KR20110028433A

KR20110028433A - 엔케팔린 분해 엑토펩티다제의 강력한 억제제로서의 오피올핀 펩타이드 유도체

Info

Publication number: KR20110028433A
Application number: KR1020107024984A
Authority: KR
Inventors: 카트린느 루조
Original assignee: 엥스띠뛰 파스퇴르
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2011-03-18
Also published as: JP2011517940A; CA2720778C; JP2015110651A; ES2714374T3; LT2274321T; HUE042998T2; US20110124571A1; RU2010145158A; CA2720778A1; US20090253639A1; PL2274321T3; WO2009124948A1; EP2274321B1; CN102083851A; PT2274321T; IL208543A; BRPI0906905A2; RU2542365C2; US8642729B2; CY1121966T1

Abstract

본 발명은 메탈로-엑토펩티다제의 새로운 억제제로서 조정된 오피올핀 펩티다제에 관한 것이다.

Description

엔케팔린 분해 엑토펩티다제의 강력한 억제제로서의 오피올핀 펩타이드 유도체{OPIORPHIN PEPTIDE DERIVATIVES AS POTENT INHIBITORS OF ENKEPHALIN-DEGRADING ECTOPETIDASES}

본 발명은 메탈로-엑토펩티다제(metallo-ectopeptidase)의 새로운 억제제로서 오피올핀 펩타이드(opiorphin peptides)를 조정하는 것에 관한 것이다.

아연 금속 엑토펩티다제는 포유류에서 중요한 생리학적 기능의 통제와 관련된 중성이고 호르몬에 의한 중재자의 수용기-의존형(receptor-dependent) 작용을 조절한다. 상기 아연 금속 엑토펩티다제는 신경 및 침투성 조직(systemic tissue)에서 세포의 표면에 위치하고, 신경펩타이드(neuropeptide) 및 규제력을 지닌 펩타이드의 후분비성(postsecretory) 과정 또는 신진대사(metabolism)를 촉진한다(Roques, BP 외 (1993), Pharmacol Rev 45, 87~146 / Turner, AJ 외 (2001), BioEssay 23, 261~269).

이 중성 및/또는 호르몬에 의한 펩타이드 신호들 중 두드러진 것은 P물질(SP) 및 엔케팔린(enkephalin)이고, 이것은 스트레스적이거나 위협적인 환경자극제에 대한 행동에 관한 적응 반응의 수용기-의존형 조절임을 시사한다. 그것들은 특히 아픈 자극에 대한 정보 및 진통제 메커니즘의 척추의 처리과정, 감성적 및/또는 자극적인 반응, 불안, 공격성 및 신경면역성 염증의 증상을 통제한다(Deckenson, AH. (1995) Br J Anaesth 75, 193~200 ; Sora, I. 외 (1997) Prox Natl Acad Sci USA 94, 1544~1549; Koning, M. 외 (1996) nature 383, 535~538; Filliol, D. 외 (2000) Nat Genet 25, 195~200).

후속적인 중성 및 호르몬에 의한 신호의 상기 기능적인 효능을 조절하는데 있어서 아연 엑토펩티다제의 면역학적 중요성 및 결정적인 역할 때문에, 그것들의 작용 및 규제력을 지닌 일련의 단계적인 반응 전체의 결과를 조절하는데 초점을 맞추는 것이 필수적이다. 엑토펩티다제 작용의 상단부 조절인자(upstream regulator)의 발견은 또한 생리병리학(physiopathological) 및 새로운 후보 약품을 개발하기 위한 잠재력 때문에 치료법의 관점으로부터 활성화된다.

스피노르핀이라 명명된 뇌 특이성 헵타펩타이드가 분리되었고, 중성 엔도펩티다제(NEP; EC 3.4.24.11[EC]) 및 아미노펩티다제 N(AP-N; EC 3.4.11.2 [EC])와 같은 엔케팔린-분해에 대한 억제 작용에 근거한 소의 척추로부터 특성화 되었다(Nishimura, K. 외 (1993), Biochem Biophys Res Commun 194, 713~719; Yamamoto, Y. 외 (2002) Curr Protein Pept Sci 3, 587~599). 또한 발명자들은 쥐에서 환경 변화의 적응에 수반되는 중재자인 쥐의 시알로르핀을 특성화했다. 쥐의 시알로르핀은 발현이 안드로겐 통제에 의하여 활성화 되고, 분비는 수컷 쥐에서 환경적인 스트레스에 대한 아드레날린 작용-중재 반응하에서 활성화된 내분비의 펩타이드 신호이다. 그것은 멤브레인-고정 쥐 NEP작용의 생리학적 억제제이고, 쥐에게 통증 감각의 강한 억제제이다(Rougeot, C. 외(1994) Eur J biochem 219, 765~773; Rougeot, C. 외(1997) Am J Physiol 273, R1309~R1320; Rougeot, C. 외(1998) Biomedical Review eds. Chaldakov, GN & Mathison, R. (불가리아 바르나 Bularian-American Center) Vol 9, 17~32; Rosinski-Chupin, I. 외(2001) Endocrinology 142, 4550~4559; Rougeot, C. 외(2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 8549~8554).

예전부터 발명자들은 지금까지 인간에게서 처음으로 특징지어진 인간 오피올핀 천연 펩타이드(QRFSR-펩타이드)는 두 엔케팔린-비활성 엑토펩티다제, 중성 엔도펩티다제 NEP(EC 3.4.24.11) 및 아미노펩티다제 AP-N(EC 3.4.11.2)의 효율적인 이중 억제를 입증했다(Wisner 외, Pro Natl Acad Sci USA, 2006년 11월, 103(47) 17979~84).

오피올핀 펩타이드 유도체는 예전부터 설명되어왔고(예를 들어 Wisner 외, Pro Natl Acad Sci USA, 2006년 11월, 103(47) 17979~84), QRFSR로서 기본 펩타이드 배열을 갖는다.

그러므로 이 배열 및 다음 식에 의해 정의되는 배열은 더 알맞도록 수정될 것이다 : X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg, X1은 H 원자 또는 Tyr 아미노산을 나타내고, X2는 X1이 H일 때, Gln 또는 Glp를 나타내거나 X1이 Tyr 또는 Cys일 때, Gln을 나타낸다. QRFSR, YQRFSQ 및/또는 QRFSR을 갖는 CQRDSR이 바람직하다. Glp는 파이로글루타메이트(pyroglutamate)이고, Tyr 또는 Y는 티로신, Gln 또는 Q는 글루타민, Arg 또는 R은 아르기닌이고, Phe 또는 F는 페닐알라닌이고, Ser 또는 S는 세린이고, Cys 또는 C는 시테인이다. 이 펩타이드들은 국제특허출원 WO2008090386에 설명되어 있다.

본 발명은 새로운 오피올핀 유도체 및 고선택적 생화학 분석에 의한 시험관 기능 특성화를 제공한다.

본 발명의 일실시예에는 식 (1)인 펩타이드 유도체가 개시된다.

ζ-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-OH (1)

여기서 ζ는 수소 원자, 티로신, Y-[링커(linker)]- 또는 C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO---), 하이드록삼산(hydroxamic acid)(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린(hydroxyquinoline)과 같은 Zn 킬레이트 조성물기(chelating group)이고, AA₁은 Q 또는 Glp이고, AA₂는 K, R 또는 H이고, AA₃는 K, R, N, R 또는 F(X)이고, AA₄는 P, S 또는 S(OAlk)이고, AA₅는 K 또는 R이고, C-[링커]는 Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-를 의미하고 여기서 n은 1 내지 20의 정수이고, Y-[링커]-는 Tyr-[NH-(CH₂)_n'CO]-를 의미하고 여기서 n'은 1 내지 20의 정수이고, F(X)는 하나 이상의 할로겐 원소에 의해 치환된 페닐기인 페닐말라닌을 의미하고, S(OAlk)는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 측쇄 알킬기에 의해 치횐된 하이드록실기인 세린(serine)을 의미하고, 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 L-배열 또는 D-배열이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아민노산일 것이다.

여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR 또는 GlpRFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.

본 발명의 다른 일실시예에는 치료를 필요로 하는 실험 대상자의 질병 또는 기능 장애의 치료 방법이 개시된다. 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제의 상기 작용의 조정은 발견되고, 상기 방법은 질병 또는 기능 장애를 치료하도록 환자에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 하나 이상의 상기 펩타이드 유도체(들)을 주입하는 단계를 포함한다.

식 (1)의 펩타이드 유도체는 중성 엔도펩티다제 NEP 및/또는 아미노펩티다제 AP-N에 대한 유리한 억제 효능을 갖는다.

ζ-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-OH (1)

도 1 내지 4는 매개체 또는 50μM QRFSR-펩타이드 상사형의 존재하에 재조합형 hNEP 또는 hAP-N에 의하여 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 속도를 나타낸 그래프이다. 각 점은 실시간(분)의 함수로써 형성된 대사산물의 양에 비례하는 RFU(Relative Fluorescence Unit; 상대적 형광 단위)로 표현된 신호의 강도를 나타낸다.
도 5는 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 QRFSR-펩타이드 상사형에 의해 억제를 나타낸 그래프이다. 각 막대는 50μM QRFST-펩타이드 상사형의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 6은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 기질을 나타낸 그래프이다. 각 막대는 50μM QRFST-펩타이드 상사형의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 7 내지 8은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 QRFSR-펩타이드 상사형에 의해 억제를 나타낸 그래프이다. 각 막대는 50μM QRFST-펩타이드 상사형의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 9는 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 QRFSR-펩타이드에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 CRFSR-펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 10은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 QRFS[O-옥타노일]R 펩타이드에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 QRFS[O-옥타노일]R-펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 11은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 Y(PE12)QRFSR (즉, Y[[NH-(CH₂)₁₂CO]-QRFSR] 펩타이드에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 Y(PE12)QRFSR-펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 12 내지 17은 매개체의 존재 하 또는 CQRFSR 또는 CQRFS[O-옥타노일]R 오피올핀-펩타이드 1 내지 50μM의 존재 하에서 재조합 hNEP 또는 hAP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해 반응 속도를 나타낸 그래프이다. 각 점은 실시간(분)의 함수로써 형성된 대사산물의 양에 비례하는 RFU(Relative Fluorescence Unit; 상대적 형광 단위)로 표현된 신호의 강도를 나타낸다.
도 18은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 CQRFST 펩타이드에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 CRFSR-펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 19는 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 Y[PE12]QRFSR-COOH 펩타이드(즉, Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR)에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 Y[PE12]QRFSR-COOH 펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 20은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드(즉, C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR)에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 21은 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 C(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드(즉, C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR)에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 C(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 22는 순수 재조합 인간 hNEP 또는 AP-N에 의한 상응하는 FRET-펩타이드 기질의 가수분해의 C[PE6]QRF[S-O-옥타노일]R 펩타이드(즉, C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R)에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 C[PE6]QRF[S-O-옥타노일]R 펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.
도 23은 배양조직에서 LNCaP 상피 세포에 의해 발현되는 세포막 인간 NEP에 의한 P물질 생리학적 NEP-기질의 가수분해의 C[PE6]QRF[S-O-옥타노일]R 펩타이드(즉, C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R)에 의한 농도-의존형 억제를 나타낸 그래프이다. 각 점은 μM(로그 스케일)로 표시되는 C[PE6]QRF[S-O-옥타노일]R 펩타이드의 다양한 농도의 부재 또는 존재하에 측정된 억제제가 없을 때의 속도의 백분율-억제제가 있을 때의 속도/억제제가 없을 때의 속도로써 회복되고 계산된 손상되지 않은 기질의 비율을 나타낸다.

본 발명은 오피올핀 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔류물 각각 또는 조합은 하나 이상의 관능기로 조정되는 펩타이드들의 조정된 버전을 제공한다.

그러한 조정된 오피올핀 펩타이드의 한정되지 않은 예는

NH₂-QRFSR-CONH₂;

NH₂-QRGPR-COOH;

NH₂-QHNPR-COOH;

NH₂-QR(4BromoF)SR-COOH (즉 NH₂-QR-F[4Br]-SR-COOH, 여기서 -F[4Br]-은 -F[4Br]-이 다음 화학식

을 갖도록 브롬 원지에 의하여 파라(para-) 위치에 치환된 페닐 그룹인 페닐알라닌이다);

N-(아세틸)QRFSR-COOH;

N-(C8-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

N-(비오틴-C6)QRFSR-COOH;

NH₂-dRdSdFdRdQ-COOH(retroinversion D-이성질체);

NH₂-YQRFSR-COOH;

NH₂-Y(C6-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH₂-Y(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH₂-QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-CQRFSR-COOH;

NH₂-CQRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-CQRF[S-O-C12-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-C-(C8-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH₂-C-(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH₂-C-(C8-폴리에틸렌)QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-[Cβ2]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[β3R]-COOH;

NH₂-C[dQ]RF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH;

NH₂-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[dR]-COOH;

NH₂-[dC]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH;

NH₂-[Cβ2]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][β3R]-COOH;

이황화물 결합을 통한 시스틴-디펩타이드로서 [CQRFSR]2;

Glp-RFSR-COOH;

NH₂-QRYSR-COOH;

NH₂-QRF[4F]SR-COOH (즉 NH₂-QR-F[4F]-SR-COOH, 여기서 -F[4F]-는 -F[4F]-가 다음 화학식

을 갖도록 불소 원지에 의하여 파라(para-) 위치에 치환된 페닐 그룹인 페닐알라닌이다);

NH₂-QKFSR-COOH;

NH₂-QRFSR-COOH;

NH₂-C-(C6-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH₂-C-(C6-폴리에틸렌)QRFS[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-C-(C12-폴리에틸렌)QRFS[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH₂-C[PE12]QRFS-dR-COOH;

NH₂-C-(C12-폴리에틸렌)QRFS[S-O-C8-폴리에틸렌]-β3R-COOH;

NH₂-C-(C8폴리에틸렌)QRFS[S-O-C8-폴리에틸렌]-β3R-COOH (여기서 Cβ2는 시스테인(H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-CO-)의 α 카르보닐기에 가까운 Cα 탄소에 인접한 β2-시스테인 포함 메틸렌 잔류물에 의하여 천연 시스테인 잔류물로 대체되고, β3R은 아르기닌(-NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH)의 α 아민기에 가까운 Cα 탄소에 인접한 β3-아르기닌 포함 메틸렌 잔류물에 의하여 천연 아르기닌 잔류물로 대체된다);

[S-O-C8-폴리에틸렌] 및 [S-O-옥타노일]은 옥타노일기에 의해 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다;

[S-O-C12-폴리에틸렌]은 도데카노일기에 의해 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다;

C6, C8 또는 C12-폴리에틸렌은 6, 8 또는 12 에틸렌 탄소(각각 (-HN-(CH₂)₆-CO-, -HN-(CH₂)₈-CO- 및 -HN-(CH₂)₁₂-CO-)의 스페이서(spacer)에 해당한다.

상기 펩타이드에서, NH₂-는 상기 펩타이드의 말단 및 카르복실산 말단 COOH로 대체된다(말단기가 아미드일 때 -CO-NH₂).

상기 리스트는 또한 다음과 같이 읽혀질 수 있다.

QRFSR-NH₂;

QRGPR;

QHNPR;

(아세틸)QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

비오틴-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

dR-dS-dF-dR-dQ;

YQRFSR;

Y-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

Y-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

QRF-S(O-옥타노일)-R;

CQRFSR;

CQRF-S(O-옥타노일)-R;

CQRF-S(O-도데카노일)-R;

C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

C-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;

[Cβ2]QRF-S(O-옥타노일)-R;

C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[β3R];

C-[dQ]-RF-S(O-옥타노일)-[dR];

C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];

[dC]-QRF-S(O-옥타노일)-[dR];

[Cβ2]-QRF-S(O-옥타노일)-[β3R];

[CQRFSR]₂;

Glp-RFSR;

QRYSR;

QR-F[4F]-SR(여기서, -F[4F]-는 불소 원자가 파라 위치에 치환된 페닐기인 페닐알라닌이다);

QR-F[4Br]-SR(여기서, -F[4Br]-는 브롬 원자가 파라 위치에 치환된 페닐기인 페닐알라닌이다);

QKFSR;

QRFSK;

C-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

C-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;

C-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;

C-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFS-dR;

C-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-β3R;

C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-β3R

여기서, Cβ2는 H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-CO-이고, β2R은 -NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH이고, -S(-O-옥타노일)은 옥타노일기로 치환된 하이드록실기인 세린을 의미하고, -S(-O-도데카노일)은 도데카노일기로 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다. 다음 정의는 즉석출원(Instant Application)전체에서 사용된다.

“펩타이드”는 펩타이드 결합에 의하여 선형 배열에서 서로 다른 것들에 연결된 아미노산의 잔류물의 선형 배열을 포함하는 분자이다. 그러한 선형 배열은 선택적으로 시클릭(cyclic), 즉 상기 선형 펩타이드의 말단 또는 펩타이드가 연결된(예를 들어 화학결합) 아미노산의 측쇄일 것이다. 그러한 펩타이드는 다른 펩타이드 또는 다른 펩타이드가 아닌 분자를 갖는 분자간 회합뿐만 아니라 이차, 삼차 또는 사차 구조를 더 포함할 것이다. 그러한 분자간 회합은 제한 없이 공유 결합 통하여(예를 들어 이황화물 결합을 통하여), 또는 킬레이트화, 정전기적인 상호작용, 소수성 상호작용, 수소결합, 이온-쌍극자 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 또는 이것들의 조합을 통한 것일 것이다.

다음 펩타이들의 일부 아미노산은 L-배열 또는 D-배열에 있을 것이다. 특히 전체 펩타이드는 L 또는 D 배열 중 어느 하나일 것이다. 상기 탄화수소 사슬은 상기 아미노산이 β 아미노산, 더 바람직하게는 β2 또는 β3 아미노산일 수 있도록 천연 아미노산과 비교되는 추가의 메틸렌기를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어 R은 lR(즉 L-Arg), dR(즉 D-Arg), β3R 또는 β2R 아미노산 중 하나를 나타낼 것이다.

“F(X)”는 하나 이상의 할로겐 원자, 바람직하게는 불소원자로 치환된 페닐기인 페닐알라닌을 의미하고, 다음과 같은 화학식 중 하나를 갖는다.

“S(OAlk)”는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 선형 또는 측쇄 알킬기(즉 “Alk”), 바람직하게는 옥타노일 또는 도데카노일기로 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다. 본 발명에서, S(O-C8-폴리에틸렌) 또는 S(O-C8)은 옥타노일기로 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다.

“C-[링커]-“는 Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-를 의미하고, 여기서 n은 1 내지 20의 정수, 바람직하게는 4 내지 15, 6, 8, 또는 12이다. 본 발명에서 “C-(C6-폴리에틸렌)” 또는 “C[PE6]”는 Cys-[NH-(CH₂)₆-CO]-를 의미하고, “C-(C8-폴리에틸렌)” 또는 “C[PE8]”은 Cys-[NH-(CH₂)₈-CO]-를 의미하고, “C-(C12-폴리에틸렌)” 또는 “C[PE12]”은 Cys-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-를 의미한다.

“Y-[링커]-“는 Tyr-[NH-(CH₂)_n-CO]-를 의미하고, 여기서 n은 1 내지 20의 정수, 바람직하게는 4 내지 15, 6, 8, 또는 12이다. 본 발명에서 “Y-(C6-폴리에틸렌)” 또는 “Y[PE6]”는 Tyr-[NH-(CH₂)₆-CO]-를 의미하고, “Y-(C8-폴리에틸렌)” 또는 “Y[PE8]”은 Tyr-[NH-(CH₂)₈-CO]-를 의미하고, “Y-(C12-폴리에틸렌)” 또는 “Y[PE12]”은 Tyr-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-를 의미한다.

특정한 펩타이드에 대한 본 발명 펩타이드 유도체의 “억제 효능”은 종래 기술 중 한 방법, 예를 들어 Ki 값 또는 IC₅₀ 값 중 어느 하나를 측정하여 손쉽게 평가될 수 있다. 특히 IC₅₀ _-값이 정해진 두 조정된 오피올핀 펩타이드의 상대적인 억제 효능은 주어진 실험조건(같은 완충제, 펩티다제 및 기질의 같은 농도)에서 주어진 펩티다제에 대하여 각 조정된 오피올핀 펩타이드의 상기 IC₅₀ 값을 측정하고 같은 실험 조건에서 오피올핀의 상기 IC₅₀ 값으로 조정된 오피올핀 펩타이드의 상기 IC₅₀ 값과 비교하여 비교될 수 있다.

본 발명은 식 (1)인 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

ζ-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-OH (1)

여기서, ζ는 수소 원자, 티로신, Y-[링커(linker)]- 또는 C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO---), 하이드록삼산(hydroxamic acid)(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린(hydroxyquinoline)과 같은 Zn 킬레이트 조성물기(chelating group)이고, AA₁은 Q 또는 Glp이고, AA₂는 K, R 또는 H이고, AA₃는 K, R, N, R 또는 F(X)이고, AA₄는 P, S 또는 S(OAlk)이고, AA₅는 K 또는 R이고, C-[링커]는 Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-를 의미하고 여기서 n은 1 내지 20의 정수이고, Y-[링커]-는 Tyr-[NH-(CH₂)_n'CO]-를 의미하고 여기서 n은 1 내지 20의 정수이고, F(X)는 하나 이상의 할로겐 원소에 의해 치환된 페닐기인 페닐말라닌을 의미하고, S(OAlk)는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 측쇄 알킬기에 의해 치횐된 하이드록실기인 세린(serine)을 의미하고, 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 L-배열 또는 D-배열이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.

일반적으로 본 발명에 따른 상기 펩타이드 유도체에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중의 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아민노산이다.

일실시예에서, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 적어도 하나는 β아미노산이다. 다른 일실시예에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 모두는 β 아미노산이다.

일실시예에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 적어도 하나는 아자-아미노산이다. 다른 일실시예에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 모두는 아자-아미노산이다.

일실시예에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 적어도 하나는 β-아자-아미노산이다. 다른 일실시예에서 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 모두는 β-아자-아미노산이다.

일실시예에서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인을 포함하고, 두 개의 시스테인의 두 개의 황 원자가 이황화물 결합으로 묶인 이량체이다. 예를 들어, [CQRFSR]₂는 이황화물 결합으로 연결된 상기 시스테인 아미노산인 상기 펩타이드 유도체 CQRFSR의 이량체이다.

바람직한 일 실시예에서 ζ가 하이드록시퀴놀린일 때, 상기 펩타이드 유도체는 다음과 같은 화학식을 갖는다.

식 (1)의 바람직한 펩타이드 유도체는 다음과 같다.

CQRFSR,

QRF(X)SR,

QRGPR,

QHNPR,

QRFPR

QRFS(OAlk)R, 바람직하게는 QRFS(O-옥타노닐)R,

C-[링커]-QRFSR, 바람직하게는 C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFSR, C-[NH-(CH₂)₈-CO]-QRFSR 또는 C-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR,

QRYSR,

QKFSR,

QRFSK,

C-[링커]-QRFST, 바람직하게는 C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFSR, C-[NH-(CH₂)₈-CO]-QRFSR 또는 C-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR,

[CQRFSR]₂,

C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFS(OAlk)R, 바람직하게는 C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFS(O-옥타노닐)R 및

Y-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR.

일실시예에서 본 발명은 식 (2)인 상기 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

ζ^a-Q-AA^a ₂-AA^a ₃-P-R-OH (2)

여기서, ζ^a는 수소 원자 또는 시스테인, C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 하이드록삼산(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린과 같은 Zn 킬레이트 조성물기이고, AA² ₂는 R 또는 H이고, AA^a ₃는 G, N, F 또는 F(X)이고, C-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 Q, AA₂, AA₃, P 및 R은 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, Q, AA₂, AA₃,P 및 R 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.

여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QHNPR 또는 QRGPR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.

식 (2)의 상기 펩타이드 유도체는 조정된 오피올핀 펩타이드이고, 인간 AP-N 억제제인 것이 이롭다. 특히 NEP 엔도펩티다제 및/또는 카르복시디펩티다제 작용(들)에 대한 억제 효능보다 더 높은(바람직하게는 적어도 6층(fold), 8층 또는 10층) AP-N에 대한 억제 효능을 가질 것이다.

식 (2)의 바람직한 팹타이드는 다음과 같다.

QRGPR,

QHNPR 및

QRFPR.

일실시예에서 본 발명은 식 (3)인 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

ζⁿ-AA₁-AAⁿ ₂-AAⁿ ₃-AAⁿ ₄-AAⁿ ₅-OH (3)

여기서 ζⁿ는 수소 원자, 티로신 또는 Y-[링커]-이고, AA₁은 Q, 또는 Glp이고, AAⁿ ₂는 K또는 R이고, AAⁿ ₃는Y, Y, F 또는 F(X)이고, AAⁿ ₄는 S 또는 S(OAlk)이고, AAⁿ ₅는 K 또는 R이고, Y-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 어느 하나는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR, QHNPR, YQRFSR 또는 GlpPFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체인 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.

식 (4)의 상기 펩타이드 유도체는 조정된 오피올핀 펩타이드이고, 인간 NEP 억제제인 것이 이롭다. 특히 AP-N에 대한 억제 효능보다 바람직하게는 적어도 6층, 8층 또는 10층 높은 NEP 엔도펩티다제 및/또는 카르복시디펩티다제 작용(들)에 대한 억제 효능을 가질 것이다.

일실시예에서, 본 발명은 식 (3a)인 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

AA₁-R-AAⁿ ₃-S(OAlk)-AAⁿ ₅-OH (3a)

여기서 상기 펩타이드가 QRFSR, QHNPR, YQRFSR 또는 GlpRFSR가 아니라는 조건을 갖는 AA₁은 Q, 또는 Glp이고, AAⁿ ₃는 F 또는 F(X)이고, AAⁿ ₅는 K 또는 R이다.

식 (3) 또는 (3a)의 바랍직한 펩타이드 유도체는 다음과 같다.

QRYSR,

QRF(X)SR,

QKFSR,

QRFSK,

QRFS(OAlk)R, 바람직하게는 QRFS(O-옥타노일)R 및

Y-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR.

일실시예에서, 본 발명은 식 (4)인 상기 펩타이드 유도체에 관한 것이다.

ζ^m-Q-R-AA^m ₃-AA^m ₄-R-OH (4)

여기서, ζ^m는 수소 원자 또는 시스테인, C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 하이드록삼산(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린과 같은 Zn 킬레이트 조성물기이고, AAⁿ ₃는 F 또는 F(X)이고, AA^m ₄는 S 또는 S(OAlk)이고, C-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 Q, AA₂, AA₃, P 및 R은 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, Q, AA₂, AA₃, P 및 R 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.

여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR 또는 YQRFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.

식 (4)의 펩타이드 유도체는 인간 NEP 및 인간 AP-N 모두에 대한 의미 있는 억제 효능을 나타내기 때문에 유리하게 이중 인간 NEP 및 인간 AP-N 억제제인 조정된 오피올핀 펩타이드이다.

식 (4)의 바람직한 펩타이드 유도체는 다음과 같다.

CQRFSR,

[CQRFSR]₂,

C-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR,

C-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR,

C-[링커]-QRF-S(O-옥타노일)-R, 바람직하게는 C-(HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R, C-(HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R 또는 C-(HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R,

QRF(X)SR 및

QRFS(OAlk)R, 바람직하게는 QRFS(O-옥타노일)R.

바람직하게 본 발명의 상기 펩타이드 유도체는 조정된 오피올핀 펩타이드이고, 중성 엔도펩티다제 NEP 및/또는 아미노펩티다제 AP-N에 대한 억제 효능을 갖는다. 더 바람직하게는 본 발명의 상기 조정된 오피올핀 펩타이드는 엔도펩티다제 NEP 및 아미노펩티다제 AP-N에 대한 억제 효능을 갖는다.

본 발명에 따른 상기 펩타이드 유도체는 incorpoorated하기 위하여 다른 아미노산 잔류물의 연속적인 결합에 의하여 액상 또는 고상으로 펩타이드 합성에 의하여 기존 방법으로 제조될 것이고(액상으로는 N-말단에서 C-말단으로, 또는 고상으로는 C-말단에서 N-말단으로), 여기서 상기 N-말단 및 반응성 측쇄는 기존 군에 의해 미리 차단된다.

고상 합성에 대하여 Merrifield가 설명한 기술은 부분적으로 사용될 것이다. 그렇지 않으면 Houbenwetl이 1974년에 설명한 기술 또한 사용될 것이다.

그것들이 천연 아미노산으로 구성된다면, 본 발명에 따른 상기 펩타이드 유도체는 또한 유전 공학 방법을 사용하여 얻을 것이다. 오피올핀 펩타이드에 대한 조정은 메틸, 폴리에틸렌 C₂, C₄, C₆, C₈, C₁₀, C₁₂ 및 그것들의 폴리에틸렌글리콜 및/또는 글리코실화한 형태 및 구조 및/또는 기능에서 펩타이드를 모방하는 예를 들어 저분자량 조성물 같은 펩타이드 유사체(peptidomimetics)와 같은 예를 들어 추가적인 화학 소량체(chemical moiety)와 같은 화학물질을 포함한다(Abell, Advanced in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press(1997); Gante, Peptodmimetica-massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Che. 106: 1780~1802 (1994); Olson 외 J. Med. Chem. 36:3039~3049 (1993) 참조).

본 발명의 상기 펩타이드 유도체에 적용된 다른 조정은 L 아미노산, 형태적인 통제, 등비 교체 또는 다른 조정 대신에 천연이 아닌 아미노산, D 아미노산, β₂ 아미노산, β₃ 아미노산, 아자 아미노산 또는 β-아자 아미노산을 이용하는 것을 포함한다. 다른 예들은 하나 이상의 아미노 결함은 아미노가 아닌 결합으로 교체되고/교체되거나 하나 이상의 아미노산 측쇄는 다른 화학 소량체로 교체되거나, 하나 이상의 N-말단, C-말단 또는 하나 이상의 측쇄는 보호기(protecting group)에 의하여 보호되고/보호되거나 이중결합 및/또는 고리화 및/또는 입체특이성(stereospecificity)은 강도(rigidity) 및/또는 결합 친화도(bonding affinity)를 증가시키기 위하여 상기 아미노산 사슬에 도입된다.

본 발명의 상기 펩타이드 유도체에 의해 영향을 받는 상기 메달로-엑토펩티다제의 결합 도메인(binding domain)의 결정구조에 근거하여, 유사제(mimetics)는 또한 컴퓨터-보조 약물 설계 개발에 의하여 얻을 수 있다(Oefner 외 J. Mol. Biol (2000), 296(2), 341~349; Gomeni 외 Eur. J. Pharm. Sci. (2001), 13(3), 261~270; Kan Curr. Top Med. Chem. (2002), 2(3), 247~269)

또한 다른 조정은 다음과 같은 사항을 포함한다.

- 친유성 알코올로 에스테르화(COOH) 또는 아미드화(COOH) 및/또는 아세틸화(NH₂) 또는 상기 NH₂ 말단에서 추가적인 카르복시알킬 또는 방향족 소수성 사슬에 의하여 상기 NH₂ 및 COOH 소수성 군을 보호하는 것

- 아미드기의 CO-NH 아미드 결합 또는 메틸화(또는 케토메틸렌, 메틸렌옥시, 하이드록시에틸렌)의 retroinversion 이성질체

- 두 아미노산 사이에 있는 -[HN-(CH₂)_n-CO-]- 부분의 첨가, n은 1 내지 20 사이의 정수이고 바람직하게는 6, 8 또는 12

유전자 코드의 변성을 고려함에도 불구하고, 핵산, 또한 c천연 아미노산이 포함된 펩타이드 유도체를 포함하는 상기 펩타이드를 부호화한 DNA 또는 RNA 분자와 같은 폴리뉴클레오디드는 또한 본 발명의 일부분이다. 바람직하게는 상기 핵산은 천연 아미노산으로 구성된 배열 암호화 펩타이드 유도체를 포함한다.

본 발명의 상기 핵산은 2xSSC의 68℃에서, 50% 포름아미드 4xSSC의 42℃에서 교잡 및/또는 세척 조건에 관한 고강도 교잡조건 하에서, 또는 이 두 가지 조건 중 어느 하나의 조건 하에서 관찰되는 것들과 동일한 교잡화의 수준을 제공하는 조건 하에서 상기 서열 또는 그것들의 상호 보완적인 서열 중의 어느 것에 교잡할 수 있는 서열을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 클로닝(cloning) 및/또는 발현에 대한 매개자(vector) 및 상기 핵산 또는 상기 매개자를 포함하는 적어도 하나의 이 매개자들이 복제된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 발현 매개자는 펩타이드 유도체를 포함하는 펩타이드를 부호화하는 핵산 서열 또는 그것을 발현하도록 하는 요소에 작동 가능하게 연결된 상기 핵산 서열인 본 발명의 단백질을 포함한다. 상기 매개자는 유전자 정보 번역의 규칙에 대한 적절한 범위뿐만 아니라 유전자 정보 번역의 개시 및 종료에 대한 신호, 촉진제 서열을 이롭게 포함한다. 숙주 세포에 매개자를 삽입하는 것은 일시적이거나 안정적이다. 상기 매개자는 또한 상기 번역된 단백질의 분비물에 대한 특정한 신호를 포함할 것이다.

숙주 세포들은 상업적으로 이용 가능한 세포계(cell line)를 포함하는 박테리아, 효모, 식물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포에 한정되지 않는 것을 포함하는 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic)세포일 것이다. 숙주 세포에 대한 바람직한 예는 COS-1, HEK 세포, 293 세포 또는 CHO 세포이다.

본 발명은 항체, 단일 클론 또는 다(多)클론, 또는 여기서 설명된 조정된 오피올핀 펩타이드를 명확하게 겨냥한(즉, 명확하게 인정된) 단편을 더 제공한다. 그러한 항체는 예를 들어 본 발명의 상기 펩타이드 유도체의 약물 동역학적 특성을 연구하는데 유용할 것이다.

다양한 문법적 형식에서의 상기 용어 “항체”는 여기서 면역 글로불린 항체 분자 및 면역 글로불린 항체 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항체 결합 부위 또는 항원과 결합한 항체의 표면을 포함하는 분자를 나타내기 위하여 사용된다. 모범적인 항체 분자들은 온전한 면역 글로불린 항체 분자, 대체로 면역 글로불린 항체 분자 및 종래 기술에서 Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v)로 알려진 면역 글로불린 항체 분자의 일부분이다.

상승한 다클론 항체에 대한 절차는 또한 잘 알려져 있다. 일반적으로 그러한 항체들은 항체 생성 이전의 혈청을 얻기 위해 처음으로 피가 뽑힌 뉴질랜드 흰 토끼에 공액 펩타이드 유도체를 포함하는 본 발명의 상기 펩타이드 유도체를 피하주입에 의하여 높여질 수 있다. 항원은 서로 다른 10개의 위치 또는 적어도 서로 다른 5개의 위치에 위치당 총 부피 50μl로 주입될 수 있다. 상기 토끼들은 첫 주사 후에 5주간 피를 뽑히고, 6주마다 세 번씩 면역 반응의 특성에 따라 최대로 최초의 주사보다 다섯 배 더 낮은 농도로 피하 주사된 같은 항원으로 주기적으로 증가된다. 그리고 나서 혈청의 시료는 각 증가 후에 10일 마다 수집된다. 다클론 항체는 항체를 포획하기 위하여 상응하는 항원을 이용하여 친화 크로마토그래피에 의하여 상기 혈정으로부터 재회수된다. 이것도 상승된 다클론 항체는 편집자 E. Harlow 외, “Antibody : A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)에서 설명되어 있다.

다양한 문법적 형식에서 “단일 클론 항체”는 특정한 항원결정기(epitope)로 면역반응을 할 수 있는 항체결합점의 한 종만 포함하는 항체 분자의 개체수에 관한 것이다. 그러므로 단일 클론 항체는 일반적으로 면역 반응을 하는 항원결정기에 대하여 단일 결합 친화를 나타낸다. 단일 클론 항체는 다른 항원결정기에 대한 각 면역 특이, 다수의 항체결합점을 갖는 항체 분자, 예를 들어 이중 특이성 단일 클론 항체를 포함할 것이다. 단일 클론 항체를 제조하는 실험적인 방법은 종래 기술에 잘 알려져 있다(예를 들어 앞에서 언급한 Harlow 외). 단일 클론 항체들은(Mabs) 결합된 펩타이드 유도체를 포함하여 본 발명의 펩타이드 유도체에 대하여 포유 동물, 예를 들어 쥐(mouse and rat), 토끼, 염소, 인간 등을 면역력을 갖게 하는 것에 의해 제조된다. 면역력을 갖게 된 포유 동물에서의 상기 항체 생성 세포는 잡종세포(융합세포; hybridoma)를 제조하기 위하여 골수종 또는 이종골수종(heteromyeloma)으로 격리되고 융합된다. 상기 단일 클론 항체를 만드는 상기 융합세포는 요구되는 단일 클론 항체의 공급원으로서 사용된다.

단일 클론 항체는 융합세포 배지에서 제조되지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 또한 고려되는 것은 융합세포로부터 복제된 발현 핵산에 의하여 제조된 단일 클론 항체의 용도이다. 즉, 융합세포에 의해 분비된 상기 분자를 발현하는 상기 핵산은 형질전환주(transformant)를 제조하기 위한 다른 세포계로 전이될 수 있다. 상기 형질전환주는 원래의 융합세포와 유전자형이 뚜렷이 다르지만, 또한 융합세포에 의해 분비된 것에 상응하는 전체 항체 분자의 면역적으로 유효한 조각을 포함하는 본 발명의 항체 분자를 제조하는 것이 가능하다. 또한 문헌은 기본 면역 반응 항체 조각에서 또한 상기 문헌은 키메라 항체(chimeric antibody), 교화된 항체, 단일 사슬 항체 등을 형성하는 방법 제공한다. 이 모든 것은 당업자가 구성한 정밀한 이형 구조에 구애받지 않으며 분류 및 항체의 특성인 범위에 있어서는 본 발명의 범위에서 고려되고, 기재되고 청구된다.

상기 조정된 오피올핀 펩타이드는 약학적으로 용인되는 매개체와 관련한 약의 조성물로 만들어질 수 있다. 예를 들어 상기 약의 조성물은 국부, 구강, 설하선, 비경구, 비내강, 정맥, 근육내, 피하, 경피성 또는 안구 주입 등에 적절하다.

위에서 설명한 상기 조정된 오피올핀 펩타이드는 질병 또는 장애의 치료에 유용하고, 여기서 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제(membrane metallo-ectopeptidase), 특히 NEP 및 AP-N과 같은 멤브레인 아연-메탈로펩티다제 의 작용의 조절은 탐구된다.

천연 NEP 기질은 주로 상기 펩타이드 호르몬 : 중앙부 및 말초부 통증 자각, 염증 현상, 무기질 교환 및/또는 동맥 신호에서 중요한 역할을 수행하는 엔케팔린(enkephalin), P물질(substance P), 브래디키닌(bradykinin), 엔지오텐신 II(angiotensin II) 및 심방 나트륨이뇨성 펩타이드(atrial natriuretic peptide)이다(Roques 외, Phamacol Rev. 1993, 45(1), 87~146).

특히 중성 엔도펩티다제 NEP 24-11은 포유동물의 신경 및 말초 조직 모두에서 분포되고, 말초에서 중성 엔도펩티다제는 특히 신장 및 태반에 풍부하다. 이 조직들에서 상기 세포 표면 메탈로펩티다제 NEP는 후분비 과정 및 신경 펩타이드, 침투성 면역 글로불린 펩타이드 및 펩타이드-호르몬의 신진대사에 관여한다. 순환 또는 분비되는 규제 펩타이드의 활성 수준을 조절하는 것에 의하여 NEP는 그것들의 생리학적 수용기-중재 작용을 조절한다. 이런 이유로 상기 멤브레인-고정 NEP는 P물질, 브래디키닌(BK), 심방 나트륨이뇨성 펩타이드(ANP) 및 엔지오텐신 II(A II)와 같은 강력한 혈관 작용 펩타이드, P물질, BK 및 fMet-Leu-Phe(fMLP)와 같은 강력한 염증성/면역글로불린성 펩타이드, Mat 및 Leu-엔케팔린(Enk)과 같은 강력한 오피오이드(opioid) 신경 펩타이드 및 ANP, C-형 나트륨 배설증가 펩타이드(CNP) 및 B-형 나트륨 배설증가 펩타이드(BNP)와 같은 강력한 무기질 교환 및 유체 항상성 조절 펩타이드의 작용의 조절에 포함된다. 그러나 이 펩타이드들의 수준은 강직성으로 방출되거나 그것들의 방출은 자극제에 의하여 촉발되는 영역에서만 NEP-유도 형성/저하를 통하여 바뀐다.

통합하는 관점으로부터, 상기 NEP 생물학적 작용은 통층 과정의 조절에서뿐만 아니라 동맥 긴장 조절, 염증성 증상, 감정상태 및 수용 무기질 항상성에도 포함되는 펩타이드성의 활성 수준을 조절하기 위한 것이다. 예를 들어 NEP 및 APN을 억제하는 것에 의하여 중심부 또는 국부 내생의 오피오이드 작용의 수준 및 지속성을 증가시키는 것, 진통제 효과 및 항억제제 또는 정신자극제 효과가 얻어질 수 있다. NEP 및/또는 AP-N 억제제의 사용에 의하여 내생의 규제 펩타이드의 농도 조절의 상기 주요 이점은 상기 약물 효과들은 중성 리간드에 의해 활성화된 수용점에서만 유도되고, 특정한 환경, 행위 및 생리병리학적 스트레스 상황에서 발생하는 그것들의 강직성 또는 자극제-각성 방출에 임계적으로 좌우되는 것이다(Roques 외, 1993).

NEP에 피하여 포유 동물의 멤브레인 메탈로펩티다제의 예는 NEP2, ECE(엔도텔린-전환 효소), 특히 X-연결 저인산염혈증 구루병(hypophosphatemic rikets) 및 AP-N(아미노펩타이드 N)와 관련된 적혈구 세포표면 항원 KELL 및 PEX 유전자의 생산의 ECE1 및 ECE2이다.

NEP2는 특히 신경계 및 생식기 조직에 분포한다.

AP-N은 매우 다양한 인간 내장 기관, 조직 및 세포 종류(내피, 상피, 섬유아세포, 백혈구)에 존재하는 아주 흔한 효소이고, 특히 신장 및 중추신경계에 풍부하다. 확인된 기질은 앤지오텐신 II(angiotensin II), 엔케팔린 및 엔도르핀을 포함하는 신경 펩타이드, 및 칼리단(kallidan) 및 소마토스타틴(somatostatin)을 포함하는 호르몬을 포함한다. AP-N은 종양형성, 면역계, 통증, 동맥 혈압의 조절 등에 관련된 다기능성 효소이다. AP-N은 또한 항원의 절삭 및 항원 표시의 과정에 관련된다. 이 기능들은 많은 종류의 질병에 대한 치료 옵션을 제공하는 생물활성 펩타이드 반응의 조절(통증 조절, 바소프레신(vasopressin) 방출), 영향 면역 및 주요 생물학적 사건(세포 급증, 분비, 침습, 혈관형성)을 용이하게 한다.

ECE의 억제는 고혈압의 치료 및 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)의 예방 및 치료에 중요하게 적용된다.

NEP와 함께 AP-N의 억제는 통증 및 우울증, 불안감, 진정(sedation) 및 사회학적 성별 감정 장애의 치료에 중요하게 적용된다.

관련된 멤브레인 메탈로펩티다제의 억제는 종양, 즉 난소암, 직장암, 뇌종양, 폐암, 췌장암, 위암 및 흑색종의 치료상의 효과 및 전이, 아테롬성 동맥 경화증 및/또는 고혈압의 발생을 줄이는 효과를 갖는다.

관련된 멤브레인 메탈로펩티다제의 억제는 통증 완화의 효과를 갖는다. 격심한 통증에 대한 그러한 항통증(antinociceptive) 효과는 진정효과 뿐만 아니라 관절염 또는 염증성 장질환과 같은 만성 염증성 통증, 암 및/또는 암치료와 관련되거나 관련되지 않은 수술 후 외상 및 신경성의 극심한 통증에도 효과가 있다.

또한 박테리아성 또는 바이러스성 메탈로펩티다제의 억제는 항감염 효과를 갖는 것으로 기대된다. 메탈로펩티다제는 병원균 숙주 조직 전이 및 면역성 및 염증성 처리, 예를 들면 화농성연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 레지오넬라병(legionella pneumophila)의 처리에서 중요한 역할을 한다. 또한 박테리아성 메탈로펩티다제, 특히 아연-메탈로펩티다제는 탄저균(B. anthracis)(탄저병의 치명적인 요소)의 독소 및 파상풍균(C. tetanum) 및 보툴리누스균의 신경독소와 같은 단백질 가수분해 독소에 의해 기인하는 질병에서 중요한 역할을 수행한다.

다른 메탈로펩티다제는 HIV(FR 2 707 169)에 의한 감염과 같은 다양한 감염에서 중요한 역할을 한다.

박테리아성 또는 바이러스성 질병의 치료에서 단백질 가수 분해 효소(proteinase) 억제의 중요성은 H. Potempa 및 J. Travis에 의해 발견될 것이다.

메탈로펩티다제의 다른 역할은 Turner 외, 2001; Kenny 외, 1997; Beaumont 외, 1996에 기재되어 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 말초, 척추 및/또는 척수상부(supraspinal) 수준에서 NEP 및 AP-N을 억제하는 것 및 엔케팔린을 포함하는 중심부 또는 말초 내생의 오피오이드의 작용의 수준 및 지속성을 증가시키는 것에 의하여 작용하는 상기 조정된 오피올핀 펩타이드로 진정 또는 항억제(anti-depressant) 치료를 제공하는 것이다.

통증, 특히 격심하고 만성적인 통증, 내장 염증 및 신경성 통증이 고려된다.

수분-무기질 불균형의 치료는 또한 본 발명의 목적이다. 목표가 되는 장애들 중 하나는 수분-무기질 불균형에 의한 뼈, 치아, 신장, 부갑상선, 췌장, 장, 위 점막, 전립선 및 타액선 기능 장애를 예로 들 것이다.

특히, 상기 기능 장애는 부갑상선 기능 항진증 또는 부갑상선 기능 부전증, 골다공증, 췌장염, 하악선 결석증, 신장결석증 및 골이영양증으로부터 선택될 것이다.

손상된 대인관계 및 행동 장애의 치료는 더 흥미롭다. 다양한 정신 기능 장애는 WO 02/051434에 기재되어 있다.

특히 본 발명은 회피 장애, 감소된 의식 장애, 자폐증, 주의력결핍 과잉행동장애, 각성 장애, 병원병, 외부와의 관계 및 대인관계 기능 장애, 정신분열적 성격 장애, 정신분열증, 우울 장애, 환경에 대한 흥미 감소, 성생활과 관련된 사회적 활동 장애 및 시기 부적절한 사정(射精), 활동 과잉 성행위 및 발기부전을 포함한 성행위 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 기능 장애에 적용된다.

본 발명은 또한 정신 자극제로서 본 발명에 따른 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유도체의 용도에 관한 것이다. 기민증, 과면증, 강박 장애, 우울 장애 또는 주요 우울 장애, 주요 우울 장애 단일 삽화 또는 반복되는 주요 우울 장애 중 어느 하나와 같은 감정장애, I 형 또는 II 형의 조울증, 기분 부전 장애 및 순환기질성 장애의 예방 또는 치료에 관한 것이다.

멤브레인 메탈로펩티다제의 조절이 발견된 질병은 또한 고혈압, 뇌경색, 종양, 염증성 관절염 및 장 질환을 포함한다.

감염의 치료 또한 포함된다. 특히 박테리아성 또는 바이러스성 질병의 치료에 대한 단백질 가수 분해 효소의 억제의 중요성은 J. Potempa 및 Travis에서 발견될 것이다.

위에서 설명된 조정된 오피올핀 펩타이드는 또한 면역성-염증 반응을 조절하는데 유용하다.

위에서 설명된 조정된 오피올핀 펩타이드는 또한 나트륨 배설 증가제 또는 이뇨제로서 유용할 것이다.

따라서 본 발명은 통증, 우울 장애, 성행위와 관련된 사회적 행동 장애 및 성행위 장애로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 기능 장애의 치료에 대한 용도에 대하여 위에서 설명한 것과 같이 펩타이드 유도체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 약물의 오남용, 특히 모르핀 약물의 오남용의 치료에서 대체물로서 위에서 설명한 펩타이드 유도체 또는 핵산의 용도이다.

연구는 약물 오남용과 보상 및 약물 의존의 발달에 대한 취약성은 적어도 부분적으로는 이미 존재하고 있거나 유도된 조정 및/ 또는 내생의 오피오드 시스템의 결함의 결과라고 제안해 왔다. 이 점에서, 내생의 엔케팔린의 효과를 증가하기 위하여 조정된 오피올핀 펩타이드 또는 핵산을 사용하는 것은 만성적인 모르핀 또는 헤로인 투여의 중단에 의해 발생되는 다양한 부작용(금단의 신체적 반응)을 줄일 것이다.

본 발명의 상기 펩타이드 유도체로 치료될 것인 바람직한 질병 및 기능 장애는 통증, 우울 장애, 성행위와 관련된 사회적 행동 장애 및 성행위 장애를 포함한다.

본 발명은 내생의 BPLP 단백질 또는 성숙 산물 즉, 천연 오피올핀 QRFSR과 상기 멤브레인 메탈로펩티다제의 작용의 조절이 발견된 질병을 예방 및 치료하기 위한 치료법의 조성물의 제조에 대하여 멤브레인 메탈로펩티다제와의 상호 작용을 조절하는 물질의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 상기 BPLP 단백질 및 상기 QRFSR 펩타이드에 대하여 상기 NEP 및/또는 AP-N 결합점에 결합시키기 위하여 그것들의 능력에 대한 감별 조성물에 대한 시험관 방법을 제공한다. 이 과정의 자세한 내용은 본 발명에 참조로서 포함된 미국 출원 번호 10/593,071(2006년 9월 15일 출원), 국제 특허 PCT/EP2009/050567 및 국제 등록 특허 WO 2005/090386에 설명되어 있다.

본 발명의 다른 목적은 이것은 예를 들어 참조로서 본 발명에 참조로서 포함된 미국 출원 번호 10/593,071(2006년 9월 15일에 출원)에 설명되어 있는 것과 같이 BPLP 단백질 또는 숙성 산물(maturation products) (또는 상기 BPLP 단백질 또는 그것의 숙성된 산물의 결합 특수성 또는 상기 생리적 작용을 유지하는 상기 펩타이드)에 대한 상기 NEP 및/또는 AP-N 결합점에 결합하는 상기 조정된 오피올핀 펩타이드의 상대적 친화도를 결정하기 위한 처리 과정이다.

[실시예]

실시예 1 : 생화학 분석에 관한 방법

공식적인 속도론적 분석은 특정 기질 가수분해의 실시간 형광 관찰을 이용하여 각 분속에 대하여 수행되었다. 각 96개 웰(well)의 적합한 형광 분석 모델에 대하여 인간 NEP 및 인간 AP-N 효소 작용의 분석을 가능하게 하는 모든 파라미터들은 초기 속도 측정의 조건 하에 정의되었다.

1. 인간 엑토펩티다제의 근원, hNEP 및 hAP-N

R&D System에서 구입한 (각각의 N-말단 시토졸 및 막을통해 생기는 부분이 전혀 없는)재조합 인간 NEP 및 재조합 인간 AP-N은 펩티다제의 순수 근원으로서 사용되었다.

2. 기질 및 합성 억제제

시험관에서, 아미노-, 카르복시디- 및 엔도-펩티다아제 작용은 다음 합성된 선택적인 기질의 분해를 측정하는 것에 의하여 분석되었다.

- NEP-카르복시디펩티다제 작용에 대하여 내부적으로 냉각된 형광 기질 특성인 Abz-dR-G-L-EDDnp FRET-펩타이드는 Thermo-Fisher Scientific(독일)에 의해 합성되었다.

- NEP-카르복시디펩티다제 작용에 대하여 내부적으로 냉각된 형광 기질 특성인 Abz-R-G-F-K-DnpOH FRET-펩타이드는 Thermo-Fisher Scientific(독일)에 의해 합성되었다.

- NEP 및 ECE 작용을 측정하기 위해 선택된 기질인 브래디키닌과 구조적으로 관련된 분자 내적으로 냉각된 형광 발생(fluorogenic) 펩타이드인 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-펩타이드(Mca-BK2)는 R&D System에서 구입되었다.

FRET는 공여체 형광단(Abz=ortho-아미노벤조일 또는 Mca=7-메톡시쿠머린-4-y1-아세틸)에서 수용체 형광단(DnpOH=2,4-디니트로페닐 또는 EDDnp=2,4-디니트로페닐 에틸렌디아민)으로의 에너지 거리-의존 전이이다.

- L-알라닌-Mca, Ala-Mca, 아미노펩티다제 작용을 측정하기 위한 형광발생 기질은 Sigma에서 구입되었다.

다른 이용 가능한 선택적 합성 펩티다제 억제제의 존재 및 부재에서 용해성 엑토펩티다제에 의하여 이 기질들의 가수분해율을 측정하는 것은 각 효소 분석의 특수성을 평가했다: -티올판(Thiorphan)(NEP 억제제)(Bachem), 베스타틴(Bestatin)(AP 억제제)(Calbiochem)

3. 96개의 웰의 적합한 형광 분석을 이용하여 펩티다제 작용 측정

초기 속도 측정의 조건에 따라 : 효소 및 기질 농도뿐만 아니라 속도, pH 및 인큐베이션(incubation)의 온도는 각 분석에 대하여 정의된다. 기질의 가수 분해는 시험된 억제 조성물(농도 범위 1 내지 50 μM)의 존재 및 부재하에서 상기 두 펩티다제에 의하여 신진대사율을 실시간 관할하는 것에 의하여 측정되었다. 이것들은 프리인큐베이션(preincubation) 매개체에 첨가되었다. 효소가 없을 때 얻어진 형광 신호를 나타내는 기질 자기분해의 배경 속도는 분당 RFU(상대 형광 단위; Relative Fluorescent Unit)로 초기 속도를 측정하기 위하여 제외되었다.

RFET 특정 펩타이드 기질, Abz-dR-G-L-EDDnp를 사용한 NEP-엔도펩티다제 작용의 측정

흑색 반면적 96개 웰 마이크로플레이트(microplate)를 이용하여, 상기 표준 반응은 200mM NaCl(최종 부피 100μl)을 함유한 100mM Tris-HCl pH 7에 효소(12.5ng)로 구성되었다. 상기 기질(최종 농도 15μM)은 28℃에서 10분간 프리인뷰베이션 후에 추가되었고, 상기 형광 신호(RFU)의 출현 속도는 각각 320 nm 및 420nm 여기 및 방사 파장에서 형광계 마이크로플레이트 인식기(단색화 장치 Infinite 200-Tea)를 이용하여 28℃에서 40분간(2.3분 간격 연속 측정) 직접 분석되었다.

초기 속도 측정 조건하에서, 상기 신호의 강도는 20~40분 반응의 시간 구간동안 형성된 대사산물의 양에 직접 비례했다. 따라서 억제제가 없을 때는, Abz-dR-G-L-EDDnp의 rhNEP-조정된 특정 내부 단백질 가수분해(endoproteolysis)의 초기 속도는 8218±2878 RFU/min/μg rhNEP에서, n=3 독립 측정(independent determination)으로써 선형회귀(기울기는 매개체의 존재 하에서의 NEP 작용/인큐베이션 시간)로부터 측정되었다.

RFET 특정 펩타이드 기질, Abz-R-G-F-K-DnpOH를 사용한 NEP-카르복시디펩티다제 작용의 측정

흑색 반면적 96개 웰 마이크로플레이트(microplate)를 이용하여, 상기 표준 반응은 50mM NaCl(최종 부피 100μl)을 함유한 100mM Tris-HCl pH 6.5에 효소(2.5ng)로 구성되었다. 상기 기질(최종 농도 4μM)은 10분간 프리인뷰베이션 후에 추가되었고, 상기 형광 신호(RFU)의 출현 속도는 각각 320 nm 여기 및 420nm 방사 파장을 이용하여 28℃에서 40분간(2.3분 간격 연속 측정) 직접 분석되었다. 초기 속도 측정 조건하에서, Abz-R-G-F-K-DnpOH의 인간 NEP-조정된 특정 가수분해는 59796±18685 RFU/min/μg rhNEP, n이 4인 독립 측정으로 평가되었다. 기질 Abz-R-G-F-K-DnpOH로 시험된 NEP-카르복시디펩티다제 작용은 도 5~8에 “NEP-CDP1 작용”으로서 나타난다.

또한 분자 내적으로 냉각된 형광 발생 펩타이드dls Nca-BK2(10μM)은 뒤에 설명된 것으로 같은 실험 조건 하에서 5ng rhNEP에 의하여 가수분해되는 것이 제안되었다. 이러한 조건하에서 상기 hNEP 효소는 주로 A-F 결합을 선택적으로 자른 카르복시티펩티다제 뿐만 아니라 G-F 결합을 자른 엔도펩티다제로서 작용한다. 초기 속도 측정 조건 하에서, Mca-BK2의 인간 NEP-조정된 특정 가수분해는 121910±24775 RFU/min/μg rhNEP에서, n이 3인 독립 측정으로 평가되었다. 기질 Abz-R-G-F-K-DnpOH로 시험된 NEP-카르복시디펩티다제 작용은 도 5~8에 “NEP-CDP2 작용”으로서 나타난다.

Ala-Mca 기질을 이용한 AP-N-엑토펩티다제 작용의 측정

흑색 반면적 96개 웰 마이크로플레이트(microplate)를 이용하여, 상기 표준 반응은 100mM Tris-HCl pH 7에 효소(4ng)로 구성되었다(최종 부피 100μl). 상기 Ala-Mca 기질(최종 농도 25μM)는 380nm 여기 및 460nm 방사 파장에서 형광계 인식기를 이용하여 28℃에서 10분간 프리인큐베이터 후에 첨가된다. 상기 신호의 강도는 반응 시간 10~40분 동안 형성된 대사산물의 양에 직접 비례한다. 초기 속도 측정의 이 조건 하에서, Ala-Mca의 상기 인간 AP-N-조정된 아미노 단백질 가수분해는 147042±44657 RFU/min/μg rhAP-N, n이 3인 독립 측정으로 평가되었다(경사도로부터 : 인큐베이션 시간의 함수로 억제제의 존재 하에서 AP-N작용).

NEP 카르복시디펩티다제 작용을 분석하기 위하여 다른 FRET-펩타이드 기질은 Barros 외, Biol. Chem., 2007, 388: 447~455에 설명되어 있다.

실시예 2 : 생화학적 분석의 결과

1. hNEP 및 hAN-P에서 오피올핀 펩타이드 유도체의 검사

조성물은 최종 농도 50μM에서 세 차례 테스트되었다.

도 1~9는 본 발명의 다양한 펩타이드 유도체로 NEP 엔도펩티다제 및 카르복시펩티다제의 작용 및 AP-N 작용에서 생화학적 측정의 결과를 나타낸다.

다양한 오피올핀 펩타이도-상사형은 두 멤브레인-고정된 세포 외 효소(ectoenzyme)인 NEP(특적 엔도펩티다제 및 카르복시펩티다제 작용) 및 APN에 대하여 선택된 형광 기반 효소 분석을 이용하여 테스트되었다 : 실험실에서 사전에 개발되고 입증된 시험관 실험 모델에서의 상기 FRET-기반의 효소(2009년 1월 18일 PCT 출원).

다음의 조성물은 분석되었다. 아래의 조성물에서, NH2-는 상기 펩타이드의 말단 아민 및 상기 펩타이드의 COOH 말단 카르복시산을 나타낸다.

- NH2-QRFSR-CONH2(오피올핀); NH2-QRGPR-COOH; NH2-QHNPR-COOH; NH2-QR(4브롬F)SR-COOH(즉, QRF(4Br)SR); NH2-QRFPR-COOH : 이것들은 인간 AP-N 에 대한 억제 선호 및 인간 NEP에 대하여 약간 억제 효능을 나타낸다.

- N-(아세틸)-QRFRS-COOH; N-(C8-폴리에틸렌)QRFSR; N-(비오틴-C6-폴리에틸렌)QRFSR-COOH : NEP 엔도펩티다제 작용에 관하여 인간 AP-N 및 NEP에 대하여 약한 억제 효능을 나타냈다

- NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(역행전도(retroinversion) D-거울상) : AP-N에 관하여 인간 AP-N 및 NEP에 대하여 의미 있는 억제 작용을 나타내지 않았다.

- NH2-YQRFSR-COOH; NH2-Y-(C6-폴리에틸렌)QRFSR-COOH; NH2-Y-(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH : 인간 NEP 엔도펩티다제 작용, 특히 Y-(C12-폴리에틸렌)QRFSR에 관하여 억제를 나타냈다.

- NH2-QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH; NH2-CQRFSR-COOH : 인간 NEP(특정 엔도펩티다제 및 카르복시디펩티다제 작용) 및 AP-N의 강력한 이중 억제제였다.

다른 조정된 오피올핀 펩타이드는 다음과 같다.

NH2-CQRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH;

NH2-CQRF[S-O-C12-폴리에틸렌]R-COOH

NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFSR-COOH;

NH2-C-(C12-폴리에틸렌)QRFSR-COOH

NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH

NH2-[Cβ2]-QRF[S-O-C8-폴리에틸렌]R-COOH

NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[β3R]-COOH

NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH

NH2-C-(C8-폴리에틸렌)QRFS[dR]

NH2-[dC]QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][dR]-COOH

NH2-[Cβ2]-QRF[S-O-C8-폴리에틸렌][ β3R]-COOH

이황화물 결합을 통한 시스테인-이펩타이드로서의 [CQRFSR]2.

2. hNEP 및 hAP-N에서 선택된 오피올핀 펩타이드 유도체의 농도-의존 억제

CQRFSR - COOH 펩타이드 (도 9~18)

상기 CQRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.99, n=19, 7±3μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

CQRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 6±1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

CQRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=30, 0.8±0.1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

CQRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=16, 17±2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-펩타이드(Mca-BK2) 분열을 막았다.

따라서 시스테인 아미노산(티올 관능기는 강한 Zn-킬레이트기이다)을 갖는 아미드 결합의 형성에 의하여 상기 NH2 - QRFSR 펩타이드의 N-말단 위치의 조정으로 hAP-N(원래의 QRFST 펩타이드에 비해 10배) 및 hNEP(5배)에 대하여 강화된 억제 효능을 나타내는 조성물(CQRFSR 펩타이드)을 만들어졌다.

QRF [S-O- 옥타노일 ]R- 펩타이드 (도 10)

QRF[S-O-C8]R-펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 2.8±0.2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

QRF[S-O-C8]R-펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 12±5μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

QRF[S-O-C8]R-펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=20, 10±1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

QRF[S-O-C8]R-펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 14±4μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-펩타이드(Mca-BK2) 분열을 막았다.

Y-[아미노- 도데카노산 스페이서 ]- QRFSR 펩타이드 (도 11 및 19)

Y(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.98, n=18, 10±1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

Y(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 24±2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

Y(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=20, 122±20μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

Y(PE12)QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 31±2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-펩타이드(Mca-BK2) 분열을 막았다.

따라서 Y-(C12-폴리에틸렌)QRFSR의 인간 NEP 엔도펩티다제 작용에 대한 억제는 확인되었다.

C[ PE6 ]QRFSR 펩타이드 (PE6는 아미노-헥사노산)(도 20)

C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.98, n=18, 40±5μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 약 217에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=20, 0.8±0.1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

C[PE6]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=18, 약 227μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-펩타이드(Mca-BK2) 분열을 막았다.

C-[아미노- 도데카노산 - 스페이서 ]- QRFSR 펩타이드 (도 21)

C[PE12]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.96, n=24, 5.7±0.5μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

C[PE12]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.97, n=30, 19±2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

C[PE12]QRFSR-COOH 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.98, n=27, 0.8±0.1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

C-[아미노- 헥사노산 스페이서 ]- QRFS [O- 옥타노일 ]R 펩타이드 (도 22)

C[PE6]QRF[S-O-옥사노일]R 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.99, n=27, 759±56nM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

C[PE6]QRF[S-O-옥사노일]R 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=27, 848±58nM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

C[PE6]QRF[S-O-옥사노일]R 펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=24, 1.7±0.1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

생물학적으로 관련 있는 시험관 실험 분석에서, hNEP의 근원으로서 상기 P물질 생리학적 NEP-기질 및 인간 세포막을 이용하여, 상기 C[PE6]QRF[S-O-옥사노일]R 유도체 펩타이드는 농도 의존 방법에서 막-고정 hNEP-엔도펩티다제 작용(측정점 r²=0.95, n=13, 1.6±0.4μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 물질P 분열을 막았다(같은 테스트에 대하여 원래의 오피올핀 펩타이드와 비교했을 때 적어도 5배 증가된 억제 효능)(도 23).

[ CQRFSR ] 디펩타이드([CQRFSR] ₂ )

[CQRFSR] 디펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP-엔토펩티다제 작용(측정점 r²=0.87, n=24, 1.4±0.5μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-dR-G-L-EDDnp 분열을 막았다.

[CQRFSR] 디펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhNEP 작용(측정점 r²=0.99, n=27, 3.3±0.2μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Abz-R-G-F-K-DnpOH 분열을 막았다.

[CQRFSR] 디펩타이드는 농도 의존 방법에서 상기 rhAP-N 작용(측정점 r²=0.99, n=24, 0.8±0.1μM에서 IC50으로)에 의해 조정된 상기 Ala-AMC 분열을 막았다.

NEP 및 AP-N 작용에서의 다양한 펩타이드 및 펩타이드 유도체의 IC50 값의 정리

오피올린 유도체 Y-[PE12]QRFSR QRFS[O-C8]R CQRFSR C-[PE6]-QRFSR C-[PE12]-QRFSR C-[PE6]-QRFS[O-C8]R	hAP-N에 대한 IC50, μM	h-NEP 엔도펩티다제에 대한 IC50, μM	hNEP-카르복시디펩티다제에 대한 IC50, μM
	122±20	10±1	24±2 / 31±2
	10±1	2.8±0.2	12±5 / 14±4
	0.8±0.1	7±3	6±1 / 17±2
	0.8±0.1	40±5	~220
	0.8±0.1	5.7±0.5	19±2
	1.7±0.1	0.76±0.06	0.85±0.06
[CQRFSR]2	0.8±0.1	1.4±0.5	3.3±0.2

모든 데이터는 인간 AP-N에 대하여 오피올핀의 억제 효능에 대한 상기 NH2 - QRFSR의 N-말단 α아미노기의 중요성을 보여주었다.

오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때, 아세틸화(Ac -Q-RFSR) 또는 고리화(pGlu-RFSR), 옥타노일화(C8 -QRFSR) 또는 비오틴화(비오틴- C6 )QRFSR은 hAP-N에 대한 약한 억제 효능을 나타내는 조성물을 만들어낸다.

그러나 오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교하면, 상기 두 조성물 pGlu-RFSR 및 C8-QRFSR은 적어도 동등하게 나타내고 그렇지 않다면 인간 hNEP에 대하여 더 나은 억제 효능을 나타낸다.

이 데이터는 오피올핀-원래의(QRFSR) 펩타이드와 비교했을 때, hNEP에 대한, 특히 NEP의 카르복시디켑티다제 작용에 대한 억제 효능에 대하여 상기 QRFSR-COOH 펩타이드의 세 개의 카르복실 말단의 중요성을 입증해 주고, 아미드화(QRFSR-CONH2)는 hNEP 작용에 대한 약한 억제 효능을 나타내는 조성물을 만들어낸다.

상기 QRFSR 펩타이드의 상기 Phe 잔류물은 hNEP 및 hAP-N에 대한 오피올핀의 억제 효능에 있어서 중요하다. 오피올핀-원래의(QRFSR) 펩타이드와 비교했을 때, Phe(QRYSR)에 대한 Tyr 잔류물의 치환은 hAP-N에 대한 억제 효능에서의 6배 감소 및 인간 NEP에 대한 억제 효능의 가벼운 감소를 나타내는 조성물을 만들어낸다.

흥미로운 것은 Phe(QR[4F]FSR)에 대하여 4-플루오르-Phe 잔류물의 치환은 오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때 hNEP에 대한 2배 감소한 억제 효능 및 hAN-P에 대한 동일한 억제 효능을 나타내는 조성물을 만들어냈다. 반대로 (4브롬-Phe) 잔류물 또는 Phe(QR[4F]FSR)의 치환은 인간 NEP에 대한 약한 억제 효능을 보이는 조성물을 만들었다.

오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때 상기 조성물 QRGPR, QHNPR 및 QRFSR는 인간AP-N에 대하여 동등한 억제 효능 및 인간 NEP에 대한 약한 억제 효능을 나타냈기 때문에, 상기 QRFSR 펩타이드의 RFS 중심부 잔류물의 조정은 hNEP에 대한 오피올핀의 억제 효능에 영향을 미친다.

이 결과는 hAP-N에 대한 오피올핀의 억제 효능에 대하여 상기 QRFSR의 위치 2에서 Arg 잔여물의 구아니디움(guanidium)의 중요성을 보여준다. 오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때, Arg2에 대한 Lys 잔여물(QKFSR)의 ε-아민의 치환은 hAP-N에 대하여 억제 효능에 있어 10배보다 큰 감소 및 인간 NEP에 대한 억제 효능에서 가벼운 감소를 보이는 조성물을 만들어 냈다.

유사하게 상기 QRFSR 펩타이드의 위치 5에서 상기 Arg 잔여물의 구아니디움 이온은 hAPN에 대한 오피올핀의 억제 효과에 있어 중요하고, 오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때 Arg5(QRFSK)에 대하여 Lys 잔여물의 ε-아민의 치환은 hAP-N에 대하여 억제 효능에 있어 10배의 감소 및 인간 NEP에 대한 동등한 억제 효능을 나타낸 조성물을 만들어 냈다.

흥미로운 것은, 옥타노산(octanoic acid)(QRF[옥타노일-세린]R)에 의한 상기 QRFSR 펩타이드의 세린 잔여물의 하이드록실기의 에스테르화는 오피올핀-원래의 QRFSR 펩타이드와 비교했을 때 hAP-N에 대한 동등한 억제 효능을 나타내는 조성물을 만들어 냈고, hNEP-엔도 및 카르복시디-펩티다제 작용에 대한 억제 효능을 강화했다(원래의 오피올핀 펩타이드 보다 적어도 10배 이상의 억제 효능)(도 19).

실시예 3 : 원래의 펩타이드보다 우수한 체내에서 진행되는 생물학적 이용 가능한 특성을 잠재적으로 나타내는 오피올핀의 시험관에서 만들어지는 강력한 대(對)생물 활성 펩타이도 -상사형의 식별

1. 생물학적 흡착에서의 잠재적 이득 : 막전위(trans-membrane) 이동(상피 및 내부 상피 세포막 통과)

폴리에틸렌 C6, C8, C19 또는 C12 스페이서와 같은 화학적으로 소수성인 부분에 의한 오피올핀 - 펩타이드를 조정하는 것은 막에 대한 생물학적인 채내 흡수 효능을 증가하게 할 것이다. 테스트된 모든 조성물 중에, NH2-QRF[S-O-옥타노일]R-COOH - NN2-Y(PE12)QRFSR-COOH(PE=[CH2]n; PE12=아미노-도데카노산)는 인간 NEP(특히 엔도펩티다제 및 카르복시디펩티다제 작용) 및 AP-N 작용의 강력한 이중 억제제가 되는 것을 나타냈다.

2. 신진대사 안정에서의 잠재적 이득 : [CQRFSR]₂

[CQRFSR]디-펩타이드는 CQRFSR 단량체 펩타이드와 비교했을 때, hNEP-엔도 및 카르복시디-펩티다제 작용에 대한 억제 효능이 적어도 두 배 증가한 것으로 나타났다. 상기 디-펩티다제 서열은 아미노펩티다제를 순환시키는 것에 의하여 유도체 조성물의 효능이 저하하는 것을 막도록 할 것이다.

분명히, 본 발명의 많은 조정 및 변형은 위에 개시한 것에 고려하여 가능하다. 그러므로 첨부된 청구항들의 범위 내에서 이해될 것이고, 본 발명은 특히 여기서 설명한 것과 다르게 실행될 수 있다.

Claims

식 (1)인 펩타이드 유도체.
ζ-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-OH (1)
(ζ는 수소 원자, 티로신, Y-[링커(linker)]- 또는 C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 하이드록삼산(hydroxamic acid)(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린(hydroxyquinoline)과 같은 Zn 킬레이트 조성물기(chelating group)이고, AA₁은 Q 또는 Glp이고, AA₂는 K, R 또는 H이고, AA₃는 K, R, N, R 또는 F(X)이고, AA₄는 P, S 또는 S(OAlk)이고, AA₅는 K 또는 R이고, C-[링커]는 Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-를 의미하고 여기서 n은 1 내지 20의 정수이고, Y-[링커]-는 Tyr-[NH-(CH₂)_n'CO]-를 의미하고 여기서 n'은 1 내지 20의 정수이고, F(X)는 하나 이상의 할로겐 원소에 의해 치환된 페닐기인 페닐말라닌을 의미하고, S(OAlk)는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 측쇄 알킬기에 의해 치횐된 하이드록실기인 세린(serine)을 의미하고, 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 L-배열 또는 D-배열이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아민노산일 것이다.
여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR 또는 GlpRFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.)
제1항에 있어서,
식 (2)인 상기 펩타이드 유도체.
ζ^a-Q-AA^a ₂-AA^a ₃-P-R-OH (2)
(ζ^a는 수소 원자 또는 시스테인, C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 하이드록삼산(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린과 같은 Zn 킬레이트 조성물기이고, AA² ₂는 R 또는 H이고, AA^a ₃는 G, N, F 또는 F(X)이고, C-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 Q, AA₂, AA₃, P 및 R은 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, Q, AA₂, AA₃,P 및 R 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.
여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QHNPR 또는 QRGPR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.)
제1항에 있어서,
식 (3)인 상기 펩타이드 유도체.
ζⁿ-AA₁-AAⁿ ₂-AAⁿ ₃-AAⁿ ₄-AAⁿ ₅-OH (3)
(ζⁿ는 수소 원자, 티로신 또는 Y-[링커]-이고, AA₁은 Q, 또는 Glp이고, AAⁿ ₂는 K또는 R이고, AAⁿ ₃는Y, Y, F 또는 F(X)이고, AAⁿ ₄는 S 또는 S(OAlk)이고, AAⁿ ₅는 K 또는 R이고, Y-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅는 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, AA₁, AA₂, AA₃, AA₄ 및 AA₅ 중 어느 하나는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR, QHNPR, YQRFSR 또는 GlpPFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체인 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.)
제1항에 있어서,
식 (4)인 상기 펩타이드 유도체.
ζ^m-Q-R-AA^m ₃-AA^m ₄-R-OH (4)
(ζ^m는 수소 원자 또는 시스테인, C-[링커]-, N-아세틸-시스테인, N-머캅토아세틸(HS-CH₂-CO-), 하이드록삼산(HO-NH-CO-) 또는 선택적으로 치환된 하이드록시퀴놀린과 같은 Zn 킬레이트 조성물기이고, AAⁿ ₃는 F 또는 F(X)이고, AA^m ₄는 S 또는 S(OAlk)이고, C-[링커]-, F(X) 및 S(OAlk)는 위에서 정의한 것과 같고, 상기 Q, AA₂, AA₃, P 및 R은 각각 상기 L-배열 또는 D-배열 중 어느 하나일 것이고, Q, AA₂, AA₃, P 및 R 중 어느 하나는 선택적으로 β 아미노산, 아자-아미노산 또는 β-아자-아미노산일 것이다.
여기서 상기 펩타이드 유도체는 시스테인이라면, 상기 펩타이드 유도체는 선택적으로 상기 펩타이는 QRFSR 또는 YQRFSR이 아니라는 조건을 갖는 이량체이다.)
제1항에 있어서,
QRFSR-NH₂;
-F[4Br]-은 브롬 원자에 의하여 파라(para-) 위치에서 치횐된 상기 페닐기인 페닐 알라닌인 QR-F[4Br]-SR;
QRFPR;
(아세틸)-QRFSR;
C-(-HN-(CH-₂)₈-CO-)-QRFSR;
비오틴-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;
dR-dS-dF-dR-dQ;
Y-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;
Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;
QRF-S(O-옥타노일)-R;
CQRFSR;
CQEF-S(O-옥타노일)-R;
CQEF-S(O-도데카노일)-R;
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;
[Cβ2]QRF-S(O-옥타노일)-R;
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[β3R];
C-[dQ]-RF-S(O-옥타노일)-[dR];
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];
[dC]-QRF-S(O-옥타노일)-[dR];
[Cβ2]-QRF-S(O-옥타노일)-[β3R];
[CQRFSR]₂;
QRYSR;
-F[4F]-은 불소 원자가 파라(para-) 위치에서 치횐된 상기 페닐기인 페닐 알라닌인 QR-F[4F]-SR;
-F[4Br]-은 브롬기 파라(para-) 위치에서 치횐된 상기 페닐기인 페닐 알라닌인 QR-F[4Br]-SR;
QKFSR;
QRFSK;
C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-R;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)-β3R; 및
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-옥타노일)β3R;
(여기서 Cβ2는 H₂N-(-CH₂-SH)-CH₂-CO-이고, β3R는 -NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH이고, -S(O-옥타노일)은 옥타노일에 의하여 치환된 하이드록실기인 세린을 의미하고, -S(O-도데카노일)은 도데카노일에 의하여 치환된 하이드록실기인 세린을 의미한다.)
인 상기 펩타이드 유도체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
중성 엔도펩티다제(endopeptidase) NEP 및/또는 아미노펩티다제(aminopeptidase) AP-N에 대한 억제 효능을 갖는 상기 펩타이드 유도체.
제2항에 있어서,
인간 AP-N에 대한 억제 효능을 갖는 상기 펩타이드 유도체.
제3항에 있어서,
인간 NEP에 대한 억제 효능을 갖는 상기 펩타이드 유도체.
제4항에 있어서,
이중 중성 엔도펩티다제 NEP 및 아미노펩티다제 AP-N 억제제인 상기 펩타이드 유도체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩타이드 유도체를 포함하는 조성물 및 약물로 수용 가능한 캐리어.
치료를 필요로 하는 실험 대상자의 질병 또는 기능 장애의 치료 방법에 있어서,
멤브레인 메탈로-엑토펩티다제의 상기 작용의 조정은 발견되고,
질병 또는 기능 장애를 치료하도록 환자에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 하나 이상의 상기 펩타이드 유도체(들)을 주입하는 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제는 멤브레인 아연-메탈로펩티다제인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제는 NEP 및/또는 AP-N인 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
통증, 우울 장애, 성별에 관련된 손상된 사회 활동 및 손상된 성적 행위로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
상기 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제 작용의 조절이 요구되는 질병 또는 장애의 치료에 사용되는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 펩타이드 유도체.
제15항에 있어서,
상기 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제는 멤브레인-아연 메탈로펩티다제인 펩타이드 유도체.
제15항 또는 제16항에 있어서,
상기 멤브레인 메탈로-엑토펩티다제는 NEP 및/또는 AP-N인 펩타이드 유도체.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
통증, 우울 장애, 성별에 관련된 손상된 사회 활동 및 손상된 성적 행위로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 장애를 치료에 사용하는 펩타이드 유도체.
펩타이드 유도체는 천연 아미노산인 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 부호화한 염기서열 펩타이드 유도체를 포함하는 핵산.
제1항 내지 제9항에서 정의된 펩타이드 유도체를 겨냥한 항체.