KR102392535B1 - 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물 - Google Patents

지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물에 관한 것으로, ALDH2의 과발현 또는 미세먼지 감소 여부를 이용하여 미세먼지 제거용 조성물을 스크리닝할 수 있으며, 상기 스크리닝된 지충이를 이용하여 미세먼지에 의해 유도되는 피부세포 보호용 조성물 개발에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물{Composition for removing particulate matter comprising extracts of sargassum thunbergii or a fraction thereof}
본 발명은 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물 및 이를 포함하는 피부세포 보호용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 미세먼지 저감용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다. 미세먼지는 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날려 내려오는 직경 10㎛ 이하의 입자상 물질을 말한다. 석탄, 석유 등의 화석연료가 연소될 때 또는 제조업ㆍ자동차 매연 등의 배출가스에서 나오며, 기관지를 거쳐 폐에 흡착되어 각종 폐질환을 유발하는 대기오염물질이다. 환경부에 따르면 2017년 3월 우리나라와 국제적으로 사용하는 미세먼지에 대한 용어가 달라 혼란스럽다는 지적에 따라 지름이 10㎛ 이하인 미세먼지(PM10)는 부유먼지, 지름이 2.5㎛ 이하인 초미세먼지(PM2.5)는 미세먼지로 정의한다.
미세먼지, 황사 등과 같은 오염 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성산소(ROS)에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다. 활성산소는 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하려는 성질을 가지고 있다. 이로 인해 적정량의 활성산소는 체내에 침입한 세균, 바이러스 등을 제거하는 생체 방어 기능을 가지고 있지만, 과량의 활성산소는 체내 세포분자들을 공격하게 되어 손상된 세포들로 인해 각종 질병들이 발생하게 된다.
최근에는 일일 미세먼지 농도가 환경기준치인 1㎥당 100㎍을 초과하는 고농도의 미세먼지 상태가 12시간 이상 지속된 사례가 빈번하게 관측되어 미세먼지로 인한 피해가 증가하고 있는 추세이다.
이에 따라, 미세먼지를 제거하거나 미세먼지에 대해 피부 세포를 보호할 수 있는 조성물의 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0059042호
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 지충이의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 미세먼지 제거용 조성물을 포함하는 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 미세먼지 제거용 조성물을 포함하는 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 스크리닝된 물질로서 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 스크리닝된 물질로서 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 지충이의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “지충이”는 모자반과이며 학명은 Sargassum　thunbergii이고, 식물체는 흑갈색으로 부착기는 납작한 방석 모양(소반)으로 원기둥 모양의 짧은 줄기가 나오고 줄기는 단독 혹은 여러 개의 중심가지로 분지한다. 체장 30-100cm정도로 자란다.
본 발명에서 용어, “추출물”은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조한 해조류로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 해조류의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
상기 지충이 추출물은 지충이에 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하여 수득할 수 있다. 구체적으로 지충이 추출물은 건조된 지충이 분말에 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 추출 용매로써 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 지충이의 100% 에탄올 추출물을 제조하여, 실험에 사용하였다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 지충이(Sargassum thunbergii) 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
본 발명에서 “미세먼지”는 지름 10㎛ 이하의 부유입자를 의미하며, 구체적으로 탄소성분(유기탄소, 원소탄소), 이온성분(황산염, 질산염, 암모늄), 광물성분 등으로 구성되어 있으며, 생물학적으로 영향을 줄 수 있는 금속 성분도 포함할 수 있다.
본 발명에서 “미세먼지”는 산화적 스트레스, 염증을 유발하는 유해성분을 포함하며, 상기 미세먼지는 PM10 이하의 미세먼지일 수 있으며, 구체적으로 에틸아세테이트를 첨가하여 제조된 PM10 이하의 에틸아세테이트 분획물(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, EtOAc fraction of < PM10, 이하 PM10 이라 함)로, 도 1에 나타난 바와 같이, 2018년에 포집된 미세먼지에서 16종의 성분, 2019년 포집된 미세먼지에서 31종의 유해성분을 포함한다.
상기 미세먼지 또는 미세먼지의 PM10 이하의 에틸아세테이트 분획물은 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “미세먼지 제거”는 미세먼지의 유해성분을 감소 또는 제거시키는 것으로, 구체적으로 미세먼지 또는 미세먼지의 PM10 이하의 에틸아세테이트 분획물에 포함된 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 감소 또는 제거시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 지충이의 100% 에탄올 추출물이 미세먼지의 유해성분인 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 또는 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)등의 화합물을 제거 또는 감소시키는 것을 확인하였다(도 12 내지 도 15).
또한, 상기 미세먼지 제거는 ALDH2의 유전자 또는 단백질의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 상기 미세먼지(PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물을 피부 각질형성세포주에 처리하고 알데하이드 탈수소 효소의 mRNA 발현을 분석한 결과, ALDHH2의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6). 또한, 미세먼지(PM10)와 지충이 100% 에탄올 추출물을 함께 처리한 경우 ALDHH2의 발현이 더욱 증가하여 지충이 100% 에탄올 추출물이 ALDHH2 발현증가를 통해 미세먼지(PM10)에 대해 피부 각질형성세포주에서 세포 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일실시예에서 ALDH2 inhibitor(Diadzin, santa cruz)와 지충이 에탄올 추출물(STE)을 함께 처리한 경우, 지충이 에탄올 추출물(STE)이 미세먼지의 유해성분인 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 또는 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)을 제거하지 못하는 것을 확인하였다. 따라서, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 이들 유해 화합물의 제거에는 ALDH2의 발현이 필요한 것을 확인하였다(도 12 내지 도 15).
상기 미세먼지 제거용 조성물은 미세먼지 제거용 화장료 조성물 또는 미세먼지 제거용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 미세먼지 제거용 화장료 조성물은 유효성분인 지충이 추출물 또는 이의 분획물 이외에, 미세먼지 제거 또는 저감 효과를 상승 또는 보강시킬 수 있도록 미세먼지 제거 또는 저감 효과가 있다고 알려진 화합물이나 천연 추출물을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 미세먼지 제거용 화장료 조성물에 있어서, 그 유효성분은 미세먼지 제거 또는 저감 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.99 중량 % 범위 내에서 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 미세먼지 제거 또는 저감 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 미세먼지 제거 조성물이 화장료 조성물로 적용되는 경우 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 구체적으로, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미세먼지 제거용 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 미세먼지 제거용 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 5 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료의 제조되는 제형에 따라 또한 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 미세먼지 제거용 조성물이 미세먼지 제거용 식품 조성물로 사용되는 경우, 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 지충이의 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 지충이의 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 이너뷰티 푸드(inner beauty) 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 미세먼지 제거 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티(inner beauty)는‘먹는 화장품 또는 뷰티푸드’로 일컬어지는 이너뷰티 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 상기 지충이의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품만 사용하는 것에 비해 미세먼지 제거 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적이다.
본 발명은 다른 양태로 미세먼지 제거용 조성물을 포함하는 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 미세먼지 제거용 조성물, 미세먼지, 화장료 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일실시예에서 지충이 에탄올 추출물이 미세먼지에 포함된 유해 화합물을 제거 또는 감소시키는 것을 확인하였으며(도 12 내지 도 15), 피부 각질형성세포주에 독성이 없으며, 피부 각질형성세포주에서 미세먼지에 의해 유발된 독성을 감소시키고 ROS 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 7 내지 도 11). 또한, 제브라피쉬에서 미세먼지에 의해 유발된 세포독성을 감소시키고 ROS와 NO 생성을 감소시키는 것을 확인하여 제브라피쉬에 보호 효과가 있는 것을 확인하였다(도 16 내지 도 18).
즉, 지충이 에탄올 추출물이 미세먼지의 유해성분 화합물을 제거 또는 저감시켜 피부 각질형성세포주를 보호함을 확인하였는 바, 본 발명의 조성물은 미세먼지 제거 또는 저감 효과를 통해 피부 각질형성세포주를 보호할 수 있는 바, 피부세포 보호용 화장료 조성물로 사용이 가능하다.
본 발명은 또 다른 양태로 미세먼지 제거용 조성물을 포함하는 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 미세먼지 제거용 조성물, 미세먼지, 피부세포 보호, 식품 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일실시예에서 지충이 에탄올 추출물이 미세먼지의 유해성분 화합물을 제거 또는 저감시켜 피부 각질형성세포주를 보호함을 확인하였는 바, 본 발명의 조성물은 미세먼지 제거 또는 저감 효과를 통해 피부 각질형성세포주를 보호할 수 있는 바, 피부세포 보호용 식품 조성물로 사용이 가능하다.
본 발명은 또 다른 양태로 후보물질을 실험구에 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 실험구에서 ALDH2의 수준을 측정하는 단계 및; 후보물질을 처리하지 않은 대조구의 ALDH2의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 미세먼지 제거용 조성물은 미세먼지 제거용 화장료 조성물 또는 미세먼지 제거용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에서 미세먼지 제거, 화장료 조성물, 식품 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "후보물질"은, 분리된 기관, 조직, 세포 또는 인간을 제외한 동물에서 ALDH2를 과발현시켜 미세먼지의 유해성분을 감소시킬 것으로 추정되는 물질을 의미한다.
상기 후보물질은 천연물의 추출물, 또는 이의 분획물, 합성화합물, 천연화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 용어 “실험구”는 후보물질을 처리한 분리된 기관, 조직, 세포 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.
본 발명의 용어 "대조구"란 후보물질을 처리하지 않은 분리된 기관, 조직, 세포 또는 인간을 제외한 동물로, 상기 후보물질을 처리한 구과 병렬 관계에 속하는 분리된 기관, 조직, 세포 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.
상기 분리된 기관, 조직, 또는 세포는 피부에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “ALDH2”는 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase) 군에 속하는 단백질 또는 이의 유전자이다. 상기 단백질은 ALDH2 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명에서 “ALDH2의 수준 측정”은 ALDH2의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 의미한다.
상기 “유전자의 발현 수준 측정”은 후보물질을 처리한 실험구 또는 비처리한 대조구에서 ALDH2의 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자 발현 분석에 사용되는 DNA 또는 RNA의 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용 가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 상기 "ALDH2의 단백질 발현 수준 측정"은 후보물질을 처리한 구 또는 비처리한 대조구에서 ALDH2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 단백질의 양을 측정한다.
또한, 상기 "ALDH2의 단백질 발현 수준 측정"은 후보물질을 처리한 구 또는 비처리한 대조구에서 ALDH2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 단백질의 양을 측정한다.
상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 실험구와 대조구에 미세먼지 분획물을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 미세먼지를 이용하여 미세먼지의 분획물을 제조할 수 있으며, 상기 미세먼지의 분획물은 PM10 이하의 미세먼지에 에틸아세테이트를 첨가하여 제조된 에틸아세테이트 분획물(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, EtOAc fraction of < PM10, 이하 PM10 이라 함)일 수 있다.
상기 미세먼지의 분획물은 유해성분인 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법은 지충이 추출물 처리시 ALDH2가 과발현되고, 지충이 추출물이 미세먼지에 포함된 유해성분인 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 제거 또는 감소시켜 미세먼지에 대한 피부세포 보호가 효과가 우수함을 확인함으로써, ALDH2 발현과 상기 유해성분 화합물의 함량을 미세먼지 제거용 후보물질을 처리하지 않은 대조구와 비교하는 방식으로 고안되었다.
전술한 실시예에서, 피부 각질형성세포주에서 지충이 추출물이 ALDH2의 발현을 유도하고, 미세먼지룰 처리한 피부 각질형성세포주에서 미세먼지 유해성분인 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 감소시키는 것을 확인하였는바, 본 발명의 스크리닝 방법은 후보물질을 처리한 실험구에서 대조구보다 ALDH2의 수준이 증가하거나 상기 유해성분 화합물의 수준이 감소 또는 제거되는 경우 상기 후보물질을 미세먼지 제거 또는 저감용 조성물로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 물질로서 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 상기 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 물질, 즉 미세먼지를 제거 또는 저감하거나 ALDH2의 발현을 유도하는 것으로 스크리닝된 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 피부세포 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 상기 미세먼지를 제거하고 미세먼지에 대한 피부세포 보호 효과를 가지는 물질로서, 지충이 추출물 또는 분획물이 스크리닝되었으나, 이에만 한정되지 않는다.
본 발명에서 미세먼지 제거, 피부세포 보호, 화장료 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명은 다른 양태로 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 물질로서 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 대한 피부세포 보호용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 상기 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 물질, 즉 미세먼지를 제거 또는 저감하거나 ALDH2의 발현을 유도하는 것으로 스크리닝된 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 피부세포 보호용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 상기 미세먼지를 제거하고 미세먼지에 대한 피부세포 보호 효과를 가지는 물질로서, 지충이 추출물 또는 분획물이 스크리닝되었으나, 이에만 한정되지 않는다.
본 발명에서 미세먼지 제거, 피부세포 보호, 식품 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명은 지충이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미세먼지 제거용 조성물에 관한 것으로, ALDH2의 과발현 또는 미세먼지 감소 여부를 이용하여 미세먼지 제거용 조성물을 스크리닝할 수 있으며, 상기 스크리닝된 지충이를 이용하여 미세먼지에 의해 유도되는 피부세포 보호용 조성물 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 2018년 및 2019년에 인천에서 포집된 미세먼지(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, EtOAc fraction of < PM10, 이하 PM10 이라 함) 유래 유해 성분을 분석한 결과이다.
도 2는 2018년 및 2019년에 포집한 미세먼지(PM10)의 피부 각질형성세포주에 대한 독성을 평가한 결과이다.
도 3은 피부 각질형성세포주에서 미세먼지(PM10) 처리 농도에 따른 ROS 생성량을 분석한 결과이다.
도 4는 피부 각질형성세포주에서 미세먼지(PM10) 처리 농도에 따른 IL-6, TNF-α, IL-1 베타의 mRNA 발현을 분석한 결과이다.
도 5는 피부 각질형성세포주에서 real-time PCR을 수행하여 미세먼지(PM10) 처리에 따른 ALDH mRNA 발현 수준을 분석한 것이다.
도 6은 피부 각질형성세포주에서 real-time PCR을 수행하여 지충이(Sargassum thunbergii) 에탄올 추출물(STE) 처리에 따른 ALDH mRNA 발현 수준을 분석한 것이다.
도 7은 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리 농도에 따른 피부 각질형성세포주에 대한 독성을 평가한 결과이다.
도 8은 미세먼지(PM10), 지충이 에탄올 추출물(STE) 또는 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리에 따른 피부 각질형성세포주에 대한 세포독성을 평가한 결과이다.
도 9는 미세먼지(PM10), 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE)의 처리 시간에 따른 피부 각질형성세포주에 대한 독성을 평가한 결과이다.
도 10은 피부 각질형성세포주에서 미세먼지(PM10), 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE)의 농도별 처리에 따른 ROS 생성량을 분석한 결과이다.
도 11은 피부 각질형성세포주에서 미세먼지(PM10), 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE), N-acetylcystein 처리에 따른 항산화 효과를 DCFDA를 이용하여 분석한 결과이다.
도 12는 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리 시간 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 ALDH2 inhibitor(Diadzin, santa cruz) 처리에 따른 미세먼지 성분 중 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene)의 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리 시간 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 ALDH2 inhibitor(Diadzin, santa cruz) 처리에 따른 미세먼지 성분 중 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-)의 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리 시간 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 ALDH2 inhibitor(Diadzin, santa cruz) 처리에 따른 미세먼지 성분 중 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol)의 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리 시간 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 ALDH2 inhibitor 처리(Diadzin, santa cruz)에 따른 미세먼지 성분 중 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)의 제거 효과를 나타낸 것이다.
도 16은 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10)에 의해 유발되는 ROS에 대한 지충이 에탄올 추출물(STE)의 효과를 분석한 결과이다.
도 17은 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10)에 의해 유발되는 세포 독성에 대한 지충이 에탄올 추출물(STE)의 보호효과를 분석한 결과이다.
도 18은 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10)에 의해 유발되는 NO 생성에 대한 지충이 에탄올 추출물(STE)의 효과를 분석한 결과이다.
도 19는 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10), 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리에 따른 ALDH2 mRNA 발현 수준을 분석한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<재료 및 실험방법>
실시예 1. 미세먼지의 포집 및 분석
인천 송도에서 오픈 박스(open box)를 활용하여 5층 이상의 건물 옥상에서 인위적인 외부오염이 없는 환경으로 미세먼지를 포집하였다.
포집된 미세먼지에 대한 성분 분석을 위하여 미세먼지의 분획물을 제조하였다. 먼저 쿼츠 마이크로파이버 필터(Quartz microfiber filter)를 이용하여 미세먼지를 PM10 이하로 분리하였으며, 상기에서 분리된 PM10 이하 미세먼지에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트 분획물(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, EtOAc fraction of < PM10, 이하 PM10 이라 함)을 제조하였다. 각각 준비하여 GC-MS를 활용하여 성분 분석을 수행하였으며, Nist 2.0 library 분석을 통해 성분 규명을 수행하였다.
실시예 2. 세포의 배양
피부 각질형성세포주(human keratinocyte cell) HaCaT 세포를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실시예 3. 세포독성 평가(MTT)
세포독성을 평가하고자, 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCaT 세포를 96 well plate에 1×105 세포/㎖로 접종하여 24시간동안 배양한 후, 각 웰에 적정농도의 미세먼지(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 미세먼지(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, PM10)을 처리하고 24시간 배양하였다. 다음으로 100㎕의 MTT 용액(2㎎/㎖)을 각 웰에 처리하고 4시간 반응시킨 후, 배지를 제거하였다. 각 웰의 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)에 DMSO 200㎕를 첨가하여 용해시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
상기 지충이 에탄올 추출물은 지충이에 100% 에탄올을 첨가하고 초음파 처리하는 추출과정을 반복하여 지충이 에탄올 추출물(STE)을 제조하였다.
실시예 4. 미세먼지에 의해 유발되는 염증성 사이토카인의 발현 분석
미세먼지(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, PM10)에 의해 염증이 유발되는 지를 확인하고자, 각질형성세포주(human keratinocyte cell)에 미세먼지(PM10)을 처리 후, 염증 인자인 TNF-알파, IL-1 베타, IL-6 유전자의 상대적 발현율을 분석하였다. 각질형성세포주에 미세먼지(PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)을 24시간 처리 후 세포를 회수하여, 전체 RNA(mRNA, rRNA, tRNA)를 추출하였다. 분리된 전체 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하였으며, 이렇게 생성된 cDNA에 염증인자인 TNF-알파, IL-1 베타, IL-6 유전자에 상보적인 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 수행하여 각 유전자의 mRNA 발현 수준을 분석하였다.
실시예 5. 알데히드탈수소 효소(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)의 mRNA 발현 분석
HaCaT 세포에 미세먼지(PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 미세먼지(PM10)을 처리 후 세포를 회수하여, 전체 RNA(mRNA, rRNA, tRNA)를 추출하였다. 분리된 전체 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하였으며, 이렇게 생성된 cDNA에 ALDH의 유전자에 상보적인 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 수행하여 각 유전자의 mRNA 발현 수준을 분석하였다.
실시예 6. 항산화 효과 분석(ROS 손상에 대한 보호 효과)
세포내의 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)을 측정하기 위해 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA) 어세이를 수행하였다. DCF-DA가 산화되면서 형광을 띄는 2', 7'-dichllorofluorescein(DCF)로 바뀌는 원리를 이용하여 생산된 ROS는 DCF 표준곡선에 의해 정량화 하였다.
미세먼지(PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 미세먼지(PM10)을 세포에 24시간 처리한 후, 20 mM DCF-DA 20㎕와 혼합한 뒤 37℃ 배양기에서 30분간 배양하고, 485㎚ excitation/535㎚ emission에서 형광도를 측정하여 ROS의 수준을 분석하였다.
실시예 7. 제브라피쉬에서 미세먼지에 대한 보호효과 분석
제브라피쉬에 미세먼지(PM10) 또는 지충이 에탄올 추출물(STE)과 미세먼지(PM10)처리하고, 제브라피쉬에서 항산화 효과, 세포독성 및 NO 생성을 분석하였다. 항산화 효과는 DCFDA를 이용하여 분석하였으며, 세포독성은 아크리딘오렌지(Acridinorange)를 이용하여 분석하였다. NO의 생성은 DAFMDA를 이용하여 분석하였다.
실시예 8. 지충이 추출물의 미세먼지 유해성분 저감 효과 분석
지충이 에탄올 추출물(STE)의 미세먼지의 유해성분의 감소효과를 직접적으로 확인하고자, 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물의 저감 또는 제거 효과를 GC/MS을 통해 분석하였다.
<분석결과>
실험예 1. 미세먼지 성분분석 및 함량 분석
포집된 PM10 이하의 미세먼지의 에틸아세테이트 분획물(PM10 이하 에틸아세테이트 분획물, EtOAc fraction of < PM10, 이하 PM10 이라 함)의 유해성분을 분석한 결과, 2018년에 포집된 미세먼지에서 16종의 성분, 2019년 포집된 미세먼지에서 31종의 유해성분을 확인하였다.
2018년 및 2019년에 인천에서 포집된 미세먼지(PM10) 내에 이중 1) 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 2) 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 3) 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol), 4) 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-) 및 5) 1-(아다만틸-1)헥센-6-올-1 (1-(Adamantyl-1)hexen-6-ol-1) 이 5가지 성분이 공통적으로 존재함을 확인하였다(도 1).
실험예 2. 피부 각질형성세포주에 대한 미세먼지(PM10)의 세포독성 분석
다음으로, 포집된 PM10 이하의 미세먼지의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fraction of < PM10, PM10)을 이용하여 피부 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCaT 세포에서 독성평가를 수행하였다. 분석결과, 2018년 미세먼지(PM10)와 2019년 미세먼지(PM10) 모두에서 세포독성이 높음을 확인하였다. 2018년과 2019년 포집된 미세먼지(PM10) 25 내지 400㎍/㎖로 세포독성을 확인한 결과, 농도가 증가할수록 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
또한, 피부 각질형성세포주에서 미세먼지(PM10) 처리 농도에 따른 ROS 생성량을 분석하였다. 그 결과, 포집된 PM10 이하의 미세먼지의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fraction of < PM10, PM10)을 처리한 결과, 미세먼지(PM10)의 농도가 증가할수록 ROS 생성 역시 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 미세먼지(PM10)에 의한 각질형성세포주의 염증 유발을 확인하고자, 염증 지표인 IL-6, TNF-알파, IL-1 베타 mRNA의 발현을 분석하였다. 그 결과, 미세먼지(PM10)에 의하여 IL-6, TNF-알파, IL-1 베타 mRNA의 발현이 증가하는 것을 확인하여, 미세먼지(PM10)가 피부 각질형성세포주에서 염증을 유발함을 확인하였다(도 4).
실험예 3. 피부 각질형성세포주에서의 알데히드탈수소 효소(Aldehyde dehydrogenase, ALDH) 발현 분석
다음으로 각질형성세포주(human keratinocyte cell)에서 포집된 PM10 이하의 미세먼지의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fraction of < PM10, PM10) 처리에 따른 알데히드 탈수소 효소(ALDH)의 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 미세먼지(PM10) 처리에 의해 ALDH2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5).
다음으로, 지충이(Sargassum　thunbergii) 에탄올 추출물(STE) 처리에 따른 ALDH mRNA 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리에 의해 각질형성세포주(human keratinocyte cell)에서 ALDH2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 6).
다음으로, 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리에 의해 ALDH2 mRNA의 발현이 증가하는 지를 확인하였다. 그 결과, 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE) 처리에 의해 ALDH2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(데이터 미도시).
실험예 4. 지충이 에탄올 추출물의 피부 각질형성세포 보호효과
피부 각질형성세포주에서 지충이 에탄올 추출물(STE)의 미세먼지(PM10)에 대한 보호효과를 분석하였다. 먼저 지충이 에탄올 추출물(STE)이 피부 각질형성세포에 독성을 유발하는 지 확인하였다. 그 결과, 지충이 에탄올 추출물(STE)은 3.125㎍/㎖ ~ 200㎍/㎖ 농도까지 피부 각질형성세포주에 독성이 없는 것을 확인하였다(도 7).
다음으로, 피부 각질형성세포주에서 지충이 에탄올 추출물(STE)이 미세먼지(PM10)에 대해 보호효과를 가지는 지를 분석하였다. 그 결과, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 경우 낮은 농도인 6.25㎍/㎖에서는 미세먼지(PM10)에 의해 유발된 세포독성에 대해 보호효과가 없으나, 12.5㎍/㎖ ~ 50㎍/㎖ 농도에서는 세포독성에 대해 보호 효과가 있는 것을 확인하였다(도 8).
다음으로, 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE)의 처리시간에 따른 피부 각질형성세포주에 대한 보호 효과를 분석하였다. 그 결과, 동일한 지충이 에탄올 추출물(STE) 50㎍/㎖을 처리한 경우에도 처리시간이 12시간, 24시간으로 증가할수록 미세먼지(PM10)에 의해 유발된 세포독성에 대해 보호효과가 높은 것을 확인하였다(도 9).
다음으로, 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE)의 처리에 따른 ROS 생성량을 평가하여 피부 각질형성세포주에 대한 보호 효과를 분석하였다. 그 결과, 피부 각질형성세포주에서 지충이 에탄올 추출물(STE)이 미세먼지(PM10)에 의해 유발된 ROS 생성을 감소시켰으며, 지충이 에탄올 추출물(STE) 농도가 증가할수록 ROS 생성 감소 효과도 증가하여 피부 각질형성세포주에 대한 보호 효과도 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
다음으로, 피부 각질형성세포주에서 지충이 에탄올 추출물(STE)의 미세먼지에 대한 보호효과인지를 확인하기 위하여, 항산화 효과를 가지는 것으로 알려진 N-acetylcystein을 함께 처리하였다. 그 결과, 미세먼지(PM10)에 의해 증가된 형광도(ROS 생성)가 N-acetylcystein 처리에 의해 감소하였다. 그러나, N-acetylcystein과 지충이 에탄올 추출물(STE)을 함께 처리한 경우에 형광도(ROS 생성)에 별다른 차이는 없었다(도 11).
실험예 5. 지충이 에탄올 추출물의 미세먼지 유해성분 제거 효과 분석
지충이 에탄올 추출물(STE)의 미세먼지(PM10)의 유해성분의 감소효과를 직접적으로 확인하고자 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)의 저감 또는 제거효과를 GC/MS을 통해 분석하였다.
분석결과, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 처리 시간이 증가함에 따라 미세먼지(PM10)에서 유래된 유해성분인 도 12에서 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 도 13에서 에타논, 1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone, 1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 도 14에서 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 도 15에서 벤젠아세트산, 알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)를 제거 또는 저감하는 확인하였다(도 13~16).
반면, 도 12 내지 도 15에서 ALDH2 inhibitor(Diadzin, santa cruz)를 처리한 경우, 지충이 에탄올 추출물(STE)이 이들 유해물질을 제거하지는 못하였다. 따라서, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 이들 유해 화합물의 제거에는 ALDH2가 반드시 필요하다는 것을 알 수 있었다.
실험예 6. 제브라피시에서 미세먼지에 대한 보호효과 분석
다음으로 제브라피쉬에서 지충이 에탄올 추출물(STE) 미세먼지(PM10)에 대한 보호효과를 분석하였다. 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10) 50㎍/㎖을 처리하면 DCFDA의 세기(ROS 생성)가 증가하는 것을 확인하였으며, 지충이 에탄올 추출물(STE) 25㎍/㎖ 또는 50㎍/㎖를 처리에 의해 DCFDA의 세기가 감소하는 것을 확인하였다(도 16). 즉, 지충이 에탄올 추출물(STE)이 제브라피쉬에서 미세먼지(PM10)에 의해 유도되는 ROS를 감소시켜 제브라피쉬를 보호함을 확인하였다(도 16).
다음으로 제브라피쉬에서 지충이 에탄올 추출물(STE)의 미세먼지(PM10)에 대한 보호 효과를 확인하였다. 분석결과 미세먼지(PM10)(50㎍/㎖) 처리시 제브라피쉬에서 아크리딘오렌지의 세기가 강하게 검출되어 세포 독성이 높음을 확인하였으며, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 처리 농도가 증가함에 따라 아크리딘오렌지의 세기가 감소하였다. 즉, 지충이 에탄올 추출물(STE)이 미세먼지(PM10)에 의한 세포독성을 현저하게 감소시켜 세포를 보호함을 확인하였다(도 17).
한편, 제브라피쉬에서 지충이 에탄올 추출물(STE)의 NO의 생성에 대한 보호효과를 DAFMDA를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 미세먼지(PM10)를 50㎍/㎖ 처리한 경우 대조군과 비교하여 NO가 약간 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 제브라피쉬에서 지충이 에탄올 추출물(STE)을 처리한 경우, 미세먼지(PM10)에 의한 NO의 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 18).
실험예 7. 제브라피쉬에서 알데히드탈수소 효소(Aldehyde dehydrogenase, ALDH) 발현 분석
제브라피쉬에 미세먼지(PM10)을 처리하고 ALDH2 mRNA 발현을 측정한 결과, 대조군과 비교하여 ALDH2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 미세먼지(PM10)와 지충이 에탄올 추출물(STE) 50㎍/㎖를 함께 처리한 경우, 미세먼지만 처리한 경우보다 ALDH2의 발현이 더 증가되는 것을 확인하였다(도 19). 따라서, 지충이 에탄올 추출물(STE)의 제브라피쉬 보호에는 ALDH2가 필요하다는 것을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. 지충이의 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는,
    알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논,1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone,1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산,알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 미세먼지 제거용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 추출된 것인, 미세먼지 제거용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 또는 이들의 혼합용매로 분획된 것인, 미세먼지 제거용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미세먼지 제거용 조성물은 미세먼지 제거용 화장료 조성물 또는 식품 조성물인 것인, 미세먼지 제거용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 후보물질을 실험구에 처리하는 단계;
    상기 후보물질이 처리된 실험구에서 ALDH2의 수준을 측정하는 단계 및;
    후보물질을 처리하지 않은 대조구의 ALDH2의 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 실험구와 대조구에 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논,1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone,1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산,알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 미세먼지 분획물을 처리하는 단계 및
    상기 후보물질을 처리한 실험구의 ALDH2의 수준이 대조구보다 증가하는 경우, 상기 후보물질을 미세먼지 제거용 조성물로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인,
    미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제8항에 있어서,
    상기 후보물질을 처리한 실험구에서 알파,알파’-디하이드록시-엠-디이소프로필벤젠(α,α'-Dihydroxy-m-diisopropylbenzene), 에타논,1-[4-(1-하이드록시-1-메틸에틸)페닐]-(Ethanone,1-[4-(1-hydroxy-1-methylethyl)phenyl]-), 알파,알파,알파’,알파’-테트라메틸-1,4-벤젠디메탄올(α,α,α',α'-Tetramethyl-1,4-benzenedimethanol) 및 벤젠아세트산,알파,알파-디메틸-2-니트로-(benzeneacetic acid α,α-dimethyl-2-nitro-)로 이루어진 화합물의 수준이 대조구보다 감소하는 경우, 상기 후보물질을 미세먼지 제거용 조성물로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인, 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 미세먼지 제거용 조성물은 미세먼지 제거용 화장료 조성물 또는 식품 조성물인 것인, 미세먼지 제거용 조성물의 스크리닝 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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