KR20110042630A

KR20110042630A - 5-하이드로시메틸퍼퓨랄를 포함하는 항염증 조성물

Info

Publication number: KR20110042630A
Application number: KR1020090099384A
Authority: KR
Inventors: 최영환; 윤식
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2011-04-27

Abstract

본 발명은 항염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 흑마늘로부터 추출된 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural) 또는 이의 유도체를 함유하는 항염증 질환의 예방용 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

항염증, 흑마늘, VCAM-1

Description

5-하이드로시메틸퍼퓨랄를 포함하는 항염증 조성물 {Anti-inflammatory composition comprising 5-Hydroxymethylfurfural}

본 발명은 항염증 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체를 포함하는 항염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적증상이 나타난다. 정상인경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서 도 장해요인이 된다.

TNF-α와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다(Verhoef, J. et al., J. Antimicrob. Chemother., 35, 1996).

여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE2의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다.

세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇽(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med., 21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc., 409, 1982). 그러므로 약물 처리를 통하여 LPS의 작용을 줄임으로서 염증억제효과를 볼 수 있을 것이다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자-α, 인터류킨-1, -2), 세포사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자, 산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE2를 방출하고, 또한 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절 한다(Bresnihan, 1999; Burmester et al., 1997; Gracie et al., 1999).

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 패혈증(septic shock)이나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병 (Gracie et al., 1999; Michaelsson et al., 1995; Stuhlmuller et al., 2000)과 관련된 손상을 막을 수 있다.

그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다. 현재까지의 항염증 약물의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

본 발명자들은 흑마늘 추출물에서 분리된 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural) 또는 이의 유도체가 부작용이 없으면서 탁월한 항염증 효과를 발휘함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural) 또는 이의 유도체를 함유하는 항염증 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural) 또는 이의 유도체가 세포에 독성을 유발하지 않으면서, 혈관 내피세포에서 TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자 VCAM-1의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다 (실시예 3, 4 참조).

또한 본 발명에서는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체가 혈관내피세포와 단핵구간 부착을 억제시키는 것을 확인하였으며 (실시예 5 참조), TNF-α에 의해 증가한 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 확인하였다 (실시예 7 참조).

더 나아가, 본 발명에서는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체가 TNF-α에 의해 증가한 NF-κB의 활성화를 억제시킴을 확인하였다 (실시예 6 참조).

결론적으로, 본 발명에서는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 항염증 작용이 있음을 규명하였다. 따라서 본 발명은 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체를 함유하는 항염증 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 유효성분인 5-하이드로시메틸퍼퓨랄은 하기 화학식 1을 가지고, 분자식C₆H₆O₃인으로서 분자량이 126.03이다.

[화학식 1]

본 발명의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄은 인공적으로 합성하거나, 천연물, 바람직하게는 흑마늘로부터 추출할 수 있다.

한 양태로서, 상기 추출은 흑마늘 상품을 Whatman No 2 여과지로 여과한 다 음 흑마늘의 성분을 추출하였다. 3 ℓ의 분획여두에 흑마늘 제품 1ℓ를 부은 다음 헥산 1 ℓ를 추가하여 흔든 다음 실온에 세워두었다. 분획한 헥산 (hexane)층을 분획하여 회수하고, 위와 같은 방법을 3회 반복하여 회수한 헥산 분리층을 모두 모아서 회전증발기로 농축시켜서 헥산추출물을 얻었다. CHCl₃와 BuOH 추출물도 유사한 방법으로 얻었으며, 물추출물은 헥산, CHCl₃및 BuOH로 추출한 다음 남은 것을 농축하였다.

흑마늘에서 추출한 CHCl₃추출물 343.6mg을 직경 3 cm 길이 105 cm의 칼럼에 실리카겔을 충진한 다음 로딩 (loading)하였다. 용매를 CHCl₃ : Acetone (15 : 5)를 흘려보내면서 179.4 mg의 순수물질을 분리하였다. 1D NMR과 2D NMR 및 GC-MS 자료로서 순수분리한 성분의 구조를 동정하였다.

본 발명의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체를 함유하는 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 양태로서, 본 발명의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체 는 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체를 함유한 약제학적 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, 에탄올, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체를 함유한 약제학적 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 보다 바람직하게는 10~1000㎍/체중kg/day의 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명에서의 항염증 질환은 동맥경화증, 당뇨병, 관절염, 비만, 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease; IBD), 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 다발성경화증 (multiple sclerosis), 결핵, 유육종증 (sarcoidosis), 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 아토피성 피부염, 건염 또는 신장염을 포함한다.

본 발명에 의한 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 새로운 혈액순환 및 면역활성 효능을 가진 새로운 물질로서, 항염증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아니고, 당업자에 의해 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 흑마늘로부터 극성별 물질 추출, 새로운 성분의 순수분리 및 구조동정

(주)뉴그린식품에서 제조한 흑마늘 상품을 Whatman No 2 여과지로 여과한 다음 흑마늘의 성분을 추출하였다. 3 ℓ의 분획여두에 흑마늘 제품 1ℓ를 부은 다음 헥산 1ℓ를 추가하여 흔든 다음 실온에 세워두었다. 분획한 헥산 (hexane)층을 분획하여 회수하고, 위와 같은 방법을 3회 반복하여 회수한 헥산 분리층을 모두 모아서 회전증발기로 농축시켜서 헥산추출물을 얻었다. CHCl₃와 BuOH 추출물도 유사한 방법으로 얻었으며, 물추출물은 헥산, CHCl₃및 BuOH로 추출한 다음 남은 것을 농축하였다.

흑마늘에서 추출한 CHCl₃추출물 343.6mg을 직경 3 cm 길이 105 cm의 칼럼에 실리카겔을 충진한 다음 로딩 (loading)하였다. 용매를 CHCl₃ : Acetone (15 : 5)를 흘여보내면서 179.4 mg의 순수물질을 분리하였다. 1D NMR과 2D NMR 및 GC-MS 자료로서 순수분리한 성분의 구조를 동정하였다.

마늘로부터 새롭게 만들어진 성분을 확인하기 위하여 흑마늘의 원료마늘인 대서마늘, 흑마늘 액상제품, 동결건조 흑마늘을 극성이 낮은 순서로 직접 추출하거나 80% MeOH로서 추출한 다음에 분획하여 추출하였다. 추출물은 실리카겔 (Silicagel) F254 플레이트 (plate) (Merck, 독일)에 다양한 전개용매를 조성한 다음 전개시킨 후 valinilin-sulfuric acid을 분무하여 110℃에서 10분간 가열하여 발색시켰다. TLC 플레이트 (plate)에서 발색한 밴드를 비교한 결과 생마늘, 건조흑마늘에서는 전혀 생성되지 않았던 새로운 물질이 생성되었다 (도 1의 화살표 참조). 따라서 각각의 추출물에 대하여 효능을 검증한 결과 NBGP추출물의 항염증, 세포 이동 등에 효과가 좋았으므로 NBGP추출물로부터 물질을 순수 분리하였다 (도 1 참조).

흑마늘로부터 순수분리한 물질의 순도를 검증하기 위하여 GC-MS 크로마토그램을 확인한 결과 순수하게 분리되었다는 것을 확인 할 수 있었다 (도 2 참조).

순수 분리한 성분을 1D NMR 2D NMR 스펙트럼으로서 구조를 동정하였다. 구조의 확인을 위한 ¹H NMR, ¹³C NMR, Dept 90 및 Dept 135의 스펙트럼은 다음 그림에 제시하였다 (도 3 참조).

1D와 2D NMR 스펙트럼을 이용하여 구조를 분석한 결과 성분은 알려진 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural)이었으며 그 구조는 다음의 그림과 같았다 (도 4, 표 1). 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural)은 분자식C₆H₆O₃인으로서 분자량이 126.03이었다.

[표 1] 5-Hydroxymethylfurfural 성분의 ¹³C NMR, ¹H NMR and HMBC data (500 MHz for ¹H and 125 MHz for ¹³C NMR inCDCl₃)

500 MHz (Bruker in CDCl₃)

δ_C		δ_H	HMBC
178.212	CH	9.385, dd, J=7.0/3.0
161.587	C
152.228	C
124.149	CH(?)	7.314, t	161.59, 152.23, 110.26
110.260	CH	6.402, t	161.59, 152.23, 124.14?
57.355	CH2	4.560, s	161.59, 152.23?, 110.26

<실시예 2> 흑마늘추출물 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (Hydroxymethylfurfural)의 혈관내피세포에 대한 세포독성효과 분석

3 ×10³개의 사람 제대정맥혈관내피세포를 2% 우태아 혈청 (fetal bovine serum (FBS))가 포함된 EGM-2 배양액에 현탁시켜 96-웰 플레이트 (well plate)에 접종 후 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 0.5% FBS를 포함한 EGM-2 배양액에 24시간 동안 배양하여, FBS의 효과를 최소화 하였다. 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (Hydroxymethylfurfural)을 1-50 μg/ml의 다양한 농도로 24시간 동안 처리한 다음 각 웰 마다 10 μl의 WST-1용액을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포에 미치는 독성효과를 조사하였다.

그 결과, 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (Hydroxymethylfurfural)은 5, 10, 20, 30, 40, 및 50 μg/ml의 농도에서 혈관내피세포에 대한 세포독성 효과를 전혀 나타내지 않음을 확인하였다 (도 5). 이후의 모든 실험에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (Hydroxymethylfurfural)의 농도는 30-50 μg/ml의 농도로 사용되었다.

<실시예 3> TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 세포표면부착분자 및 사이토카인 유전자의 발현조절 효과 분석

흑마늘추출물의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 혈관내피세포에 각각 30분, 2시간 동안 전처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α를 6시간 (E-selectin의 경우) 혹은 12시간 (VCAM-1, 및 ICAM-1의 경우) 동안 처리한 다음 RT-PCR법을 이용하여 세포표면부착분자 및 사이토카인의 유전자 발현 패턴을 분석하였다.

먼저 6 웰 플레이트 (well plate)에 배양한 세포에 약물을 처리하고 1 ml 트 리졸 (Trizol) (Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 양은 자외선 흡광도를 이용하여 측정하였다. 2 μg의 RNA를 주형으로 0.5 mg oligo(dT)_12-18와 1 μl의 10 mM dNTP mix를 혼합하고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음위에 2분간 보관하였다. 5 μl M-MLV 5X reaction buffer (Promega), 5 μl 10 mM dNTP mix (Promega), 1 μl recombinant RNasin RNase inhibitor (25 units), 1 μl M-MLV reverse transcriptase (Promega)를 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시켰다. 역전사 효소를 이용하여 합성한 cDNA를 주형으로 5 ×PCR reaction buffer, 10 mM dNTP mix, forward/reverse primer와 Taq DNA polymerse를 혼합하였다. 94℃에서 5분간 DNA를 변성시킨 다음 94℃에서 30초, 51-57℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 25-30회 반복하고 72℃에서 10분간 반응시켰다. 1.5% 아가로트 겔 전기영동을 통해 증폭된 DNA를 확인하였으며, RT-PCR 대조군으로는 GAPDH 프라이머를 사용하여 비교하였다. 세포표면부착분자의 유전자를 증폭하기 위해 각각의 프라이머를 제작하여 사용하였다 (표 2).

[표 2] RT-PCR 용 프라이머 세트

Target gene	GeneBank accession No.	Sequences of primer	Product size
VCAM-1	NM_001078	S : 5'- GAGCTACAGCCTCTTTCTGA -3' A : 5'- GAGGATGCAAAATAGAGCAC -3'	461 bp
ICAM-1	NM_000201	S : 5'- CTGCAGACAGTGACCATCTA -3' A : 5'- AAAGTGCCATCCTTTAGACA -3'	407 bp
E-selectin	NM000450	S : 5'- ACCTCCACGGAAGCTATGAC -3' A : 5'- TCCCAGATGAGGTACACTGA -3'	796 bp
GAPDH	NM_002046	S : 5'- AAGTGGATATTGTTGCCATC -3' A : 5'- ACTGTGGTCATGAGTCCTTC -3'	454 bp

먼저 RT-PCR법을 이용하여 5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 혈관내피세포의 세포표면부착분자의 유전자 발현에 미치는 효과를 분석한 결과, 10 ng/ml TNF-α를 처리한 혈관내피세포에서 세포표면부착분자의 발현이 TNF-α를 처리하지 않은 대조군에 비해 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 발현이 현저하게 증가하였으나, 30 μg/ml의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 각각 30분 및 2시간 동안 전처리하였을 때 VCAM-1의 발현이 현저하게 감소되었다 (도 6 참조).

이러한 결과는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄은 혈관내피세포에서 세포표면부착분자 중 특이적으로 VCAM-1의 발현을 감소시킨다는 사실을 보여준다.

<실시예 4> TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 혈관내피세포의 표면세포부착분자의 단백질 발현에 미치는 효과 분석

4-1. 웨스턴 블롯 (Western blot)

세포질단백질과 핵단백질을 각각 분리한 후 세포질분획을 이용하여 혈관내피세포의 표면 세포부착분자의 단백질 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 (western blot)을 수행하였다. 각 세포질분획 단백질은 Bio-rad protein assay (Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질을 샘플 버퍼 (sample buffer)와 함께 100℃에서 10분 동안 끓여 준 후 12% SDS-PAGE를 통해 1차원 단백질 전기영동을 수행하였다. SDS-PAGE gel은 semi-dry trasfer (Bio-rad)를 이용하여 polyvinylidene fluiride (PVDF, Bio-rad)에 전사시켰다. 단백질 전사를 마친 PVDF 멤브레인을 5% 탈지유 (skimmed milk)가 포함된 완충용액에서 2시간 동안 블 로킹 (blocking) 시킨 다음 anti-VCAM-1 (SC-1504, Santa cruze biotechnology, USA)와 anti-α-tubulin 항체로 4℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 멤브레인을 TBST로 7분씩 3회 세척 후 HRP-conjugated anti-rabbit/mouse IgG 항체 (Santa cruze biotechnology)와 함께 실온에서 반응시켰다. 2시간 후 TBST로 7분씩 5회 세척 후 enhanced chemiluminescent substrate와 반응 시켜 LAS-3000 (FujiFilm, Japan)으로 단백질의 발현을 확인하였다.

4-2. 유세포 분석 (Flowcytometry)

혈관내피세포에서 세포부착분자의 발현을 확인하기 위하여 유세포 분석법을 이용하였다. 6 웰 플레이트 (well plate)에 부착시킨 혈관내피세포에 30-70 μg/ml의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 2시간 동안 전처리하고 TNF-α (10 ng/ml)를 처리한 후, 각각 6시간 (E-selectin의 경우) 혹은 12시간 (ICAM-1 및 VCAM-1의 경우)이 경과 되었을 때 trypsin/EDTA 처리하여 1x10⁵개의 세포를 100 μl의 FACS buffer (0.09% Sodium azide, 1% FBS in Dulbeccco's PBS)에 부유시킨다. Phycoerythrin (PE)로 표지된 anti-VCAM-1 (Biolegend, USA), anti-ICAM-1 (Biolegend) 및 anti-E-selectin (Biolegend) 항체를 넣고 4℃에서 30분간 염색한 다음, FACS 버퍼로 3회 세척하였다. FACSCantoⅡ (Becton-Dickson, CA, USA)를 이용하여 TNF-α로 자극 한 혈관내피세포의 표면 세포부착분자의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자들 중 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해서는 VCAM-1과 ICAM-1이 모두 감소되었다 (도 7).

4-3.면역형광법 (Immunofluorescent microscopy)

세포를 잘 부착하기 위해 poly-L-Lysine (PLL)으로 코팅한 커버 글래스 (cover glass)가 들어있는 24 웰 플레이트 (well plate)에 4 ×10⁴ 개의 혈관내피세포를 각각 부착시켰다. 30-70 μg/ml의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 2시간 동안 전처리하고 TNF-α (10 ng/ml)를 12시간 처리하였다. 4% PFA에 고정한 다음 알데하이드 고정에 의한 가교반응 (cross-linkage)때문에 항체가 항원으로의 접근을 막고 있으므로 0.5% Triton ×100을 사용하여 항원성을 회복시킨 후, 비특이적인 면역반응을 제거하기 위해 1% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 실온에서 1시간 동안 처리한 다음 PE가 결합된 anti-ICAM-1 및 anti-VCAM-1 항체를 4℃에서 14-16시간 동안 반응시켰다. PBS로 5분씩 3회 세척 후 봉입 (Vectashield, Vector Lab, USA)하여 식은 CCD 마이크로스코프 (cooled CCD microscope)하에서 관찰하였다.

유세포분석기로 확인하였을 때와 같이, TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자들 중 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해서 VCAM-1과 ICAM-1이 모두 감소되었다 (도 8).

<실시예 5>TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural)이 혈관내피세포와 THP-1 세포 사이의 부착능에 미치는 영향

5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 TNF-α로 자극된 혈관내피세포에서 세포부착분자의 발현을 억제시킴을 위의 결과들에서 확인할 수 있었으며, 이는 곧 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능에 중요한 역할을 할 것이라 생각하고 부착능 실험 (adhesion assay)을 통해 확인해 보았다.

35 mm 배양 접시 (culture dish)에 혈관내피세포를 3.5X10⁴ cells/well를 접종하여 하루 동안 세포를 부착시키고 0.5% FBS가 포함된 EGM-2 배지로 12시간 동안 starvation하였다. 세포에 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 전처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α를 15시간 동안 처리하였다. 그 후 3X10⁶ 개의 THP-1 세포를 각 접시 (dish)에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 혈관내피세포에 부착하지 않은 THP-1 세포를 제거하기 위해서, FBS가 포함되지 않은 RPMI-1640으로 2회-3회 씻어주었다. 혈관내피세포에 부착된 THP-1 세포를 회수하기 위해 PBS를 첨가하여 강하게 피펫팅 (pipetting)하였다. 헤마토사이토미터 (Hematocytometer)를 사용하여 회수된 THP-1 세포수를 확인하였다.

그 결과, 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 처리한 군은 TNF-α를 처리한 군에 비해서 혈관내피세포에 부착한 단핵구의 수가 유의하게 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 통한 세포부착분자의 발현 억제가 혈관내피세포 와 단핵구 사이의 부착능을 억제시킴을 보여준다(도 9).

< 실시예 6> TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural)이 혈관내피세포의 활성 산소종 생성에 미치는 영향 분석

5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 TNF-α 자극에 의해 혈관내피세포에서 생성되는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성 조절에 미치는 효과를 분석하기 위하여, 2'7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCF-DA)를 이용한 면역형광염색법을 사용하였다. 혈관내피세포에 5-하이드로시메틸퍼퓨랄(30 μg/ml, 2시간)을 전처리하고 10 ng/ml TNF-α를 1시간 처리한 뒤, 20 μM의 DCF-DA를 30분 동안 염색하였다. Vectashield로 봉입하여 형광현미경을 이용하여 ROS의 생성을 분석하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 증가한 ROS의 발현이 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해 완전히 감소하였다. 이것은 곧, 5-하이드로시메틸퍼퓨랄이 매우 강력한 항산화 작용을 가지고 있음을 나타낸다(도 10).

<실시예 7> TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural)의 NFkB 활성조절 효과 분석

5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 전처리하고 TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 핵단백질을 분리하였다. 두 가닥 올리고핵산의 말단부에 비오틴 (biotin)을 부착시켰다. NFκB의 활성화는 Pierce의 LightShift® Chemiluminescent EMSA kit의 설명서 에 따라 수행하였다. 즉, 10 μg의 핵추출물을 바인딩 버퍼 (binding buffer), 글라이세롤 (glycerol), poly(dI·dC), NP-40, biotin-NFkB DNA와 함께 20분간 반응시켰고, 반응물은 4% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 free probe로부터 분리시켰다. 전기영동이 끝나고 나일론 멤브레인 (nylone membrane)에 전사 시킨 후에 strepavidin-HRP 결합체와 반응시켜, luminol/enhance solution으로 NFκB의 활성화 정도를 확인하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 증가한 NF-κB의 활성화가 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해 뚜렷하게 억제된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).

도 1은 흑마늘 제품에서 새로이 생성된 물질인 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 순수 분리하여 동정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 흑마늘에서 생성된 새로운 성분인 5-하이드로시메틸퍼퓨랄의 GC-MS 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 흑마늘에서 생성된 새로운 성분인 5-하이드로시메틸퍼퓨랄의 NMR 스펙트럼의 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 흑마늘로부터 분리한 5-하이드로시메틸퍼퓨랄의 구조 및 주요 HMBC를 나타낸 것이다.

도 5는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 5, 10, 20,30,40 및 50μg/ml에서의 혈관내피세포에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 것이다. 각 농도에서 혈관내피세포에 대한 세포독성 효과를 전혀 나타내지 않았다 (meansㅁ SD).

도 6는 30 μg/ml의 5-하이드로시메틸퍼퓨랄을 HUVEC 세포에 2시간 동안 전처리하였을 때 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin의 발현을 RT-PCR 결과로 나타낸 것이다.

도 7은 유세포 분석법을 통하여, TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자들 중 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해서 VCAM-1과 ICAM-1이 감소된 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자들 중 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해서 VCAM-1과 ICAM-1이 모두 감소된 결과를 면역형광법으로 나타낸 것이 다.

도 9는 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능 실험의 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 TNF-α에 의해 증가한 ROS의 발현이 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해 완전히 감소됨을 나타낸 것이다.

도 11은 TNF-α에 의해 증가한 NF-κB의 활성화가 5-하이드로시메틸퍼퓨랄에 의해 뚜렷하게 억제됨을 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 (5-Hydroxymethylfurfural) 또는 이의 유도체를 함유하는 항염증 질환의 예방용 또는 치료용 조성물.

[화학식 1]
제 1항에 있어서, 상기 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 흑마늘로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 혈관 내피세포에서 TNF-α에 의해 증가한 세포표면부착분자 VCAM-1의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 혈관내피세포와 단핵구간 부착을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 TNF-α에 의해 증가한 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5-하이드로시메틸퍼퓨랄 또는 이의 유도체는 활성 산소종의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항염증 질환은 동맥경화증, 당뇨병, 관절염, 비만, 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease; IBD), 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 다발성경화증 (multiple sclerosis), 결핵, 유육종증 (sarcoidosis), 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 아토피성 피부염, 건염 또는 신장염인 것을 특징으로 하는 항염증 질환의 예방 및 치료제.