KR101110064B1

KR101110064B1 - 항염증성 조성물

Info

Publication number: KR101110064B1
Application number: KR1020090050593A
Authority: KR
Inventors: 현창구; 양은진; 문지영; 김민진; 이욱재; 이남호
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2012-03-14
Also published as: KR20100131809A

Abstract

본 발명은 항염증성 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 미역쇠(Petalonia binghamiae), 꼬마모자반(Sargassum nipponicum Yendo), 미끈뼈대그물말(Dictyopteris divaricata), 바위수염(Myelophycus simplex) 등의 해조류 추출물을 유효성분으로 하는 항염증성 조성물에 관한 것이다.

염증, 해조류

Description

항염증성 조성물{Anti-inflammatory Composition}

본 발명은 항염증성 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 미역쇠 추출물, 꼬마모자반 추출물, 바위수염 추출물 등 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리?화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins) 의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비 해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.

따라서 iNOX 억제 활성이나 COX-2 억제 활성, NO, PGE₂, TNF-α, IL-6 등 염증 매개 인자의 억제 활성을 갖는 물질은 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명은 항염증성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 구체적인 양태는 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자는 하기 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 미역쇠, 꼬마모자만, 미끈뼈대그물말 등 아래 <표 1>의 29종의 해조류를 80% 에탄올로 추출하고 그 추출물을 증류수와 에틸아세테이트층으로 분획한 다음에 그 에틸아세테이트층 분획물을 LPS(lipopolysaccharide)로 염증반응을 유도시킨 RAW 264.7 세포에 처리한 결과, 모든 해조류 추출물이 NO 생성 억제 활성, PGE₂ 생성 억제 활성, IL-6 생성 억제 활성 및/또는 TNF-α 생성 억제 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 실험 결과에 기초하여 제공되는 것이다.

따라서 본 발명의 항염증성 조성물은 미역쇠(Petalonia binghamiae), 꼬마모자반(Sargassum nipponicum Yendo), 미끈뼈대그물말(Dictyopteris divaricata), 바위수염(Myelophycus simplex), 애기마디잘록이(Lomentaria hakodatensis Yendo), 가시뼈대그물말(Dictyopteris prolifera), 붉은까막살(Prionitis cornea), 패(Ishige okamurae Yendo), 진두발(Chondrus ocellatus Holmes), 가는개도박(Grateloupia lanceolata), 참갈고리풀(Bonnemaisonia hamifera), 타래서 실(Laurencia intricata Lamouroux), 감태(Ecklonia cava Kjellman), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 빈참지누아리(Grateloupia filicina), 불레기말(Colpomenia sinuosa), 주름붉은잎(Callophyllis crispata), 바위두둑(Leathesia difformis), 부챗말(Padina arborescens), 그물바구니 (구멍볼레기말)(Hydroclathrus clathratus), 쌍발이서실(Laurensia okamurae), 서실(Chondria crassicaulis), 참도박(Grateloupia elliptica), 지충이(Sargassum thunbergii), 가는미역실(Scytosiphon gracilis), 주름진두밭(Chondrus crispus), 애기풀가사리(Gloiopeltis furcata), 까막살(Carpopeltis affinis) 및 톳(Hizikia fusiformis) 중 어느 하나의 해조류 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

바람직하게는 NO 생성 억제 활성, PGE₂ 생성 억제 활성, IL-6 생성 억제 활성 및 TNF-α 생성 억제 활성을 모두 가지는 미역쇠(Petalonia binghamiae), 꼬마모자반(Sargassum nipponicum Yendo), 미끈뼈대그물말(Dictyopteris divaricata), 바위수염(Myelophycus simplex), 애기마디잘록이(Lomentaria hakodatensis Yendo), 가시뼈대그물말(Dictyopteris prolifera), 붉은까막살(Prionitis cornea), 진두발(Chondrus ocellatus Holmes), 타래서실(Laurencia intricata Lamouroux), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 빈참지누아리(Grateloupia filicina), 불레기말(Colpomenia sinuosa), 주름붉은잎(Callophyllis crispata), 바위두둑(Leathesia difformis), 부챗말(Padina arborescens), 그물바구니 (구멍볼레기 말)(Hydroclathrus clathratus), 쌍발이서실(Laurensia okamurae), 서실(Chondria crassicaulis), 참도박(Grateloupia elliptica), 지충이(Sargassum thunbergii), 가는미역실(Scytosiphon gracilis), 주름진두밭(Chondrus crispus), 애기풀가사리(Gloiopeltis furcata), 까막살(Carpopeltis affinis) 및 톳(Hizikia fusiformis) 중 어느 하나 해조류 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서 "해조류 추출물"은 추출 방법을 불문하고 상기 해조류를 메탄올, 증류수, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 포화노말부탄올, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 물, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 더 정제된 분획을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상인 해조류를 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 상기 "해조류 추출물"은 바람직하게는 해조류를 물, 증류수, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 추출 용매를 제거하여 고형상의 추출물을 얻고 그 고형상의 추출물을 에탄올층과 에틸아세테이트층으로 분획한 후 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물을 말한다. 더 바람직하게는 해조류를 에탄올 수용액으로 추출하고 추출 용매를 제거하여 고형상의 추출물을 얻고 그 고형상의 추출물을 에탄올층과 에틸아세테이트층으로 분획한 후 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물을 말한다. 상기 에탄올 수용액은 바람직하게는 에탄올 함량이 70% 내지 90%의 에탄올 수용액이다. 여기서 %는 부피 백분율(v/v)을 의미한다.

본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내 거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료 및 그러한 질환의 발병 억제/지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리?화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과 적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

한편 본 발명의 조성물은 그 유효성분인 상기 해조류 추출물을 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효물질인 해조류 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 적응증이 피부염 등인 경우에는 국소적으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 껌류, 비타민 복합제, 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 유효성분인 해조류 추출물이 포함되는 것 이외에, 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 감미제, 사과, 레몬, 감귤 등의 과일이나 녹차잎, 둥굴레, 대잎 등의 차류에서 얻어진 풍미제, 카테킨, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤 등의 생리활성 성분, 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물 등의 미네랄 등이 또한 첨가될 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 골다공증 예방 등)을 추가하기 위하여 여러 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 항염증 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항염증 조성물은 약제학적 조성물 또는 식품 조성물로 응용되어 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 해조류의 추출물 제조

아래 <표 1>의 29종의 각 해조류를 80% 에탄올에 침지시켜 상온에서 24시간 동안 추출한 후 추출 잔사를 제거하고 감암농축하여 추출 용매를 제거한 후 고형상의 추출물을 얻었다. 그 각 해조류의 고형상의 추출물 3g을 증류수 300 ml와 에틸아세테이트 300 ml에 넣고 상온에서 72시간 동안 추출하여 에틸아세테이트층을 감압농축하여 동결건조하였다. 각각의 시료는 분주하여 DMSO에 녹여 사용하였다.

추출에 사용한 해조류

시료번호	시료	학명
JBR163	미역쇠	Petalonia binghamiae
JBR243	꼬마모자반	Sargassum nipponicum Yendo
JBR246	미끈뼈대그물말	Dictyopteris divaricata
JBR256	바위수염	Myelophycus simplex
JBR261	애기마디잘록이	Lomentaria hakodatensis Yendo
JBR267	가시뼈대그물말	Dictyopteris prolifera
JBR268	붉은까막살	Prionitis cornea
JBR270	진두발	Chondrus ocellatus Holmes
JBR271	패	Ishige okamurae Yendo
JBR272	가는개도박	Grateloupia lanceolata
JBR274	참갈고리풀	Bonnemaisonia hamifera
JBR276	타래서실	Laurencia intricata Lamouroux
JBR278	감태	Ecklonia cava Kjellman
JBR345	고리매	Scytosiphon lomentaria
JBR348	빈참지누아리	Grateloupia filicina
JBR351	불레기말	Colpomenia sinuosa
JBR354	주름붉은잎	Callophyllis crispata
JBR359	바위두둑	Leathesia difformis
JBR368	부챗말	Padina arborescens
JBR374	그물바구니 (구멍볼레기말)	Hydroclathrus clathratus
JBR375	쌍발이서실	Laurensia okamurae
JBR376	서실	Chondria crassicaulis
JBR510	참도박	Grateloupia elliptica
JBR511	지충이	Sargassum thunbergii
JBR512	가는미역실	Scytosiphon gracilis
JBR514	주름진두발	Chondrus crispus
JBR518	애기풀가사리	Gloiopeltis furcata
JBR519	까막살	Carpopeltis affinis
JBR538	톳	Hizikia fusiformis

<실시예 2> 세포 배양 및 시약

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 항온기 (incubator)에서 배양하였으며, 2~3일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

세포 계대 배양에 사용된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 배지와 fetal bovine serum (FBS)은 Hyclone (Logan, Utah, USA)에서 구입하였고, lipopolysaccharide (LPS, E. coli serotype 0111:B4)는 sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. TNF-α와IL-6 정량을 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 BD Biosciences (San Diego, USA)로부터 구입하였으며, PGE₂정량을 위한 ELISA kit는 R&D systems (Minneapolis, USA)으로부터 구입하였다.

<실시예 3> Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/㎖)를 18시간 전 배양 후 시료(25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였고, 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100 ㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 동량 혼합하여 10분간 실온 암소에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution하여 얻었다 (10-100μM).

결과를 <표 2>에 나타내었다.

NO 생성 억제 활성

시료번호	처리 농도(㎍/㎖)	NO 생성 억제 활성(%)
JBR163	50	59.1±0.1*
JBR243	100	72.1±2.7**
JBR246	50	81.6±0.0**
JBR256	100	81.9±0.3**
JBR261	50	77.8±1.5**
JBR267	100	78.2±0.3**
JBR268	100	77.9±0.3**
JBR270	100	78.2±0.3**
JBR271	100	30.8±0.9*
JBR272	100	81.3±0.1**
JBR274	100	81.8±0.1**
JBR276	100	80.4±0.6**
JBR278	100	43.3±1.5**
JBR345	100	70.4±0.2**
JBR348	100	77.8±0.2**
JBR351	50	76.2±0.3**
JBR354	100	83.6±0.0**
JBR359	100	81.9±0.5**
JBR368	100	59.7±0.4**
JBR374	25	38.5±0.6**
JBR375	25	82.4±0.1**
JBR376	100	75.7±0.0**
JBR510	50	78.2±0.4**
JBR511	50	77.3±0.2**
JBR512	50	77.2±0.6**
JBR514	100	77.9±0.1**
JBR518	50	77.6±0.5**
JBR519	50	77.0±0.2**
JBR538	50	77.2±0.1**
- Data represent MEAN±SD of independent observations performed in triplicate. - * p<0.05, ** p<0.01

상기 실험 결과는 시료를 저농도부터(즉 25 ㎍/㎖부터) 처리하고 유의미한 NO 생성 억제 활성이 나타나지 않을 경우 농도를 100 ㎍/㎖까지 높여가면서 처리한 결과이다.

그리고 상기 각 시료가 유의미한 NO 생성 억제 활성을 보이는 처리 농도에서의 세포 독성은 아래의 <표 4>에 나타내었다.

상기 <표 2>의 결과와 아래 <표 4>의 결과를 종합할 때 상기 NO 생성 억제 활성을 보이는 각 시료의 농도에서 각 시료는 거의 세포 독성을 나타내지 않는다는 점에서 상기 각 시료는 모두 NO 생성 억제 활성을 가짐을 알 수 있다

<실시예 4> 염증 매개 인자인 PGE ₂ , TNF-α및 IL-6의 정량

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포 (4.0×10⁵cells/㎖)를 18시간 전 배양하고 각 시료를 상기 <표 2>의 농도로 LPS (1 ㎍/㎖)와 동시처리 하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 PGE₂, TNF-α와 IL-6 함량을 측정하였다. 정량은 murine enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다 (Cho et al., 2000).

결과를 아래의 <표 3>에 나타내었다.

염증 매개 인자의 억제율

시료 번호	억제율(%)
시료 번호	PGE2	IL-6	TNF-α
JBR163	83.8±1.2**	77.3±0.9**	40.0±2.1**
JBR243	86.2±0.8**	74.9±7.2**	90.0±2.6**
JBR246	97.0±0.2**	91.9±0.0**	68.5±4.9
JBR256	65.0±0.8**	74.5±4.5**	51.8±1.2**
JBR261	83.2±3.0**	57.5±3.1**	53.0±0.9**
JBR267	99.0±0.1**	95.3±0.4**	59.7±0.6**
JBR268	86.2±0.8**	58.5±4.6**	51.3±2.1**
JBR270	90.7±1.0**	83.1±2.4**	71.0±1.9**
JBR271	N.D	47.1±0.7**	3.1±0.8*
JBR272	N.D	90.1±0.6**	72.4±2.7**
JBR274	N.D	18.0±0.6**	73.8±0.0**
JBR276	34.5±1.6**	74.4±1.7**	43.7±0.9**
JBR278	30.7±2.0**	52.6±0.2**	N.D
JBR345	89.9±1.5**	90.4±0.2**	55.2±0.3**
JBR348	53.7±3.2**	80.8±4.8**	63.1±4.1**
JBR351	77.6±1.7**	32.7±0.5**	54.7±1.3
JBR354	84.7±3.1**	90.4±0.5**	75.7±0.9**
JBR359	53.6±7.1**	82.0±1.5**	81.0±0.1**
JBR368	80.5±0.9**	71.3±3.7**	80.9±0.7**
JBR374	42.6±0.6**	49.3±0.5**	57.7±0.8**
JBR375	82.1±4.2**	76.9±0.6**	52.5±0.0**
JBR376	90.7±1.0**	84.8±0.6**	84.8±0.6**
JBR510	81.0±4.8	85.7±0.8	63.8±0.8**
JBR511	73.8±4.0	46.9±4.4**	63.1±1.2**
JBR512	86.9±0.6**	77.9±6.3**	74.5±0.6**
JBR514	89.8±0.2**	92.5±0.2**	92.5±0.7**
JBR518	85.6±0.6**	82.1±2.2**	70.9±1.3**
JBR519	84.9±1.2**	69.2±2.4**	57.5±0.3**
JBR538	81.0±4.8**	69.9±6.7**	61.5±3.9**
N.D, not detected Data represent MEAN±SD of independent observations performed in triplicate. * p<0.05, **p<0.01

상기 <표 3>의 각 시료의 염증 매개 인자 생성 활성은 시료를 <표 1>의 농도로 LPS와 함께 처리한 결과이다.

그리고 <표 2>의 농도에서 시료의 세포 독성은 아래의 <표 4>에서 확인할 수 있다.

상기 <표 3>의 결과와 아래 <표 4>의 결과를 종합할 때 상기 각 시료는 염증 매개 인자 즉 PGE₂, TNF-α및 IL-6의 생성 억제 활성을 가짐을 알 수 있다.

<실시예 5> 세포독성 평가

세포독성은 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 생존하면서 대사가 왕성한 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈수소효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT [3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]를 환원시켜 자주색을 띠는 비 수용성의 formazan을 형성한다 (Gerlier et al., 1986; Liu, 1999). RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/㎖)에 각 시료를 상기 <표 2>의 농도로 LPS (1 ㎍/㎖)와 동시 처리하고 24시간 배양한 후, MTT (Sigma, MO, USA) 용액 50 ㎕ (2 ㎖/㎎)를 첨가하여 4시간 동안 반응시킨다. 상층액을 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO : Sigma, MO, USA)를 200 ㎕를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader (Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 독성 정도를 평가하였다.

결과는 아래와 같다.

세포 독성

시료번호	처리 농도(㎍/㎖)	세포 생존율(%)
JBR163	50	84.7±11.0*
JBR243	100	132.5±5.2
JBR246	50	108.8±9.9*
JBR256	100	105.5±1.6
JBR261	50	102.5±11.1
JBR267	100	104.9±3.6*
JBR268	100	99.6±6.1
JBR270	100	106.1±12.4
JBR271	100	118.6±3.8**
JBR272	100	97.0±6.5
JBR274	100	99.5±1.0
JBR276	100	87.5±5.3*
JBR278	100	109.0±3.5*
JBR345	100	93.6±6.9
JBR348	100	114.4±6.6**
JBR351	50	102.3±8.1
JBR354	100	79.7±5.9**
JBR359	100	92.7±3.4*
JBR368	100	87.8±8.7*
JBR374	25	92.5±7.6*
JBR375	25	91.4±2.4**
JBR376	100	100.4±12.3
JBR510	50	89.4±6.9*
JBR511	50	98.0±3.7
JBR512	50	92.4±3.6
JBR514	100	83.3±2.8**
JBR518	50	108.3±4.8*
JBR519	50	109.6±2.8**
JBR538	50	105.8±3.5**
- Data represent MEAN±SD of independent observations performed in triplicate. - * p<0.05, ** p<0.01

상기 <표 4>의 결과는 상기 각 실시예 시료의 NO 생성 억제 활성 및 염증 매개 인자의 생성 억제 활성이 세포 독성에 의한 결과가 아님을 보여준다.

통계처리

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error (SE) 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student’s t-test 분석방법을 사용하였다.

Claims

미역쇠(Petalonia binghamiae), 미끈뼈대그물말(Dictyopteris divaricata), 바위수염(Myelophycus simplex), 애기마디잘록이(Lomentaria hakodatensis Yendo), 가시뼈대그물말(Dictyopteris prolifera), 붉은까막살(Prionitis cornea), 타래서실(Laurencia intricata Lamouroux), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 빈참지누아리(Grateloupia filicina), 불레기말(Colpomenia sinuosa), 주름붉은잎(Callophyllis crispata), 바위두둑(Leathesia difformis), 부챗말(Padina arborescens), 그물바구니 (구멍볼레기말)(Hydroclathrus clathratus), 쌍발이서실(Laurensia okamurae), 서실(Chondria crassicaulis), 참도박(Grateloupia elliptica), 지충이(Sargassum thunbergii), 가는미역실(Scytosiphon gracilis), 주름진두밭(Chondrus crispus), 및 애기풀가사리(Gloiopeltis furcata) 중 어느 하나의 해조류를, 메탄올, 증류수, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 포화노말부탄올, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 물, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 해조류 추출물 또는 그 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물.
삭제
제1항에 있어서,

상기 분획물은 상기 어느 하나의 해조류를 에탄올 수용액으로 추출하고 추출 용매를 제거하여 고형상의 추출물을 얻고 그 고형상의 추출물을 에탄올층과 에틸아세테이트층으로 분획한 후 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
제3항에 있어서,

상기 에탄올 수용액은 그 에탄올 함량이 70% 내지 90%의 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
제1항에 있어서,

상기 항염증성은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 염증성 질환의 개선, 치료, 발병 억제 또는 발병 지연인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.