CN102083851A - Opiorphin肽衍生物作为脑啡肽降解性外肽酶的有力抑制剂 - Google Patents
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Abstract
现有发明涉及作为金属外肽酶新抑制剂的经修饰的opiorphin肽。
Description
本申请要求于2008年4月7日提交的美国临时申请号61/042,922的优先权，并将其引入作参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及作为金属外肽酶(metallo-ectopeptidase)新抑制剂的经修饰的opiorphin肽。
相关技术描述
锌金属外肽酶(ectopeptidase)控制参与哺乳动物中重要生理功能调节的神经性和激素性介质的受体依赖性活性。它们位于神经及全身组织中的细胞表面，并催化神经肽及调节肽的分泌后加工或代谢(Roques，BP，Noble，F，Dauge，V，Fournie-Zaluski，MC & Beaumont，A.(1993)Pharmacol Rev 45，87-146.Turner，AJ，Isaac，RE & Coates，D.(2001)BioEssays 23，261-269)。
在这些神经和/或激素肽信号中突出的有P物质(SP)和脑啡肽，其涉及对行为适应性应答的受体依赖性调节，所述应答是针对应激性或威胁性的环境刺激。它们显著地调节疼痛信息和镇痛机制的脊髓处理、情绪和/或动机性应答、焦虑，攻击行为和神经免疫炎症现象(Dickenson，AH.(1995)Br J Anaesth 75，193-200.Sora，I，Takahashi，N，Funada，M，Ujike，H，Revay，RS，Donovan，DM，Miner，LL & Uhl，GR.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94，1544-1549；Konig，M，Zimmer，AM，Steiner，H，Holmes，PV，Crawley，JN，Brownstein，MJ & Zimmer，A.(1996)Nature 383，535-538；Filliol，D，Ghozland，S，Chluba，J，Martin，M，Matthes，HW，Simonin，F，Befort，K，Gaveriaux-Ruff，C，Dierich，A & LeMeur，M，et al.(2000)Nat Genet 25，195-200)。
由于锌外肽酶在对下游神经及激素信号潜能的调节中的生理重要性及关键作用，有必要聚焦于是什么控制了它们的活性，以及作为结果，聚焦于总的调节级联。因具有开发新候选药物的潜力，从病理生理学及治疗的角度来看，外肽酶活性上游调节物的发现也是令人激动的。
基于其对诸如中性内肽酶(NEP；EC 3.4.24.11[EC])及氨肽酶N(AP-N；3.4.11.2[EC])等的脑啡肽降解性外肽酶的抑制活性，从牛脊髓中分离及表征出称作spinorphin的脑特异性七肽(Nishimura，K & Hazato，T.(1993)Biochem Biophys Res Commun 194，713-719；Yamamoto，Y，Ono，H，Ueda，A，Shimamura，M，Nishimura，K & Hazato，T.(2002)Curr Protein Pept Sci 3，587-599)。此外，我们表征了大鼠sialorphin，在大鼠中参与对环境改变的适应的肽介质。大鼠sialorphin是内分泌激肽信号，在雄性大鼠中，其表达由雄激素调节所激活，并且其分泌由肾上腺激素介导的对环境应激的应答所刺激。它是膜锚定的大鼠NEP活性的生理抑制剂以及是大鼠疼痛感觉的强力抑制剂(Rougeot，C，Rosinski-Chupin，I，Njamkepo，E & Rougeon，F.(1994)Eur J Biochem 219，765-773；Rougeot，C，Vienet，R，Cardona，A，Le Doledec，L，Grognet，JM & Rougeon，F.(1997)Am J Physiol 273，R1309-R1320.；Rougeot，C，Rosinski-Chupin，I & Rougeon，F.(1998)in Biomedical Reviews eds.Chaldakov，GN & Mathison，R.(Bulgarian-American Center，Varna，Bulgaria，)Vol 9，pp.17-32；Rosinski-Chupin，I，Huaulme，JF，Rougeot，C & Rougeon，F.(2001)Endocrinology 142，4550-4559；Rougeot，C，Messaoudi，M，Hermitte，V，Rigault，AG，Blisnick，T，Dugave，C，Desor，D&Rougeon，F.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100，8549-8554)。
我们先前证明了目前首个在人中被表征的人Opiorphin天然肽(QRFSR肽)，是两个脑啡肽失活性外肽酶，中性内肽酶NEP(EC 3.4.24.11)及氨肽酶AP-N(EC 3.4.11.2)的有效双重抑制剂(Wisner et al.Proc Natl Acad Sci USA，Nov.2006，103(47)：17979-84)。
Opiorphin肽衍生物先前已有描述，参见例如Wisner et al.Proc Natl Acad Sci USA，Nov.2006，103(47)：17979-84，并具有基本肽序列QRFSR。
因此，此序列及由下式所定义的序列可以被修饰：X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg，其中X1代表氢原子或Tyr氨基酸，当X1为氢时X2代表Gln或Glp，或者当X1为Tyr或Cys时X2代表Gln。优选的是QRFSR、YQRFSR、和/或CQRFSR，最优选QRFSR。众所周知，Glp是焦谷氨酸，Tyr或Y是酪氨酸，Gln或Q是谷氨酰胺，Arg或R是精氨酸，Phe或F苯丙氨酸，Ser或S是丝氨酸，以及Cys或C是半胱氨酸。这些肽在作为WO2005090386公开的国际专利申请中已有描述。
发明概述
本发明提供了新的Opiorphin衍生物以及通过使用高选择性的生化测定法来进行的体外功能性表征。
附图简述
图1-4：在存在载体(vehicle)或存在50μM的QRFSR肽类似物的情况下，重组hNEP或hAP-N对相应FRET肽底物的水解动力学。每个点代表以RFU(相对荧光单位)表示的信号强度，其作为反应时间(min)的函数与所形成的代谢物的量成比例。
图5：由QRFSR肽类似物针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解所进行的抑制。每一条棒(bar)表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无50μM的QRFSR肽类似物的情况下测量。
图6：纯重组人hNEP或AP-N的底物。每一条棒表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无50μM的QRFSR肽类似物的情况下测量。
图7-8：由QRFSR肽类似物针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解所进行的抑制。每一条棒表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速率度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无50μM的QRFSR肽类似物的情况下测量。
图9：由CQRFSR肽针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解所进行的浓度依赖性抑制。每一点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的CRFSR肽的情况下测量。
图10：由QRFS[O-辛酰基]R-肽针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解所进行的浓度依赖性抑制。每一点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的QRFS[O-辛酰基]R-肽的情况下测量。
图11：由Y(PE12)QRFSR(如Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR)肽针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解所进行的浓度依赖性抑制。每一点表示所回收的完整底物百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以logμM标记的浓度的Y(PE12)QRFSR的情况下测量。
图12-17：在存在载体或存在1到50μM的CQRFSR或CQRFS[O-辛酰基]R Opiorphin肽类似物的情况下，由重组hNEP或hAP-N对相应FRET肽底物进行的水解的动力学。每个点代表以RFU(相对荧光单位)表示的信号强度，其作为反应时间(min)的函数与所形成的代谢物的量成比例。
图18：由CQRFSR肽针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的CRFSR肽的情况下测量。
图19：由Y[PE12]QRFSR-COOH肽(如Y-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR)针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的Y(PE12)QRFSR-COOH肽的情况下测量。
图20：由C[PE6]QRFSR-COOH肽(如C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR)针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的C[PE6]QRFSR-COOH肽的情况下测量。
图21：由C(PE12)QRFSR-COOH肽(如C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR)针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的C(PE12)QRFSR-COOH肽的情况下测量。
图22：由C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽(如C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R)针对纯重组人hNEP或AP-N对相应FRET肽底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽的情况下测量。
图23：通过C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽(如C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R)针对由培养中的LNCaP上皮细胞所表达的膜结合人NEP对P物质生理NEP底物的水解进行的浓度依赖性抑制。每个点表示所回收的完整底物的百分比，并计算为：无抑制剂时的速度-有抑制剂时的速度/无抑制剂时的速度所得的百分比，其分别在有或无各种以μM(log-尺度)标记的浓度的C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽的情况下测量。
优选实施方案详述
本发明在此提供这些肽经修饰的形式，其中组成opiorphin肽的每个氨基酸残基或氨基酸残基的组合用一个或多个观能团来修饰。
此种经修饰的opiorphin肽的非限定性例子包括：
NH2-QRFSR-CONH2；
NH2-QRGPR-COOH；
NH2-QHNPR-COOH；
NH2-QR(4溴F)SR-COOH(如NH2-QR-F[4Br]-SR-COOH，其中-F[4Br]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由溴原子取代，因此-F[4Br]-结构式如下：
)；
N-(乙酰)QRFSR-COOH；
N-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；
N-(生物素-C6)QRFSR-COOH；
NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(逆反转(retroinversion)D-对映异构体)；
NH2-YQRFSR-COOH；
NH2-Y-(C6-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-Y-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-CQRFSR-COOH；
NH2-CQRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-CQRF[S-O-C12-聚乙烯]R-COOH；
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-C-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[β3R]-COOH；
NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH；
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[dR]；
NH2-[dC]QRF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH；
NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯][β3R]-COOH；
[CQRFSR]2作为通过二硫键的半胱氨酸二肽；
Glp-RFSR-COOH；
NH2-QRYSR-COOH；
NH2-QRF[4F]SR-COOH，其中-F[4F]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由氟原子取代，因此-F[4F]-结构式如下：
NH2-QKFSR-COOH；
NH2-QRFSK-COOH；
NH2-C-(C6-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-C-(C6-聚乙烯)-QRFS[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-C-(C12-聚乙烯)QRFS[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-C[PE12]QRFS-dR-COOH；
NH2-C-(C12-聚乙烯)-QRFS[S-O-C8-聚乙烯]-β3R-COOH；
NH2-C-(C8-聚乙烯)-QRFS[S-O-C8-聚乙烯]-β3R-COOH，
其中Cβ2通过β2-半胱氨酸替代天然半胱氨酸残基，所述β2-半胱氨酸在接近半胱氨酸α羰基附近的Cα碳邻近结合了亚甲基残基(H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-)；
β3R通过β3-精氨酸替代天然精氨酸，所述β3-精氨酸在精氨酸α氨基附近的Cα碳邻近结合了亚甲基残基(-NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH)(NH2)]-COOH)；
[S-O-C8-聚乙烯]和[S-O-辛酰基]意指其羟基被辛酰基取代的丝氨酸；
[S-O-C12-聚乙烯]意指其羟基被月桂基取代的丝氨酸；
C6，C8或C12-聚乙烯对映于6、8或12个乙烯碳的间隔区(分别为(-HN-(CH2)6-CO-，-HN-(CH2)8-CO-和(-HN-(CH2)12-CO-)。
在以上肽中，NH2表示肽的终端氨基，COOH表示终端羧酸(当终端官能团为酰胺时为-CO-NH2)。以上列表也可如下表示：
QRFSR-NH2；
QRGPR；
QHNPR；
(乙酰)QRFSR；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR；
生物素-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
dR-dS-dF-dR-dQ；
YQRFSR；
Y-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
Y-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR；
QRF-S(O-辛酰基)-R；
CQRFSR；
CQRF-S(O-辛酰基)-R；
CQRF-S(O-月桂基)-R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；
[Cβ2]QRF-S(O-辛酰基)-R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[β3R]；
C-[dQ]-RF-S(O-辛酰基)-[dR]；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]；
[dC]-QRF-S(O-辛酰基)-[dR]；
[Cβ2]-QRF-S(O-辛酰基)-[β3R]；
[CQRFSR]2；
Glp-RFSR；
QRYSR；
QR-F[4F]-SR，其中-F[4F]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由氟原子取代；
QR-F[4Br]-SR，其中-F[4Br]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由溴原子取代；
QKFSR
QRFSK；
C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；
C(-HN-(CH2)12-CO-)QRF-S(O-辛酰基)-R；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFS-dR；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-β3R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-β3R，
其中，
Cβ2是H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-；
β3R是-NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH)(NH2)]-COOH；
-S(-O-辛酰基)意指其羟基被辛酰基取代的丝氨酸；
-S(-O-月桂基)表示其羟基被一个月桂基取代的丝氨酸。
以下定义在本申请被始终使用。
肽是指由线性排列中通过肽键相互连接的氨基酸残基的线性排列所组成的分子。此种线性排列可以任选是环状的，即线性肽的末端或是肽内部氨基酸侧链可以例如经化学键而相连。此种肽可进一步包括二级，三级或四级结构，以及与其它肽或其它非肽分子的分子间联系。此种分子间联系可通过(无限制性目的)共价键(如通过二硫键)、或通过螯合、静电相互作用，疏水相互作用、氢键、离子偶极相互作用、偶极-偶极相互作用、或以上任意的组合。
以下肽的任意氨基酸可以是L构型或D构型。特别地，整条肽可以是L构型或是D构型。与天然氨基酸相比，碳氢链可进一步含有亚甲基，从而此氨基酸也可成为β氨基酸，更确切地说是β2或β3氨基酸。例如：R可以代表以下氨基酸之一：lR(即L-Arg)，dR(即D-Arg)，β3R或β2R。以下肽的任意氨基酸也可以是氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸。
“F(X)”意指苯丙氨酸，其苯基被一个或多个卤素原子取代，优选氟，优选的F(X)具有一个以下的结构式：
“S(OAlk)”意指丝氨酸，其羟基被线状或分枝的具有1-20个碳原子的烷基即(“Alk”)取代，优选辛酰基或月桂基。在本申请中，S(O-C8-聚乙烯)或S(O-C8)意指其羟基被辛酰基取代的丝氨酸。
“C-[接头]-”意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-，其中n是介于1-20间的整数，优选介于4-15间，尤其优选6、8或12。在本申请中，“C-(C6-聚乙烯)”或“C[PE6]”意指Cys-[NH-(CH2)6-CO]-；“C-(C8-聚乙烯)”或“C[PE8]”意指Cys-[NH-(CH2)8-CO]-；以及“C-(C12-聚乙烯)”或“C[PE12]”意指Cys-[NH-(CH2)12-CO]-。
“Y-[接头]-”意指Tyr-[NH-(CH2)n’-CO]-，其中n’是介于1-20间的整数，优选介于4-15间，尤其优选6、8或12。在本申请中，“Y-(C6-聚乙烯)”或“Y[PE6]”意指Tyr-[NH-(CH2)6-CO]-；“Y-(C8-聚乙烯)”或“Y[PE8]”意指Tyr-[NH-(CH2)8-CO]-；以及“Y-(C12-聚乙烯)”或“Y[PE12]”意指Tyr-[NH-(CH2)12-CO]-。
本发明中的肽衍生物对于特定肽酶的“抑制潜能”可容易地由本领域技术人员来评估，例如通过测量Ki值或IC50值。具体来说，当确定了IC50值时，两个经修饰的opiorphin肽的相对抑制潜能，可以通过在给定实验条件下(相同的缓冲液，相同浓度的肽酶和底物)测量每个经修饰的opiorphin肽对特定肽酶的IC50值来进行比较，以及可以通过在相同实验条件下，比较上述经修饰的opiorphin肽的IC50值与opiorphin的IC50值。
本发明涉及结构式(I)的肽衍生物：
ζ-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-OH (I)，
其中：
-ζ是氢原子，酪氨酸，Y-[接头]-或Zn螯合基团，比如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选取代的羟基喹啉，
-AA1是Q或Glp，
-AA2是K，R或H，优选R，
-AA3是Y，G，N，F或F(X)，优选F或F(X)，
-AA4是P，S或S(OAlk)，优选S或S(OAlk)，
-AA5是K或R，优选R，
-C-[接头]-意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-，其中n是介于1-20间的整数，n优选为6、8或12，
-Y-[接头]-意指Tyr-[NH-(CH2)n’-CO]-，其中n’是介于1-20间的整数，n优选为6、8或12，
-F(X)意指苯丙氨酸，其苯基被一个或多个卤素原子取代，
-S(OAlk)意指丝氨酸，其羟基被线状或分枝的具有1到20个碳原子的烷基取代，
-所述AA1，AA2，AA3，AA4和AA5可独立地是L构型或D构型，并且AA1，AA2，AA3，AA4，和AA5中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
其中，如果该肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是该肽不是QRFSR、QHNPR、QRGPR、YQRFSR或GlpRFSR。
通常，在根据本发明的肽衍生物中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5可独立地是L构型或D构型，AA1、AA2、AA3、AA4，和AA5中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸。
在一个实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5中至少有一个为β氨基酸。在另一实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5都是β氨基酸。
在一个实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5中至少有一个为氮杂氨基酸。在另一实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5都是氮杂氨基酸。
在一个实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5中至少有一个为β-氮杂氨基酸。在另一实施方案中，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5都是为β-氮杂氨基酸。
在一个实施方案中，该肽衍生物包含半胱氨酸且是二聚体，其中两个半胱氨酸的两个硫原子以二硫键相连。例如，[CQRFSR]2是肽衍生物CQRFSR的二聚体，其半胱氨酸氨基酸由二硫键相连。
在一个优选实施方案中，当ζ是羟基喹啉时，该肽衍生物有如下结构式：
结构式(I)的肽衍生物是经修饰的opiorphin肽，其有利地是具有对中性内肽酶NEP和/或氨肽酶AP-N的抑制潜能。
结构式(I)的优选肽衍生物为：
CQRFSR，
QRF(X)SR，
QRGPR，
QHNPR，
QRFPR，
QRFS(OAlk)R，优选QRFS(O-乙酰)R，
C-[接头]-QRFSR，优选C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFSR、C-[NH-(CH2)8-CO]-QRFSR、或C-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR，
QRYSR，
QKFSR，
QRFSK，
C-[接头]-QRFSR，优选C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFSR、C-[NH-(CH2)8-CO]-QRFSR、或C-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR，
[CQRFSR]2，
C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFS(OAlk)R优选C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFS(O-辛酰基)R
以及Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR。
在一个实施方案中，本发明涉及结构式(II)的肽衍生物：
ζa-Q-AAa 2-AAa 3-P-R-OH(II)
其中：
-ζa是氢原子或Zn螯合基团，比如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选取代的羟基喹啉，
-AAa 2是R或H，优选R，
-AAa 3是G、N、F或F(X)，优选F，
-所述Q、AA2、AA3、P和R可独立地是L构型或D构型，以及Q、AA2、AA3、P和R中的任意一个可随意任选为β氨基酸，氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是此肽不是QHNPR或QRGPR。
所述结构式(II)的肽衍生物是经修饰的opiorphin肽，且有利地是人AP-N抑制剂。特别是，它可以具有比其对NEP内肽酶和/或羧基二肽酶活性的抑制潜能高的对AP-N的抑制潜能(优选至少6倍、8倍或10倍)。
结构式(II)的优选肽衍生物为：
QRGPR，
QHNPR和
QRFPR。
在一个实施方案中，本发明涉及结构式(III)的肽衍生物：
ζn-AA1-AAn 2-AAn 3-AAn 4-AAn 5-OH(III)，
其中，
-ζn是氢原子、酪氨酸或Y-[接头]-，
-AA1是Q或Glp，优选为Q，
-AAn 2是K或R，优选为R，
-AAn 3是Y、F或F(X)，优选为F或F(X)，
-AAa 4是S或S(OAlk)，
-AAn 5是K或R，优选为R，
-所述AA1、AA2、AA3、AA4和AA5可独立地是L构型或D构型，AA1、AA2、AA3、AA4和AA5中的任意一个可任选为β氨基酸，氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
前提是此肽不是QRFSR、QHNPR、YQRFSR或GlpRFSR。
所述结构式(III)的肽衍生物是经修饰的opiorphin肽，且有利地是人NEP抑制剂。特别是，它可以具有比其对AP-N的抑制潜能高的对NEP内肽酶和/或羧基二肽酶活性的抑制潜能(优选至少6倍、8倍或10倍)。
在一个实施方案中，本发明涉及结构式(IIIa)的肽衍生物：
AA1-R-AAn 3-S(OAlk)-AAn 5-OH (IIIa)，
其中：
-AA1是Q或Glp，
-AAn 3是F或F(X)，
-AAn 5是K或R，优选为R，
前提是该肽不是QRFSR、QHNPR、YQRFSR或GlpRFSR。
结构式(III)或(IIIa)的优选肽衍生物为：
QRYSR，
QRF(X)SR，
QKFSR，
QRFSK，
QRFS(OAlk)R，优选为QRFS(O-辛酰基)R和
Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR。
在一个实施方案中，本发明涉及结构式(IV)的肽衍生物：
ζm-Q-R-AAm 3-AAm 4-R-OH (IV)，
其中，
-ζm是氢原子，或Zn螯合基团，比如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选取代的羟基喹啉，
-AAn 3是F或F(X)，优选为F(X)，
-AAm 4是S或S(OAlk)，优选为S或S(OAlk)，
-所述Q、R、AA3、AA4和R可独立地是L构型或D构型，Q、R、AA3、
AA4和R中的任意一个可任选为β氨基酸，氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；其中，如果该肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是此肽不是QRFSR或YQRFSR。
结构式(IV)的肽衍生物是经修饰的opiorphin肽，有利地为人NEP和人AP-N双重抑制剂，因其显示出对人NEP和人AP-N的显著抑制潜能。
结构式(IV)的优选肽衍生物为：
CQRFSR，
[CQRFSR]2，
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
C-[接头]-QRF-S(O-辛酰基)-R，优选为C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R，C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R或C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；
QRF(X)SR和
QRFS(OAlk)R，优选为QRFS(O-辛酰基)R。
优选地，本发明的肽衍生物是经修饰的opiorphin肽并且具有针对中性内肽酶NEP和/或氨肽酶AP-N的抑制潜能。最优选地，本发明中经修饰的肽衍生物具有对中性内肽酶NEP和氨肽酶AP-N的抑制潜能。
根据本发明的肽衍生物可以常规的方式通过液相或固相中的肽合成来制备，所述肽合成是通过把将要结合的不同氨基酸残基相继连接来(在液相中从N-末端到C-末端，或在固相中从C-末端到N-末端)，其中，N-末端和活性侧链事先用常规基团阻断。
对于固相合成，具体可使用Merrifield所描述的技术。或者，Houbenweyl于1974年描述的技术也可使用。
若其由天然氨基酸组成，则根据本发明的肽衍生物也可经由基因工程的方法获得。
Opiorphin肽的修饰包括化学的修饰(比如，含有添加的化学部分，诸如甲基，C2、C4、C6、C8、C10、C12聚乙烯以及其聚乙二醇，和/或糖基化形式，和模拟肽类(peptidomimetics)(比如，一个在结构和/或功能上模拟肽的低分子量化合物(参见例如Abell，Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics，London：JAI Press(1997)；Gante，Peptidmimetica-massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew.Chem.106：1780-1802(1994)；and Olson et al.，J.Med.Chem.36：3039-3049(1993))。
其它可以引入本发明肽衍生物的修饰包括使用非天然氨基酸、D型氨基酸、β2氨基酸、β3氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸来替代L型氨基酸，构象约束，等构置换，环化或其它修饰。其它例子有一个或多个酰胺键被非酰胺键取代，以及/或一个或多个氨基酸侧链被不同的化学部分取代，或一个或多个N-末端、C-末端或一个或多个侧链被保护基团保护，以及/或在氨基酸链中被引入双键和/或环化和/或立体特异性以增强刚性和/或结合亲合性。
基于本发明中肽衍生物所靶向的金属外肽酶结合结构域的晶体结构，也可通过计算机辅助药物设计开发的方法获得模拟物(Oefner et al.J.Mol.Biol.(2000)296(2)：341-9；Gomeni et al.Eur.J.Pharm.Sci.(2001)13(3)：261-70；Kan，Curr Top Med Chem(2002)，2(3)：247-69)。
其它修饰还包括：
-通过与亲脂性醇的酯化作用(COOH)或通过酰胺化作用(COOH)和/或通过乙酰化作用(NH2)或在NH2末端添加羧烷基或芳香族疏水链来保护NH2和COOH亲水基团；
-CO-NH酰胺键的逆反转异构体或酰胺基的甲基化(或酮亚甲基，亚甲基氧(methyleneoxy)，羟基乙烯)；
-在两个氨基酸间插入-[HN-(CH2)n-CO-]-部分，n是介于1-20间的整数，优选6、8或12。
当考虑到遗传密码的简并性时，核酸，又称多核苷酸，诸如编码肽包括含有天然氨基酸的肽衍生物的DNA或RNA分子，如上所定义，也是本发明的一部分。所述核酸优选包含编码由天然氨基酸组成的肽衍生物的序列。
本发明中的核酸包含可与上述任意序列或其互补序列在高严格杂交条件下杂交的序列，所述条件是指在68℃0.2X SSC中，在42℃50％甲酰胺、4X SSC中的杂交和/或洗涤条件，或者是能提供等同于在上述两条件任一条件下所观察到的杂交水平的条件。
本发明进一步涉及包含本发明核酸序列的用于克隆和/或表达的载体以及涉及包含该核酸或所述载体的宿主细胞，即其中至少转移了这些载体中一种的宿主细胞。根据本发明的表达载体包含核酸序列，其编码肽，包括肽衍生物或本发明的蛋白，所述述核酸序列可操作地与使其表达的元件相连。所述载体有利地是含有启动子序列、用于启动和终止翻译的信号、以及用于翻译调节的合当的区域。其插入宿主细胞可以是暂时的或稳定的。所述载体也可含有用于翻译好的蛋白分泌的特定信号。
宿主细胞可以是原核的或真核的，包括但不仅限于细菌，酵母，植物细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞，包括商业可购得的细胞系。宿主细胞的优选例子是COS-1，HEK细胞，293细胞，或CHO细胞。
本发明进一步提供特异性针对(即特异性识别)本文所述经修饰的opiorphin肽的抗体，单克隆的或多克隆的，或其片段。这类抗体可用于例如研究本发明中肽衍生物的药代动力学特性。
本文使用的不同语法形式的术语“抗体“指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗体结合位点或抗原互补位的分子。示例的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、实质上完整的免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的一部分，包括领域中已知的为Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的部分。
多克隆抗体的产生过程也是众所周知的。这类抗体的产生典型地可通过对已被事先采血以获得免疫前血清的新西兰白兔进行皮下注射本发明的肽衍生物，包括缀合的肽衍生物。抗原可在十个或至少五个不同点以每个位点总体积50μl注射。继而在初次注射后五周对兔采血并周期性地(每六周三次)经皮下使用同一抗原以最多比初次注射低五倍的浓度(取决于免疫应答的性质)来进行加强。继而在每次加强后10天收集血清样本。多克隆抗体随后通过使用相应抗原捕获抗体的亲和层析来从血清中进行回收。这种及其它多克隆抗体的产生过程公开于E.Harlow，et.al.，editors，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)。
不同语法形式的“单克隆抗体”指的是仅含有一类能与特定表位免疫反应的抗体结合位点的抗体分子群体。因此，单克隆抗体典型地显示出对于与其免疫反应的任何表位的单一结合亲和性。所以单克隆抗体可含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，每一位点对不同的抗原决定基是免疫特异的，例如双特异单克隆抗体。
制备单克隆抗体的实验室方法在本领域中是众所周知的(参见，例如Harlow et al.，supra)。单克隆抗体(Mab)可通过将哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、人等针对本发明的肽衍生物包括缀合的肽衍生物进行免疫来制备。经免疫的哺乳动物中的抗体产生细胞被分离并与骨髓瘤细胞或异源骨髓瘤细胞(heteromyeloma)融合产生杂交细胞(杂交瘤)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞被用作所需单克隆抗体的来源。
虽然Mab可由杂交瘤培养产生，本发明并不限制为如此。克隆自杂交瘤的表达性核酸所产生的单克隆抗体的使用也被规划在内。也就是说，可将表达杂交瘤分泌分子的核酸转入另一细胞系以产生转化体。该转化体在基因型上与原始的杂交瘤不同，但也能够产生本发明的抗体分子，包括整体抗体分子的免疫活性片段，相应于杂交瘤所分泌的那些。此外，文献中提供了在基本的免疫反应性抗体片段上产生嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体及类似变异的方法。在公开并要求保护某类和某特异性的抗体的情况下，不管本领域技术人员可构建何种确切的变体结构，所有这些都被认为是在在本发明的范围内。
经修饰的opiorphin肽可结合药学上可接受的载体而配制到药物组合物中。例如，该药物组合物适合于局部、口服，舌下、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉、皮下、经皮、或眼内施用及其它。
以上所述的经修饰的opiorphin肽在疾病或病症的治疗中有用，其中寻求对膜金属外肽酶的活性的调节，更具体而言是对膜锌金属肽酶，如NEP和AP-N。
天然NEP的底物主要是肽激素：脑啡肽，P物质，缓激肽，血管紧张素II及心房利尿钠肽，其在控制中枢及外周疼痛感知，炎症现象，矿物质交换和/或动脉节律(arterial tone)中起关键作用(Roques et al.，Pharmacol Rev.1993；45(1)：87-146)。
更具体而言，中性内肽酶，NEP 24-11在哺乳动物的神经和周围组织中均有分布，并且在外周其在肾脏和胎盘中尤为丰富。在这些组织中，该细胞表面金属肽酶NEP参与神经肽、全身免疫调节肽和肽激素的分泌后处理和代谢。NEP通过控制循环或分泌的调节肽的活性程度来调节其生理受体介导的活动。因此，膜锚定的NEP参与调节以下的活性：有力的血管活性肽，如P物质，缓激肽(BK)，心房利尿钠肽(ANP)和血管紧张素II(AII)；有力的炎症/免疫调节肽，如P物质和BK及fMet-Leu-Phe(fMLP)；有力的阿片样物质神经肽，如Met和Leu-脑啡肽(Enk)以及有力的矿物质交换及体液稳态调节肽，如ANP，C型利尿钠肽(CNP)，和B型利尿钠肽(BNP)。然而这些肽的水平只有在其紧张性(tonically)释放或受刺激而引发释放的区域才通过NEP诱导的形成/降解而改变。
从综合的角度来看，NEP的生物活性是控制肽能信号的活性水平，所述肽能信号涉及动脉压调节、炎症现象、情绪状态和水-矿物质稳态、以及涉及疼痛处理的控制。从临床角度来看，这证实了NEP在各种疾病状态中是重要的药物靶点这一事实。例如，通过抑制NEP和APN，由此提高了中枢或外周的内源性阿片样物质的水平和活动持续时间，可获得镇痛效果或抗镇静剂或精神振奋剂效果。通过使用NEP和/或AP-N抑制剂来更改内源性调节肽浓度的主要优势是，药理学作用只在由天然配体激活的受体位点被诱导，且严重依赖于其在特定环境的、行为的和生理病理的压力情况下所发生的紧张性或刺激诱发性释放(Roques et al，1993)。
哺乳动物膜金属肽的例子除NEP外还有NEP2、ECE(内皮肽转变酶)，尤其是ECE1和ECE2、红细胞表面抗原KELL和与X-连锁低磷酸性佝偻病(X-linked hypophosphatemic rickets)相关联的PEX基因产物、以及AP-N(氨肽酶N)。
NEP2特定地分布于神经系统和生殖组织中。
AP-N是在各种人体器官、组织和细胞类型(内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、白细胞)中普遍存在的酶，且在肾脏和中枢神经系统中尤为丰富。经鉴定的底物包括血管紧张素III(Ang III)；神经肽，包括脑啡肽和内啡肽；和激素，包括胰激肽(kallidan)和促生长素抑制素。AP-N是多功能酶，与肿瘤发生、免疫系统、疼痛、动脉血压调节等相关。AP-N也参与抗原修剪(trimming)和抗原递呈过程。这些功能促使生物活性肽应答的调节(疼痛处理、血管升压素的释放)及影响免疫功能和主要生物学事件(细胞增殖、分泌、侵入、血管生成)由此向多种疾病提供治疗选择。
ECE的抑制在高血压的治疗和动脉粥样硬化的预防和治疗中有着重要应用。
AP-N的抑制协同NEP在疼痛和抑郁、焦虑、镇静和社会-性别情绪病症的治疗中有着重要应用。
相关膜金属肽酶的抑制在肿瘤，即卵巢癌、结直肠癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和黑色素瘤的治疗中有治疗效果，并能降低转移、动脉粥样硬化和/或高血压的发病率。
相关膜金属肽酶的抑制在减轻疼痛中有作用。这种对急性疼痛的抗伤害作用是镇痛作用，但也是对慢性炎症疼痛如关节炎或炎性肠疾病、术后损伤及与癌症和/或癌症治疗相关或不相关的神经严重性疼痛的作用。
此外，细菌或病毒金属肽酶的抑制预期具有抗感染作用。
金属肽酶在病原体宿主组织侵入和免疫及炎症过程中起着重要作用，例如化脓链球菌(Strptococcus pyogenes)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的那些。
此外，细菌金属肽酶，特别是锌金属肽酶在由蛋白水解毒素所导致的疾病中起着重要作用，如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的毒素(炭疽致死因子)和破伤风梭菌(C.tetanum)及肉毒梭菌(C.botulinum)的神经毒素。
其它金属肽酶在各种感染如由HIV导致的感染中起重要作用(FR 2 707169)。
在细菌性或病毒性疾病的治疗中，蛋白酶抑制剂的重要性可见J.Potempa和J.Travis。
金属肽酶的不同作用在Turner et al，2001；Kenny et al，1977；Kenny et al，1987；Beaumont et al，1996中有公开。
本发明的目的之一是提供用经修饰的opiorphin肽的镇痛或抗镇静剂疗法，所述经修饰的opiorphin肽通过在外周、脊柱和/或脊椎上水平抑制NEP和AP-N并从而增加中枢或外周内源性阿片样物质包括脑啡肽的水平和活动持续时间来发挥作用。
规划了疼痛的治疗，特别是急性和慢性疼痛，内脏的炎症性和神经性疼痛。
任何水-矿物质失衡的治疗也是本发明的目的。在目标病症中，可举出由水-矿物质失衡所导致的骨，牙齿，肾脏，甲状旁腺，胰腺，肠，胃粘膜，前列腺和唾液腺的病症。
这些病症特别可以是选自甲状旁腺机能亢进或减退、骨质疏松，胰腺炎，下颌下腺结石，肾结石和骨营养不良。
进一步感兴趣的是受损的人际间和行为上病症的治疗。各种精神病症在WO 02/051434中有描述。
本发明尤其着眼于选自以下所组成的组的任何病症：回避障碍(avoidance disorder)、意识减退症(decreased awareness disorder)、孤独症、注意力缺陷多动症，觉醒障碍(arousal disorder)，入院就医癖，对外界的人际功能和与关系受损、精神分裂样人格障碍(schizoid personality disorder)、精神分裂症，抑郁症(depressive disorder)、对环境兴趣减退、与性相关的社会活动受损、以及性行为受损包括早泄、性亢进和勃起功能障碍。
本发明也涉及根据本发明的肽或肽衍生物作为作为精神振奋剂的用途。相应地是对发作性睡眠、睡眠过度、强迫症(obsessional compulsive troubles)、心境障碍诸如抑郁症或重症抑郁症(major depressive disorder)-重症抑郁症个别发作或重症抑郁症复发、I型或II型双相性精神障碍、情绪恶劣症和循环性情绪障碍的预防和治疗。
其中寻求膜金属肽酶的调节的疾病还包括高血压、动脉粥样硬化、肿瘤，炎性关节炎和肠疾病。
所涵盖的还有感染的治疗。特别是用于治疗细菌性或病毒性疾病的蛋白酶抑制剂的重要性可见J.Potempa和Travis。
以上所述的经修饰的opiorphin肽在控制免疫炎症应答中也有用。
以上所定义的经修饰的opiorphin肽作为排钠利尿剂或利尿剂也有用。
因此，本发明有利地是提供了上述定义的肽衍生物用于治疗选自由以下疾病或病症组成的组：疼痛、抑郁症，性相关的社会活动受损和性行为受损。
本发明的另一目的是以上所述的肽衍生物或核酸在药物滥用特别是在吗啡药物滥用的治疗中作为替代物的用途。
的确，研究表明，对药物滥用的易受损性(vulnerability)和回馈(reward)及药物依赖的发展至少部分地是内源阿片样物质系统中预先存在的或诱导修饰和/或缺陷的结果。在这一点上，使用经修饰的opiorphin肽或核酸来增强内源性脑啡肽的作用将会减少由中断慢性吗啡或海洛因施用而产生的各种副作用(停药的体征(somatic signs of withdrawal))。
可用本发明的肽衍生物治疗的优选疾病或病症包括疼痛、抑郁症、性相关的社会活动受损和性行为受损。
本发明进一步涉及药剂(agent)的使用，所述药剂调节内源性BPLP蛋白或成熟产物，例如天然opiorphin QRFSR，与膜金属肽之间的相互作用来用于治疗性药物组合物的制备，该组合物是用于预防或治疗其中寻求对所述膜金属肽的活性进行调节的疾病。
本发明提供了依其结合BPLP蛋白或QRFSR肽的NEP和/或APN结合位点的能力对化合物进行筛选的体外方法。此过程的细节在2006年9月15日提交的美国申请系列号为10/593,071有描述，其也作为WO 2005/090386公开，以及国际专利申请PCT/EP2009/050567中有描述，其内容援引加入本文。
本发明的另一目的是用于确定经修饰的opiorphin肽相对亲和力的过程，所述经修饰的opiorphin肽特异地结合BPLP蛋白或成熟产物的NEP和/或AP-N结合位点(或是保留BPLP蛋白或其成熟产物的结合特异性或生理活性的肽)，如在2006年9月15日提交的美国申请系列号为10/593,071中所述，其内容援引加入本文。
实施例
实施例1：用于生化测定的方法
对每个测定用特定底物水解的实时监测来进行正式的动力学分析。对每个96孔适应荧光计模型(adapted fluorimetric model)，所有可分析人NEP和人AP-N酶活性的参数都是在的初始速度测量的条件下定义的。
1-人外肽酶hNEP和hAP-N的来源
购自R&D Systems的重组人NEP和重组人AP-N(缺乏它们各自的N-端细胞溶质和跨膜区段)，被用作纯肽的来源。
2-底物和合成抑制剂
在体外的氨基-，羧基二-和内-肽酶的活性是通过测量以下合成选择性底物的分解来测定的：
特异于NEP-内肽酶活性的内部淬灭(quenching)的荧光底物-Abz-dR-G-L-EDDnp FRET-肽，由Thermo-Fisher Scientific(德国)合成。
特异于NEP-羧基二肽酶活性的内部淬灭的荧光底物-Abz-R-G-F-K-DnpOH FRET-肽，由Thermo-Fisher Scientific(德国)合成。
结构上与缓激肽相关的分子内淬灭的荧光肽-Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca-BK2)，其是一个测量NEP和ECE活性的选择性底物，购自R&D System。
FRET是从供体荧光团(Abz＝邻-氨基苯基或Mca＝7-甲氧基香豆素-4-基-乙酰基)到受体荧光团(DnpOH＝2，4-二硝基苯基或EDDnp＝2，4-二硝基苯基乙二胺)的距离依赖性能量转移。
-L-丙氨酸-Mca，Ala-Mca，用于测量氨肽酶活性的荧光底物，购自Sigma。
在存在和缺少不同可用的选择性合成肽酶抑制剂的情况下，用可溶性外肽酶对这些底物水解率的测量可评估每种酶的特异性：-Thiorphan(NEP抑制剂)(Bachem)，-苯丁抑制素(Bestatin)(AP抑制剂)(Calbiochem)。
3-使用适合96孔适应荧光计测定来测量肽酶活性
依照初始速度测量的条件：来对每个测定的时间、pH和温育温度以及酶和底物的浓度进行定义。底物的水解是在存在和缺少所测试的抑制化合物(浓度范围从1到50μM)的情况下，通过实时监测它们由两种肽酶的代谢率来测量。将这些加入到预温育的培养基中。代表缺少酶时所得到的荧光信号的底物自溶的背景率被扣除，来计算以RFU(相对荧光单位)/min表示的初始速度。
用FRET特异的肽底物，Abz-dR-G-L-EDDnp，来测量NEP-内肽酶活性。使用黑色半区(half area)96孔微平板，标准反应由在pH 7的100mM Tris-HCL中的酶(12.5ng)含有200mM NaCl组成(终体积100μl)。在28℃预温育10分钟后加入底物(终浓度15μM)，直接在28℃通过使用荧光计微瓶板读数器(单色器Infinite 200-Tecan单色仪)分别在320nm和420nm的激发和发射波长，对荧光信号(RFU)出峰(appearance)的动力学分析40分钟(2.3min-间隔连续测量)。
在初始速度测量条件下，信号强度直接与反应的20-40分钟时间段形成的代谢物量成比例。因此，在缺少抑制剂时，rhNEP介导的对Abz-dR-G-L-EDDnp的特异内切酶解的初始速度，由线性回归(斜率＝存在载体时NEP的活性/温育时间)计算为8218±2878RFU/min/μg rhNEP，n＝3独立测定。
用FRET特异性肽底物Abz-R-G-F-K-DnpOH来测量NEP-羧基二肽酶的活性。使用黑色半区96孔微平板，标准反应由在pH 6.5的100mM Tris-HCL中的酶(2.5ng)含有50mM NaCl组成(终体积100μl)。在预温育10分钟后加入底物(终浓度4μM)，直接在28℃通过使用荧光计读数器，在320nm激发波长和420nm发射波长，对荧光信号(RFU)出峰的动力学分析40分钟(2.3min间隔连续测量)。在初始速度测量的这些条件下，人NEP介导的对Abz-R-G-F-K-DnpOH的特异水解被评估为59796±18685RFU/min/μgrhNEP，n＝4独立测定。在图5-8中，使用底物Abz-R-G-F-K-DnpOH所测定的NEP羧基二肽酶的活性被称为“NEP-CDP1活性”。
此外，在与后面所述相同的实验条件下，将分子内淬灭荧光肽Mca-BK2(10μM)交由5ng rhNEP水解。在这些条件下，hNEP酶主要作为优选切割A-F键的羧基二肽酶但也作为切割G-F键的内肽酶来作用于Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH。在初始速度测量的条件下，人NEP介导的对Mca-BK2的特异水解被评估为121910±24755RFU/min/μg rhNEP，n＝3独立测定。在图5-8中，使用底物Abz-R-G-F-K-DnpOH所测定的NEP羧基二肽酶的活性被称为“NEP-CDP2活性”。
用底物Ala-Mac测量AP-N外肽酶活性。使用黑色半区96孔微平板，标准反应由在pH 7的100mM Tris-HCL中的酶(4ng)组成。在28℃预温育10分钟后加入Ala-Mac底物(终浓度25μM)，直接在28℃通过使用荧光计读数器，在380nm激发波长和460nm发射波长，对信号出峰的动力学监测40分钟。信号强度直接与反应的10-40分钟时间段所形成的代谢物量成比例。在初始速度测量的这些条件下，人AP-N介导的对Ala-Mac的氨基蛋白水解直接(由斜率：缺少抑制剂时AP-N活性作为温育时间的函数)计算为147042±44657 RFU/min/μg rhAP-N，n＝3独立测定。
其它用来测定NEP羧基二肽酶活性的FRET肽底物在Barros et al.Biol.Chem.，2007，388：447-455中已有描述。
实施例2：生化测定的结果
1-在hNEP和hAP-N上筛选opiorphin肽衍生物
化合物以50μM终浓度做三重测试。
图1-9显示的是用本发明的各种肽衍生物对NEP内肽酶和羧基二肽酶活性及AP-N活性的生化测定结果。
通过使用基于荧光的选择性酶测定：即先前在实验室中开发并验证的基于FRET的酶体外模型(2009年1月18日提交的PCT申请，援引加入本文)，来测试各种opiorphin肽类似物对两种膜锚定的外酶，即NEP(特异性内肽酶和羧基二肽酶活性)和APN的抑制潜能。
对以下化合物作了分析。在以下化合物中，NH2-表示肽的末端氨基而COOH表示肽的末端羧酸。
-NH2-QRFSR-CONH2(Opiorphin)；NH2-QRGPR-COOH；NH2-QHNPR-COOH；
NH2-QR(4溴F)SR-COOH(即QRF(4Br)SR)；NH2-QRFPR-COOH：它们显示出对人AP-N的抑制偏好及对人NEP的弱抑制潜能。
-N-(乙酰)QRFSR-COOH；N-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；N-(生物素-C6-聚乙烯)QRFSR-COOH：它们显示出对人AP-N和NEP的弱抑制潜能，具有对NEP内肽酶活性的偏好。
-NH2-dRdSdFdRdQ-COOH(逆反转D-对映异构体)：它没有显示出具有AP-N活性偏好的对人AP-N和NEP的显著抑制活性。
-NH2-YQRFSR-COOH；NH2-Y-(C6-聚乙烯)QRFSR-COOH；NH2-Y-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH：它们显示出对人NEP内肽酶活性的抑制偏好尤其是Y-(C12-聚乙烯)QRFSR。
-NH2-QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；NH2-CQRFSR-COOH：它们是人NEP(特异性内肽酶和羧基二肽酶)及AP-N的有力双重抑制剂。
其它经修饰的opiorphin肽有：
NH2-CQRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH；
NH2-CQRF[S-O-C12-聚乙烯]R-COOH
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFSR-COOH；
NH2-C-(C12-聚乙烯)QRFSR-COOH
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH
NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯]R-COOH
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[β3R]-COOH
NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH
NH2-C-(C8-聚乙烯)QRFS[dR]
NH2-[dC]QRF[S-O-C8-聚乙烯][dR]-COOH
NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-聚乙烯][β3R]-COOH
[CQRFSR]2作为通过二硫键的半胱氨酸二肽。
2-选择的opiorphin肽衍生物对hNEP和hAP-N的浓度依赖性抑制
CQRFSR-COOH肽(图9和18)
CQRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.97，n＝18个测定点，IC50为7±3μM。
CQRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50为6±1μM。
CQRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝30个测定点，IC50为0.8±0.1μM。
CQRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca-BK2)切割：r2＝0.99，n＝16个测定点，IC50为17±2μM。
因此，通过与半胱氨酸氨基酸(硫醇官能团是强的Zn螯合基团)形成酰胺键来对NH2-QRFSR肽的N末端位置进行的修饰导致了化合物(CQRFSR肽)，其显示出加强了的对hAP-N(与QRFSR天然肽相比强10倍)和hNEP(5倍)的抑制潜能。
QRF[S-O-辛酰基]R肽(图10)
QRF[S-O-C8]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.98，n＝18个测定点，IC50为2.8±0.2μM。
QRF[S-O-C8]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50为12±5μM。
QRF[S-O-C8]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝20个测定点，IC50为10±1μM。
QRF[S-O-C8]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca-BK2)切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50为14±4μM。
Y-[氨基-十二烷-酸间隔区]-QRFSR肽(图11和19)
Y(PE12)QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.98，n＝18个测定点，IC50为10±1μM。
Y(PE12)QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50为24±2μM。
Y(PE12)QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝20个测定点，IC50为122±20μM。
Y(PE12)QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca-BK2)切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50为31±2μM。
所以，证实了Y-(C12-聚乙烯)QRFSR对人NEP内肽酶活性的抑制偏好。
C[PE6]QRFSR肽(PE6＝氨基己酸)(图20)
C[PE6]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.98，n＝18个测定点，IC50为40±5μM。
C[PE6]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50约为217。
C[PE6]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝20个测定点，IC50为0.8±0.1μM。
C[PE6]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-肽(Mca-BK2)切割：r2＝0.99，n＝18个测定点，IC50约为227μM。
C-[氨基-十二烷-酸间隔区]-QRFSR肽(图21)
C[PE12]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.96，n＝24个测定点，IC50为5.7±0.5μM。
C[PE12]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.97，n＝30个测定点，IC50为19±2μM。
C[PE12]QRFSR-COOH肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.98，n＝27个测定点，IC50为0.8±0.1μM。
C-[氨基己-酸间隔区]-QRFS[O-辛酰基]R肽(图22)
C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.99，n＝27个测定点，IC50为759±56nM。
C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝27个测定点，IC50为848±58nM。
C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝24个测定点，IC50为1.7±0.1μM。
在生物学相关的体外测定中，使用P物质生理NEP底物和人细胞膜作为hNEP的来源，C[PE6]QRF[S-O-辛酰基]R衍生肽以浓度依赖性的方式阻止由膜结合的hNEP内肽酶活性介导的P物质切割：r2＝0.95，n＝13个测定点，IC50为1.6±0.4μM(比同一测试中的opiorphin天然肽，抑制潜能至少增加了5倍)(图23)。
[CQRFSR]二肽([CQRFSR]2)
[CQRFSR]二肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP内肽酶活性介导的Abz-dR-G-L-EDDnp切割：r2＝0.87，n＝24个测定点，IC50为1.4±0.5μM。
[CQRFSR]二肽以浓度依赖性的方式阻止由rhNEP活性介导的Abz-R-G-F-K-DnpOH切割：r2＝0.99，n＝27个测定点，IC50为3.3±0.2μM。
[CQRFSR]二肽以浓度依赖性的方式阻止由rhAP-N活性介导的Ala-AMC切割：r2＝0.99，n＝24个测定点，IC50为0.8±0.1μM。
表1：各种肽和肽衍生物对NEP和AP-N活性的IC50值的总结
数据一起显示了NH2-QRFSR肽的N-末端α氨基基团对于opiorphin对人AP-N抑制潜能的重要性。
的确，比起opiorphin-QRFSR天然肽，其乙酰化(Ac-QRFSR)或环化(pGlu-RFSR)，其辛酰化(C8-QRFSR)或生物素化(生物素-C6)QRFSR)，导致的化合物对hAP-N显示出弱抑制潜能。
然而，比起opiorphin-QRFSR天然肽，pGlu-RFSR和C8-QRFSR这两个化合物对人hNEP显示出即便不是更好也至少是相同的抑制潜能。
这些数据进一步表明了，与opiorphin(QRFSR)天然肽相比，QRFSR-COOH肽的自由羧基末端在其对hNEP，特别是对NEP羧基二肽酶活性的抑制潜能中的重要性，酰胺化(QRFSR-CONH2)导致的化合物对hNEP活性显示出弱抑制潜能。
QRFSR肽的Phe残基对于opiorphin对hNEP和hAP-N肽酶活性的抑制效n能很重要。的确，与opiorphin(QRFSR)天然肽相比，用Tyr残基取代Phe(QRYSR)导致的化合物对hAP-N显示出降低6倍的抑制潜能，以及对人NEP抑制潜能的轻微减小。
然而，有趣的是，用4-氟-Phe残基取代Phe(QR[4F]FSR)导致的化合物与opiorphin-QRFSR天然肽相比，对hNEP显示出仅降低2倍的抑制潜能，和对hAP-N等同的抑制潜能。相反，用(4溴-Phe)残基取代Phe(QR[4Br]FSR)导致的化合物对人NEP显示出弱抑制潜能。
对QRFSR肽的RFS中心残基的修饰影响opiorphin对hNEP的抑制潜能，因为与opiorphin-QRFSR天然肽相比，化合物QRGPR、QHNPR和QRFPR对人AP-N显示出等同的抑制效能，以及对人NEP显示出弱抑制潜能。
该结果进一步表明QRFSR肽位置2的精氨酸残基的胍离子对于opiorphin对hAPN抑制潜能的重要性。与opiorphin-QRFSR天然肽相比，用ε-氨基的Lys残基取代Arg2(QKFSR)导致的化合物对hAP-N显示出降低超过10倍的抑制潜能以及对人NEP抑制潜能的轻微减小。
类似地，QRDSR肽位置5的Arg的胍离子对于opiorphin对hAPN的抑制潜能很重要，与opiorphin-QRFSR天然肽相比，用ε-氨基的Lys残基取代Arg5(QRFSK)导致的化合物对hAP-N显示出降低10倍的抑制潜能以及对人NEP等同的抑制潜能。
有趣的是，用辛酸对QRFSR肽丝氨酸残基的羟基进行酯化(QRF[辛酰基丝氨酸]R)导致的化合物与opiorphin-QRFSR天然肽相比，对hAP-N显示出等同的抑制潜能，以及增强了的对hNEP内肽酶和羧基二肽酶活性的抑制潜能(比opiorphin天然肽至少多10倍的抑制潜能)(参见图19)。
实施例3：会在体内潜在地展现出优于天然肽的生物利用率特性的有力的生物活性opiorphin肽模拟物的体外鉴定。
1.生物吸附中的可能增益(gain)：跨膜转运(上皮和上皮内(endo-epithelial)细胞膜通道(passage))
通过化学疏水部分(如聚乙烯C6，C8，C10或C12间隙的)的添加而对 Opiorphin肽的修饰，会增加其对膜的生物学体内吸附潜能。在经测试的所有化合物中，NH2-QRF[S-O-辛酰基]R-COOH-NH2-Y(PE12)QRFSR-COOH(PE＝[CH2]n；PE12＝氨基十二烷-酸)表现为对人NEP(特异性内肽酶和羧基二肽酶活性)和AP-N活性的有力的双重抑制剂。
2.代谢稳定性的潜在增益：半胱氨酸-二肽：[CQRFSR]2
[CQRFR]二肽与CQRFSR单体肽相比显示出对hNEP内肽酶和羧基二肽酶活性至少增加2倍的抑制潜能。该二肽序列应可以保护衍生化合物以防循环氨肽酶的降解。
显然，本发明中的众多修饰与变更在以上的指引下是可行的。因此可理解为，在所附的权利要求书的范围内，也可在本文具体的描述之外实行本发明。
Claims (20)
1.结构式(I)的肽衍生物：
ζ-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-OH (I)，
其中：
-ζ是氢原子，酪氨酸，Y-[接头]-或Zn螯合基团，诸如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选经取代的羟基喹啉，
-AA1是Q或Glp，
-AA2是K、R或H，优选R，
-AA3是Y、G、N、F或F(X)，优选F或F(X)，
-AA4是P、S或S(OAlk)，优选S或S(OAlk)，
-AA5是K或R，优选R，
-C-[接头]-意指Cys-[NH-(CH2)n-CO]-，其中n是1-20间的整数，
-Y-[接头]-意指Tyr-[H-(CH2)n’-CO]-，其中n’是1-20间的整数，
-F(X)意指苯丙氨酸，其苯基被一个或多个卤素原子取代，
-S(OAlk)意指丝氨酸，其羟基被线状或分枝的具有1到20个碳原子的烷基取代，
-所述AA1、AA2、AA3、AA4和AA5可独立地是L构型或D构型，并且AA1、AA2、AA3、AA4，和AA5中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是该肽不是QRFSR、QHNPR、QRGPR、YQRFSR或GlpRFSR。
2.结构式(II)的根据权利要求1的肽衍生物：
ζa-Q-AAa 2-AAa 3-P-R-OH(II)
其中：
-ζa是氢原子，或Zn螯合基团，诸如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选经取代的羟基喹啉，
-AAa 2是R或H，优选R，
-AAa 3是G、N、F或F(X)，优选F，
-C-[接头]-、F(X)和S(OAlk)如权利要求1所定义，
-所述Q、AA2、AA3、P和R可独立地是L构型或D构型，并且Q、AA2、AA3、P和R中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
其中，如果肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是该肽不是QHNPR或QRGPR。
3.结构式(III)的根据权利要求1的肽衍生物：
ζn-AA1-AAn 2-AAn 3-AAn 4-AAn 5-OH(III)，
其中，
-ζn是氢原子、酪氨酸或Y-[接头]-，
-AA1是Q或Glp，优选Q，
-AAn 2是K或R，优选R，
-AAn 3是Y、F或F(X)，优选F或F(X)，
-AAn 4是S或S(OAlk)，
-AAn 5是K或R，优选R，
-Y-[接头]-、F(X)和S(OAlk)如权利要求1所定义，
-上述AA1、AA2、AA3、AA4和AA5可独立地是L构型或D构型，并且AA1、AA2、AA3、AA4和AA5中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；
前提是此肽不是QRFSR、QHNPR、YQRFSR或GlpRFSR。
4.结构式(IV)的根据权利要求1的肽衍生物：
ζm-Q-R-AAm 3-AAm 4-R-OH (IV)，
其中，
-ζm是氢原子，或Zn螯合基团，诸如半胱氨酸，C-[接头]-，N-乙酰-半胱氨酸，N-巯基乙酰(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(HO-NH-CO-)或任选经取代的羟基喹啉，
-AAm 3是F或F(X)，优选F(X)，
-AAm 4是S或S(OAlk)，优选S或S(OAlk)，
-C-[接头]-、F(X)和S(OAlk)如权利要求1所定义，
-所述Q、R、AA3、AA4和R可独立地是L构型或D构型，并且Q、R、AA3，
AA4和R中的任意一个可任选为β氨基酸、氮杂氨基酸或β-氮杂氨基酸；其中，如果该肽衍生物包含半胱氨酸，那么所述肽衍生物任选是二聚体，前提是此肽不是QRFSR或YQRFSR。
5.权利要求1的肽衍生物，其是：
QRFSR-NH2；
QR-F[4Br]-SR，其中-F[4Br]-是苯丙氨酸，其苯基在对位被溴原子取代；
QRFPR；
(乙酰)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR；
生物素-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
dR-dS-dF-dR-dQ；
Y-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
Y-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR；
QRF-S(O-辛酰基)-R；
CQRFSR；
CQRF-S(O-辛酰基)-R；
CQRF-S(O-月桂基)-R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；
[Cβ2]QRF-S(O-辛酰基)-R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[β3R]；
C-[dQ]-RF-S(O-辛酰基)-[dR]；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]；
[dC]-QRF-S(O-辛酰基)-[dR]；
[Cβ2]-QRF-S(O-辛酰基)-[β3R]；
[CQRFSR]2；
QRYSR；
QR-F[4F]-SR，其中-F[4F]-是苯丙氨酸，其苯基在对位被氟原子取代；
QR-F[4Br]-SR，其中-F[4Br]-是苯丙氨酸，其苯基在对位被溴原子取代；
QKFSR；
QRFSK；
C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR；
C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-R；
C(-HN-(CH2)12-CO-)QRF-S(O-辛酰基)-R；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFS-dR；
C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-β3R；
C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-辛酰基)-β3R；
其中：
Cβ2是H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-；
β3R是-NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH)(NH2)]-COOH；
-S(-O-辛酰基)意指丝氨酸，其羟基被辛酰基取代，
-S(-O-月桂基)意指丝氨酸，其羟基被月桂基取代。
6.权利要求1到5任一项的肽衍生物，其具有对中性内肽酶NEP和/或氨肽酶AP-N的抑制潜能。
7.权利要求2的肽衍生物，其具有对人AP-N的抑制潜能。
8.权利要求3的肽衍生物，其具有对人NEP的抑制潜能。
9.权利要求4的肽衍生物，其是中性内肽酶NEP和氨肽酶AP-N的双重抑制剂。
10.一种组合物，包含至少一种权利要求1到9任一项的肽衍生物和药学上可接受的载体。
11.一种对需要治疗的对象的疾病或病症进行治疗的方法，其中寻求对膜金属外肽酶活性的调节，该方法包含以一定剂量向该对象施用权利要求1到9中任一项的一种或多种肽衍生物以治疗所述疾病或病症。
12.权利要求11的方法，其中所述膜金属外肽酶是膜锌金属肽酶。
13.权利要求11或12的方法，其中所述膜金属外肽酶是NEP和/或AP-N。
14.权利要求11到13任一项的方法，用于治疗选自以下所组成的组的疾病或病症：疼痛、抑郁症、与性相关的社会活动受损和性行为受损。
15.权利要求1到9任一项所定义的肽衍生物，用于其中寻求膜金属外肽酶活性调节的疾病或病症的治疗。
16.权利要求15的肽衍生物，其中所述膜金属外肽酶是膜锌金属肽酶。
17.权利要求15或16的肽衍生物，其中所述膜金属外肽酶是NEP和/或AP-N。
18.权利要求15到17任一项的肽衍生物，用于治疗选自以下所组成的组的疾病或病症：疼痛、抑郁症、与性相关的社会活动受损和性行为受损。
19.一种核酸，其包含编码权利要求1到9任一项的肽衍生物的序列，其中所述肽衍生物由天然氨基酸组成。
20.一种针对权利要求1到9任一项所定义的肽衍生物的抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110601 |