KR20110056684A - 좁은잎천선과 잎 추출물을 이용한 항염증제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NO(Nitric Oxide) 생성 억제 활성, PGE₂와 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성 억제 활성, iNOS 및 COX-2의 발현 억제 활성을 가지는 좁은잎천선과 잎 추출물을 이용한 항염증제 조성물을 개시한다.

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Description

좁은잎천선과 잎 추출물을 이용한 항염증제 조성물{Anti-inflammatory Composition Using a Extract of Ficus erecta Leaf}

본 발명은 좁은잎천선과 잎 추출물을 이용한 항염증제 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins) 의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비 해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.

따라서 염증성 사이토카인의 억제제나 iNOX 억제제 그리고 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명은 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성, iNOS 생성 억제 활성, COX-2 생성 억제활성 등을 가지는 좁은잎천선과 잎 추출물을 이용한 항염증제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 좁은잎천선과(Ficus erecta) 잎의 80% 에탄올 추출물, 이 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때, 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 NO(Nitric Oxide) 생성을 억제하고, PGE₂와 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제하며, 나아가 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 완성된 것이다.

따라서 본 발명의 항염증제 조성물은 좁은잎천선과의 잎 추출물 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미 한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "좁은잎천선과 잎 추출물"은 추출 방법을 불문하고 추출 대상인 좁은잎천선과의 잎을 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물을 상기 열거된 용매로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상인 좁은잎천선과 잎을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 상기 "좁은잎천선과 잎 추출물"은 바람직하게는 추출 대상인 좁은잎천선과 잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 것으로서, 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 의미하며, 더 바람직하게는 그 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄 또는 물과 에틸아세테이트로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물, 또는 그 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물을 의미한다. 여기서 "순차적으로 분획한다"는 것의 의미는 물층의 분획물을 분획 후에도 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

바람직하게는 상기 염증성 질환은 관절염(특히 류머티스성 관절염)을 의미한 다. 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되듯이 디클로로메탄 분획물을 carrageenan에 의하여 관절염이 유발된 실험동물에 투여할 경우, 발의 부종 정도를 완화시키는 효과에 있어서 양성대조군인 조인스정®(SK제약)과 유사한 수준의 활성을 보였다. 이러한 동물실험 결과는 본 발명의 항염증제 조성물이 특히 관절염에 유용한 적응증을 가질 것임을 보여준다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 추출물을 유효성분으로 포함하는 iNOS 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, iNOS의 억제는 NO의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실험예는 본 발명의 좁은잎천선과 잎 추출물이 NO의 생성을 억제하고 iNOS의 발현을 단백질 수준에서 억제함으로 보여주고 있으며, iNOS의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "iNOS 억제"의 의미는 iNOS 유전자의 발현 억제 및 iNOS 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 NO의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 추출물을 유효성분으로 포함하는 COX-2 억제제 조성물에 관한 것이다.

전술하였지만, COX의 억제는 PGE₂의 생성을 억제시켜 염증성 질환의 개선을 가져올 수 있다.

본 발명의 아래의 실시예는 본 발명의 좁은잎천선과 잎 추출물이 PGE₂의 생성을 억제하고 COX-2의 발현을 단백질 수준에서 억제함으로 보여주고 있으며, COX-2의 발현을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주고 있다.

본 명세서에서, "COX-2 억제"의 의미는 COX-2 유전자의 발현 억제 및 COX-2 생성 억제를 포함하는 의미이며, 중간 기작이 어떻든 PGE₂의 생성의 억제 및/또는 감소를 포함하는 의미이다.

한편 본 발명의 조성물(즉 항염증제 조성물, iNOS 억제제 조성물 및 COX-2 억제제 조성물을 말함; 이하 같음)은 그 유효성분인 상기 정의된 좁은잎천선과 잎 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효물질인 좁은잎천선과 잎 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산 제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 유효성분인 좁은잎천선과 잎 추출물이 포함되는 것 이외에, 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 감미제, 사과, 레몬, 감귤 등의 과일이나 녹차잎, 둥굴레, 대잎 등의 차류에서 얻어진 풍미제, 카테킨, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤 등의 생리활성 성분, 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물 등의 미네랄 등이 또한 첨가될 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 관절염 또는 골다공증 예방)을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항염증제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항염증제 조성물은 기능성 음료나 약품으로 제품화되어 관절염 등의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 좁은잎천선과 잎 추출물 및 분획물의 제조

좁은잎천선과 잎 분말 100g을 80% 에탄올에 24시간 동안 침지시켜 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 용매를 제거하여 분말상의 추출물 10.83g을 얻었다.

그리고 상기 얻어진 에탄올 추출물 10g을 10배량의 증류수로 현탁시킨 후에 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올 (BuOH)로 순차적으로 분획하여 헥산층에서 1.39g(13.9%), 디클로로메탄층에서 0.92g(9.2%), 에틸아세테이트층에서 0.30g(3%), 부탄올층에서 1.08g(10.8%) 및 잔여 물층에서 5.97g(59.7%)의 분획물을 얻었다.

<실험예> 항염증 세포 실험 및 관절염 개선 효과 동물실험

<실험예 1> 항염증 세포 실험

<실험예 1-1> 세포 배양

대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받아 penicillin-streptomycin 100 units/㎖과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

<실험예 1-2> NO(Nitric oxide) 생성 억제 활성 평가

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 추출물 시료(100 ㎍/㎖)와 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포 배양 상등 액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 <도 1>에 나타내었다.

<도 1>을 참조하여 보면, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 유의 수준으로 NO 생성을 억제하였으며, 80% 에탄올 추출물의 경우도 NO 생성을 억제하였으나 유의성은 없었다. 부탄올 분획물이나 물층의 경우는 NO 생성 억제 활성이 없었다.

<실시예 1-3> 세포독성 평가 (LDH assay)

RAW 264.7 세포(1.5×10⁵cells/㎖)를 DMEM 배지에 추출물 시료(100 ㎍/㎖)와 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후, 배양 배지를 얻어 12,000rpm에서 3분간 원심분리 하였다. Lactate dehydrogenase (LDH) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit(Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50㎕와 reconstituted substrate mix를 50㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(무처리군)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다

결과를 <도 1>에 함께 나타내었는데, <도 1>를 참조하여 보면, 디클로로메탄 분획물이 약간의 세포 독성을 나타낸 것을 제외하고 모든 시료가 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다. 이러한 결과는 상기 NO 생성 억제 활성이 세포 독성에 의한 결과가 아님을 보여주는 것이라 할 수 있다.

<실시예 1-4> Prostaglandin E ₂ (PGE ₂ )생성 억제 활성 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도 (1㎎/㎖)로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE₂를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE₂의 측정은 PGE₂ ELISA assay kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다.

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 <도 2>에 나타내었다.

<도 2>를 참조하여 보면, <도 1>의 결과와 유사하게 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 유의 수준으로 PGE₂ 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.

<실시예 1-5> 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 생성 활성 억제 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(1㎎/㎖)로 조제된 추출물 시료 50㎕와 450㎕의 LPS(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 염증성 사이토카인을 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 그리고 IL-6는 ELISA assay kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다

결과를 대조군(LPS만의 처리군)에 대한 백분율로 <도 3> 내지 <도 5>에 나타내었는데, 대체로 상기 <도 1> 및 <도 2>의 결과와 유사하게 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성을 보였다.

<실시예 1-6> iNOS 및 COX 발현 억제 활성 평가

상기 <실시예 1-5>에서 배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline(PBS)로 세척 한 후 세포 용해버퍼[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 ㎍/㎖ aprotinin, 25 ㎍/㎖ leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4℃, 15,000rpm에서 15분 간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20~30㎍를 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane(BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS(0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를, COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액에서 1:1000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

결과를 <도 6>에 나타내었는데, 앞의 결과들과 유사하게 80% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 iNOS 및 COX 발현 억제 활성을 보였다.

통계 분석

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 평균±표준편차로 나타내었고, 통계학적 유의차는 one way ANOVA test 및 student’s t-test로 평가하였다. 유의 수준은 p < 0.05 및 p < 0.01 이하로 하였다.

<실험예 2> 관절염 개선 효과 동물 실험

<실험예 1>에서 효과가 가장 우수한 것으로 나타난 좁은잎천선과 잎의 디클로로메탄 분획물을 부형제인 0.5% Carboxy methyl Cullulose(CMC)에 현탁하여 중앙실험동물(주)에서 구입한 Sprague-Dawley(SD) 계통의 특정병원균 부재(SPF) 랫드에 10mg/kg과 100mg/kg의 투여액량으로 경구투여하였다. 양성대조군은 SK케미컬의 조인스정을 사용하였다.

급성관절염 유도는 랫드의 발다닥 용적을 plethysmometer로 측정한 후 시험물질을 경구투여하고 30분 후에 우측 뒷 발다닥에 기염제로 1% carrageenan/생리식염수를 0.1㎖씩 피하주사하여 급성관절염을 유발시켰다.

부종 측정은 부종 유발 후 1시간 간격으로 5회에 걸쳐 부종의 용적을 측정한 후 시험물질 투여전 용적을 기준으로 하여 부종율을 아래의 식으로 계산하고 결과를 <도 7>에 나타내었다.

부종율(E) % = (Vt-Vn)/Vn x 100

Vt: 기염제 주사후 발바닥의 용적

Vn: 기염제 주사전 발바닥의 용적

<도 7>을 참조하여 보면, 대조군의 경우 부종 유발 후 3시간 경과시에 96.6%의 최대 부종증가율을 나타냈으며, 4시간 경과부터 부종 증가율이 떨어졌다. 좁은잎천선과나무 투여군은 10mg/kg과 100mg/kg 투여군 모두 전 측정 기간에 걸쳐 대조군에 비하여 유의성 있는 수준으로 부종 증가율이 감소하였다. 양성대조군인 조인 스정 투여군에서는 10mg/kg의 경우 4시간에서 100mg/kg의 경우에는 2시간 경과 후부터 각각 대조군에 비하여 유의성 있는 수준으로 부종 증가율이 감소하였다.

통계 분석

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 평균±표준편차로 나타내었고, 통계학적 유의차는 one way ANOVA test 및 student’s t-test로 평가하였다. 유의 수준은 p < 0.05 및 p < 0.01 이하로 하였다.

도 1은 좁은잎천선과 잎 추출물의 NO 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 2는 좁은잎천선과 잎 추출물의 PGE₂ 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 3은 좁은잎천선과 잎 추출물의 TNF-α의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 4는 좁은잎천선과 잎 추출물의 IL-1β의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 5 좁은잎천선과 잎 추출물의 IL-6의 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 6은 좁은잎천선과 잎 추출물의 iNOS 및 COX 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 7은 관절염을 유발시킨 실험동물에서 좁은잎천선과 잎 추출물의 발 부종 을 완화시키는 활성을 보여주는 결과이다.

Claims (8)

1. 좁은잎천선과의 잎 추출물 유효성분으로 포함하는 항염증제 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 추출물은 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 하나인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.

   (Ⅰ) 좁은잎천선과의 잎을 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물;

   (Ⅱ) 좁은잎천선과 잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄 또는 물과 에틸아세테이트로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물; 및

   (Ⅲ) 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 항염증은 염증성 질환의 개선, 치료, 발병 억제 또는 발병 지연을 의미하며,

   상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진 및 다발성 경화증 중 하나인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 항염증은 염증성 질환의 개선, 치료, 발병 억제 또는 발병 지연을 의미하며,

   상기 염증성 질환은 관절염인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 조성물은 약품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
7. 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 어느 하나의 좁은잎천선과 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 iNOS 억제제 약품 조성물.

   (Ⅰ) 좁은잎천선과의 잎을 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물;

   (Ⅱ) 좁은잎천선과 잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄 또는 물과 에틸아세테이트로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물; 및

   (Ⅲ) 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물.
8. 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 어느 하나의 좁은잎천선과 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 COX-2 억제제 약품 조성물.

   (Ⅰ) 좁은잎천선과의 잎을 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물;

   (Ⅱ) 좁은잎천선과 잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄 또는 물과 에틸아세테이트로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물; 및

   (Ⅲ) 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물.

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