KR20080107207A

KR20080107207A - 당유자 잎 추출물 및 이를 함유하는 항염증용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20080107207A
Application number: KR1020070055233A
Authority: KR
Inventors: 유은숙; 양은진; 이혜자; 강경진; 박선순; 강희경; 김소미
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2007-06-05
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2008-12-10

Abstract

염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물이 개시된다. 상기 당유자 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 한다. 또한 상기 당유자 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 당유자 잎 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 분획시킨 분획물인 것을 특징으로 한다.

당유자 잎, 염증, 아토피, 염증성인자(NO, iNOS, COX, TNF-alpha, IL-6, MDC, TARC)

Description

당유자 잎 추출물 및 이를 함유하는 항염증용 약학 조성물{Extract of Citrus grandis Osbeck Leaves and Anti-inflammatory Pharmaceutical Composition Containing the Same}

도 1은 당유자 잎의 추출 및 분획과정을 나타낸 도면이다.

도 2는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 nitric oxide 및 LDH 생성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 LDH 생성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 iNOS 발현저해를 나타낸 도면이다.

도 5는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 COX-2 발현저해를 나타낸 도면이다.

도 6은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 TNF-α 발현저해를 나타낸 도면이다.

도 7은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 IL-6 발현저해를 나타낸 도면이다.

도 8은 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 TARC 발현 저해를 나타낸 도면이다.

도 9는 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 MDC 발현저해를 나타낸 도면이다.

본 발명은 당유자 잎 추출물 및 이를 함유하는 항염증용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 병원성 이물질에 감염되었을 때 이물질에 대항하여 방어하기 위한 첫 번째 작용이다. 염증반응이 일어나면 nitric oxide (NO), prostaglandin E₂ (PGE₂), tumor necrosis factor (TNF-α) 그리고 interleukin-6 (IL-6) 등의 염증인자가 생성된다. 이중 NO는 염증질환을 일으켜 조직을 파괴하고, 세포에 독성을 일으키며, 자가면역 질환 등을 일으키는 물질로 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 생성되는데, NOS는 inducible NOS (iNOS), endothelial NOS (eNOS), neuronal NOS (nNOS)의 3가지 동종물질로 나뉜다. 특히, iNOS는 LPS나 외부항원 등에 노출되면 L-arginine을 L-citrulline으로 전환시켜 다량의 NO를 생성한다.

대부분의 비스테로이드성 소염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs: NSAIDs)의 항염증 효과는 시클로옥시게나제(Cyclooxygenase; COX) 효소 활성을 억제하는 것에 의해 매개된다. COX는 아라키도닉 산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘(prostaglandins) (PGs)으로 전환시키는 효소로서, COX-1과 COX-2의 2가지 형으로 분류된다. COX-1은 생체내에서 혈소판 형성, 위벽보호, 신장기능 유지 등의 생리학적으로 정상적인 기능을 하지만, COX-2는 LPS나 외부항원에 자극을 받으면 PGE₂를 생성하고, PGE₂는 염증인자 매개체, 종양 성장 인자 및 발암물질로 작용한다.

현재까지 염증성 질환의 중요한 치료제로는 프로스타글란딘 생합성 과정상에서 중요 효소인 포스포리파아제 A2와 시클로옥시게나아제의 활성 저해 기작을 가진 약물들이 주로 사용이 된다. 포스포리파아제 A2의 저해제로는 스테로이드계열 호르몬 들이 이용되고 있으나 스테로이드성 약제의 다량 사용 또는 장기 사용은 여러 가지 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있어 증상이 심하거나 즉각적인 반응을 필요로 하는 치료가 아닌 이상 스테로이드성 약제의 사용은 극히 제한되어 있는 실정이다. 스테로이드성 약제의 과도한 부작용 때문에 일반적인 염증성 질환의 치료나 만성 치료시에는 비스테로이드성 항염증제(Non-steroidial anti-inflammatory drugs)를 주로 사용하게 된다. 비스테로이드성 항염증제로는 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid, 아스피린), 이부프로펜(ibuprofen), 아세트아미노펜(acetaminophen) 등이 널리 이용되고 있다. 비스테로이드성 항염증제는 대부분 시클로옥시게나아제의 저해제들로 구성되어 있으며, 시클로옥시게나아제의 활성을 완전 억제하거나 또는 효소의 활성 부위에 결합하여 프로스타글란딘과 다른 구조의 화합물을 만들어 내도록 한다. 그러나 이들 비스테로이드성 항염증제들 역시 스테로이드성 약제에 비하여 부작용이 적은 편이나 만성 섭취시 위장관 출혈과 같은 위장 장애를 야기하는 것으로 알려져 있다. 관절염, 피부염 및 위염 과 같은 만성 염증성 질환의 대부분은 원인을 제거하고 완전한 치료를 하는데 있어서 상당 기간이 소요되기 때문에 이러한 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증제의 사용에 있어서 부작용은 질환 치료에 있어서 큰 장애요인으로 작용한다. 현재 인구의 노령화, 사회적 스트레스와 화학물질 섭취의 증가로 인하여 이러한 만성 염증 질환자의 수는 급속도로 증가하고 있다. 따라서, 만성 염증 질환의 치료에 있어서 장기간에 걸쳐서 복용시 부작용이 없으면서도 염증을 효과적으로 제어할 수 있는 소재의 개발이 절실한 실정이다.

감귤류는 운향과 (Rutacae) 감귤아과 (Auranti-oideae)에 속하는 식물로서, 감귤속 (Citrus), 금귤속 (Fortunella), 탱자나무속(Ponicirus) 및 클리메니아 (Clymennia)의 4속이 있다. 그 중 감귤속(Citrus)에 속하는 당유자는 국내에서는 제주도에서만 재배되는 식물로, 오바쿠논(obacunone), 리모넨(limonene), 노밀린(nomiline), 나린진(naringin), 리모노이드(limonoid) 등을 함유하고 있다. 특히, 리모노이드는 당유자에 다량함유 되어있는 물질로 암세포의 증식 억제와 예방에 효능이 있다고 알려져 있으며, 임상실험 결과 간, 폐, 장, 피부암 억제에 효과 가 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 나린진은 항균, 항암, 항염증, 콜레스테롤 저하, 자유 라디칼 소거(free radical scavenging) 기능이 있는 것으로 보고되고 있고, 당유자 미숙과 추출물은 항염, 항산화 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 하지만 당유자 잎은 특별히 사용되는 용도가 없어, 폐기되고 있으며, 당유자 잎에 대한 어떠한 활성 및 기전이 보고된 바도 없다.

이에, 본 발명자들은 당유자 잎 추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 염증성 인자로 알려진 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6와 hIFN-γ로 활성화된 HaCaT 세포의 염증성 인자로 알려진 TARC와 MDC의 생성에 미치는 영향을 조사하고자 예의 노력한 결과, 당유자 잎 추출물이 염증 억제 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은, 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 당유자 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물을 제공한다.

본 발명은, 다른 관점에서, 당유자 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물을 제공한다.

본 발명에 따른 당유자(Citrus grandis Osbeck) 잎 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 즉, 당유자 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등을 사용할 수 있으며, 메탄올 또는 메탄올 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 당유자 잎은 그대로 사용하거나, 분쇄한 후 사용할 수 있으며, 사용되는 용매의 사용량은 당유자 잎 100g당 0.1 내지 5L를 사용할 수 있다. 상기 추출을 위한 온도는 4 내지 120℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다.

상기 용매로 추출된 당유자 잎 추출물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 극성에 따라 순차적으로 더욱 분획될 수 있다.

즉, 본 발명은 (a) 당유자 잎을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들 의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 다음, 농축하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 농축물을 물로 녹인 후, 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 첨가하여 분획하는 단계를 포함하는 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물의 제조방법을 제공한다.

추출 및 분획과정을 일예로 설명하면 다음과 같다. 당유자 잎 100g당 메탄올 0.1L를 가하여 메탄올 추출물을 제조한다. 다음으로 메탄올 추출물에 헥산을 가하여 헥산 분획물을 제조하고, 잔류물에 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 순차적으로 가하여 분획함으로써 클로로포름 추출물, 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물을 각각 제조할 수 있으며, 상기 용매에서 추출되지 않은 물 분획은 물 추출물로 제조된다. 상기 용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매를 1: 0.1 내지 10 부피비로 가하여 실시할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 당유자 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 항염증용 약학 조성물은 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 상기 유효성분은 항염증용 약학 조성물에 0.001 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.1 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 당유자 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝 솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 당유자 잎 추출물을 함유하는 항염증용 약학조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항염증용 조성물은 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 쇼크, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 안과질환, 기관지염, 염증성 장질환 또는 염증성 피부질환 및 아토피성 피부염의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.

특히, 아토피성 피부염은 만성 재발성 피부질환으로서, 많은 아토피 환자에서 특이적으로 혈청 IgE가 증가하고, 피부조직에 호산구, T 세포, 비만세포, 그리고 대식세포의 침윤이 일어난다. 케모카인(Chemokine)은 작은 분자량을 가진 단백질로, 백혈구의 이동과 활성을 조절하는 사이토카인의 한 그룹이며, T림프구의 T-helper2 (Th2) 세포를 활성화시켜 CC 케모카인 수용체-4 (CCR4)를 발현하고, 발현된 CCR4는 thymus and activation-regulation chemokine (TARC)/CCL17과 macrophage-derived chemokine(MDC)/CCL22의 수용체로 작용한다. 아토피가 발생하면 CCR4에 특이적으로 결합하는 케모카인인 TARC가 Th2세포의 이주를 선택적으로 조절하고, MDC는 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포와 자연 살해 세포 등의 이주를 조절하는 것으로 알려져 있다. 그 결과 최근의 보고자료에 따르면, 아토피 환자의 혈청에서 TARC와 MDC의 농도가 증가된다고 보고되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 하기 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 당유자 잎 시료의 추출

제주도에서 재배되는 당유자 잎을 2005년 12월에 채집하여 동결건조 후, 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료(50.0g)를 80% methanol (MeOH)로 2회 교반 추출 후 여과하고 감압 농축하여 용매를 증발시켰다. 여기에서 얻은 MeOH 추출물 (10.810g)을 계통적 추출방법에 의하여 hexane 분획물(0.7121g), chloroform (CHCl₃) 분획물(0.2517g), ethylacetate (EtOAc) 분획물(1.268g), buthanol (n-BuOH) 분획물(2.170g), H₂O 분획물(5.4634g)을 획득하였다 (도 1 참조). 도 1은 당 유자 잎의 추출 및 분획과정을 나타낸 도면이다.

[실험예 1] 당유자 잎 추출물의 염증 억제 효능 실험

가. 세포배양

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포를 KCLB(Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받았고, Dr. M. J. Cho (Cheju National University, Korea)로부터 변형된 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 분양 받아 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

나. 세포(RAW264.7)독성 평가 (LDH assay)

Lactate dehydrogenase (LDH)는 모든 세포의 세포질에 존재하는 효소로 세포의 원형질막에 손상이 생기면 세포 밖으로 급격하게 분비되어 배양액 안에 LDH가 증가된다. 배양액 안의 LDH 증가는 원형질막이 손상된 세포가 증가되었음을 암시하고, 이것은 곧 죽은 세포가 증가 된 것을 의미한다.

RAW264.7세포 (1.5×10⁵cells/㎖)를 24시간 전 배양 후 실시예 1에서 제조된 당유자 잎 추출물(분획물 포함)(100㎍/㎖), Lipopoly-saccharide(LPS, E. coli serotype 0111:B4, Sigma) (1㎍/㎖)를 동시에 처리하고, 24시간 배양하였다. 다음 으로, LDH assay방법에 따라 배양액을 걷어낸 다음 3000rpm 에서 5분 원심 분리하여 상층액 50㎕를 substrate mix (PBS+1% bovine serum albumin)와 동량 혼합하여 실온암소에서 30분간 반응시킨 후, stop solution (1M acetic acid)을 50㎕ 넣고, 490nm에서 흡광도를 측정함으로써, 세포독성을 확인 하였다. 대조군에는 30분간 lysis solution을 처리해 모든 세포를 100% 용해시킨 후, 흡광도를 측정해 이를 100%로 했을 때 각각의 상대적 %를 구했으며, 모든 실험은 동일한 조건에서 실시하였다.

그 결과, hexane 분획물이 대조군에 비해 약 32%의 LDH 분비를 초래하였고, 나머지 분획물의 LDH 분비량은 20% 이하였다 (도 2 참조). 도 2는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 nitric oxide 및 LDH 생성을 나타낸 그래프이다.

다. 세포(HaCaT)독성 평가 (LDH assay)

HaCaT 세포 (5.0×10⁵cells/㎖)는 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 시료(실시예 1에서 제조된 당유자 잎 추출물(분획물 포함))(50㎍/㎖)와 human interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli, Roche, Basel, Swiss) (10ng/㎖)를 동시 처리하고 24시간 배양 후, 상층액을 얻어 RAW264.7 세포의 LDH 측정법과 동일한 방법으로 실험하였다. 모든 실험은 동일한 조건에서 실시하였고 실험방법은 Promega (Medison, WI, USA)사의 Cytotox96^®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit의 방 법을 이용하였다.

그 결과, 헥산(hexane), 클로로포름(CHCl₃) 분획물이 대조군에 비해 각각 약 65%, 68%의 LDH 분비를 초래하였고, 나머지 분획물의 LDH 분비량은 30% 이하였다(도 3 참조). 도 3은 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 조추출물 및 분획물의 LDH 생성을 나타낸 그래프이다.

라. Nitric oxide 측정

NO는 inducible nitric oxide (iNOS)에 의해서 생성되는 물질로 신경전달, 혈관확장, 숙주방어 등의 여러 생물학적 기능의 매개체로 알려져 있으며, 최근에는 염증유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지면서 억제효과를 나타내는 약물을 찾는 것에 큰 초점이 맞추어지고 있다. LPS의 자극에 의해 생성된 NO는 세포배양액 중에 NO₂ ^- 형태로 존재하며, 이는 Griess 시약을 이용하여 측정할 수 있다.

RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 1.5×10⁵cells/㎖로 분주하여 24시간 배양하고, 시료(실시예 1에서 제조된 당유자 잎 추출물(분획물 포함))(100㎍/㎖)와 LPS (1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100㎕를 96 well plate에 혼합하여 10분간 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNo₂)를 serial dilution (연속 희석)하여 얻었다 (1-100μM).

그 결과, 클로로포름(CHCl₃) 분획물이 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 높은 NO 생성 억제 효과를 나타내었다 (도 2 참조).

마. 당유자 잎 추출물의 iNOS 발현에 미치는 영향

RAW264.7 세포 (1.0×10⁶cells/㎖)를 24시간 전 배양하고, 시료(실시예 1에서 제조된 당유자 잎 추출물(분획물 포함, (100㎍/㎖))와 LPS (1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. Total RNA 추출을 위해 TRI-reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA)를 이용하였으며, 모든 실험은 RNase-free 한 조건에서 실시하였다. cDNA 합성은 Improm-II^TMcDNA kit (Promega, WI, USA)를 이용하여, 1㎍의 total RNA를 oligo(dT)₁₈ primer와 mix후 70℃ 5 min 반응시킨 후 dNTP (0.5μM), 1 unit RNase inhibitor, M-MuLV reverse transcriptase (2U)를 넣고 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 70℃ 15 min 반응 시킨 후 중지하였다.

2㎕cDNA, 4μM의 5'과 3'primer(F: 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3', R: 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3') 10x buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM MgCl₂, 1 unit Taq polymerase (Promega, WI, USA)를 넣고 distilled water로 최종 볼륨을 25 ㎕로 맞추고 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 RT PCR을 시행하였다. PCR에 의하여 생성된 산물을 1.0% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하고, ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다.

그 결과, LPS 자극에 의해 iNOS는 현저히 증가하였으며, 당유자 잎의 클로로포름(CHCl₃) 분획물에서 iNOS의 mRNA 발현이 약 66% 억제되었다 (도 4 참조). 도 4는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 iNOS 발현저해를 나타낸 도면이다.

상기의 결과로 부터 당유자 잎 추출물의 NO 생성 억제 효과는 iNOS 발현 억제에 의한 것으로 사료된다.

바. 당유자 잎 추출물의 COX-2 발현에 미치는 영향

염증 억제 약물들중 다수는 프로스타글란딘(prostaglandin) 생성 억제를 위한 것이 고, 이들은 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다. COX는 COX-1과 COX-2로 나눠지는데, COX-1은 위 및 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 prostaglandin의 합성에 작용하며, 상대적으로 COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발현된다. 그러므로 COX-2에 의해 prostaglandin이 합성된다는 것은 염증반응이 일어난다는 것을 의미한다.

iNOS primer 대신에 COX-2 primer(F: 5'-CACTACATCCTGACCCACTT-3', R: 5'- ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3')를 사용한 것을 제외하고는 상기 '실험예1의 마'와 동일한 방법으로 RT PCR을 실시한 후, 전기영동을 실시하였다.

그 결과, 클로로포름(CHCl₃) 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해서 약 10%의 낮은 억제 효과를 보였다 (Fig 5). 도 5는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 COX-2 발현저해를 나타낸 도면이다.

사. 당유자 잎 추출물의 TNF-α 발현에 미치는 영향

TNF-α는 그람 음성 세균의 세포막에 존재하는 내독소인 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 생성되는 pro-inflammatory 사이토카인으로 소량의 TNF-α는 백혈구나 혈관세포에 작용하여 국소적인 염증반응을 일으켜 이물질을 제거한다. 하지만 과량의 TNF-α는 류마티스성 관절염이나 폐혈성 쇼크를 일으키고 만성적 염증질환을 유발한다.

iNOS primer 대신에 TNF-α primer (F:5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3', R:5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3')를 사용한 것을 제외하고는 상기 '실험예1의 마'와 동일한 방법으로 RT PCR을 실시한 후, 전기영동을 실시하였다.

그 결과, 클로로포름 및 부탄올 분획물에서 TNF-α 발현에 대한 미약한 억제효과를 확인하였다 (도 6 참조). 도 6은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 TNF-α 발현저해를 나타낸 도면이다.

아. 당유자 잎 추출물의 IL-6 발현에 미치는 영향

IL-6는 면역계와 포유류의 세포사이 소통에 중요하게 작용하는 사이토카인의 하나로 세포의 분화, 성장, 생존 그리고 기능에 영향을 주는 조절자로 작용한다. 이러한 IL-6는 염증반응이 일어나는 동안 일정하게 생성되고 in vivo와 in vitro에서 상호 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

iNOS primer 대신에 IL-6 primer(F:5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3', R:5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3')를 사용한 것을 제외하고는 상기 '실험예1의 마'와 동일한 방법으로 RT PCR을 실시한 후, 전기영동을 실시하였다.

그 결과, 당유자 잎의 클로로포름(CHCl₃) 분획물이 대조군에 비하여 약 41%의 억제효과를 나타내었다 (도 7 참조). 도 7은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 IL-6 발현저해를 나타낸 도면이다. 본 발명에 따른 당유자 잎 추출물에 의한 IL-6의 발현 저해는 염증전구물질의 형성억제를 나타낸다.

자. 당유자 잎 추출물의 TARC 및 MDC 발현에 미치는 영향

각질형성세포는 T림프구와 상호작용을 통해 여러 가지 피부 질환의 면역반응을 일으키는데, 이 반응은 T림프구에서 분비하는 IFN-γ 등의 염증성 사이토카인에 의해 활성화 되고, IFN-γ가 각질형성 세포에서 면역활성인자로 알려진 TARC 와 MDC의 발현을 증가시킨다고 보고되었다.

변형된 각질형성 세포인 HaCaT 세포(5.0×10⁵cells/㎖)를 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 넣은 후, hIFN-γ (10ng/㎖)를 처리하여 케모카인을 유도하고, 시료(실시예 1에서 제조된 당유자 잎 추출물(분획물 포함)(50㎍/㎖)을 처리하였다.

다음으로 상기 '실험예1의 마'와 동일한 방법으로 Total RNA를 추출하고, RT PCR을 실시한 후, 전기영동을 실시하였다. RT PCR에서는 TARC primer(F: 5'-ATGGCCCCACTGAAGATGCT-3', R: 5'-TGAACACCAACGGTGGAGGT-3') 및 MDC primer(F:5'-GCATGGCTCGCCTACAGACT-3', R: 5'-GCAGGGAGGGAGGCAGAGGA-3')가 각각 사용되었다.

그 결과, 조 추출물 (MeOH extract)의 염증성 인자(TARC, MDC)에 대한 억제 활성은 미약하였으나, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물은 TARC 및 MDC에 대하여 우수한 억제활성을 나타내었다(도 8 및 도 9 참조). 도 8은 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 TARC 발현저해를 나타낸 도면이고, 도 9는 hIFN-γ로 자극된 HaCaT 세포에 대한 당유자 잎 추출물의 MDC 발현저해를 나타낸 도면이다.

[실시예 2] 항염증용 약학 조성물의 제조

가. 산제의 제조

당유자 잎 추출물의 클로로포름 분획물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

나. 정제의 제조

당유자 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

다. 캅셀제의 제조

당유자 잎 추출물의 클로로포름 분획물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

라. 주사제의 제조

당유자 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

마. 액제의 제조

당유자 잎 추출물의 클로로포름 분획물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 첨가하였다. 다음으로 상기의 성분을 혼합하고, 정제수를 가한 후 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, RAW 264.7 세포를 LPS로 자극을 주고 당유자 잎 추출물을 처리하여 염증성 인자 억제 활성을 조사한 결과, CHCl₃ 분획물이 iNOS와 IL-6의 mRNA 발현을 억제하였다. 그리고 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포에 hIFN-γ로 자극을 주고, 당유자 잎 추출물을 처리한 결과 EtOAc 분획물이 TARC 와 MDC 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

이러한 결과는, 본 발명에 따른 당유자 잎이 NO생성 억제 및 iNOS, IL-6, MDC와 TARC의 발현억제 효과를 나타냄으로써 염증을 억제하거나 치료할 수 있는 가능성이 있고, 아토피 환자의 피부질환을 완화시키는 탁월한 효과를 가질 것으로 기대된다. 또한 당유자 잎의 염증 예방 및 치료를 위한 활성 성분의 분리와 작용기전 연구에 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.

또한 본 발명은 사용되지 않고 폐기되는 당유자 잎으로부터, 염증 억제 활성 을 확인함으로서, 경제적 부가가치를 창출할 수 있다.

<110> Cheju National University Industry Foundation <120> Extract of Citrus grandis Osbeck Leaves and Anti-inflammatory Pharmaceutical Composition Containing the Same <130> P07-B111 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS primer(F) <400> 1 cccttccgaa gtttctggca gcagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNos primer(R) <400> 2 ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 primer(F) <400> 3 cactacatcc tgacccactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 primer(R) <400> 4 atgctcctgc ttgagtatgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer(F) <400> 5 ttgacctcag cgctgagttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha primer(R) <400> 6 ttgacctcag cgctgagttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer(F) <400> 7 gtactccaga agaccagagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer(R) <400> 8 tgctggtgac aaccacggcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TARC primer(F) <400> 9 atggccccac tgaagatgct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TARC primer(R) <400> 10 tgaacaccaa cggtggaggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDC primer(F) <400> 11 gcatggctcg cctacagact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDC primer(R) <400> 12 gcagggaggg aggcagagga 20

Claims

염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물.
제1항에 있어서, 상기 당유자 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 당유자 잎 추출물.
제1항에 있어서, 상기 당유자 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 당유자 잎 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 분획시킨 분획물인 것을 특징으로 하는 당유자 잎 추출물.
다음의 단계를 포함하는 염증 억제 효과를 나타내는 당유자 잎 추출물의 제조방법:

(a) 당유자 잎을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 다음, 농축하는 단계; 및

(b) 상기 수득된 농축물을 물로 녹인 후, 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 첨가하여 분획하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 당유자 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항염증용 약학 조성물은 염증성 피부질환 및 아토피성 피부염 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 것인 항염증용 약학 조성물.