MX2011005177A - Antagonistas de la trayectoria hedgehog de piridazinas tetrasustituidas. - Google Patents
Antagonistas de la trayectoria hedgehog de piridazinas tetrasustituidas.Info
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Abstract
La presente invención provee una nueva trayectoria hedgehog de piridina tetrasubstituida de la siguiente fórmula I (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde: X es C-R1 o N; R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; R2 es fórmula II (II), piperidinilo, o ciclohexilo gem di-F-substituido; R3 es metilo o trifluorometilo; R4 es pirrolidinilo, morfolinilo o piridilo, amino o dimetilamino; R5 es trifluorometilo o metilsulfonilo; R6 es hidrógeno o metilo; y R7, R8, R9, R10 y R11 son independientemente hidrógeno fluoro, ciano, cloro, metilo, trifluorometilo, trifluorometoxi o metilsulfonilo, siempre que al menos dos de R7, R8, R9, R10y R11 son hidrógeno útiles en el tratamiento de cáncer. (Ver fórmulas (I) (II)).
Description
ANTAGONISTAS DE LA TRAYECTORIA HEDGEHOG DE PIRIDAZINAS
TETRASUSTI UIDAS
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a antagonistas de la trayectoria Hedgehog y, más específicamente, a nuevas piridazinas tetrasustituidas y uso terapéutico de las mismas. La trayectoria de señalización Hedgehog (Hh) juega un papel importante en la formación del patrón embriónico y mantenimiento del tejido en adultos dirigiendo la diferenciación y proliferación celular. La familia de la proteina Hedgehog (Hh) , la cual incluye Hedgehog Sónica (Shh) , Hedgehog India (Ihh), y Hedgehog Desierto (Dhh) son glicoproteínas secretadas que sufren modificaciones post-traduccionales, incluyendo escisión autocatalítica y acoplamiento de colesterol al péptido amino terminal para formar el fragmento que posee actividad de señalización. Hh enlaza a la proteína de transmembrana de doce pasos Ptch (Ptchl y Ptch2), aliviando la supresión mediada por Ptch de Smoothened (Smo) . La activación de Smo activa una serie de eventos intracelulares que culminan en la estabilización de los factores de transcripción Gli (Glil, Gli2, y Gli3) y la expresión de los genes dependientes de Gli que son responsables de la proliferación celular, supervivencia celular, angiogénesis e invasión.
La señalización de Hh recientemente ha atraído interés considerable con base en el descubrimiento que la activación aberrante de la señalización de Shh conduce a la formación de varios tumores, por ejemplo, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma de célula basal, cáncer de pulmón de células pequeñas, y cáncer de próstata. Varios antagonistas de Hh se han reportado en el arte, tal como el compuesto alcaloide esteroideo IP-609; el compuesto aminoprolina CUR61414; y el compuesto tiazol 2 , 4-disustituido JK18. WO2005033288 describe ciertos compuestos de ftalazina 1, 4-disustituida que se afirma son antagonistas de hedgehog. De manera similar, WO2008110611 describe ciertos compuestos de ftalazina 1,4 disustituida relacionados con el diagnóstico y tratamiento de patologías relacionadas con la trayectoria de hedgehog.
Aún existe una necesidad de inhibidores potentes de la trayectoria de hedgehog, particularmente aquellos que tienen perfiles farmacodinámicos, farmacocinéticos y de toxicología deseables. La presente invención proporciona nuevas piridazinas tetrasustituidas que son antagonistas potentes de esta trayectoria.
La presente invención proporciona un compuesto de
Fórmula I:
o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde: X es C-R1 o N;
R1 es hidrógeno, fluoro o ciano;
piperidinilo, o ciclohexilo gem di-fluoro-sustituido;
R3 es metilo o trifluorometilo;
R4 es pirrolidinilo, morfolinilo o piridilo, amino o dimetilamino;
R5 es trifluorometilo, o metilsulfonilo;
R6 es hidrógeno o metilo; y
R7, R8, R9, R10 y R11 son independientemente hidrógeno, fluoro, ciano, cloro, metilo, trifluorometilo, trifluorometoxi o metilsulfonilo, siempre que al menos dos de R7, R8, R9, R10 y R11 sean hidrógeno.
Se entenderá por el experto en la técnica que los compuestos de la presente invención comprenden una porción amina terciaria y son capaces de reaccionar con un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Tales sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, P. Stahl, et. al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE,
(VCHA/Wiley-VCH, 2002); S. . Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol . 66, No. 1, Enero 1977.
Las modalidades especificas de la invención incluyen compuestos de Fórmula I, o una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable, en donde:
(a) X es C-R1
(b) R1 es fluoro;
(c) R1 es ciano;
(h) R1 es fluoro y R2 es
(i) R1 es ciano y R2 es
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en combinación con un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
compuestos de la presente invención preferiblemente formulados como composiciones farmacéuticas administradas por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral o intravenosa. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en el arte. Vez, por ejemplo, RE INGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds . , 19th ed., Mack Publishing Co., 1995) .
La presente invención también proporciona un método
para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma en un paciente que comprende administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Se entenderá que la cantidad del compuesto actualmente administrado será determinada por un médico bajo las circunstancias relevantes, incluyendo la afección a ser tratada, la ruta de administración elegida, el compuesto o compuestos actuales administrados, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente. Las dosis por día normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo antedicho pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores. Por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no se propone para limitar el alcance de la invención en alguna forma. Esta invención también proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo
farmacéuticamente aceptable, para uso como un medicamento.
Adicionalmente, esta invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer. En particular, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon y melanoma .
Además, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, como un ingrediente activo para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma.
Los compuestos de Fórmula I, o sales de los mismos, se pueden preparar por una variedad de procedimientos
conocido en el arte, así como también aquellos descritos en los Esquemas de reacción, Preparaciones y Ejemplos posteriores. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas descritas se pueden combinar en diferentes formas, o en conjunto con las etapas de diferentes esquemas de reacción, para preparar los compuestos de Fórmula I, o sales de los mismos.
Los sustituyentes, a menos que se indique de otra forma, son como se definieron previamente. Los reactivos y materiales de partida son generalmente fácilmente disponibles para uno de experiencia ordinaria en el arte. Se pueden hacer otros por técnicas estándares de química orgánica y heterocíclica, técnicas las cuales son análogas a las síntesis de compuestos estructuralmente similares conocidos, y los procedimientos descritos en las Preparaciones y Ejemplos los cuales siguen incluyendo cualquiera de los procedimientos nuevos.
Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados indicados: "boc" o "t-boc" se refiere a ter-butoxicarbonilo; "BOP" se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- (dimetilamino) -fosfonio; "DMA" se refiere a N, N-dimetilacetamida; "DMF" se refiere a N,N-dimetilformamida; "DMSO" se refiere a metilsulfóxido; "EDCI" se refiere a clorhidrato de 1- ( 3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida; "Et20" se refiere a éter dietílico; "EtOAc"
se refiere a acetato de etilo; "iPrOH" se refiere a isopropanol; "MeOH" se refiere a metanol; "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético"; "SCX" se refiere a intercambio catiónico fuerte; "PyBOP" se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitripirrolidino-fosfonio; e "IC50" se refiere a la concentración de un agente que produce 50% de la respuesta inhibitoria máxima posible para este agente.
Esquema de Reacción 1
Etapa 3
Un compuesto de Fórmula I se puede preparar de conformidad con las reacciones representadas en el Esquema de reacción 1.
En el Esquema de reacción 1, la 3, 6-dicloro-4, 5-dimetilpiridazina (1) se desplaza con metil (piperidin-4-il)carbamato de ter-butilo (2) en una reacción de sustitución aromática nucleofilica (SNAr) en un solvente aprótico polar
tal como D F, DMA, o DMSO en la presencia de una base orgánica tal como trietilamina y/o diisopropiletilamina y/o una base inorgánica tal como carbonato de potasio con calentamiento a 100-140°C para proporcionar 1- ( 6-cloro-4 , 5-dimetilpiridazin-3-il)piperidin-4-il (metil) carbamato de ter-butilo (3) . En la Etapa 2, el cloruro remanente en la dimetilpiridazina se puede hacer reaccionar con un ácido aril borónico (4) en una reacción de acoplamiento cruzado Suzuki-Miyaura para producir la 4 , 5-dimetil-6-arilpiridazina sustituida-3-piperidina sustituida (5) correspondiente. El experto en la técnica reconocerá que existe una variedad de condiciones útiles para facilitar tales reacciones de acoplamiento cruzado. Las condiciones de reacción hacen uso de un solvente adecuado tal como dioxano o dioxano/agua en la presencia de una base tal como carbonato de cesio o fluoruro de cesio y un catalizador de paladio tal como cloruro de (1, 1' -bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio (II) o (SP-4-1)-bis [bis ( 1 , 1-dimetiletil ) ( 4-metoxifenil ) fosfina-??] dicloro-paladio (preparado de acuerdo con J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112) bajo una atmósfera inerte a una temperatura de aproximadamente 80-160°C para producir un compuesto de fórmula (5) . La amina se puede desproteger por métodos de desprotección estándares. Los métodos para introducir y remover los grupos protectores nitrógeno son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Green and Wuts, Protective
Groups in Organic Synthesis, 3 Ed. , John Wiley and Sons, New York, (1999)). Por ejemplo, la desproteción boc de la amina de fórmula (5) se puede realizar bajo condiciones ácidas, tal como con cloruro de hidrógeno o ácido trifluoroacético para producir un compuesto de fórmula (6). La acilación de la amina en la Etapa 4 se puede realizar con un cloruro ácido sustituido (7) en un solvente inerte tal como diclorometano o alternativamente, un compuesto de fórmula (6) se puede acilar usando un ácido carboxilico sustituido y un reactivo de acoplamiento apropiado tal como ByBOP, difenilfosfinato de pentafluorofenilo, BOP, o EDCI y una base apropiada tal como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente adecuado tal como DMF y/o DMSO, o diclorometano para producir compuestos neutros de Fórmula I se pueden convertir a una sal tal como la sal de HC1 por métodos conocidos por un experto en el arte tal como agregar HC1 en Et20 o el HC1 se puede generar in situ por adición por goteo de cloruro de acetilo a una solución de un solvente alcohol tal como metanol a 0-20°C.
Esquema de reacción 2
Los ácidos carboxilicos deseados (7), (Y = OH, Etapa 4, Esquema de reacción 1), se pueden preparar como se muestra en el Esquema de reacción 2. La amina primaria en la posición 2 del tiazol (8) se desplaza con un cloruro en una reacción Sandmeyer usando cloruro de cobre y nitrito de isopentilo en un solvente apropiado tal como acetonitrilo como se muestra en la Etapa 1 para producir un tiazol 2-cloro-4 , 5-sustituido (9) . El cloruro luego se desplaza con la amina deseada (10) en la Etapa 2 en un solvente aprótico polar tal como DMSO para producir el amino tiazol correspondiente (11) . La hidrólisis del éster en la Etapa 3 con una base adecuada tal como hidróxido de sodio acuoso o hidróxido de litio acuoso en un solvente adecuado tal como MeOH o dioxano produce el ácido carboxilico (12) deseado.
Esquema de reacción 3
En un ejemplo adicional para preparar el ácido carboxilico deseado (7), (Y = OH, Etapa 4, Esquema de reacción 1), como se muestra en el Esquema de reacción 3, un pirazol (13) se protege con un grupo protector adecuado tal como 4-metoxibencilo como se muestra en la Etapa 1 usando una
base inorgánica tal como carbonato de potasio en un solvente tal como acetona para producir el pirazol protegido (14). El éster luego se hidroliza con una base adecuada como se muestra en la Etapa 3 para producir un compuesto de fórmula (15). Después de la acilación en la Etapa 4, Esquema de reacción 1, la desprotección del pirazol se puede completar bajo condiciones ácidas tal como TFA para producir los compuestos de Fórmula I .
El Esquema de reacción 4 muestra un ejemplo aún adicional para preparar un ácido carboxilico (7), (Y = OH, Etapa 4, Esquema de reacción 1) .
Esquema de reacción 4
Nitrito de isopentilo se puede agregar por goteo a una solución de un amino pirazol (16) y disulfuro de dimetilo en un solvente inerte tal como cloroformo para convertir la amina primaria a un grupo tiometilo para formar l-metil-5- (metiltio) -lH-pirazol-4-carboxilato de etilo (17) como se muestra en la Etapa 1. El grupo tiometilo del compuesto (17) se puede oxidar a la metilsulfona con un agente oxidante tal
como peróxido de hidrógeno en un solvente apropiado tal como ácido acético para producir un compuesto de fórmula 18, Etapa 2. La hidrólisis del éster como se describió previamente produce el ácido carboxilico apropiado como se muestra en la Etapa 3, compuesto (7).
Las siguientes Preparaciones y Ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención con detalle adicional y representan síntesis típicas de los compuestos de Fórmula (I) . Los nombres de los compuestos de la presente invención generalmente se proporcionan por ChemDraw Ultra® 10.0.
Preparación 1
1- ( 6-Cloro-4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4- il (metil ) carbamato de ter-butilo
Calentar una mezcla de 3 , 6-dicloro-4 , 5-dimetilpiridazina (11.0 g, 62.1 mmol), metil (piperidin-4-il) carbamato de ter-butilo (23.3 g, 109 mmol), y K2CO3 en polvo (17.2 g, 124 mmol) en DMSO (310 mL) a 120 °C por 2 d. Enfriar la mezcla de reacción, diluir con H20, y filtrar el sólido. Enjuagar el sólido con ¾0, y secar bajo vacío a 45 °C. Disolver el sólido en CH2CI2 y pasar la solución a través de una almohadilla de gel de sílice, eluyendo con CH2CI2.
Concentrar la capa orgánica bajo presión reducida para obtener el compuesto del titulo como un sólido amarillo (14.3 g, 65%). ES/MS m/z (35C1) 355.0 (M+l).
Preparación 2
1- ( 6- ( 4-Fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4- il (metil ) carbamato de ter-butilo
Calentar una mezcla de 1- ( 6-cloro-4, 5-dimetilpiridazin-3-il)piperidin-4-il (metil) carbamato de ter-butilo (1.5 g, 4.23 mmol), ácido 4-fluorofenilborónico (887 mg, 6.34 mmol), Cs2C03 (5.51 g, 16.9 mmol) y (SP-4-1)-bis [bis ( 1, 1-dimetiletil ) ( 4-metoxifenil ) fosfina-??] dicloro-paladio (J. Org. Chem. 2007, 72, 5104-5112) (29 mg, 0.042 mmol) en una mezcla de 1,4-dioxano (30 mL) y H20 (10 mL) bajo N2 a 90 °C durante la noche. Dividir la mezcla de reacción entre H20 y CH2C12. Separar las capas, y extraer la capa acuosa con CH2CI2. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 2% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) para proporcionar el compuesto del título como una espuma blanca (1.05 g, 60%). ES/MS m/z 415.2 (M+l).
Procedimiento alterno:
Tratar una mezcla desgasificada con N2 de l-(6-cloro-4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il (metil ) carbamato de ter-butilo (3.01 g, 8.48 mmol), ácido 4-fluorofenilborónico (1.23 g, 8.80 mmol) y CsF (4.08 g, 26.8 mmol) en 1,4-dioxano (80 mL) con cloruro de (1,1'-bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio ( I I ) ( 1.10 g, 1.35 mmol). Calentar la mezcla resultante bajo N2 a 95 °C durante la noche. Dividir la mezcla de reacción entre H20 y EtOAc. Separar las capas, y lavar la capa orgánica con salmuera. Secar la capa orgánica sobre Na2SC , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 20 a 80% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto del título (3.05 g, 87%). ES/MS m/z 415.2 (M+l).
Preparación 3
1- ( 6- ( 4-Cianofenil ) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4- il (metil) carbamato de ter-butilo
Calentar una mezcla de 1- ( 6-cloro-4 , 5-dimetilpiridazin-3-il) piperidin-4-il (metil) carbamato de ter-butilo (1.5 g, 4.23 mmol), ácido 4-cianofenilborónico (932
mg, 6.34 mmol) , Cs2C03 (5.51 g, 16.9 mmol) y (SP-4-1)-bis [bis ( 1, 1-dimetiletil) ( 4-metoxifenil ) fosfina-??] dicloro-paladio (29 mg, 0.042 mmol) en una mezcla de 1,4-dioxano (30 mL) y H20 (10 mL) bajo N2 a 90 °C durante la noche. Dividir la mezcla de reacción entre EtOAc y H20 con NaHCC>3 disuelto. Separar las capas, y extraer la capa acuosa con EtOAc. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2S0 , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 2% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (1.68 g, 94%). ES/MS m/z 422.2 (M+l) .
Preparar las fenilpiridazinas sustituidas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la Preparación 3, usando el ácido aril borónico apropiadamente sustituido. Para la Preparación 5, filtrar directamente la mezcla de reacción cruda sobre una almohadilla de gel de sílice eluyendo con 5% M NH3/MeOH en CH2CI2. Concentrar el eluyente y purificar sin una elaboración acuosa.
Preparación 6
1- (6- (4-Fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) -Armetilpiperidin- -amina
Tratar una solución de 1- ( 6- ( -fluorofenil) -4, 5- dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il (metil ) carbamato de ter- butilo (1.04 g, 2.51 mmol) en 1,4-dioxano (10 mL) con HC1 4 M en 1,4-dioxano (15.0 mL) . Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente por 2 h. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida. Disolver el residuo en MeOH, y verter sobre una columna SCX (Varían, 10 g) . Enjuagar la columna con MeOH y CH2CI2, y eluir el producto con una mezcla 1:1 de CH2C12 y NH3 2 M/MeOH. Concentrar bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido blancuzco (784 mg, 99%). ES/MS m/z 315.2 (M+1).
Preparación 7
4- ( , 5-Dimetil-6- (4- (metílamino) piperidin-l-il)piridazin-3- il ) enzonitrilo
Tratar una solución de 1- ( 6- ( 4-cianofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il)piperidin-4-il (metil) carbamato de ter-butilo (1.68 g, 3.99 mmol) en 1,4-dioxano (20 mL) con HC1 4 M en 1,4-dioxano (20 mL) . Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente por 2 h. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida. Disolver el residuo en MeOH, y verter sobre una columna SCX (Varían, 20 g) . Enjuagar la columna con MeOH y CH2CI2, y eluir el producto con una mezcla 1:1 de CH2C12 y NH3 2 M/MeOH. Concentrar bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (1.28 g, cuantitativo). ES/MS m/z 322.2 (M+1).
Preparar la N-metilaminopiperidina desprotegida en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la Preparación 7, usando la piperidina protegida con boc apropiada.
Prep. ES/MS
Nombre Químico Estructura
No. m/z
1- (4, 5-Dimetil-6- fenilpiridazin-3-il) - 8
N-metilpiperidin-4- x y—
amina í- //—u N 297.2
\ (M+1)
Preparación 9
1- ( 4 , 5-Dimetil-6- (piridin-4-il ) piridazin-3-il ) -Armetilpiperidin- -amina
Agregar CH2C12 (20 mL) y ácido trifluoroacético mL) a 1- ( , 5-dimetil-6- (piridin-4-il ) piridazin-3-il) piperidin-4-il (metil) carbamato de ter-b tilo (1.19 g, 2.99 mmol) . Agitar a temperatura ambiente por 3 d. Concentrar bajo presión reducida para producir un residuo. Dividir el residuo entre CH2C12 y NaOH 1 N. Separar las capas, y extraer la capa acuosa dos veces con CH2C12. Combinar los extractos orgánicos, secar sobre Na2SC>4, filtrar, y concentrar bajo presión reducida para obtener el compuesto del titulo (790 mg, 89%). ES/MS m/z 298.2 (M+l) .
Preparación 10
2-Cloro-4- ( trifluorometil) tiazol-5-carboxilato de etilo
Tratar lentamente una mezcla a 0°C de CuCl2 (671 mg, 4.99 mmol) y nitrito de isopentilo (732 mg, 6.24 mmol) en
acetonitrilo (10 mL) con 2-amino-4- (trifluorometil ) tiazol-5-carboxilato de etilo (1.0 g, 4.16 mmol) . Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente por 1 h. Calentar a 50 °C por 1 h. Remover la mayoría de los solventes, y verter en una mezcla de hielo y HC1 concentrado. Extraer con CH2CI2. Lavar la capa orgánica con salmuera, secar sobre Na2SC>4 , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía instantánea en gel de sílice (20:1 hexanos: EtOAc) para producir el compuesto del título (762 mg, 71%). *H NMR (300 MHz, DMSO-d6) d 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H) , 4.31 (q, J = 7.0 Hz, 2H) .
Preparación 11
2-Morfolino-4- ( trifluorometil ) tiazol-5-carboxilato de etilo
Agregar 2-cloro-4- (trifluorometil ) tiazol-5-carboxilato de etilo (4.00 g, 15.4 mmol) a una solución de morfolina (4.03 g, 46.2 mmol) en DMSO (10 mL) . Agitar la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Agregar CH2CI2, y lavar la mezcla con H2O. Secar la fase orgánica sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía instantánea en gel de sílice (20:5:1 hexanos: EtOAc: 2 M NH3/MeOH) para
producir el compuesto del título (4.58 g, 96%). ES/MS m/z 311.0 (M+1).
Preparar los amino tiazol ásteres en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento como se describe en la Preparación 11, usando la amina apropiada.
Preparación 15
Ácido 2-morfolino-4- ( trifluorometil ) tiazol-5-carboxílico
Agregar 2-morfolino-4- ( trifluorometil ) tiazol-5-carboxilato de etilo (4.58 g, 14.8 mmol) a una mezcla de NaOH
1 N (20 mL) en MeOH (20 mL) , y calentar la reacción a 50 °C por 1 h. Concentrar la reacción bajo presión reducida, y agregar H20 al residuo. Acidificar la mezcla a pH 4, y filtrar el sólido. Lavar el sólido con H20, y secar para obtener el compuesto del titulo (4.13 g, 99%). ES/MS m/z 283.0 (M+1).
Preparar los ácidos amino tiazol en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento como se describe en la Preparación 15, usando el éster apropiado.
Preparación 19
2- ( (1- (6- (4-Fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin- 4-il) (metil)carbamoil)piperidin-l-carboxilato de (S)-ter- butilo
Tratar consecutivamente una solución de l-(6-(4-fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) -N-metilpiperidin-4-amina (100 mg, 0.318 mmol) en CH2CI2 (3.2 mL) con ácido (S)-l-( ter-butoxicarbonil) piperidin-2-carboxílico (109 mg, 0.477 mmol), trietilamina (0.067 mL, 0.477 mmol) y EDCI (92 mg, 0.477 mmol). Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente por 2 d. Verter la mezcla de reacción en H20 que contiene NaHC03. Separar las capas, y extraer la capa acuosa con CH2CI2. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 2% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (82 mg, 49%). ES/MS m/z 526.2 (M+l) .
Preparación 20
1- ( 4-Metoxibencil) -3- (trifluorometil ) -lH-pirazol-4- carboxilato de etilo
Agregar K2C03 (503 mg, 3.60 mmol) a una solución de
3- (trifluorometil) -ltf-pirazol-4-carboxilato de etilo (500 mg, 2.40 mmol) en acetona (8 mL) a temperatura ambiente bajo N2. Agregar l-bromometil-4-metoxibenceno (0.51 mL, 3.6 mmol) por goteo a la mezcla, y agitar durante la noche bajo N2. Apagar la reacción con H2Or y extraer dos veces con EtOAc. Secar las capas orgánicas combinadas sobre MgSC , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 15% EtOAc en hexanos) para producir el compuesto del título (789 mg, cuantitativo). ES/MS m/z 351.0 (M+Na) .
Preparación 21
Ácido 1- (4-metoxibencil ) -3- (trifluorometil ) -lJí-pirazol-4- carboxílico
Agregar una solución de LiOH (122 mg, 5.03 mmol) en H20 (3 mL) a una solución agitada de 1- ( 4-metoxibencil ) -3-
(trifluorometil ) -lfí-pirazol-4-carboxilato de etilo (550 mg, 1.68 mmol) en 1,4-dioxano (10 mL) . Agitar durante la noche a temperatura ambiente. Acidificar a pH 5 con HCl 1 N y extraer con CH2C12 y 2X con 20% iPrOH en CHC13. Secar las capas orgánicas combinadas con MgSC , filtrar y concentrar bajo presión reducida para obtener 140 mg del compuesto del título como un sólido blanco. Acidificar la capa acuosa a pH 2-3 con HCl 1 N, y extraer dos veces con 20% iPrOH en CHCÍ3. Secar los orgánicos combinados sobre MgS04, filtrar, y agregar la solución a los 140 mg de sólidos blancos inicialmente obtenidos. Concentrar para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (426 mg, 85%). ES/MS m/z 299.0 (M-l) .
Preparación 22
iV- ( 1- ( 6- ( 4-Fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin- 4-il) -1- ( 4-metoxibencil ) -W-metil-3- (trifluorometil) -1Jipirazo1-4-carboxamida
Agregar PyBOP (343 mg, 0.65 mmol) y trietilamina (0.21 mL, 1.50 mmol) a una solución agitada de l-(6-(4-fluorofenil ) - , 5-dimetilpiridazin-3-il ) -W-metilpiperidin-4-amina (157 mg, 0.50 mmol) y ácido 1- (4-metoxibencil) -3-
(trifluorometil ) -lH-pirazol-4-carboxílico (165 mg, 0.55 mmol) en DMF anhidra (2.5 mL) . Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente bajo N2 durante la noche. Concentrar, agregar MeOH, filtrar los sólidos, y concentrar el filtrado. Diluir el residuo con MeOH, y verter sobre una columna SCX (Thermo Scientific, 10 g) . Lavar con MeOH, y luego eluir el producto con NH3 2 M/MeOH. Concentrar y purificar por cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente de 0 a 10% (10 % NH3 2 M/MeOH en EtOAc) en hexanos para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (170 mg, 43%). ES/MS m/z 597.0 (M+l).
Preparación 23
l-Metil-5- (metiltio) -lfí-pirazol-4-carboxilato de etilo
Agregar nitrito de isopentilo (0.5 mL, 3.75 mmol) a una solución a 5°C agitada de l-metil-5-amino-lH-pirazol-4-carboxilato de etilo (1.69 g, 10.0 mmol) y disulfuro de dimetilo (1.79 mL, 20.0 mmol) en CHC13 bajo nitrógeno en un matraz de 3 cuellos equipado con un termómetro y un condensador. Permitir que la reacción se caliente a 20 °C en un baño de H2O, y tratar con nitrito de isopentilo adicional (1.5 mL, 11.3 mmol) por goteo. Después de 15 min, remover la
reacción del baño de H2O a 20°C (la exoterma eleva la temperatura a 50 °C durante aproximadamente 1 min) . Agitar a temperatura ambiente bajo N2 durante la noche. Lavar con H20, y separar las capas. Extraer la capa, acuosa con CHCI3, combinar las capas orgánicas, secar sobre MgS04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice '(gradiente de 0 a 35% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto del título (1.94 g, 97%). ES/MS m/z 201.0 (M+l).
Preparación 24
l-Metil-5- (metilsulfonil) -Ií-pirazol-4-carboxilato de etilo
Combinar l-metil-5- (metiltio) -líf-pirazol-4-carboxilato de etilo (1.68 g, 8.39 mmol) , ácido acético glacial (11 mL) , y peróxido de hidrógeno (5.10 mL, 50.3 mmol) y calentar la mezcla resultante a 100 °C por 1.5 h. Permitir que la reacción se enfríe a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Agregar hielo y extraer dos veces con CH2CI2. Combinar las capas orgánicas, secar sobre MgS04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 50% EtOAc en hexanos) para proporcionar el
compuesto del titulo (1.95 g, 100%). ES/ S m/z 233.0 (M+l) .
Preparación 25
Ácido l-metil-5- (metilsulfonil ) -l.fí-pirazol-4-carboxilico
Agregar una solución de LiOH (22 mg, 0.90 mmol) en
H20 (1 mL) a una solución rápidamente agitada de l-metil-5- (metilsulfonil) -líT-pirazol-4-carboxilato de etilo (175 mg, 0.75 mmol) en 1,4-dioxano (3 mL) a temperatura ambiente. Tratar la mezcla de reacción con LiOH adicional (5 mg, 0.21 mmol), y agitar durante la noche. Acidificar a pH 2 con HC1 1 N, y extraer dos veces con CH2CI2. Combinar las capas orgánicas, secar sobre MgS04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida para producir el compuesto del titulo como un sólido blanco (98 mg, 64%). ES/MS m/z 202.9 (M-l).
Ejemplo 1
Clorhidrato de 4-ciano-N- (1- (6- (4-cianofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il ) -N-metilbenzamida
Tratar una solución de 4- (4, 5-dimetil-6- (4- (metilamino) piperidin-l-il ) piridazin-3-il)benzonitrilo (90 mg, 0.28 mmol) y trietilamina (0.12 mL, 0.84 mmol) en CH2C12 (2.8 mL) con cloruro de 4-cianobenzoilo (56 mg, 0.34 mmol). Agitar la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Lavar con H20 y separar las capas. Purificar directamente la capa orgánica por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 2% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) . Concentrar para proporcionar un sólido blanco. Disolver el material en MeOH y agregar 1.1 eq de HCl metanólico (realizar haciendo gotear cloruro de acetilo en MeOH) . Concentrar la mezcla bajo una corriente de gas N2 y secar el residuo en un horno de vacío a 45 °C para obtener el compuesto del título como sólido amarillo (130 mg, 95%). ES/MS m/z 451.2 (M+l) .
Preparar las piperadinilamidas en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando el cloruro ácido apropiado con tiempo de reacción que varían desde 6 h a 3 d. Para los Ejemplos 7, 8 y 13, usar HCl 1 M en exceso en Et20 para formar las sales. Para el Ejemplo 10, usar 3 equivalentes de HCl metanólico realizado para formar la sal.
Ejemplo 14
Diclorhidrato de N- ( 1- ( 6- ( 4-cianofenil ) - , 5-dimetilpiridazin 3-il) piperidin-4-il) -W-metil-2- (trifluorometil) nicotinamida
Combinar 4- (4, 5-dimetil-6- (4- (metilamino) piperidin- 1-il) piridazin-3-il) benzonitrilo (102 mg, 0.32 mmol) , ácido
2- (trifluorometil) nicotínico (70 mg, 0.38 mmol), y trietilamina (0.13 mL, 0.96 mmol) en DMF (10 mL) . Agregar PyBOP (200 mg, 0.38 mmol) a la mezcla y agitar durante la noche a temperatura ambiente. Agregar CH2C12 a la mezcla de reacción y lavar con salmuera. Secar la fase orgánica sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía instantánea en gel de sílice (20:5:1 hexanos: EtOAc: NH3 2 M/MeOH) . Agregar HCI 1
en exceso en Et20 a una solución de la base libre en CH2Cl2/MeOH, y evaporar los solventes bajo gas N2 para producir el compuesto del título (103 mg, 57%). ES/MS m/z 495.2 (M+l).
Procedimiento de acoplamiento alterno:
Combinar 4- ( 4, 5-dimetil-6- (4- (metilamino) piperidin- 1-il) piridazin-3-il) benzonitrilo (300 mg, 0.93 mmol) , ácido
2- (trifluorometil) nicotínico (210 mg, 1.12 mmol) y diisopropiletilamina (0.79 mL, 4.51 mmol) en una mezcla 4:1 de DMF y DMSO (20 mL) . Calentar la mezcla brevemente a 60 °C para disolver los sólidos, y luego enfriar a 0 °C. Agregar una solución de difenilfosfinato de perfluorofenilo (750 mg, 1.96 mmol) en una mezcla 4:1 de DMF y DMSO (1 mL) por goteo. Calentar la mezcla resultante a 60 °C durante la noche. Dividir la mezcla de reacción entre solución acuosa de NaHC03 y CH2CI2. Lavar la capa orgánica con salmuera, secar sobre Na2S0 , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía instantánea en gel de sílice (20:5:1 hexanos: EtOAc: NH32 M/MeOH) para proporcionar la base libre del compuesto del título (346 mg, 75%). ES/MS m/z 495.2 (M+l). Formar la sal de HC1 como se describió anteriormente .
Preparar las piperidinil amidas en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento descrito
en el primer procedimiento para el Ejemplo 14, usando la dimetil piridazina y ácido carboxilico apropiados. Para el Ejemplo 28, usar 1.1 equivalentes de HC1 1 M en MeOH (realizar haciendo gotear cloruro de acetilo en MeOH) luego concentrar para proporcionar la sal de monoclorhidrato. Para el Ejemplo 28, seguir el procedimiento alterno del Ejemplo
Ej. ES/MS
Nombre Químico Estructura
No. m/z
Clorhidrato de N-(l- (4, 5-dimetil-6- fenilpiridazin-3- 560.8
15 il)piperidin-4-il) -N- (M+1) metil-2-morfolino-4- (trifluorometil ) tiazo
1-5-carboxamida HCI
Clorhidrato de N-(l- (6- (4-fluorofenil) - 4, 5-dimetilpiridazin- 578.8
16 3-il ) piperidin-4-il ) - (M+1) N-metil-2-morfolino- 4- (trifluorometil )
tiazol-5-carboxamida HCI
Clorhidrato de 2- (dimetilamino) -N- ( 1- (6- (4-fluorofenil) - 4, 5-dimetilpiridazin- 537.2
17
3-il)piperidin-4-il) - N=N N—' 1 (M+1) N-metil-4- ( trifluorometil ) HCI
tiazol-5-carboxamida
Clorhidrato de N-(l- (4, 5-dimetil-6- fenilpiridazin-3- il) piperidin-4-il) -2- 518.8
18
(dimetilamino) -N- N=N —' N 1 (M+1) metil-4- (trifluorometil) tiazo HCI
1-5-carboxamida
Ejemplo 29
Clorhidrato de N- (1- (6- (4-cianofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3 il) piperidin-4-il) -W-metil-4- ( trifluorometil ) nicotinamida
Tratar una solución de 4- ( , 5-dimetil-6- (4-
(metílamino) piperidin-l-il) piridazin-3-il) enzonitrilo (102 mg, 0.32 mmol) , ácido 4- (trifluorometil ) nicotinico (81 mg, 0.42 mmol), trietilamina (0.07 mL, 0.5 mmol) en CH2C12 (4 mL) con EDCI (99 mg, 0.52 mmol) y agitar por 3 d. Verter la mezcla de reacción en H20 y extraer con EtOAc. Lavar la capa orgánica con H20, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 10% MeOH en CH2C12) . Disolver la base libre en MeOH (2 mL) y agregar HCI 1 M en Et20 (0.5 mL) . Concentrar para proporcionar el compuesto del título (82 mg, 49%). ES/MS m/z 495.2 (M+1).
Preparar las piperidinil amidas en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento descrito en el Ejemplo 29, usando el ácido carboxílico apropiado. Para los Ejemplos 31-33, agitar durante la noche. Para formar las sales de HCI en los Ejemplos 31-33, disolver la base libre correspondiente en MeOH y agregar 1.1 equivalentes de HCI metanólico (realizar haciendo gotear cloruro de acetilo en MeOH) luego concentrar.
Ejemplo 34
Diclorhidrato de ( S) -N- ( 1- ( 6- ( 4-fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il ) -A7-metilpiperidin-2 carboxamida
Agregar HCl 4 M en 1,4-dioxano (1.00 mL, 4.00 mmol) a una solución de 2- ( ( 1- ( 6- ( -fluorofenil) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il) (metil) carbamoil) piperidin-l-carboxilato de (S) -ter-butilo (80 mg, 0.152 mmol) en CH2CI2 (2 mL) . Agitar la mezcla
resultante por 4 h a temperatura ambiente. Concentrar bajo presión reducida y secar el residuo en un horno de vacio a 45 °C para proporcionar el compuesto del titulo como espuma amarilla pálida (79 mg, cuantitativo) . ES/ S m/z 426.2 (M+l) .
Ejemplo 35
Diclorhidrato de N- ( 1- ( 6- ( 4-fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il) -N, l-dimetil-5- ( trifluorometil ) -lH-pirazol-4-carboxamida
Disolver 1- (6- ( 4-fluorofenil ) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il) -A7-metilpiperidin-4-amina (800 mg, 4.12 mmol) en DMF (25 mL) . Agregar ácido l-metil-5- (trifluorometil) -lfí-pirazol-4-carboxilico (1.08 g, 3.44 mmol), trietilamina (1.44 mL, 10.3 mmol) y PyBOP (2.68 g, 5.15 mmol) . Agitar a temperatura ambiente por 3 h. Concentrar la mezcla de reacción y purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente de 0-100% (5:1 EtOAc: NH3 2 M/MeOH) en hexanos . Disolver el producto aislado en CH2CI2 (10 mL) y agregar HC1 2 M en ???0 (8 mL) . Remover los solventes bajo una corriente de N2 y secar en un horno de vacío a 50 °C durante la noche para proporcionar el compuesto del título
(612 mg, 32%). ES/MS (m/z) 491.2 (M+l).
Preparar las amidas en la tabla posterior siguiendo esencialmente el procedimiento descrito en el Ejemplo 34, usando el ácido carboxilico apropiado. Purificar el Ejemplo 36 sobre una columna SCX (eluyendo con NH3 2 M/MeOH) seguido por cromatografía instantánea.
Ejemplo 38
Diclorhidrato de N- ( 1- ( 6- (4-fluorofenil ) -4,5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il ) -2V-metil
(trifluorometil ) -lff-pirazol-4-carboxamida
Agregar ácido trifluoroacético (10 mL) a ?G-(1-(6- (4-fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) piperidin-4-il ) -1- (4-metoxibencil ) -W-metil-S- (trifluorometil) -lH-pirazol-4-carboxamida (99 mg, 0.12 mmol) y calentar a reflujo bajo 2 durante la noche. Concentrar bajo presión reducida. Disolver el residuo en 20% iPrOH en CHCI3, y lavar con solución acuosa saturada de Na2CC>3 . Extraer la capa acuosa con 20% iPrOH en CHCI3. Combinar las capas orgánicas, secar sobre MgS04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 10% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) . Disolver la base libre purificada en CH2CI2 (2 mL) y agregar HC1 1 M en Et20 (0.5 mL) por goteo. Agitar por 30 min. Concentrar y secar en un horno de vacío a 50 °C durante la noche para proporcionar el compuesto del título (55 mg, 60%). ES/MS m/z 477.0 (M+l).
Biología
Hedgehog se ha implicado como un factor de supervivencia para los siguientes cánceres: carcinoma de célula basal; cánceres del tracto gastrointestinal superior (esófago, estómago, páncreas, y tracto biliar) ; cáncer de próstata; cáncer de mama; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de pulmón de células no pequeñas; linfoma de célula B; mieloma múltiple; cáncer gástrico; cáncer de
ovarios; cáncer colorrectal; cáncer de hígado; melanoma; cáncer de riñón; y cáncer de cerebro.
Se ha afirmado que los elementos de la trayectoria de hedgehog son objetivos potenciales del fármaco para el tratamiento de cánceres. Una línea celular Daoy establecida de tumor de meduloblastoma (ATCC, HTB-186), es respondedora a ligandos Hh. Cuando estas células son tratadas con medios acondicionados con Shh agregado exógenamente, la trayectoria de señalización de Hh se activa y resulta en una expresión incrementada de Glil. Ciclopamina, un alcaloide aislado del lirio del maíz Veratrum californicum es un antagonista de hedgehog débil y se ha mostrado que suprime la expresión de Glil en respuesta a la estimulación de Shh. Recientes observaciones sugieren que la ciclopamina inhibe el crecimiento de aloinjertos y células de meduloblastoma cultivadas. Usando este sistema de modelo de célula Daoy, se pueden identificar potentes inhibidores de las trayectorias de señalización de hedgehog. Puesto que los compuestos de la presente invención son antagonistas de hedgehog, son adecuados para el tratamiento de los tipos de tumor mencionados antes.
Determinación de la IC5o de Actividad Biológica
El siguiente protocolo de ensayo y resultados del mismo adicionalmente demuestran la utilidad y eficacia de los
compuestos y métodos de la invención actual. Los ensayos funcionales proporcionan soporte que los compuestos de la presente invención exhiben la capacidad de inhibir la señalización de Shh. Todos los ligandos, solventes, y reactivos empleados en el siguiente ensayo están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden preparar fácilmente por un experto en la técnica.
La actividad biológica se determina usando un ensayo funcional en células de cáncer neuronal Daoy y mide los niveles de ácido ribonucleico Glil vía un sistema de ensayo de bDNA (ácido desoxirribonucleico ramificado) (Panomics, Inc., Fremont, CA) . Gli originalmente se descubrió en una linea celular de Glioblastoma y codifica una proteina de veta de zinc que se activa por señalización de Shh. La respuesta máxima se obtiene induciendo la transcripción de Glil en las células Daoy con medio acondicionado (células de riñon embriónico humano HEK-293 que expresan establemente Shh recombinante ) por 24 horas y luego se mide la cantidad del transcripto Glil estimulado. La respuesta mínima es la cantidad de transcripto Glil inhibida con un compuesto de control en células Daoy que se han estimulado con medios acondicionados (células de riñon embriónico humano HEK-293 que expresan establemente Shh recombinante) por 24 horas.
Ensayo Funcional para Medir la Inhibición de Glil en Células
Daoy
El sistema de ensayo de bDNA utiliza la tecnología de DNA de cadena ramificada para permitir la amplificación de un ácido ribonucleico objetivo (transcripto) . La tecnología emplea tres tipos de sondas de cDNA específico de Glil, corto, híbrido, sintético que determinan la especificidad del transcripto objetivo [extensores de captura (CEs), extensores de etiqueta (LEs) , y bloqueadores (BLs) ] que se hibridan como un complejo con los transcriptos objetivo para amplificar la señal de hibridación. La adición de un sustrato quimiolumigénico durante la etapa de amplificación permite la detección usando luminiscencia.
La línea celular Daoy obtenida de la colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) es una línea celular de tumor neuronal humano respondedora a Shh y fue establecida en 1985 a partir de un tumor de meduloblastoma cerebelar desmoplásico, una línea celular de tumor fisiológicamente relevante. Los niveles endógenos de niveles de transcriptos Glil son bajos en células Daoy pero se pueden estimular usando medios acondicionados tomados de células que establemente sobre-expresan Shh humano (una línea celular de HEK 293 establemente transfectada con hShh) .
Las células Daoy crecen a confluencia en matraces T225 de cultivo de tejido en medio de crecimiento Daoy que contiene Medio Esencial Mínimo (MEM) más 10% Suero Bovino
Fetal (FBS) con aminoácidos no esenciales 0.1 nM y piruvato de sodio 1 mM. Las células se remueven de los matraces T225 usando tripsina/ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , se centrifugan, resuspenden en el medio, y luego se cuentan.
Las células Daoy luego se siembran a 50,000 células por cavidad en el medio de crecimiento en placas de cultivo de tejido claras de 96 cavidades Costar y se dejan incubar durante la noche a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% (C02) . Las células se lavan una vez en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) seguido por adición de 100 i de Medio Acondicionado con Shh (Shh-CM) para estimular los niveles de expresión de Glil. Shh-CM se diluye para lograr la estimulación máxima usando medio de crecimiento de control -0.1% FBS/DMEM (Medio Eagle Modificado con Dulbeccos) . Las células Daoy tratadas con Shh-CM luego se tratan con varias concentraciones de inhibidores de hedgehog que varían desde aproximadamente 1 µ? a 0.1 nM. Los compuestos de prueba se dejan incubar por 24 horas a 37°C bajo C02 al 5%.
La medición del transcripto Glil se realiza usando el ensayo Quantigene 2.0 Glil como se describe por el fabricante (Panomics, Inc.) . Se prepara un amortiguador de mezcla de lisis diluida (DLM), el cual incluye Proteinasa K. Después de una incubación de 24 horas con el compuesto, las células se lavan una vez con PBS y se agregan 180 µ? de DLM a las células. La placa de células que contiene el amortiguador
de lisis se sella y coloca a 55°C por 30 a 45 minutos. Los lisados de célula resultantes luego son triturados 5 veces. Una serie de sonda de trabajo que contiene sondas GUI se hace diluyendo las sondas en el DLM de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego se agregan 20 µ? de la serie de sonda de trabajo a las placas de ensayo de bDNA con 80 µ? de los lisados Daoy. Las placas se sellan e incuban durante la noche a 55 °C. Las placas de bDNA luego se procesan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal se cuantifica leyendo las placas en un lector Perkin Elmer Envision que detecta la luminiscencia. La señal luminiscente es directamente proporcional a la cantidad de transcripto objetivo presente en la muestra.
Los datos de señal luminiscente del ensayo funcional se usan para calcular la IC5o para el ensayo in vitro. Los datos se calculan con base en los valores de control máximos (células Daoy tratadas con Shh-CM) y el valor de control mínimo (células Daoy tratadas con Shh-CM y una concentración inhibitoria de un compuesto de control, 1 µ? de N- (3-lH-benzo [d] imidazol-2-il ) -4-clorofenil ) -3,5-dimetoxibenzamida) . Un ajuste de curva logística de cuatro parámetros se usa para generar los valores de IC50 usando programas de software ActivityBase versión 5.3, ecuación 205 (ñssay Guidance Manual Versión 5.0, 2008, Eli Lilly and Company and NIH Chemical Genomics Center) .
Siguiendo el protocolo descrito, los compuestos de la invención ejemplificados en la presente exhiben una IC50 de < 15 nM. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 14 tiene una IC5o de aproximadamente 1.27 nM con un error estándar de 0.114 (n=4) y el compuesto del Ejemplo 34 tiene una IC50 de aproximadamente 1.22 nM con un error estándar de 0.293 (n=3) en el ensayo descrito anteriormente. Estos resultados proporcionan evidencia que los compuestos de la presente invención son antagonistas de hedgehog y, como tal, son útiles como agentes anticáncer.
Claims (13)
1. Un compuesto de la siguiente fórmula: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque: X es C-R1 o N; R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; piperidinilo, o ciclohexilo gem di-F-sustituido; R3 es metilo o trifluorometilo; R4 es pirrolidinilo, morfolinilo o piridilo, amino o dimetilamino; R5 es trifluorometilo, o metilsulfonilo; R6 es hidrógeno o metilo; y R7, R8, R9, R10 y R11 son independientemente hidrógeno, fluoro, ciano, cloro, metilo, trifluorometilo, trifluorometoxi o metilsulfonilo, siempre que al menos dos de R7, R8, R9, R10 y Ru sean hidrógeno.
2'. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque X es C-R1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque R2 es: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque R1 es fluoro, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
5. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque R2 una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque R5 es trifluorometilo y R6 es metilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
7. El compuesto de conformidad con cualquiera reivindicaciones 1-3, caracterizado porque R1 es ciano sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
8. El compuesto de conformidad con cualquiera reivindicaciones 1-3 o 7, caracterizado porque R2 es , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable
9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque R7 es trifluorometilo y Rs, R10, y R11 son hidrógeno, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Un método para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable .
12. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado para uso como un medicamento.
13. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado para uso en el tratamiento de cáncer .
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