segundo, com uma fenda de divergência de 0,6 mm e uma fen- da do detetor de 10,39 mm.

Fendas primárias e secundárias Soller estão cada uma a 2º; a fenda de antidifusão é de 6,17 mm; a pia de dispersão de arestáno lugar.

Posições de pico características e intensidades relativas:

: oa] 6 o | astro [os | a so | Los da HO o6 oe 26 | amo 29,24 As análises de calorimetria de difusão diferencial (DSC) podem ser realizadas em uma unidade Mettler-Toledo DSC (Modelo DSC822e). As Amostras são aquecidas em cadinhos de alumínio fechados com orifício de 25a350ºC a 10ºC/min com uma purga de nitrogênio de 50 mL/min.

A análi- se termogravimétrica (TGA) pode ser realizada em uma unidade Mettler To- ledo TGA (Modelo TGA/SDTA 851e). Amostras são aquecidas em cadinhos de alumínio selados com um orifício de 25 a 350ºC a 10ºC /min com uma purga de nitrogênio de 50 mL/min. 7 O perfil térmico de DSC mostra um exoterma fraco amplo de 80 — 140ºC seguido por um endoterma de fusão aguda a 222ºC, início (225ºC, pico). Uma perda de massa de 4% é vista pelo TGA de 25 — 140ºC.

Claims (14)

1. AREA SERENA AESA SCORE EA ACE RAA —— 12

   REIVINDICAÇÕES . 1. Composto, caracterizado pelo fato de que é 5-(5-(2-(3- aminopropóxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou í um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato do sal.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ilamino) pirazina-2-carbonitrila, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3- ilamino) pirazina-2-carbonitrila.
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal de ácido 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-S6-metoxifenil)- 1H- pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila fórmico ou sal de dicloreto de hidro- gênio de 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-6-metoxifenil)-1H-pirazol-3-ilamino) pirazi- E na-2-carbonitrila.
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ' pelo fato de que é sal de ácido 5-(5-(2-(3-aminopropóxi)-S-metoxifenil)-1H- pirazol-3-ilamino) pirazina-2-carbonitrila metanossulfônico.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula: “o a " N-N

   QE N

   H ? Q y * Me-S-OH o NH, “HO
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na forma cristalina apresenta um padrão de difração de pó de raios X tendo picos a 26 + 0.02 = 12.64, 21.25, e 26.15.
8. 8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto ou sal, como definido em qualquer uma das reivin-

   dicações 1 a 7, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente far- " maceuticamente aceitável.
9. 9. Uso de composto, como definido em qualquer uma das reivin- i dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica utilizável no tratamento de câncer.
10. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer da be- xiga, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer mamário, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, mesoteli- oma, câncer renal, e câncer uterino.
11. 11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer.
12. 12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica útil para o tratamento de câncer. .
13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte- - rizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em õ câncer da bexiga, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer mamário, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreáti- co,mesotelioma, câncer renal, e câncer uterino.
14. 14. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretiza- ções ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.