CN107823228B - 采绒革盖菌提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采绒革盖菌提取物、包括所述采绒革盖菌提取物的药物组合物及其制备方法和治疗用途。有利地，所述采绒革盖菌提取物具有免疫调节、抗肿瘤、抗微生物和抗病毒作用。在一个优选实施方案中，本发明可被用于抑制癌细胞的转移性扩散。在某些优选实施方案中，本发明可被用于治疗多形性成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌，以及细菌、病毒、真菌、原生动物和/或其他微生物感染。

Description

采绒革盖菌提取物及其制备方法和用途
本申请是申请日为2011年10月6日、申请号为“201180058847.X”、发明名称为“采绒革盖菌提取物及其制备方法和用途”的发明专利申请的分案申请。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2010年10月6日提交的美国临时申请流水号61/390,279和2011年1月14日提交的美国临时申请流水号61/432,853的优先权，所述申请全文均以引用的方式纳入本文。
背景技术
采绒革盖菌(Coriolus versicolor)，还称为杂色蘑菇(Agaricus versicolor)、杂色牛肝菌(Boletus versicolor)、白云山芝多糖(Polyporus versicolor)、杂色革盖菌(Polystictus versicolor)、杂色茯苓(Poria versicolor)、杂色栓菌(Trametesversicolor)、云芝(Yun-Zhi，中国)、云芝(Kawaratake，日本)和“火鸡尾”(turkey tail，北美)，其属于担子菌纲，多孔菌科。其广泛分布于世界各地，在亚洲、欧洲和北美的多树木的温带中已经鉴定了多于120种不同的株系。
采绒革盖菌的药用价值由中国明朝(公元1368-1644年)的李时珍首先记录于《本草纲目》(Compendium of Materia Medica，Compendium Medica)。根据《本草纲目》的记载，如果经常食用采绒革盖菌(云芝)，可以补气、保持最佳体重、延年益寿并避免不必要的衰老。人们还认为采绒革盖菌对肝和脾功能有保护作用(3)，并已被用于治疗多种与肝功能障碍和呼吸道感染有关的症状。在中国以及日本，采绒革盖菌被干燥、磨碎并制成茶。没有报道显示采绒革盖菌在长期服用时会有毒性作用(24)。
据报道，采绒革盖菌具有免疫调节(4)、抗肿瘤(4)、抗微生物(5)和抗病毒作用(6，7)。这些药理学作用可能主要是由多糖肽(PSP)(例如云芝多糖K(PSK))产生的(4)。
特别地，采绒革盖菌被报告可增强抵御病原体和疾病的免疫系统。体外实验显示，采绒革盖菌的水性提取物可有效地激活免疫细胞，包括T淋巴细胞(8-14)、B淋巴细胞(9,13)、单核细胞/巨噬细胞(9，12，13，15)、骨髓细胞(13)、自然杀伤细胞和淋巴细胞激活的杀伤细胞(8，9)。另外，据报道，采绒革盖菌提取物可增强抗体和多种细胞因子(包括白细胞介素例如IL-2和IL-6、干扰素和肿瘤坏死因子的产生(9)。体内研究也证明，采绒革盖菌水性提取物有助于恢复接受化疗的患者中的免疫应答(5，14，16，17)，并有助于减少由抗癌药物导致的免疫抑制。
另外，采绒革盖菌可抑制肿瘤细胞的生长、迁移和转移(18)。研究已经证明采绒革盖菌提取物在体外可抑制癌细胞的生长，所述癌细胞包括胃癌细胞(gastric cancercell)(例如，7907)、肺癌细胞(例如，SPC)、白血病细胞(例如，MCL)、淋巴瘤细胞(例如，SLY)、人白血病细胞(例如，HK-60)、肝癌细胞(例如，SMMU-7721)和胃癌细胞(stomachcancer cell)(例如，SCG-7901)(16，19-23)。所述提取物还可被用于预防食道癌、结肠癌、乳癌、肝癌、肺癌和膀胱癌(9)。虽然采绒革盖菌提取物显示出强有力的抗肿瘤活性，其对正常细胞几乎没有细胞毒性作用(25)。
虽然采绒革盖菌的经验性使用有很长的历史，但对其发挥药理学作用的确切机制仍然了解有限。另外，采绒革盖菌的许多生物学活性化学组分还没有被鉴定。因此，需要阐明采绒革盖菌的药物机制，以通过这种方式来开发新的治疗组合物和方法。另外，需要开发更加有效和方便的提取方法，以用于放大采绒革盖菌提取物的生产，并用于鉴定其用于治疗用途的生物学活性化学组分。
发明内容
本发明提供了有效且方便的方法，用于制备用于治疗用途的采绒革盖菌提取物。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备采绒革盖菌提取物和/或用于从采绒革盖菌中分离生物学活性化学组分的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用极性溶剂提取所述采绒革盖菌原材料以得到采绒革盖菌提取物和残留物，其中步骤b)进行一次或多于一次；
c)回收所述采绒革盖菌提取物。
优选地，所述采绒革盖菌提取物包含生物学活性化学组分，包括多糖肽(PSP)(例如云芝多糖K(PSK))或其他生物活性小分子。在一个实施方案中，所述采绒革盖菌提取物可被进一步地蒸发以产生固体或半固体组合物。
本发明还提供了由本发明提取方法产生的采绒革盖菌提取物。还提供了药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的采绒革盖菌提取物以及任选的可药用载体。本发明还提供了包括本发明的采绒革盖菌提取物的膳食补充剂以及保健食物或饮料配方。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括，通过组合使用高效液相色谱(HPLC)和/或气相色谱-质谱(GC-MS)建立采绒革盖菌提取物的化学谱图。
本发明还提供了预防、治疗或改善疾病或病症——其中调节免疫应答是有益的——的方法。在一个实施方案中，所述方法包括，将有效量的含治疗有效量的本发明采绒革盖菌提取物的组合物给予需要这种治疗的受试者。
在一个实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗或改善癌症或肿瘤，包括但不限于脑肿瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、膀胱癌和胃癌(gastric cancer)。
在一个优选实施方案中，本发明可被用于治疗或改善多形性成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌和/或结肠癌。
在另一个实施方案中，本发明可被用于治疗或改善单纯疱疹病毒(HSV)及相关疱疹病毒的感染，所述相关疱疹病毒包括但不限于水痘带状疱疹、巨细胞病毒和疱疹病毒-8。这些病毒感染通常被发现存在于癌症患者或免疫妥协患者中。
附图说明
图1A-C示出了采绒革盖菌的示例性提取方案。(A)通过在室温下在乙醇(12倍体积)中持续超声提取采绒革盖菌1小时来获得采绒革盖菌的乙醇提取物。简要地，将采绒革盖菌原材料在12倍体积乙醇中浸渍(macerate)，同时持续超声1小时。将残留物在10倍体积乙醇中浸渍，重复所述提取程序两次。收集所得提取物、合并并在真空下蒸发至干燥。(B)通过连续提取——在室温下使用12x乙醇作为第一溶剂、在加热条件下使用10x 50％乙醇作为第二溶剂、在加热条件下使用10x0.04％NaOH溶液作为第三溶剂——制备了采绒革盖菌提取物。收集所得提取物、合并、浓缩并冻干。(C)通过连续提取——使用10x 50％乙醇作为第一溶剂、10x 0.04％NaOH溶液作为第二溶剂——制备了采绒革盖菌提取物。所述提取程序是在加热条件下进行。收集所得提取物、合并、浓缩并冻干。
图2A-C示出了使用图1A、1B中示出的提取方案制备或通过将采绒革盖菌原材料在乙醇中浸渍18小时而制备的采绒革盖菌乙醇提取物的高效液相色谱(HPLC)色谱图。通过使用Agilent 1200系列HPLC系统和装有ODS-键合硅胶的柱(Lichrospher 100RP C18，EC5um)来对所述采绒革盖菌乙醇提取物进行HPLC。流速设定为1.0ml/min，使用水-乙腈混合物作为流动相。在210、254和280nm处检测峰值。(A)在持续超声1小时的情况下，用乙醇提取的采绒革盖菌提取物的HPLC色谱图。重复两次所述提取程序。(B)通过在乙醇中浸渍18小时提取的采绒革盖菌提取物的HPLC色谱图。(C)使用图1B示出的提取方案提取的采绒革盖菌提取物的HPLC色谱图。简言之，将采绒革盖菌在室温下用乙醇提取，然后在加热条件下用50％乙醇提取。
图3A-B示出了使用图1A中示出的提取方案制备或通过将采绒革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时而制备的采绒革盖菌乙醇提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。将所述提取物与吡啶和衍生试剂BSTFA[N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]在70℃下混合2小时。通过使用HP-5MS柱(30m x 250um x 0.25um)的气相色谱-质谱(GC-MS)分析所产生的混合物。初始的烘箱温度维持在70℃并持续1分钟，以每分钟10℃的速率增加至180℃，维持在180℃并持续2分钟，以每分钟10℃的速率增加至280℃，维持在280℃并持续3分钟。注射器温度设定为275℃。使用流速为1ml/min的氦作为载气。(A)在持续超声1小时的情况下，用乙醇提取的采绒革盖菌提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。所述提取程序被重复两次。(B)通过在乙醇中浸渍18小时提取的采绒革盖菌提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。
图4示出了使用图1A中示出的提取方案制备的采绒革盖菌乙醇提取物(MPUB-乙醇)的HPLC色谱图。使用反相柱(Lichrospher 100RP C18，EC 5nm)将MPUB-乙醇提取物进一步分离为5种级分。流速设定为1.0ml/min，使用水-乙腈混合物作为流动相。在210、254和280nm处检测峰值。
图5A-B示出了在用聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I：C))处理的原代人血巨噬细胞中，采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)增加了INFβ的产生(A)并减少了IL10的产生(B)。所有数据被绘制为至少3次独立实验的均值±SD。p值＜0.05(＊)或＜0.001(＊＊)被认为是统计学显著的。
图6A-B示出了采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)减少了LPS诱导的TNFα产生。所有数据被绘制为至少3次独立实验的均值±SD。p值＜0.05(＊)或＜0.001(＊＊)被认为是统计学显著的。
图7示出了采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)减少LPS诱导的亚硝酸盐产生。所有数据被绘制为至少3次独立实验的均值±SD。p值＜0.05(＊)被认为是统计学显著的。
图8A-C示出了采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)的抗病毒作用。(A)示出了由采绒革盖菌提取物导致的单纯疱疹病毒(HSV)病毒滴度的降低。如图4所示，所述采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)被分级分离为级分1-5。级分4-5是细胞毒性的(数据未示出)，因此没有进一步检查其抗病毒作用。(B)示出了由采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)的级分1-3导致的HSV病毒滴度的降低。(C)示出了由采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)的级分3导致的HSV病毒滴度的降低。p值＜0.001(＊)被认为是统计学显著的。
图9示出了采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)减少了MMP-3表达。p值＜0.05(＊)被认为是统计学显著的。
图10示出了采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)降低了小鼠中HSV感染的严重程度。
具体实施方式
本发明提供了用于制备采绒革盖菌提取物的有效且方便的方法。在一个优选实施方案中，使用水、乙醇或乙醇-水的混合物作为溶剂在室温下制备所述采绒革盖菌提取物。在一个实施方案中，所述采绒革盖菌提取物还可被蒸发以产生固体或半固体组合物。
本发明还提供了由本发明的提取方法产生的采绒革盖菌提取物。还提供了治疗或药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的采绒革盖菌提取物以及任选的可药用载体。本发明还提供了包括本发明的采绒革盖菌提取物的膳食补充剂以及保健食物或饮料配方。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括，通过组合使用高效液相色谱(HPLC)和/或气相色谱-质谱(GC-MS)建立所述采绒革盖菌提取物的化学谱图。
本发明还提供了预防、治疗或改善疾病或病症——其中调节免疫应答是有益的——的方法。在一个实施方案中，所述方法包括，将有效量的包括本发明采绒革盖菌提取物的组合物给予需要这种治疗的受试者。
具体地，本发明的组合物可被用于治疗或改善疾病或病症，其中刺激IFNβ的产生和/或减少TNF-α、IL10和/或MMP-3的产生对所述疾病或病症是有益的。
在一个优选实施方案中，本发明可被用于治疗多形性成胶质细胞瘤和/或鼻咽癌。在另一个实施方案中，本发明可被用于治疗细菌、病毒和/或微生物感染。在某些实施方案中，本发明可被用于治疗感染，所述感染包括但不限于水痘带状疱疹、巨细胞病毒和疱疹病毒-8感染，这些病毒感染通常被发现存在于癌症患者或免疫妥协患者中。
采绒革盖菌提取物
本发明一方面提供了用于制备采绒革盖菌提取物的方法。所述方法还可被用于从采绒革盖菌中分离生物学活性化学组分。还提供了根据本发明制备的采绒革盖菌提取物。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种用于制备采绒革盖菌提取物和/或用于从采绒革盖菌中分离生物学活性化学组分的方法，所述方法包括如下步骤或(基本上)由如下步骤组成：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用极性溶剂提取所述采绒革盖菌原材料以得到采绒革盖菌提取物和残留物，其中步骤b)进行一次或多于一次；
c)回收所述采绒革盖菌提取物。
有利地，在约15℃至约30℃的温度下使用极性溶剂可有助于提取一种或多种生物学活性小分子化学组分，所述化学组分具有抗癌和/或抗病毒作用。
优选地，所述采绒革盖菌原材料被干燥并研磨为粉末。优选地，所述采绒革盖菌提取物包含生物学活性化学组分，包括多糖肽(PSP)例如云芝多糖K(PSK)。优选地，所述原材料为采绒革盖菌子实体。
在某些实施方案中，用于采绒革盖菌制备的适合溶剂包括但不限于，醇类(例如，C1-C8醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；C1-C8烷基多元醇；C1-C8酮(例如丙酮)或烷基酮；氯仿；乙酸；水；以及无机酸例如盐酸)。在一个实施方案中，本发明使用的采绒革盖菌与溶剂的比例(v/v)为1∶5至1∶20，优选约1∶10、1∶12或1∶15。在优选的实施方案中，所述提取程序使用水、醇(例如乙醇)或醇-水(例如乙醇-水)混合物作为溶剂。所述醇-水(例如乙醇-水)混合物可包括约5％、10％、15％、20％、25％，30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的醇(例如乙醇)。
优选地，所述提取程序的步骤(b)在室温下进行。步骤(b)还可在稍低于或高于室温的温度下进行。在一个实施方案中，进行步骤(b)的温度为约15℃至约30℃、约18℃至约28℃、约20℃至约28℃或约22℃至约26℃。在一个具体实施方案中，在约25℃下进行步骤(b)。
在一个实施方案中，在所述提取程序的步骤(b)中，将所述采绒革盖菌原材料浸渍在冰冷溶剂中，优选在室温下或低于室温。在一个实施方案中，在所述提取程序的步骤(b)之前和/或之中，所述溶剂以及所述采绒革盖菌原材料都没有被煮沸或加热至高于50℃的温度或高于45℃的温度。
在一个实施方案中，将所述采绒革盖菌原材料与溶剂混合至少约15分钟以提取所述生物学活性化学组分。优选地，所述提取时间为至少约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。
优选地，所述提取的步骤(b)以持续超声进行。超声是在某些情况中可改善从干燥药材中提取化合物的效率并缩短提取时间的方法。这种增强作用的潜在机制是加强质量转移和使所述溶剂更容易进入药材。因此，超声是常规提取技术的迅速、廉价且有效的替代方案，在某些情况中甚至优于超临界流体提取和微波-辅助提取。
在优选实施方案中，在步骤(b)期间，用持续超声将所述采绒革盖菌原材料与所述溶剂混合至少约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。但是本发明人已经发现，在某些实例中，超声可能不会提高某些化学组分的提取率，所述化学组分可容易地被从所述原料药材中滤出到溶剂中。在这种情况中，优选地不使用超声或很少使用超声进行所述提取程序。
可通过例如，可促进从含有溶剂提取物的液相中分离固相(例如残留物)的技术(例如通过离心)来回收所述采绒革盖菌提取物。可通过例如过滤除去残留物来收集所述提取物。在一个实施方案中，所述采绒革盖菌提取物还可被蒸发以产生固体或半固体组合物。在另一个实施方案中，所述采绒革盖菌提取物可被浓缩和/或纯化。
可通过单次提取或连续提取获得所述采绒革盖菌提取物。在一个实施方案中，在回收第一提取物后，可将所得残留物重新溶解在相同溶剂中用于进一步提取。在另一个实施方案中，可通过连续提取获得所述采绒革盖菌提取物，通过每次用不同溶剂提取所述溶剂提取物或残留物提取需要的生物学活性化学组分。
在一个实施方案中，本发明的提取方法还包括以下步骤或(基本上)由以下步骤组成：在步骤(a)-(b)后，在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用极性溶剂提取采绒革盖菌残留物以得到第二采绒革盖菌提取物和第二残留物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明的提取方法进一步包括以下步骤或(基本上)由以下步骤组成，在步骤(a)-(b)后，在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性水溶液(例如NaOH和KOH)提取采绒革盖菌残留物以得到第二采绒革盖菌提取物和第二残留物的步骤。在一个实施方案中，所述碱性水溶液具有0.1N或低于0.1N的任何值的当量浓度，例如0.05N、0.02N、0.01N或0.001N。
在一个具体实施方案中，本发明的提取方法包括：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用第一极性溶剂提取所述采绒革盖菌原材料以得到第一采绒革盖菌提取物和第一残留物；
c)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用第二极性溶剂提取所述第一残留物，以得到第二采绒革盖菌提取物和第二残留物；
d)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性溶液提取所述第二残留物，以得到第三采绒革盖菌提取物和第三残留物；
e)回收所述采绒革盖菌提取物。
在另一个具体实施方案中，本发明的提取方法包括：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用第一极性溶剂提取所述采绒革盖菌原材料，以得到第一采绒革盖菌提取物和第一残留物；
c)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性溶液(例如NaOH或KOH)提取所述第一残留物，以得到第二采绒革盖菌提取物和第二残留物；
d)回收所述采绒革盖菌提取物。
在一个实施方案中，本发明的提取方法包括以下步骤或(基本上)由以下步骤组成：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)用极性溶剂提取所述采绒革盖菌原材料以得到采绒革盖菌提取物和残留物，并且回收所述采绒革盖菌提取物，其中步骤b)进行一次或多于一次；
c)用碱性水溶液提取步骤b)获得的残留物以得到水性提取物，并且回收所述水性提取物，其中步骤c)进行一次或多于一次；
d)合并从步骤b)和c)获得的一种或多种提取物以得到采绒革盖菌提取物。
在某些实施方案中，用于在加热条件下提取采绒革盖菌的极性溶剂包括C1-C8醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一个具体实施方案中，用于在加热条件下提取采绒革盖菌的极性溶剂为乙醇或乙醇-水混合物。在一个具体实施方案中，用于在加热条件下提取采绒革盖菌的极性溶剂不是水。
根据本发明，在以下温度下进行加热：高于60℃、高于65℃、高于70℃、高于75℃、高于80℃、高于85℃、高于90℃、高于95℃或高于100℃。
图1A-C示出了本发明提取方法的优选实施方案。
有利地，使用碱性溶液作为溶剂可有助于提取生物学活性大分子化学组分，包括多糖-肽(PSP)例如云芝多糖K(PSK)。
在另一个实施方案中，所述采绒革盖菌粗提取物可被分级分离或分离以得到一种或多种含有需要的生物学活性化学组分的级分。在一个实施方案中，使用水-乙腈作为流动相对所述采绒革盖菌粗提取物进行HPLC。在一个具体实施方案中，使用表1示出的洗脱参数对所述采绒革盖菌粗提取物进行HPLC，从而得到图4中示出的5个级分。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括，通过组合使用HPLC和/或气相色谱-质谱(GC-MS)建立所述采绒革盖菌提取物的化学谱图。在一个实施方案中，所述方法包括：对所述提取物进行HPLC；洗脱所述提取物；在HPLC后建立所述提取物的化学谱图。在另一个实施方案中，所述方法包括：对所述提取物进行气相色谱-质谱测定并建立所述提取物的色谱/光谱谱图。
本发明还提供了由本发明提取方法产生的采绒革盖菌提取物。在一个具体实施方案中，所述采绒革盖菌提取物具有如图2A、2B、2C中所示的高效液相色谱(HPLC)谱图，或图4中示出的任意的级分1-5；和/或如图3A或3B中所示的气相色谱-质谱(GC-MS)谱图。
本文使用的术语“基本上由......组成”，将本发明的范围限制为所具体说明的步骤以及实质上不会影响本发明的基本和新的特性的步骤，即，用于制备采绒革盖菌提取物和/或从采绒革盖菌分离生物学活性化学组分的方法。例如，通过使用“基本上由......组成”，所述用于制备采绒革盖菌提取物的方法不含任何未具体说明的提取或接触采绒革盖菌的步骤，例如，用未具体说明的溶剂提取或接触采绒革盖菌的额外步骤，或在不同于所具体说明的条件的条件(例如温度)下提取采绒革盖菌的额外步骤。通过使用术语“基本上由......组成”，所述过程还可包括实质上不影响从采绒革盖菌提取生物学活性化学组分的步骤，所述步骤包括收集或回收所述采绒革盖菌提取物；浓缩所述采绒革盖菌提取物；将多个采绒革盖菌提取物合并为单一组合物；将所述采绒革盖菌提取物冻干或干燥成为固体或半固体组合物；将所述采绒革盖菌提取物配制为药物组合物，例如溶液剂、悬液剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、煎剂和酊剂；将所述采绒革盖菌提取物与可药用的载体、赋形剂、调味剂、缓冲剂和/或乳化剂混合；包装所述采绒革盖菌提取物。
调节免疫应答
本发明的另一方面提供了所述采绒革盖菌提取物用于调节免疫应答的治疗用途。有利地，本发明的采绒革盖菌提取物可刺激保护性免疫应答，同时抑制不需要的可导致疾病的免疫应答。例如，所述采绒革盖菌提取物可恢复或改善被抑制的免疫系统功能，所述被抑制的免疫系统功能是由例如给予抗癌试剂而导致的。在另一个实施方案中，所述采绒革盖菌提取物可刺激抵御病毒、细菌和/或微生物感染的保护性免疫应答。另外，本发明的采绒革盖菌提取物可抑制不需要的免疫应答，例如TNF-α的产生和其对金属蛋白酶产生的诱导，所述不需要的免疫应答可被某些肿瘤细胞利用以促进转移。
具体地，本发明人现在发现，采绒革盖菌可减少TNF-α的产生，TNF-α是一种促炎性介质，其在对抗病原感染和肿瘤发生的急性期免疫应答中起关键作用。TNF-α还可诱导产生基质金属蛋白酶(MMP)和MMP家族成员，其可降解胞外基质蛋白。但是，某些肿瘤细胞(例如成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌)已经对TNF-α的细胞毒性作用产生抗性。结果，这些肿瘤细胞利用TNF-α对MMP的诱导以侵入相邻组织以及位于身体远处部位的器官。
有利地，采绒革盖菌可抑制肿瘤细胞中的TNF-α产生，因此尤其可用于预防或减少对TNF-α有抗性的恶性肿瘤细胞(例如成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌细胞和结肠癌)的转移性扩散。
另外，本发明人现在发现采绒革盖菌可减少IL-10的产生，IL-10是一种可下调促炎性细胞因子表达的抗炎性细胞因子。本发明人还发现，采绒革盖菌可增强IFN-β的产生，其可刺激对抗病原入侵的急性期免疫应答。
在一个实施方案中，本发明提供了预防、治疗或改善疾病或病症——其中调节免疫应答是有益的——的方法。所述方法包括，将有效量的包括本发明采绒革盖菌提取物的组合物给予需要这种治疗的受试者。具体地，本发明的组合物可被用于治疗或改善疾病或病症，其中刺激IFNβ的产生和/或减少TNF-α和/或IL10的产生对所述疾病或病症是有益的。
本文使用的术语“受试者”，描述了可被提供使用本发明组合物进行的治疗的生物，包括哺乳动物例如灵长类。可受益于所公开的治疗方法的哺乳动物包括但不限于，猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；家养动物例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；和其他动物例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
本文使用的术语“治疗”(treatment)或其任何语法变体(例如treat、treating和treatment等)包括但不限于，改善或减轻疾病或病症的症状，降低、遏制、抑制、减少或影响病症的进展、严重程度和/或范围。
本文使用的术语“预防”(prevention)或其任何语法变体(例如prevent、preventing和prevention等)包括但不限于，延迟症状的发病、预防疾病复发、增加症状发作之间的潜伏期，或其组合。本文使用的预防不要求完全没有症状。
本文使用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症的量或者其他能够产生预期治疗效果的量。在某些实施方案中，所述有效量能够使TNF-α和/或IL-10的产生减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，所述有效量能够使IFNβ的产生增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一个实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗或改善癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤包括但不限于脑肿瘤、鼻咽癌、乳癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肝癌、胃癌(stomachcancer)、食道癌、膀胱癌和胃癌(gastric cancer)。
在一个优选实施方案中，本发明可被用于预防或减少肿瘤细胞(尤其是那些对TNF-α的细胞毒性作用有抗性的肿瘤细胞)的转移性扩散。在一个具体实施方案中，本发明可被用于治疗多形性成胶质细胞瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或鼻咽癌。在另一个具体实施方案中，本发明可被用于预防或减少多形性成胶质细胞瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或鼻咽癌的转移性扩散。
在一个实施方案中，本发明可被用于增强免疫系统和/或恢复或改善免疫系统功能。在一个具体实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗或改善化疗和/或放射治疗的免疫抑制作用。在一个实施方案中，本发明的组合物在给予化疗剂之前、期间和/或之后给予，以抵消所述化疗剂对免疫系统的抑制作用。
另外，本发明的组合物可被用于预防、治疗或改善细菌、病毒、真菌、原生动物和/或其他微生物或病原感染。有利地，本发明的组合物可调节和/或增强响应于病原感染的免疫系统功能。
在一个实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗或改善病毒感染，例如，以下病毒的感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹(带状疱疹)、疱疹病毒-8、巨细胞病毒、I型人T淋巴细胞病毒类(HTLV-1)、牛白血病病毒(BLV)、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)和冠状病毒。
在某些实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗或改善真菌感染，包括但不限于，念珠菌属和曲霉属种的感染；细菌感染，包括但不限于，以下细菌的感染：分枝杆菌(Mycobacteria)例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、大肠杆菌(Escherichii coli)、单核细胞增多性李司忒(氏)菌(Listeriamonocytogenes)和亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)；和原生动物感染，包括但不限于，肺囊虫属(Pneumocystis)和弓形体属(Toxoplasma)的感染。
在一个实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗肝功能障碍、呼吸道感染和支气管炎。
治疗组合物和制剂
本发明提供了治疗组合物或药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的采绒革盖菌提取物以及任选的可药用载体。本发明还提供了治疗组合物或药物组合物，其包括根据本发明从采绒革盖菌分离的生物学活性化合物或化学组分。本发明还包含，包括本发明的采绒革盖菌提取物的膳食补充剂以及保健食物或饮料配方。
所述术语“载体”是指可用于给予所述化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶剂(vehicle)。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、豆油和芝麻油)、动物油或合成来源的油。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可被用作液体载体，尤其用于注射用溶液。
适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述治疗组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、悬液剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、缓释制剂等形式。可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)来配制所述组合物。适合的药物载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。这种组合物含有治疗有效量的所述治疗组合物，还含有适合量的载体以提供用于适合给予患者的形式。所述制剂应适应给药的方式。
本发明的治疗或药物组合物可被配制为中性或盐形式。可药用盐包括但不限于，与盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁等形成的盐。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包括一种或多种容器，所述容器填充有一种或多种本发明药物组合物的成分，例如化合物、载体。
本发明的组合物还可以按照中药实践进行配制。可有效治疗具体疾病、病症或障碍的所述制剂的组成和剂量将取决于通过标准临床技术确定的所述疾病、病症或障碍的性质。
可容易地将处方量的中药制造为任何适于给予人或动物的药物形式。适合的形式包括例如酊剂、煎剂和干提取物。这些形式可通过口服摄入、通过静脉注射或粘膜来施用。所述活性成分还可被配制为胶囊剂、粉剂、丸剂(pallet)、锭剂、栓剂、口服溶液、巴氏消毒的胃肠道混悬注射液、小量或大量的注射液、冻干粉注射液、巴氏消毒的粉剂注射液等。所有上述方法是本领域技术人员已知的，在书籍中有描述并且是草药从业者通常使用的。
酊剂是通过将原料药材(例如草药和真菌)悬浮于醇溶液(例如果酒或烈性酒)中而制备的。悬浮一段时间后，可将所述液体(醇溶液)给药，例如一天2次或3次，每次1茶匙。
提取物是药用原料的必需组分的浓缩制品。所述必需组分一般是通过将原料药材(例如草药和真菌)悬浮在适当的溶剂中而从所述原料药材提取的，所述溶剂一般为水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。可通过浸渍、渗滤、再渗滤、逆流提取、涡流提取(turbo-extraction)的方式或通过二氧化碳超临界(温度/压力)提取进一步促进所述提取过程。过滤除去草药残渣后，可将所述提取溶液进一步蒸发并由此浓缩得到软提取物(浸膏)和/或通过喷雾干燥、真空烘箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥最终得到干提取物(浸膏)。所述软提取物或干提取物可进一步被溶解在合适的液体中至所需给药浓度，或者加工成例如丸剂、胶囊剂、注射剂等形式。
给药途径
本发明的化合物和组合物可通过标准途径给予被治疗的受试者，所述途径包括口服、吸入或肠胃外给药，所述肠胃外给药包括静脉、皮下、局部、经皮、真皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为待插入(暂时或永久)到受试者中的任何医学装置或物体的组分共同给药。在优选实施方案中，本发明的化合物和组合物通过口服给药给予受试者。
可有效治疗具体疾病、病症或障碍的本发明治疗组合物或药物组合物的量，将取决于给药途径以及所述疾病、病症或障碍的严重性，并应根据开业医生的判断和每个患者的情况来决定。通常，所述剂量范围为约0.001mg/kg至约3g/kg。
例如，适合的单位剂量可以是约0.01至约500mg、约0.01至约400mg、约0.01至约300mg、约0.01至约200mg、约0.01至约100mg、约0.01至约50mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约3mg、约0.01至约1mg或约0.01至约0.5mg。这样的单位剂量可被给予多于一次/天，例如2次或3次/天。
依赖于所述病症的类型和要治疗的受试者，可与所述载体物质结合产生单一剂型的活性成分的量会有所变化。通常，治疗组合物含有约5％至约95％的活性成分(w/w)。更具体地，治疗组合物含有约20％至约80％(w/w)或约30％至约70％的活性成分(w/w)。
一旦患者的病症出现改善，如果必要，可给予维持剂量。随后，可根据症状，降低给药剂量和/或给药频率至所述改善的状态得以维持的水平。当所述症状已缓解至所需水平时，治疗应停止。但是一旦疾病症状出现任何复发，患者可能需要长期的间歇性治疗。
另外，可任选地使用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。在所述制剂中使用的精确剂量还将取决于给药途径以及所述疾病、病症或障碍的严重性，并应根据开业医生的判断和每个患者的情况来决定。可以从由体外或动物模型试验系统得到的剂量-应答曲线来推断有效剂量。
材料和方法
用于生物测定法的细胞培养物
在生物测定法中使用原代人血巨噬细胞和人白血病单核细胞淋巴瘤细胞(U937)以检查采绒革盖菌提取物对免疫系统的作用。通过菲科帕克离心(Ficoll-Paquecentrifugation)从健康供体(香港红十字会输血服务中心)的血液样品中分离了血单核细胞，并通过前述的贴壁方法(27-28)对其进行纯化。
简言之，将血液样品以3000rpm离心15分钟，分离为血浆和细胞层。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1∶1的比例稀释所述细胞层。将所述稀释的细胞慢慢铺在Ficoll(GEHealthcare)上并以2300rpm离心20分钟以从红细胞中分离单核细胞。移除所述单核细胞层并用RPMI 1640培养基(Gibco)洗涤直到上清澄清。
将所述细胞沉淀重悬在补充有5％自体血浆、1％青霉素和链霉素(Gibco)的RPMI1640中。将悬液铺到培养皿中并在37℃下孵育1小时以使单核细胞贴壁。然后用RPMI 1640培养基洗涤并孵育过夜，用含有5mM EDTA的冷RPMI 1640分离所述贴壁的单核细胞。
将所述单核细胞以0.5×106个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养板中并用补充有5％自体血浆、1％青霉素和链霉素的RPMI 1640孵育。如本发明人之前的报告(27，30)中所述，体外培养14天后获得了分化的巨噬细胞。
将从美国典型培养物保藏中心获得的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)和人成神经细胞(SKNSH)维持在培养基中，分别用于一氧化氮测定法和单纯疱疹病毒感染测定法。
用于mRNA分析的实时逆转录聚合酶链式反应
根据制造商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。用DNA酶处理总RNA，然后用寡聚核苷酸(dT)引物通过Superscript II逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。如本发明人之前的报告(27-30)中所述，使用TaqMan基因表达测定法(AppliedBiosystems)测定细胞因子的mRNA水平。
用于细胞因子分析的酶联免疫吸附测定法
使用可市购的测定试剂盒(R&D Systems)通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量细胞培养上清液中细胞因子的蛋白水平(27-30)。每个样品重复测定两次。
实施例
如下为举例示出实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。
实施例1-采绒革盖菌提取物的制备
该实施例举例示出了制备采绒革盖菌提取物的优选提取方案。
图1A举例示出了所述提取方案的一个实施方案。简言之，将采绒革盖菌原材料浸渍在12倍体积的乙醇中，在室温下用持续超声提取1小时，然后离心得到乙醇提取物和残留物。将所得残留物浸渍在10倍体积乙醇中，并如图1A所示，重复提取程序两次。收集所述提取物、合并并在真空下蒸发至干燥，以产生包括采绒革盖菌乙醇提取物的颗粒。
在一个实施方案中，将采绒革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时，然后离心得到乙醇提取物和残留物。
在一个实施方案中，使用milli-Q水作为制备采绒革盖菌水提取物的溶剂。简言之，将采绒革盖菌原材料浸渍在15倍体积的milli-Q水中，在室温下用持续超声提取30分钟，然后离心得到水提取物和残留物。将所得残留物重新溶解在10倍体积水中，重复提取程序两次。收集所述水提取物、合并并在真空下蒸发至干燥，以产生包括采绒革盖菌水提取物的颗粒。
为帮助提取包括多糖-肽(PSP)(例如PSK)的生物活性大分子和其他生物活性小分子，将采绒革盖菌原材料或采绒革盖菌残留物进一步用碱性溶液(例如NaOH、KOH)提取。
图1B示出了所述提取方案的另一个实施方案。简言之，在室温下将采绒革盖菌原材料浸渍在12倍体积乙醇中，同时持续超声1小时。离心后，获得第一提取物和第一残留物。重复该程序两次。在室温下将所述第一残留物浸渍在10倍体积的50％乙醇中2小时。然后将所述乙醇浸渍的残留物再煮沸2个小时。通过过滤从上清中分离不溶物质，得到第二残留物和第二提取物。将所述第二残留物加入到10x 0.04％NaOH中并煮沸6小时。通过过滤从上清中分离不溶物质，得到第三残留物和第三提取物。收集所述提取物、合并并冻干。
图1C示出了所述提取方案的另一个实施方案。简言之，在室温下将采绒革盖菌原材料浸渍在10倍体积的50％乙醇中2小时。将所述乙醇浸渍的采绒革盖菌原材料再煮沸2个小时。通过过滤从上清中分离不溶物质，得到第一残留物和第一提取物。将所述第一残留物加入到10x0.04％NaOH中并再煮沸6小时。通过过滤从上清中分离不溶物质，得到第二残留物和第二提取物。收集所述提取物、合并并冻干。
实施例2-采绒革盖菌提取物的高效液相色谱分析
该实施例通过高效液相色谱(HPLC)分析了采绒革盖菌提取物的化学指纹图谱。使用图1A、1B中举例示出的提取方案或通过将采绒革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时获得了采绒革盖菌提取物。
简言之，使用配备有PDA检测器(G1315C)和自动进样器(G1367C)的Agilent 1200系列HPLC系统(Binary Pump SL，G1312B)对100ug/uL的乙醇提取物进行高效液相色谱(HPLC)分析。将色谱柱(4.6×250mm)中装入ODS-键合的硅胶(Lichrospher 100RP C18，EC5um)，在分离期间柱温维持在室温下。
将5微升采绒革盖菌提取物注射到所述HPLC系统中。使用水和乙腈的混合物作为流动相以1.0ml/min流速进行HPLC。采用的梯度洗脱方法在表1中举例示出。使用设定在210、254和280nm的快速扫描光电二极管阵列检测器的Agilent 1200系列实现峰值检测。图2A-C示出了HPLC后的所述采绒革盖菌乙醇提取物的化学谱图。
表1：用于对用图1A和1B中提取方案获得的采绒革盖菌提取物的指纹图谱分析的HPLC梯度洗脱情况
Figure BDA0001429425210000191
实施例3-采绒革盖菌提取物的气相色谱-质谱分析
该实施例通过气相色谱-质谱(GC-MS)进一步分析了采绒革盖菌提取物的化学指纹图谱。使用图1A中示出的提取方案或通过将采绒革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时获得了采绒革盖菌提取物。
在通过GC-MS分析之前，对所述采绒革盖菌提取物进行硅烷化。简言之，将100ul的溶于乙腈中的所述提取物(30ug/μL)转移到1ml反应瓶(Alltech)中，然后加入50ul吡啶和50ul衍生试剂BSTFA[N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]，其与多种极性化合物反应，从而用-Si(CH3)3基团替换所述极性化合物的不稳定氢原子。在70℃下孵育2小时后，可以对所述混合物进行GC-MS分析。
通过使用GC-MS(GC：Agilent，7890A；MS：Agilent，5975C)和HP-5MS柱(30m x250um x 0.25um)分析所述混合物。使用分流比为1∶50的氦作为载气，将1ul流速为1ml/min的氦注射入所述柱中。初始的烘箱温度为70℃，该温度维持1分钟，以每分钟10℃的速率增加至180℃，维持在180℃下2分钟，以每分钟10℃的速率增加至280℃，维持在280℃下3分钟。注射器温度为275℃；界面温度为250℃，离子源温度为230℃，以200eV进行电子碰撞电离(EI)。在50-700原子质量单位(amu)的范围分析质谱，运行时间22分钟，使用AgilentG1701EA化学工作站(chemstation)处理所得数据。图3示出了根据GC-MS分析后采绒革盖菌乙醇提取物的色谱谱图。
实施例4-采绒革盖菌提取物的分级分离
使用配备有1525双HPLC泵、2998光电二极管阵列检测器和Waters级分收集器III的Waters制备型液相色谱系统，将使用图1A中示出的提取方案获得的采绒革盖菌乙醇提取物(MPUB-乙醇)进一步分离为5个级分(图4)。使用反相柱(Lichrospher100RP C18，EC 5um)进行所述分级分离，检测波长设定为210、254和280nm。流速为1ml/min，由两种溶剂(A)水和(B)乙腈组成的梯度程序如下：0-16分钟，10-90％B；16-18分钟，90％B；18-22分钟，10％B。
实施例5-采绒革盖菌提取物对细胞因子产生的作用
为研究采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)对IFNβ和IL-10产生的作用，用50ug/ml的MPUB-乙醇预处理原代人血巨噬细胞18小时。然后将所述细胞用聚肌苷-聚胞苷酸(poly I：C)(50ug/ml)处理3小时。通过TaqMan基因表达测定法分析IFNβ mRNA和IL-10mRNA水平。如图5A-B中所示，所述采绒革盖菌提取物增加了IFNβ产生并抑制了IL-10产生。
为研究采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)对LPS诱导的TNFα产生的作用，用多种浓度(1、10和50ug/ml)的MPUB-乙醇预处理原代人血巨噬细胞18小时。然后将所述细胞用脂多糖(LPS)(1ng/ml)处理3和24小时。通过TaqMan基因表达测定法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别分析了TNFα mRNA水平和蛋白质水平。如图6A-B中所示，采绒革盖菌提取物以剂量依赖的方式减少了TNFα产生。
为研究采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)对LPS诱导的亚硝酸盐产生的作用，用多种浓度(20、50和100ug/ml)的MPUB-乙醇预处理小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)24小时。然后将所述细胞用LPS(100ng/ml)处理18小时，通过格里斯试剂测量亚硝酸盐浓度(uM)。如图7中所示，采绒革盖菌提取物以剂量依赖的方式抑制了亚硝酸盐产生。
实施例6-采绒革盖菌提取物的抗病毒作用的测定
为研究采绒革盖菌提取物的抗病毒作用，用10ug/ml的MPUB-乙醇预处理人神经元细胞(human neuronal cell，SKNSH)18小时。保留培养上清用于连续孵育。然后以m.o.i.(感染复数)为0.01的单纯疱疹病毒(HSV)感染所述细胞1小时。病毒感染后，用PBS洗涤所述细胞两次，并用保留的培养上清再孵育18小时。收集培养上清用于测定病毒滴度，这是通过在T98G(人成胶质细胞瘤细胞系)细胞感染期间半数组织培养物感染剂量(TCID50)的滴定来测量的。
如实施例4中所述，将MPUB-乙醇进一步分级分离为5个级分。将SKNSH细胞用MPUB-乙醇-1、-2和-3预处理，并如上所述用HSV病毒感染。测量了培养上清的病毒滴度(TCID50)。MPUB-乙醇-4和-5对细胞是细胞毒性的(数据未示出)，因此没有进一步研究其抗病毒作用。图8A和8C中示出的所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。p值＜0.001(＊)被认为是统计学显著的。
如图8中所示，采绒革盖菌提取物显著降低培养上清中的病毒滴度，其中级分3显示出最有力的抗病毒作用(图8B和8C)。
实施例7-采绒革盖菌提取物对MMP-3表达的作用
本实施例显示，采绒革盖菌提取物可降低MMP-3表达(图9)。简言之，用不同浓度(1、10和50ug/ml)的MPUB-乙醇预处理成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞18小时，然后用重组人TNFα(10ng/ml)处理3小时。通过TaqMan基因表达测定法分析MMP-3mRNA水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的均值±SD。p值＜0.05(＊)被认为是统计学显著的。
实施例8-采绒革盖菌提取物的体内抗病毒作用的测定
为研究采绒革盖菌提取物在体内的抗病毒作用，将二甲基亚砜(DMSO)(MPUB-乙醇的溶剂)或MPUB-乙醇(250mg/kg)以腹膜内(ip)方式给予3周龄雄性BALB/c小鼠(每组15只小鼠)，每天一次，间隔24小时，持续7天。
简言之，在第0天，腹膜内接种1 x 105TCID50/ml的HSV以感染所述小鼠。感染后1小时开始，通过腹膜内给予DMSO、MPUB-乙醇或阿昔洛韦(acyclovir)(10mg/kg)，每天一次，间隔24小时，持续5天。每天检查所述小鼠，通过后肢麻痹测量疾病严重程度，所述后肢麻痹基于如下评分系统：0，没有麻痹；1，后肢运动明显困难；2，一条后肢不完全麻痹；3，一条后肢完全麻痹；4，两条后肢不完全麻痹；5，两条后肢完全麻痹。
如图10中所示，与DMSO-处理的对照相比，采绒革盖菌提取物(MPUB-乙醇)显著地降低小鼠中HSV感染的严重程度。采绒革盖菌提取物的抗病毒作用与阿昔洛韦相当。
本文所列举的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引证的方式纳入本文，就如同每份参考文献分别且具体地被指明是通过引证的方式纳入本文且在本文中以其全部内容提出。
除非在本文中另外说明或明显与上下文相悖，在描述本发明的上下文中所使用的术语“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”和类似指代物应解释为涵盖单数和复数形式。
除非本文另外说明，本文对数值范围的叙述仅旨在作为分别指代落入该范围内的每个单独数值的速记法，并且每个单独的数值就如同其在本文中被单独记载一样纳入本说明书。除非另外说明，本文所提供的所有准确数值代表相应的近似值(例如，对于具体因素或测量所提供的所有准确的示例性数值，如果合适，可认为也提供了相应的近似测量，由“约”修饰)。
除非另外指明，使用本文所提供的任意和所有实例或示例性语言(如，“例如”)仅旨在更好地阐明本发明而不对本发明范围构成限制。除非作同样的明确说明，本说明书中的语言不应被解释为指明任意要素对本发明的实施是必要的。
除非另外说明或明显与上下文不符，本文中对使用涉及一个要素或多个要素的术语如“含有”、“具有”、“包括”或“包含”的本发明任意方面或实施方案的描述旨在支持“由......组成”、“基本上由......组成”或“基本包含”一个或多个该具体要素的本发明的类似方面或实施方案(例如，除非另外说明或与上下文明显相悖，本文所述的含有具体要素的组合物应理解为也描述了由该要素组成的组合物)。
应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，对本领域技术人员暗示了基于它们的多种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的主旨和范围内。
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Claims (2)

1.采绒革盖菌提取物或包含采绒革盖菌提取物的组合物用于制备用于治疗由单纯疱疹病毒(HSV)引起的感染的药剂的用途，其中所述采绒革盖菌提取物是通过基本上由步骤a)至b)和d)组成的方法制备：
a)提供足够量的采绒革盖菌原材料；
b)在15℃至30℃的温度下用极性溶剂乙醇提取所述采绒革盖菌原材料，以得到采绒革盖菌醇的提取物和残留物，然后回收所述采绒革盖菌的醇提取物；
其中步骤b)进行一次或多于一次；
d)合并从步骤b)中获得的一种或多种提取物以得到采绒革盖菌提取物。
2.根据权利要求1的用途，所述采绒革盖菌提取物是通过将采绒革盖菌原材料浸渍在12倍体积的乙醇中，在室温下用持续超声提取1小时，然后离心得到乙醇提取物和残留物，将所得残留物浸渍在10倍体积乙醇中，并重复提取程序两次，收集所述提取物、合并并在真空下蒸发至干燥，以产生包括采绒革盖菌乙醇提取物的颗粒；或者，所述采绒革盖菌提取物通过将采绒革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时而获得。
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