KR20110070920A

KR20110070920A - 사치환된 피리다진 헷지호그 경로 길항제

Info

Publication number: KR20110070920A
Application number: KR1020117011148A
Authority: KR
Inventors: 졸리 앤 바스티안; 줄리아 마리 클레이; 제프리 다니엘 코헨; 필립 아써 힙스킨드; 캐런 린 로브; 다니엘 존 살; 윌슨 (니 타카쿠와), 타카코; 미셸 리 톰슨
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-05
Publication date: 2011-06-24
Also published as: MX2011005177A; EP2358698A1; CY1113377T1; US20110263602A1; WO2010056588A1; US8507490B2; CA2743483C; JP2012509263A; JP5518887B2; KR101342184B1; PL2358698T3; SI2358698T1; ES2392759T3; PT2358698E; EA201170699A1; AU2009314349A1; BRPI0921782A2; AU2009314349B2; CN102216285A; DK2358698T3

Abstract

본 발명은 암 치료에 유용한 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 따른 신규 사치환된 피리딘 헷지호그 경로 길항제를 제공한다:
<화학식 I>

상기 식에서, X는 C-R¹ 또는 N이고; R¹은 수소, 플루오로 또는 시아노이고; R²는 화학식 II

, 피페리디닐 또는 같은자리 디-F-치환된 시클로헥실이고; R³은 메틸 또는 트리플루오로메틸이고; R⁴는 피롤리디닐, 모르폴리닐 또는 피리딜, 아미노 또는 디메틸아미노이고; R⁵는 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고; R⁶은 수소 또는 메틸이고; R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 플루오로, 시아노, 클로로, 메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시 또는 메틸술포닐이되, 단 R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹ 중 적어도 2개가 수소이다.

Description

사치환된 피리다진 헷지호그 경로 길항제 {TETRASUBSTITUTED PYRIDAZINE HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONISTS}

본 발명은 헷지호그(Hedgehog) 경로 길항제, 보다 구체적으로 신규 사치환된 피리다진 및 그의 치료 용도에 관한 것이다. 헷지호그 (Hh) 신호전달 경로는 세포 분화 및 증식을 지시함으로써 배아 패턴 형성 및 성체 조직 유지에서 중요한 역할을 수행한다. 소닉 헷지호그 (Shh), 인디안 헷지호그 (Ihh) 및 데저트 헷지호그 (Dhh)를 포함하는 헷지호그 (Hh) 단백질 패밀리는 번역 후 변형, 예를 들어 자가촉매적 절단 및 콜레스테롤의 아미노-말단 펩티드로의 커플링을 수행하여 신호전달 활성을 보유하는 단편을 형성하는 분비성 당단백질이다. Hh는 12회-통과 막횡단 단백질 Ptch (Ptch1 및 Ptch2)에 결합하고, 이로써 스무슨드(Smoothened)(Smo)의 Ptch-매개 억제를 완화시킨다. Smo 활성화는 세포 증식, 세포 생존, 혈관신생 및 침입에 책임이 있는 Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2 및 Gli3)의 안정화 및 Gli-의존성 유전자의 발현을 초래하는 일련의 세포내 사건을 일으킨다.

Hh 신호전달은, Shh 신호전달의 비정상적 활성화가 다양한 종양, 예를 들어 췌장암, 수모세포종, 기저 세포 암종, 소세포 폐암 및 전립선암의 형성을 야기한다는 발견에 근거하여, 최근에 상당한 관심을 불러일으켜 왔다. 스테로이드성 알카로이드 화합물 IP-609; 아미노프롤린 화합물 CUR61414; 및 2,4-이치환된 티아졸 화합물 JK18과 같은 여러 Hh 길항제가 당업계에 보고된 바 있다. WO2005033288은 헷지호그 길항제인 것으로 주장되는 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다. 유사하게, WO2008110611은 헷지호그 경로와 관련된 병리상태의 진단 및 치료와 관련된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다.

강력한 헷지호그 경로 억제제, 특히 바람직한 약력학, 약동학 및 독성학 프로파일을 갖는 강력한 헷지호그 경로 억제제에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 이 경로의 강력한 길항제인 신규 사치환된 피리다진을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:

<화학식 I>

상기 식에서,

X는 C-R¹ 또는 N이고;

R¹은 수소, 플루오로 또는 시아노이고;

R²는

, 피페리디닐 또는 같은자리 디-플루오로-치환된 시클로헥실이고;

R³은 메틸 또는 트리플루오로메틸이고;

R⁴는 피롤리디닐, 모르폴리닐 또는 피리딜, 아미노 또는 디메틸아미노이고;

R⁵는 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고;

R⁶은 수소 또는 메틸이고;

R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 플루오로, 시아노, 클로로, 메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시 또는 메틸술포닐이되, 단 R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹ 중 적어도 2개가 수소이다.

당업자라면, 본 발명의 화합물이 3급 아민 잔기를 포함하고, 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 제약상 허용되는 산 부가염 및 이들을 제조하기 위한 통상의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al ., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; [S.M. Berge, et al ., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, number 1, January 1977]을 참조한다.

본 발명의 구체적 실시양태는

(a)X가 C-R¹이고;

(b) R¹이 플루오로이고;

(c) R¹이 시아노이고;

(d) R²가

이고;

(e) R²가

이고;

(f) R²가

이고;

(f) R²가

이고;

(g) R²가

이고;

(h) R¹이 플루오로이고, R²가

이고;

(i) R¹이 시아노이고, R²가

인

화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 조합으로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로로 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 경구 또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 이의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al ., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.

본 발명은 또한 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.

실제로 투여되는 화합물의 양은 치료할 상태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 비롯한 관련된 상황 하에서 의사에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 일일 투여량은 통상적으로 체중의 약 0.1 내지 약 5 mg/kg의 범위 내에 해당된다. 일부 경우에는 상기 언급한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 훨씬 더 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 용량이 사용될 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

추가로, 본 발명은 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 특히, 이들 암은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

게다가, 본 발명은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 위한 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 당업계에 공지된 다양한 절차 뿐만 아니라, 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 기재된 것에 따라 제조될 수 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되거나 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 당업자에게 일반적으로 쉽게 이용가능하다. 다른 것은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기술, 및 임의의 신규 절차를 비롯한 하기의 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 따라 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 하기에 나타낸 의미를 갖는다: "boc" 또는 "t-boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "BOP"는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "DMA"는 N,N-디메틸아세트아미드를 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 메틸술폭시드를 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "Et₂O"는 디에틸 에테르를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "iPrOH"는 이소프로판올을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "SCX"는 강 양이온 교환을 지칭하고; "PyBOP"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대하여 가능한 최대 억제 반응의 50％를 생성하는 작용제의 농도를 지칭한다.

반응식 1

화학식 I의 화합물은 반응식 1에 도시된 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다.

반응식 1, 단계 1에서, 3,6-디클로로-4,5-디메틸피리다진 (1)을 친핵성 방향족 치환 반응 (SNAr)에서 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMF, DMA 또는 DMSO 중에서 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민 및/또는 디이소프로필에틸아민 및/또는 무기 염기, 예컨대 탄산칼륨의 존재 하에 100-140℃로 가열하면서 tert-부틸 메틸(피페리딘-4-일)카르바메이트 (2)로 대체하여 tert-부틸 1-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (3)을 제공한다. 단계 2에서, 디메틸피리다진 상에 남아있는 클로라이드를 스즈끼-미야우라 교차 커플링 반응에서 아릴 보론산 (4)와 반응시켜 상응하는 4,5-디메틸-6-치환된 아릴피리다진-3-치환된 피페리딘 (5)를 제공할 수 있다. 당업자는 이러한 교차-커플링 반응을 용이하게 하기 위해 유용한 다양한 조건이 존재함을 인지할 것이다. 반응 조건은 염기, 예컨대 탄산세슘 또는 불화세슘 및 팔라듐 촉매, 예컨대 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 또는 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-ĸP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112]에 따라 제조됨)의 존재 하에 불활성 분위기 하에 약 80-160℃의 온도에서 적합한 용매, 예컨대 디옥산 또는 디옥산/물을 사용하여 화학식 5의 화합물을 제공하는 것으로 이루어진다. 아민은 표준 탈보호 방법에 의해 탈보호될 수 있다. 질소 보호기의 도입 및 제거 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)] 참조). 예를 들어, 화학식 5의 아민의 boc 탈보호는 산성 조건, 예컨대 염화수소 또는 트리플루오로아세트산 하에서 달성되어 화학식 6의 화합물을 제공할 수 있다. 단계 4에서 아민의 아실화는 불활성 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 치환된 산 클로라이드 (7)을 사용하여 달성될 수 있거나, 또는 별법으로, 화학식 6의 화합물을 치환된 카르복실산 및 적절한 커플링 시약, 예컨대 PyBOP, 펜타플루오로페닐 디페닐포스피네이트 (BOP) 또는 EDCI 및 적절한 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민을 사용하여 적합한 용매, 예컨대 DMF 및/또는 DMSO, 또는 디클로로메탄 중에서 아실화시켜 중성 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 Et₂O 중 HCl을 첨가함으로써 염, 예컨대 HCl 염으로 전환될 수 있거나, 또는 HCl은 아세틸 클로라이드를 알콜 용매, 예컨대 메탄올의 용액에 0-20℃에서 계내 적가함으로써 생성될 수 있다.

<반응식 2>

목적하는 카르복실산 (7) (Y = OH, 반응식 1, 단계 4)은 반응식 2에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다. 티아졸 (8)의 2-위치에 있는 1급 아민을 단계 1에 나타낸 바와 같이 적합한 용매, 예컨대 아세토니트릴 중에서 염화구리 및 이소펜틸 니트리트를 사용하는 샌드마이어(Sandmeyer) 반응에서 클로라이드로 대체하여 2-클로로-4,5-치환된 티아졸 (9)를 제공한다. 이어서, 클로라이드를 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 단계 2에서 목적하는 아민 (10)으로 대체하여 상응하는 아미노 티아졸 (11)을 제공한다. 단계 3에서 에스테르를 적합한 용매, 예컨대 MeOH 또는 디옥산 중에서 적합한 염기, 예컨대 수성 수산화나트륨 또는 수성 수산화리튬을 사용하여 가수분해시켜 목적하는 카르복실산 (12)를 제공한다.

<반응식 3>

반응식 3에 나타낸 바와 같이, 목적하는 카르복실산 (7) (Y = OH, 반응식 1, 단계 4)을 제조하는 추가의 실시예에서, 피라졸 (13)을 용매, 예컨대 아세톤 중에서 무기 염기, 예컨대 탄산칼륨을 사용하여 단계 1에서 나타낸 바와 같이 적합한 보호기, 예컨대 4-메톡시벤질로 보호하여 보호된 피라졸 (14)을 제공한다. 이어서, 에스테르를 단계 3에 나타낸 바와 같이 적합한 염기로 가수분해하여 화학식 15의 화합물을 제공한다. 반응식 1, 단계 4에서의 아실화 이후에, 피라졸의 탈보호는 산성 조건, 예컨대 TFA 하에서 완료되어 화학식 1의 화합물을 제공할 수 있다.

반응식 4는 카르복실산 (7) (Y = OH, 반응식 1, 단계 4)의 제조를 위한 추가의 실시예를 나타낸다.

<반응식 4>

이소펜틸 니트리트를 단계 1에 나타낸 바와 같이 불활성 용매, 예컨대 클로로포름 중 아미노 피라졸 (16) 및 디메틸 디술피드의 용액에 적가하여 1급 아민을 티오메틸기로 전환시켜 에틸 1-메틸-5-(메틸티오)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (17)을 제공할 수 있다. 화합물 (17)의 티오메틸기를 적합한 용매, 예컨대 아세트산 중에서 산화제, 예컨대 과산화수소를 사용하여 메틸술폰으로 산화시켜 화학식 18의 화합물을 제공할 수 있다 (단계 2). 이전에 기재된 바와 같은 에스테르의 가수분해는 단계 3에서 나타낸 바와 같은 적절한 카르복실산인 화합물 (7)을 제공한다.

하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하고, 화학식 I의 화합물의 전형적인 합성을 나타내기 위해 제공된다. 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 켐드로우 울트라® 10.0에 의해 제공된다.

제조예 1

tert-부틸 1-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

DMSO (310 mL) 중 3,6-디클로로-4,5-디메틸피리다진 (11.0 g, 62.1 mmol), tert-부틸 메틸(피페리딘-4-일)카르바메이트 (23.3 g, 109 mmol) 및 분말화 K₂CO₃ (17.2 g, 124 mmol)의 혼합물을 120℃에서 2 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, H₂O로 희석하고, 고체를 여과하였다. 고체를 H₂O로 세정하고, 진공 하에 45℃에서 건조시켰다. 고체를 CH₂Cl₂ 중에 용해시키고, 용액을 실리카 겔 패드를 통해 통과시키면서 CH₂Cl₂로 용리하였다. 유기 층을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (14.3 g, 65％).

제조예 2

tert-부틸 1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

1,4-디옥산 (30 mL) 및 H₂O (10 mL)의 혼합물 중 tert-부틸 1-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (1.5 g, 4.23 mmol), 4-플루오로페닐보론산 (887 mg, 6.34 mmol), Cs₂CO₃ (5.51 g, 16.9 mmol) 및 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (문헌 [J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112]) (29 mg, 0.042 mmol)의 혼합물을 N₂ 하에 90℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 H₂O 및 CH₂Cl₂ 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→2％ 2 M NH₃/MeOH의 구배) 표제 화합물을 백색 발포체로서 수득하였다 (1.05 g, 60％).

별법의 절차:

1,4-디옥산 (80 mL) 중 tert-부틸 1-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (3.01 g, 8.48 mmol), 4-플루오로페닐보론산 (1.23 g, 8.80 mmol) 및 CsF (4.08 g, 26.8 mmol)의 N₂ 탈기된 혼합물을 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 (1.10 g, 1.35 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 N₂ 하에 95℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 H₂O 및 EtOAc 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 20→80％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (3.05 g, 87％).

제조예 3

tert-부틸 1-(6-(4-시아노페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

1,4-디옥산 (30 mL) 및 H₂O (10 mL)의 혼합물 중 tert-부틸 1-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (1.5 g, 4.23 mmol), 4-시아노페닐보론산 (932 mg, 6.34 mmol), Cs₂CO₃ (5.51 g, 16.9 mmol) 및 (SP-4-1)-비스[비스(1,1-디메틸에틸)(4-메톡시페닐)포스핀-κP]디클로로-팔라듐 (29 mg, 0.042 mmol)의 혼합물을 N₂ 하에 90℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc, 및 용해된 NaHCO₃을 갖는 H₂O 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→2％ 2 M NH₃/MeOH의 구배) 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (1.68 g, 94％).

본질적으로 제조예 3에 기재된 절차에 따라, 적절하게 치환된 아릴 보론산을 사용하여 하기 표의 치환된 페닐피리다진을 제조하였다. 제조예 5의 경우, 조 반응 혼합물을 CH₂Cl₂ 중 5％ M NH₃/MeOH로 용리하면서 실리카 겔 패드 상에서 직접 여과하였다. 용리액을 농축시키고, 수성 후처리 없이 정제하였다.

제조예 6

1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-N-메틸피페리딘-4-아민

1,4-디옥산 (10 mL) 중 tert-부틸 1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (1.04 g, 2.51 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 중 4 M HCl (15.0 mL)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH 중에 용해시키고, SCX 칼럼 (배리안, 10 g) 상에 부었다. 칼럼을 MeOH 및 CH₂Cl₂로 세정하고, 생성물을 CH₂Cl₂ 및 2 M NH₃/MeOH의 1:1 혼합물로 용리하였다. 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다 (784 mg, 99％).

제조예 7

4-(4,5-디메틸-6-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)피리다진-3-일)벤조니트릴

1,4-디옥산 (20 mL) 중 tert-부틸 1-(6-(4-시아노페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (1.68 g, 3.99 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 중 4 M HCl (20 mL)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH 중에 용해시키고, SCX 칼럼 (배리안, 20 g) 상에 부었다. 칼럼을 MeOH 및 CH₂Cl₂로 세정하고, 생성물을 CH₂Cl₂ 및 2 M NH₃/MeOH의 1:1 혼합물로 용리하였다. 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (1.28 g, 정량).

본질적으로 제조예 7에 기재된 절차에 따라, 적절한 boc-보호된 피페리딘을 사용하여 하기 표의 보호된 N-메틸아미노피페리딘을 제조하였다.

제조예 9

1-(4,5-디메틸-6-(피리딘-4-일)피리다진-3-일)-N-메틸피페리딘-4-아민

CH₂Cl₂ (20 mL) 및 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 tert-부틸-1-(4,5-디메틸-6-(피리딘-4-일)피리다진-3-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (1.19 g, 2.99 mmol)에 첨가하였다. 주위 온도에서 3 일 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 잔류물을 얻었다. 잔류물을 CH₂Cl₂ 및 1 N NaOH 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH₂Cl₂로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다 (790 mg, 89％).

제조예 10

에틸 2-클로로-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실레이트

아세토니트릴 (10 mL) 중 CuCl₂ (671 mg, 4.99 mmol) 및 이소펜틸 니트리트 (732 mg, 6.24 mmol)의 0℃ 혼합물을 에틸 2-아미노-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실레이트 (1.0 g, 4.16 mmol)로 서서히 처리하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 1 시간 동안 50℃로 가열하였다. 대부분의 용매를 제거하고, 얼음 및 진한 HCl의 혼합물에 부었다. CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (20:1 헥산: EtOAc) 표제 화합물을 수득하였다 (762 mg, 71％).

제조예 11

에틸 2-모르폴리노-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실레이트

에틸 2-클로로-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실레이트 (4.00 g, 15.4 mmol)를 DMSO (10 mL) 중 모르폴린 (4.03 g, 46.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. CH₂Cl₂를 첨가하고, 혼합물을 H₂O로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (20:5:1 헥산:EtOAc:2 M NH₃/MeOH) 표제 화합물을 수득하였다 (4.58 g, 96％).

본질적으로 제조예 11에 기재된 바와 같은 절차에 따라, 적절한 아민을 사용하여 하기 표의 아미노 티아졸 에스테르를 제조하였다.

제조예 15

2-모르폴리노-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실산

에틸 2-모르폴리노-4-(트리플루오로메틸)티아졸-5-카르복실레이트 (4.58 g, 14.8 mmol)를 MeOH (20 mL) 중 1 N NaOH (20 mL)의 혼합물에 첨가하고, 반응물을 1 시간 동안 50℃로 가열하였다. 반응물을 감압 하에 농축시키고, H₂O를 잔류물에 첨가하였다. 혼합물을 pH 4로 산성화시키고, 고체를 여과하였다. 고체를 H₂O로 세척하고, 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (4.13 g, 99％).

본질적으로 제조예 15에 기재된 바와 같은 절차에 따라, 적절한 에스테르를 사용하여 하기 표의 아미노 티아졸 산을 제조하였다.

제조예 19

(S)-tert-부틸 2-((1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)(메틸)카르바모일)피페리딘-1-카르복실레이트

CH₂Cl₂ (3.2 mL) 중 1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-N-메틸피페리딘-4-아민 (100 mg, 0.318 mmol)의 용액을 (S)-1-(tert-부톡시카르보닐)피페리딘-2-카르복실산 (109 mg, 0.477 mmol), 트리에틸아민 (0.067 mL, 0.477 mmol) 및 EDCI (92 mg, 0.477 mmol)로　순차적으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 2 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO₃을 함유한 H₂O 내에 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH₂Cl₂ 중 0→2％ 2 M NH₃/MeOH의 구배) 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (82 mg, 49％).

제조예 20

에틸 1-(4-메톡시벤질)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실레이트

K₂CO₃ (503 mg, 3.60 mmol)을 아세톤 (8 mL) 중 에틸 3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (500 mg, 2.40 mmol)의 용액에 주위 온도에서 N₂ 하에 첨가하였다. 1-브로모메틸-4-메톡시벤젠 (0.51 mL, 3.6 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 밤새 N₂ 하에 교반하였다. 반응물을 H₂O로 켄칭하고, EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 0→15％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (789 mg, 정량).

제조예 21

1-(4-메톡시벤질)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실산

H₂O (3 mL) 중 LiOH (122 mg, 5.03 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 (10 mL) 중 에틸 1-(4-메톡시벤질)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (550 mg, 1.68 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 1 N HCl을 사용하여 pH 5로 산성화시키고, CH₂Cl₂로 및 CHCl₃ 중 20％ iPrOH로 2× 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 140 mg을 백색 고체로서 수득하였다. 수성 층을 1 N HCl을 사용하여 pH 2-3으로 산성화시키고, CHCl₃ 중 20％ iPrOH로 2회 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 용액을 처음에 얻어진 백색 고체 140 mg에 첨가하였다. 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (426 mg, 85％).

제조예 22

N-(1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-1-(4-메톡시벤질)-N-메틸-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복스아미드

PyBOP (343 mg, 0.65 mmol) 및 트리에틸아민 (0.21 mL, 1.50 mmol)을 무수 DMF (2.5 mL) 중 1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-N-메틸피페리딘-4-아민 (157 mg, 0.50 mmol) 및 1-(4-메톡시벤질)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실산 (165 mg, 0.55 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 N₂ 하에 밤새 교반하였다. 농축시키고, MeOH를 첨가하고, 고체를 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 MeOH로 희석시키고, SCX 칼럼 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 10 g) 상에 부었다. MeOH로 세척한 다음, 생성물을 2 M NH₃/MeOH로 용리하였다. 농축시키고, 헥산 중 0→10％ (EtOAc 중 10％ 2 M NH₃/MeOH)의 구배를 사용하는 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (170 mg, 43％).

제조예 23

에틸 1-메틸-5-(메틸티오)-1H-피라졸-4-카르복실레이트

온도계 및 응축기가 장착된 3-구 플라스크 내에서 이소펜틸 니트리트 (0.5 mL, 3.75 mmol)를 CHCl₃ 중 에틸 1-메틸-5-아미노-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (1.69 g, 10.0 mmol) 및 디메틸 디술피드 (1.79 mL, 20.0 mmol)의 교반된 5℃ 용액에 질소 하에 첨가하였다. 반응물을 H₂O 조에서 20℃로 가온되도록 하고, 추가의 이소펜틸 니트리트 (1.5 mL, 11.3 mmol)로 적하 처리하였다. 15 분 후에, 반응물을 20℃ H₂O 조로부터 제거하였다 (발열은 대략 1 분에 걸쳐 온도를 50℃로 상승시킴). 주위 온도에서 N₂ 하에 밤새 교반하였다. H₂O로 세척하고, 층을 분리하였다. 수성 층을 CHCl₃으로 추출하고, 유기 층을 합하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 0→35％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (1.94 g, 97％).

제조예 24

에틸 1-메틸-5-(메틸술포닐)-1H-피라졸-4-카르복실레이트

에틸 1-메틸-5-(메틸티오)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (1.68 g, 8.39 mmol), 빙초산 (11 mL) 및 과산화수소 (5.10 mL, 50.3 mmol)를 합하고, 생성된 혼합물을 100℃에서 1.5 시간 동안 가열하였다. 반응물을 주위 온도로 냉각되도록 하고, 밤새 교반하였다. 얼음을 첨가하고, CH₂Cl₂로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 0→50％ EtOAc의 구배) 표제 화합물을 수득하였다 (1.95 g, 100％).

제조예 25

1-메틸-5-(메틸술포닐)-1H-피라졸-4-카르복실산

H₂O (1 mL) 중 LiOH (22 mg, 0.90 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 (3 mL) 중 에틸 1-메틸-5-(메틸술포닐)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (175 mg, 0.75 mmol)의 신속 교반 용액에 주위 온도에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가의 LiOH (5 mg, 0.21 mmol)로 처리하고, 밤새 교반하였다. 1 N HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시키고, CH₂Cl₂로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (98 mg, 64％).

실시예 1

4-시아노-N-(1-(6-(4-시아노페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N-메틸벤즈아미드 히드로클로라이드

CH₂Cl₂ (2.8 mL) 중 4-(4,5-디메틸-6-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)피리다진-3-일)벤조니트릴 (90 mg, 0.28 mmol) 및 트리에틸아민 (0.12 mL, 0.84 mmol)의 용액을 4-시아노벤조일 클로라이드 (56 mg, 0.34 mmol)로 처리하였다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. H₂O로 세척하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 직접 정제하였다 (CH₂Cl₂ 중 0→2％ 2 M NH₃/MeOH의 구배). 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 물질을 MeOH 중에 용해시키고, 1.1 당량의 메탄올성 HCl (아세틸 클로라이드를 MeOH에 적하함으로써 미리 형성함)을 첨가하였다. 혼합물을 N₂ 기체 기류 하에 농축시키고, 잔류물을 진공 오븐 내 45℃에서 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (130 mg, 95％).

본질적으로 실시예 1에 기재된 절차에 따라, 6 시간 내지 3 일 범위의 반응 시간으로 적절한 산 클로라이드를 사용하여 하기 표의 피페라디닐아미드를 제조하였다. 실시예 7, 8 및 13의 경우, 과량의 Et₂O 중 1 M HCl을 사용하여 염을 형성하였다. 실시예 10의 경우, 3 당량의 미리 형성된 메탄올성 HCl을 사용하여 염을 형성하였다.

실시예 14

N-(1-(6-(4-시아노페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-2-(트리플루오로메틸)니코틴아미드 디히드로클로라이드

4-(4,5-디메틸-6-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)피리다진-3-일)벤조니트릴 (102 mg, 0.32 mmol), 2-(트리플루오로메틸)니코틴산 (70 mg, 0.38 mmol) 및 트리에틸아민 (0.13 mL, 0.96 mmol)을 DMF (10 mL) 중에 합하였다. PyBOP (200 mg, 0.38 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 밤새 주위 온도에서 교반하였다. CH₂Cl₂를 반응 혼합물에 첨가하고, 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (20:5:1 헥산:EtOAc:2 M NH₃/MeOH). 과량의 Et₂O 중 1 M HCl을 CH₂Cl₂/MeOH 중 유리 염기의 용액에 첨가하고, 용매를 N₂ 기체 하에 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다 (103 mg, 57％).

별법의 커플링 절차:

4-(4,5-디메틸-6-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)피리다진-3-일)벤조니트릴 (300 mg, 0.93 mmol), 2-(트리플루오로메틸)니코틴산 (210 mg, 1.12 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.79 mL, 4.51 mmol)을 DMF 및 DMSO의 4:1 혼합물 (20 mL) 중에 합하였다. 혼합물을 60℃에서 간단하게 가열하여 고체를 용해시킨 다음, 0℃로 냉각시켰다. DMF 및 DMSO의 4:1 혼합물 (1 mL) 중 퍼플루오로페닐 디페닐포스피네이트 (750 mg, 1.96 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 NaHCO₃ 수용액 및 CH₂Cl₂ 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (20:5:1 헥산:EtOAc:2 M NH₃/MeOH) 표제 화합물의 유리 염기를 수득하였다 (346 mg, 75％).

상기 기재된 바와 같이 HCl 염을 형성하였다.

본질적으로 실시예 14의 첫번째 절차에 기재된 절차에 따라, 적절한 디메틸 피리다진 및 카르복실산을 사용하여 하기 표의 피페리디닐 아미드를 제조하였다. 실시예 28의 경우, MeOH 중 1 M HCl (아세틸 클로라이드를 MeOH 내로 적하함으로써 미리 형성함) 1.1 당량을 사용한 다음, 농축시켜 모노히드로클로라이드 염을 수득하였다. 실시예 28의 경우, 실시예 14의 별법의 절차를 따랐다.

실시예 29

N-(1-(6-(4-시아노페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-4-(트리플루오로메틸)니코틴아미드 히드로클로라이드

CH₂Cl₂ (4 mL) 중 4-(4,5-디메틸-6-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)피리다진-3-일)벤조니트릴 (102 mg, 0.32 mmol), 4-(트리플루오로메틸)니코틴산 (81 mg, 0.42 mmol), 트리에틸아민 (0.07 mL, 0.5 mmol)의 용액을 EDCI (99 mg, 0.52 mmol)로 처리하고, 3 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H₂O 내에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 H₂O로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (CH₂Cl₂ 중 0→10％ MeOH의 구배). 유리 염기를 MeOH (2 mL) 중에 용해시키고, Et₂O 중 1 M HCl (0.5 mL)을 첨가하였다. 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다 (82 mg, 49％).

본질적으로 실시예 29에 기재된 절차에 따라, 적절한 카르복실산을 사용하여 하기 표의 피페리디닐 아미드를 제조하였다. 실시예 31-33의 경우, 밤새 교반하였다. 실시예 31-33에서 HCl 염을 형성하기 위해, 상응하는 유리 염기를 MeOH 중에 용해시키고, 1.1 당량의 메탄올성 HCl (아세틸 클로라이드를 MeOH 내로 적하함으로써 미리 형성함)을 첨가한 다음 농축시켰다.

실시예 34

(S)-N-(1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N-메틸피페리딘-2-카르복스아미드 디히드로클로라이드

1,4-디옥산 중 4 M HCl (1.00 mL, 4.00 mmol)을 CH₂Cl₂ (2 mL) 중 (S)-tert-부틸 2-((1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)(메틸)카르바모일)피페리딘-1-카르복실레이트 (80 mg, 0.152 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 4 시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 진공 오븐 내 45℃에서 건조시켜 표제 화합물을 연황색 발포체로서 수득하였다 (79 mg, 정량).

실시예 35

N-(1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N,1-디메틸-5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복스아미드 디히드로클로라이드

1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-N-메틸피페리딘-4-아민 (800 mg, 4.12 mmol)을 DMF (25 mL) 중에 용해시켰다. 1-메틸-5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복실산 (1.08 g, 3.44 mmol), 트리에틸아민 (1.44 mL, 10.3 mmol) 및 PyBOP (2.68 g, 5.15 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 헥산 중 0-100％ (5:1 EtOAc:2 M NH₃/MeOH)의 구배를 사용하는 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 단리된 생성물을 CH₂Cl₂ (10 mL) 중에 용해시키고, Et₂O 중 2 M HCl (8 mL)을 첨가하였다. 용매를 N₂ 기류 하에 제거하고, 진공 오븐 내 50℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (612 mg, 32％).

본질적으로 실시예 34에 기재된 절차에 따라, 적절한 카르복실산을 사용하여 하기 표의 아미드를 제조하였다. 실시예 36을 SCX 칼럼 (2 M NH₃/MeOH로 용리)에 이어 플래쉬 크로마토그래피 상에서 정제하였다.

실시예 38

N-(1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-N-메틸-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복스아미드 디히드로클로라이드

트리플루오로아세트산 (10 mL)을 N-(1-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)-1-(4-메톡시벤질)-N-메틸-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-카르복스아미드 (99 mg, 0.12 mmol)에 첨가하고, 환류에서 N₂ 하에 밤새 가열하였다. 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 CHCl₃ 중 20％ iPrOH 중에 용해시키고, 포화 수성 Na₂CO₃ 용액으로 세척하였다. 수성 층을 CHCl₃ 중 20％ iPrOH로 추출하였다. 유기 층을 합하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (CH₂Cl₂ 중 0→10％ 2 M NH₃/MeOH의 구배). 정제된 유리 염기를 CH₂Cl₂ (2 mL) 중에 용해시키고, Et₂O 중 1 M HCl (0.5 mL)을 적가하였다. 30 분 동안 교반하였다. 농축시키고, 진공 오븐 내 50℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (55 mg, 60％).

생물학

헷지호그는 기저 세포 암종; 상부 위장관 암 (식도, 위, 췌장 및 담관); 전립선암; 유방암; 소세포 폐암; 비-소세포 폐암; B-세포 림프종; 다발성 골수종; 위암; 난소암; 결장직장암; 간암; 흑색종; 신장암; 및 뇌암과 같은 암에 대한 생존 인자로서 관련된 것으로 시사되어 왔다.

헷지호그 경로의 요소들은 암의 치료를 위한 잠재적 약물 표적이라고 주장되어 왔다. 수모세포종 종양으로부터 확립된 Daoy 세포주 (ATCC, HTB-186)는 Hh 리간드에 반응한다. 이들 세포를 외인성 첨가된 Shh-조건화 배지로 처리하는 경우, Hh 신호전달 경로가 활성화되어, Gli1의 발현의 증가를 야기한다. 익시아(corn lily) 베라트룸 칼리포르니쿰(Veratrum californicum)으로부터 단리된 알칼로이드인 시클로파민은 약한 헷지호그 길항제이고, Shh 자극에 반응하여 Gli1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 최근의 관찰은 시클로파민이 배양된 수모세포종 세포 및 동종이식편의 성장을 억제함을 시사한다. 이러한 Daoy 세포 모델 시스템을 이용하여, 헷지호그 신호전달 경로의 강력한 억제제를 확인할 수 있다. 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이므로, 이들은 전술한 종양 유형의 치료에 적합하다.

생물학적 활성 IC₅₀의 측정

하기의 검정 프로토콜 및 그의 결과는 화합물의 유용성 및 효능, 및 본 발명의 방법을 추가로 증명한다. 기능적 검정은 본 발명의 화합물이 Shh 신호전달을 억제하는 능력을 나타낸다는 근거를 제공한다. 하기 검정에 사용된 모든 리간드, 용매 및 시약은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.

생물학적 활성은 Daoy 뉴런 암 세포에서의 기능적 검정을 이용하여 측정되며, bDNA (분지형 데옥시리보핵산) 검정 시스템 (파노믹스, 인크.(Panomics, Inc.), 캘리포니아주 프레몽트)를 통해 Gli1 리보핵산의 수준을 측정한다. Gli는 교모세포종 세포주에서 최초로 발견되었고, Shh 신호전달에 의해 활성화되는 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 코딩한다. 최대 반응은 조건화 배지 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)를 사용하는 Daoy 세포에서 24 시간 동안 Gli1 전사를 유도한 다음, 자극된 Gli1 전사체의 양을 측정함으로써 수득하였다. 최소 반응은 조건화 배지 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)로 자극된 Daoy 세포에서 24 시간 동안 대조군 화합물에 의해 억제된 Gli1 전사체의 양이다.

Daoy 세포에서 Gli1의 억제를 측정하기 위한 기능적 검정

bDNA 검정 시스템은 표적 리보핵산 (전사체)의 증폭을 허용하는 분지쇄 DNA의 기술을 활용한다. 이 기술은 표적 전사체와 복합체로서 혼성화하여 혼성화 신호를 증폭시키는 표적 전사체 [포획 익스텐더 (CE), 표지 익스텐더 (LE) 및 차단제 (BL)]의 특이성을 결정하는 합성 하이브리드인 짧은 Gli1-특이적 cDNA 프로브의 3가지 유형을 사용한다. 증폭 단계 동안 화학 발광성 기질의 첨가는 발광을 이용하는 검출을 허용한다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture collection)(ATCC)으로부터 입수한 Daoy 세포주는 Shh-반응성 인간 뉴런 종양 세포주이고, 섬유조직형성의 소뇌 수모세포종 종양, 생리학적으로 관련된 종양 세포주로부터 1985년에 확립되었다. Gli1 전사체 수준의 내인성 수준은 Daoy 세포에서는 낮지만, 인간 Shh를 안정하게 과다발현하는 세포 (hShh로 안정하게 형질감염된 HEK-293 세포주)로부터 획득한 조건화 배지를 사용하여 자극될 수 있다.

Daoy 세포는 조직 배양 T225-플라스크에서 0.1 nM 비-필수 아미노산 및 1 mM 나트륨 피루베이트를 포함하는 10％ 태아 소 혈청 (FBS)을 더한 최소 필수 배지 (MEM)를 함유하는 Daoy 성장 배지 중에서 전면배양으로 성장시켰다. 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 T225-플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하고, 배지 중에 재현탁한 다음, 계수하였다.

이어서, Daoy 세포를 코스타 96 웰 투명 조직 배양 플레이트 내 성장 배지 중에 각 웰 당 50,000개의 세포를 시딩하고, 5％ 이산화탄소 (CO₂) 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 인산염 완충 염수 (PBS) 중에서 1회 세척하고, 이어서 Shh 조건화 배지 (Shh-CM) 100 ㎕를 첨가하여 Gli1 발현 수준을 자극하였다. 대조군 성장 배지-0.1％ FBS/DMEM (둘베코 변형 이글 배지)을 사용하여 최대 자극을 달성하기 위해 Shh-CM을 희석하였다. 이어서, Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포를 대략 1 μM 내지 0.1 nM 범위의 다양한 농도의 헷지호그 억제제로 처리하였다. 시험 화합물은 5％ CO₂ 하에 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.

Gli1 전사체의 측정은 제조사 (파노믹스, 인크.)에 의해 기재된 바와 같은 퀀티젠(Quantigene) 2.0 Gli1 검정을 이용하여 수행하였다. 프로테이나제 K를 포함하는 희석된 용해 혼합물 (DLM) 완충액을 제조하였다. 화합물과 함께 24 시간 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, DLM 180 ㎕를 세포에 첨가하였다. 용해 완충액을 함유하는 세포 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 30분 내지 45분 동안 두었다. 그 후, 생성된 세포 용해물을 5회 연화처리하였다. 제조사의 지시에 따라 프로브를 DLM 중에 희석시켜 Gli1 프로브를 함유하는 작업 프로브 세트를 제조한 다음, 작업 프로브 세트 20 ㎕를 Daoy 용해물 80 ㎕와 함께 bDNA 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 bDNA 플레이트를 처리하였다. 발광을 검출하는 퍼킨 엘머 엔비젼(Perkin Elmer Envision) 판독기 상에서 플레이트를 판독하여 신호를 정량화하였다. 발광 신호는 샘플 중에 존재하는 표적 전사체의 양에 직접적으로 비례하였다.

기능적 검정으로부터의 발광 신호 데이터는 시험관내 검정에 대한 IC₅₀을 계산하기 위해 사용하였다. 데이터는 최대 대조군 값 (Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포) 및 최소 대조군 값 (Shh-CM 및 억제 농도의 대조군 화합물, 1 μM의 N-(3-(1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-클로로페닐)-3,5-디메톡시벤즈아미드로 처리된 Daoy 세포)을 기준으로 계산하였다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트는 액티비티베이스 소프트웨어 프로그램 버전 5.3, 방정식 205 (Assay Guidance Manual Version 5.0, 2008, Eli Lilly and Company and NIH Chemical Genomics Center)를 사용하여 IC₅₀ 값을 생성하기 위해 사용하였다.

기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 본 발명의 화합물은 < 15 nM의 IC₅₀을 나타냈다. 예를 들어, 실시예 14의 화합물은 상기 기재된 검정에서 0.114 (n=4)의 표준 오차를 갖는 대략 1.27 nM의 IC₅₀을 나타내고, 실시예 34의 화합물은 0.293 (n=3)의 표준 오차를 갖는 대략 1.22 nM의 IC₅₀을 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이고, 그 자체로 항암제로서 유용하다는 증거를 제공한다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:

상기 식에서,
X는 C-R¹ 또는 N이고;
R¹은 수소, 플루오로 또는 시아노이고;
R²는
, 피페리디닐 또는 같은자리 디-F-치환된 시클로헥실이고;
R³은 메틸 또는 트리플루오로메틸이고;
R⁴는 피롤리디닐, 모르폴리닐 또는 피리딜, 아미노 또는 디메틸아미노이고;
R⁵는 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고;
R⁶은 수소 또는 메틸이고;
R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 플루오로, 시아노, 클로로, 메틸, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시 또는 메틸술포닐이되, 단 R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹ 중 적어도 2개가 수소이다.
제2항에 있어서, X가 C-R¹인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, R²가

인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 플루오로인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R²가
인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제5항에 있어서, R⁵가 트리플루오로메틸이고, R⁶이 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 시아노인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R²가
인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제8항에 있어서, R⁷이 트리플루오로메틸이고, R⁹, R¹⁰ 및 R¹¹이 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함하는 제약 조성물.
뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서의 상기 질환의 치료 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.