BRPI0906905B1 - Derivados de peptídeo, composição e uso de um derivado de peptídeo - Google Patents

Abstract

DERIVADO DE PEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO, ANTICORPO E USO DE UM DERIVADO DE PEPTÍDEO. A presente invenção trata de peptídeos opiorfínicos modificados, como novos inibidores de metalo-ectopeptidases.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório US 61/042,922 que foi depositado em 7 de abril de 2008, e que está incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção trata de peptídeos opiorfínicos modificados como novos inibidores de metalo-ectopeptidases.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] As ectopeptidases de metal de zinco controlam a atividade receptor dependente de mediadores neurais e hormonais envolvidos na regulação de funções fisiológicas importantes nos mamíferos. Elas estão localizadas na superfície de células em tecidos nervosos e sistêmicos e catalisam os processamentos pós-secretórios ou metabolismo de neuropeptídeos e peptídeos regulatórios (Roques, BP, Noble, F, Dauge, V, Fournie-Zaluski, MC & Beaumont, A. (1993) Pharmacol Rev 45, 87-146. Turner, AJ, Isaac, RE & Coates, D. (2001) BioEssays 23, 261-269).

[004] Importantes entre esses sinais de peptídeos neuronais e/ou hormonais são a substância P (SP) e as encefalinas, que estão envolvidas na modulação receptor-dependente de respostas adaptativas comportamentais a estímulos ambientais estressas ou ameaçadores. Eles regulam em particular o processamento espinhal de informação nociceptiva e mecanismos analgésicos, respostas emocionais e/ou motivacionais, ansiedade, agressão, e fenômenos inflamatórios neuroimunes (Dickenson, AH. (1995) Br J Anaesth 75, 193-200. Sora, I, Takahashi, N, Funada, M, Ujike, H, Revay, RS, Donovan, DM, Miner, LL & Uhl, GR. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 1544-1549; Konig, M, Zimmer, AM, Steiner, H, Holmes, PV, Crawley, JN, Brownstein, MJ & Zimmer, A. (1996) Nature 383, 535-538; Filliol, D, Ghozland, S, Chluba, J, Martin, M, Matthes, HW, Simonin, F, Befort, K, Gaveriaux-Ruff, C, Dierich, A & LeMeur, M, et al. (2000) Nat Genet 25, 195-200).

[005] Devido à importância fisiológica e o papel crítico das zinco- ectopeptidases na modulação da potência funcional dos sinais neuronais e hormonais a jusante, é essencial dirigir o foco para aquilo que controla sua atividade e, consequentemente, a cascata regulatória total. A verificação dos reguladores da atividade ectopeptidase a montante também desperta entusiasmo dos pontos de vista fisiopatológico e terapêutico devido ao potencial para o desenvolvimento de novos candidatos a drogas.

[006] Um heptapeptídeo específico para o cérebro denominado espinorfina (spinorphin) foi isolado e caracterizado a partir da medula espinhal de bovinos com base em sua atividade inibitória sobre as ectoenzimas que degradam encefalinas, tais como a endopeptidase neutra (NEP; EC 3.4.24.11 [EC]) e a aminopeptidase N (AP-N; EC 3.4.11.2 [EC]) (Nishimura, K & Hazato, T. (1993) Biochem Biophys Res Commun 194, 713-719; Yamamoto, Y, Ono, H, Ueda, A, Shimamura, M, Nishimura, K & Hazato, T. (2002) Curr Proteína Pept Sci 3, 587-599). Além disso, caracterizamos a sialorfina em ratos, um mediador peptídico envolvido na adaptação as mudançasambientais em ratos. A sialorfina em ratos é um sinal peptídico endócrino cuja expressão é ativada por regulação androgênica e cuja secreçãoé estimulada sob resposta adrenérgica mediada ao estresse ambiental em ratos machos. Ela é um inibidor fisiológico da atividade NEP do rato ancorada na membrana e é um inibidor potente da sensação de dor em ratos (Rougeot, C, Rosinski-Chupin, I, Njamkepo, E & Rougeon, F. (1994) Eur J Biochem 219, 765-773; Rougeot, C, Vienet, R, Cardona, A, Le Doledec, L, Grognet, JM & Rougeon, F. (1997) Am J Physiol 273, R1309-R1320.; Rougeot, C, Rosinski-Chupin, I & Rougeon, F. (1998) in Biomedical Reviews eds. Chaldakov, GN & Mathison, R. (Bulgarian-American Center, Varna, Bulgaria,) Vol 9, pp. 17-32; Rosinski-Chupin, I, Huaulme, JF, Rougeot, C & Rougeon, F. (2001) Endocrinology 142, 4550-4559; Rougeot, C, Messaoudi, M, Hermitte, V, Rigault, AG, Blisnick, T, Dugave, C, Desor, D & Rougeon, F. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 8549-8554).

[007] Demonstramos anteriormente que o peptídeo nativo da Opiorfina humana (QRFSR-peptide), o primeiro caracterizado em humanos até hoje, é um eficiente inibidor duplo de duas ectopeptidases que inativam as encefalinas, a endopeptidase neutra NEP (EC 3.4.24.11) e aminopeptidase AP- N (EC 3.4.11.2) (Wisner et al. Proc Natl Acad Sci USA, Nov. 2006, 103(47): 17979-84).

[008] Derivados de peptídeos de opiorfina foram descritos anteriormente, ver, por exemplo, Wisner et al. Proc Natl Acad Sci USA, Nov. 2006, 103(47): 17979-84 e tem a sequência peptídica básica como QRFSR.

[009] Assim, essa sequência e a sequência definida pela fórmula a seguir pode ser modificada: X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg, em que X1 representa um átomo de H ou um aminoácido Tyr, X2 representa Gln ou Glp quando X1 for H, ou X2 representa Gln quando X1 for Tyr ou Cys. Prefere-se QRFSR, YQRFSR, e/ou CQRFSR com QRFSR mais preferencialmente ainda. Deve-se entender que Glp é piroglutamato, Tyr ou Y é Tirosina, Gln ou Q é glutamina, Arg ou R é Arginina, Phe ou F é Fenilalanina, Ser ou S é Serina, e Cys ou C para Cisteína. Esses peptídeos foram descritos no pedido de patente internacional publicado como WO2005090386.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[010] A presente invenção propõe novos derivados de Opiorfina e caracterização funcional in vitro usando ensaios bioquímicos altamente seletivos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[011] As Figuras 1-4 referem-se à cinética de hidrólise dos substratos de peptídeos FRET-correspondentes por recombinante hNEP ou hAP-N na presença de veículo ou na presença de 50 μM de análogos de peptídeo QRFSR-. Cada ponto representa a intensidade do sinal expressa em RFU (Unidade de Fluorescência Relativa), que foi proporcional à quantidade de metabolitos formados, como função do tempo de reação (min).

[012] Figura 5: inibição por análogos de peptídeo QRFSR da hidrólise dos substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada barra representa a porcentagem de substrato intacto recuperado e calculado como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade em presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na ausência ou na presença de 50 μM de análogos de peptídeo QRFSR.

[013] Figura 6: substratos por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada barra representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de 50 μM análogos de peptídeo QRFSR.

[014] Figuras 7-8: inibição por Análogos de peptídeo QRFSR da hidrólise dos substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada barra representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de 50 μM análogos de peptídeo QRFSR.

[015] Figura 9: inibição dependente de concentração por Peptídeo CQRFSR da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo CRFSR plotados em μM (escala log).

[016] Figura 10: inibição dependente de concentração por QRFS[O-peptídeo octanoil]R da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo QRFS[O-octanoil]R plotados em μM (escala log).

[017] Figura 11: Inibição dependente de concentração por peptídeo Y(PE12)QRFSR (i.e. Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR) da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo Y(PE12)QRFSR - plotados em Log μM.

[018] Figuras 12-17: Cinética da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante hNEP ou hAP-N na presença de veículo ou na presença de 1 to 50 μM de análogos de peptídeo de Opiorfinas CQRFSR ou CQRFS[O-octanoil]R. Cada ponto representa a intensidade do sinal expressa em RFU (Unidade de Fluorescência Relativa), que foi proporcional à quantidade de metabólitos formados, como função do tempo de reação (min).

[019] Figura 18: Inibição dependente de concentração por Peptídeo CQRFSR da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo CRFSR plotados em μM (escala log).

[020] Figura 19: Inibição dependente de concentração por um peptídeo Y[PE12]QRFSR-COOH (i.e. Y-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR) da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo Y(PE12)QRFSR- COOH plotados em μM (escala log).

[021] Figura 20: Inibição dependente de concentração por um peptídeo C[PE6]QRFSR-COOH (i.e. C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR) da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo C[PE6]QRFSR- COOH plotados em μM (escala log).

[022] Figura 21: Inibição dependente de concentração por um peptídeo C(PE12)QRFSR-COOH (i.e. C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR) da hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo C(PE12)QRFSR-COOH plotados em μM (escala log).

[023] Figura 22: Inibição dependente de concentração por peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R (i.e. C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O- octanoil)-R) de hidrólise de substratos de peptídeos FRET correspondentes por recombinante humano puro hNEP ou AP-N. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R plotado em μM (escala log).

[024] Figura 23: Inibição dependente de concentração por peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R (i.e. C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O- octanoil)-R) da hidrólise do substrato NEP fisiológico da substância P por NEP humano ligado à membrana expresso por células epiteliais LNCaP em cultura. Cada ponto representa a percentagem de substrato intacto recuperado e calculada como: porcentagem de velocidade sem inibidor - velocidade na presença de inibidor / velocidade sem inibidor, que foi medida na presença ou na presença de várias concentrações de peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R - plotados em nM (escala log).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[025] A presente invenção propõe aqui versões modificadas desses peptídeos cada um ou combinações de resíduos de aminoácidos que compõem o peptídeo de opiorfinas são modificados por um ou mais grupos funcionais.

[026] Como exemplos não limitativos de tais peptídeos de opiorfinas modificados podem ser citados: NH2-QRFSR-CONH2; NH2-QRGPR-COOH; NH2-QHNPR-COOH; NH2-QR(4BromoF)SR-COOH (i.e. NH2-QR-F[4Br]-SR-COOH, em que -F[4Br]- é uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído na posição para por um átomo de bromo de modo que -F[4Br]- a seguinte fórmula:

N-(Acetil)QRFSR-COOH; N-(C8-polietileno)QRFSR-COOH; N-(biotina-C6)QRFSR-COOH; NH2-dRdSdFdRdQ-COOH (retroinversão D-enatiômero); NH2-YQRFSR-COOH; NH2-Y-(C6-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-Y-(C12-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-CQRFSR-COOH; NH2-CQRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-CQRF[S-O-C12-polietileno]R-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-C-(C12-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFS[β3R]-COOH; NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-polietileno][dR]-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFS[dR]; NH2-[dC]QRF[S-O-C8-polietileno][dR]-COOH; NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-polietileno][β3R]-COOH; [CQRFSR]2 como dipeptídeo cistina través de ligação dissulfeto; Glp-RFSR-COOH; NH2-QRYSR-COOH; NH2-QRF[4F]SR-COOH, em que -F[4F]- é uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído na posição para por um átomo de flúor de modo que - F[4F]- possui a seguinte fórmula:

NH2-QKFSR-COOH; NH2-QRFSK-COOH; NH2-C-(C6-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-C-(C6-polietileno)-QRFS[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-C-(C12-polietileno)QRFS[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-C[PE12]QRFS-dR-COOH; NH2-C-(C12-polietileno)-QRFS[S-O-C8-polietileno]-β3R-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)-QRFS[S-O-C8-polietileno]-β3R-COOH, em que Cβ2 substitui um resíduo de Cisteína natural por β2-cisteina incorporando um resíduo metileno adjacente a Cα carbono próximo do grupo α carbonila da Cisteína (H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-); β3R substitui um resíduo de Arginina natural por β3-Arginina incorporando um resíduo metileno adjacente a Cα carbono próximo do grupo α amina da Arginina (-NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH)(NH2)]-COOH); [S-O-C8-polietileno] e [S-O-octanoil] indica a serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo octanoíla; [S-O-C12-polietileno] indica uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo dodecanoíla; C6, C8 ou C12 - polietileno corresponde ao espaçador de 6, 8 ou 12 carbonos do etileno ((-HN-(CH2)6-CO-, -HN-(CH2)8-CO-) e (-HN-(CH2)12-CO- ), respectivamente).

[027] Nos peptídeos acima, NH2- representa a amina terminal do peptídeo e COOH o ácido carboxílico terminal (-CO-NH2 quando a função terminal for uma amida). A lista acima também pode ser lida como: QRFSR-NH2; QRGPR; QHNPR; (Acetil)QRFSR; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR; biotina-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR; dR-dS-dF-dR-dQ; YQRFSR; Y -(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR; Y -(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR; QRF-S(O-octanoil)-R; CQRFSR; CQRF-S(O-octanoil)-R; CQRF-S(O-dodecanoil)-R; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFSR; C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-octanoil)-R; [Cβ2]QRF-S(O-octanoil)-R; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[β3R]; C-[dQ]-RF-S(O-octanoil)-[dR]; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]; [dC]-QRF-S(O-octanoil)-[dR]; [Cβ2]-QRF-S(O-octanoil)-[β3R]; [CQRFSR]2; Glp-RFSR; QRYSR; QR-F[4F]-SR, em que -F[4F]- é uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído na posição para por um átomo de flúor; QR-F[4Br]-SR, em que -F[4Br]- é uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído na posição para por um átomo de bromo; QKFSR; QRFSK; C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR; C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRF-S(O-octanoil)-R; C(-HN-(CH2)12-CO-)QRF-S(O-octanoil)-R; C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFS-dR; C-(-HN-(CH2)i2-CO-)-QRF-S(O-octanoil)-β3R; C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-octanoil) β3R, em que: Cβ2 é H2N(-CH2-SH)-CH2-CO-; β3R é -NH-CH2-C[-(CH2)3-NH-C(NH)(NH2)]-COOH; Y S(-O-octanoil) significa uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo octanoíla; -S(-O-dodecanoil) significa uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo dodecanoíla. As definições a seguir são utilizadas em todo o presente pedido.

[028] Um "peptídeo" é uma molécula composta de um arranjo linear de resíduos de aminoácidos unidos entre si no arranjo linear por ligações peptídicas. Esse arranjo linear pode opcionalmente ser cíclico, i.e., as extremidades do peptídeo linear ou das cadeias laterais de aminoácidos no peptídeo podem estar unidas, e.g., por uma ligação química. Esses peptídeos podem ainda compreender estruturas secundárias, terciárias ou quaternárias, bem como associações intermoleculares com outros peptídeos ou outras moléculas não peptídicas. Essas associações intermoleculares podem ser, sem limitação, através de ligação covalente (por exemplo, através de ligações dissulfeto), ou através de quelação, interações eletrostáticas, interações hidrófobas, ligação hidrogênio, interações íon dipolares, dipolares dipolares interações, ou qualquer combinação acima.

[029] Qualquer aminoácido dos peptídeos a seguir pode estar seja na Configuração-L ou na configuração-D. Em particular, o peptídeo inteiro pode estar na configuração L ou D. A cadeia de hidrocarbonetos pode opcionalmente conter mais um grupo metileno em comparação com o aminoácido natural, de modo que os aminoácidos podem também ser p-aminoácidos, mais precisamente β2 ou β3 aminoácidos. Por exemplo, R podem um dos seguintes aminoácidos: lR (i.e. L-Arg), dR (i.e. D-Arg), β 3R ou β 2R. Qualquer aminoácido dos seguintes peptídeos podem também ser um aza-aminoácido ou um β-aza- aminoácido.

[030] “F(X)” significa uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído por um ou mais átomos de halogênio, de preferência flúor, e o F(X) possui uma das seguintes fórmulas:

[031] “S(OAlk)” significa uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo alquila linear ou ramificado que possui de 1 a 20 átomos de carbono (i.e. “Alk”), de preferência uma octanoíla ou por um grupo dodecanoíla. No presente pedido, S(O-C8-polietileno) ou S(O-C8) significa uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo octanoíla.

[032] “C-[ligante]-” significa Cys-[NH-(CH2)n-CO]-, em que n é um inteiro entre 1 e 20, de preferência entre 4 e 15, 6, 8 ou 12 sendo particularmente preferidos. No presente pedido, “C-(C6-polietileno)” ou “C[PE6]” significa Cys- [NH-(CH2)6-CO]-; “C-(C8-polietileno)” ou “C[PE8]” significa Cys-[NH-(CH2)8-CO]- ; e “C-(C12-polietileno)” ou “C[PE12]” significa Cys-[NH-(CH2)12-CO]-.

[033] “Y-[ligante]-” significa Tyr-[NH-(CH2)n’-CO]-, em que n’ é um inteiro entre 1 e 20, de preferência entre 4 e 15, 6, 8 ou 12 sendo particularmente preferidos. No presente pedido, “Y-(C6-polietileno)” ou “Y[PE6]” significa Tyr- [NH-(CH2)6-CO]-; “Y-(C8-polietileno)” ou “Y[PE8]” significa Tyr-[NH-(CH2)8-CO]-; e “Y-(C12-polietileno)” ou “Y[PE12]” significa Tyr-[NH-(CH2)12-CO]-.

[034] A “potência inibidora” de um derivado de peptídeo da presente invenção em relação a uma peptidase particular pode ser prontamente avaliada pelo técnico no assunto, isto é, medindo os valores Ki ou os valores IC50. Em particular, quando valores IC50 são determinados, as potências inibidoras relativas de dois peptídeos de opiorfinas modificados podem ser comparadas medindo o valor IC50 de cada peptídeo de opiorfinas modificado em relação a uma peptidase dada, condições experimentais determinadas (mesmo tampão, mesas concentrações de peptidase e substrato), e comparando os ditos valores IC50 dos peptídeos de opiorfinas modificados com o valor IC50 das opiorfinas nas mesmas condições experimentais.

[035] A presente invenção trata de um derivado de peptídeo de fórmula (I):

em que: - Z é um átomo de hidrogênio, tirosina, Y-[ligante]- ou um grupo quelante de Zn, tal como cisteína, C-[ligante]-, N-acetil-cisteína, N- mercaptoacetil (HS-CH2-CO-), ácido hidroxâmico (HO-NH-CO-) ou uma hidroxiquinolina opcionalmente substituída, - AA1 é Q ou Glp, - AA2 é K, R ou H, de preferência R, - AA3 é Y, G, N, F ou F(X), de preferência F ou F(X), - AA4 é P, S ou S(OAlk), de preferência S ou S(OAlk), - AA5 é K ou R, de preferência R, - C-[ligante]- significando Cys-[NH-(CH2)n-CO]-, em que n é um número inteiro entre 1 e 20, e n é de preferência 6, 8 ou 12, - Y-[ligante]- significando Tyr-[NH-(CH2)n’-CO]-, em que n’ é um inteiro entre 1 e 20, e n’ é de preferência 6, 8 ou 12, - F(X) significando uma fenilalanina, cujo grupo fenila é substituído por um ou mais átomos de halogênio, - S(OAlk) significando uma serina, cujo grupo hidroxila é substituído por um grupo alquila linear ou ramificado que possui de 1 a 20 átomos de carbono, - ditos AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 podem estar independentemente na Configuração-L ou na configuração-D, e qualquer um entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 pode ser opcionalmente um p-aminoácido, um aza-aminoácido ou β- aza-aminoácido; em que se o derivado de peptídeo compreender uma cisteína, dito derivado de peptídeo é opcionalmente um dímero, desde que o peptídeo não seja QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR ou GlpRFSR.

[036] Em geral, no derivado de peptídeos de acordo com a presente invenção, AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 estão independentemente na Configuração-L ou na configuração-D, qualquer um entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 é opcionalmente um p-aminoácido, um aza-aminoácido ou um β-aza- aminoácido.

[037] Em um modo de realização, pelo menos um entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 é um β-aminoácido. Em outro modo de realização, todos entre AAi, AA2, AA3, AA4, e AA5 são β-aminoácidos.

[038] Em um modo de realização, pelo menos um entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 é um aza-aminoácido. Em outro modo de realização, todos entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 são um aza-aminoácido.

[039] Em um modo de realização, pelo menos um entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 é um β-aza-aminoácido. Em outro modo de realização, todos entre AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 são β-aza-aminoácido.

[040] Em um modo de realização, o derivado de peptídeo compreende uma cisteína e é um dímero em que dois átomos de enxofre de duas cisteínas estão unidos com duas ligações dissulfeto. Por exemplo, [CQRFSR]2 é o dímero do derivado de peptídeo CQRFSR, cujos aminoácidos de cisteína estão ligados com uma ligação dissulfeto.

[041] Em um modo preferido de realização, quando Z for uma hidroxiquinolina, o derivado de peptídeo possui a seguinte fórmula:

[042] Os derivados de peptídeos de fórmula (I) são peptídeos de opiorfinas modificados que vantajosamente possuem uma potência inibidora contra a endopeptidase neutra NEP e/ou a aminopeptidase AP-N.

[043] Os derivados preferidos de peptídeos de fórmula (I) são: CQRFSR, QRF(X)SR, QRGPR, QHNPR, QRFPR, QRFS(OAlk)R, de preferência QRFS(O-octanoil)R, C-[ligante]-QRFSR, de preferência C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFSR, C- [NH-(CH2)8-CO]-QRFSR, ou C-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR, QRYSR, QKFSR, QRFSK, C-[ligante]-QRFSR, de preferência C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFSR, C- [NH-(CH2)8-CO]-QRFSR, ou C-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR, [CQRFSR]2, C-[NH-(CH2)6-CO]-QRFS(OAlk)R, de preferência C-[NH-(CH2)6- CO]-QRFS(O-octanoil)R, e Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR.

[044] Em um modo de realização, a presente invenção está relacionada com um derivado de peptídeo de fórmula (II):

em que: - Za é um átomo de hidrogênio um grupo quelante de Zn, tal como cisteína, C-[ligante]-, N-acetil-cisteína, N-mercaptoacetil (HS-CH2-CO-), ácido hidroxâmico (HO-NH-CO-) ou uma hidroxiquinolina opcionalmente substituída, - AAa2 é R ou H, de preferência R, - AAa3 é G, N, F ou F(X), de preferência F, - os ditos Q, AA2, AA3, P, e R podem estar independentemente na Configuração-L ou na configuração-D, qualquer um entre Q, AA2, AA3, P, e R pode opcionalmente ser um p-aminoácido, um aza-aminoácido ou um β-aza- aminoácido; em que se o derivado de peptídeo compreender a cisteína, o dito derivado de peptídeo é opcionalmente um dímero, desde que o peptídeo não seja QHNPR ou QRGPR.

[045] O dito derivado de peptídeo de fórmula (II) é um peptídeo de opiorfinas modificado e é vantajosamente um inibidor da AP-N humana. Em particular ele pode ter uma potência inibidora em relação à AP-N mais elevada (de preferência pelo menos 6 vezes, 8 vezes, ou 10 vezes) que sua potência inibidora em relação à endopeptidase NEP e/ou à(s) atividade(s) carboxidipeptidase.

[046] Os derivados de peptídeos preferidos de fórmula (II) são: QRGPR, QHNPR, e QRFPR.

[047] Em um modo de realização, a presente invenção trata de um derivado de peptídeo de fórmula (III):

em que: - Zn é um átomo de hidrogênio, tirosina ou Y-[ligante]-, - AA1 é Q ou Glp, de preferência Q, - AAn2 é K ou R, de preferência R, - AAn3 é Y, F ou F(X), de preferência F ou F(X), - AAn4 é S ou S(OAlk), - AAn5 é K ou R, de preferência R, - os ditos AA1, AA2, AA3, AA4, e AA5 podem estar independentemente na Configuração-L ou na configuração-D, e qualquer um entre AAI, AA2, AA3, AA4, e AA5 podem ser opcionalmente um p-aminoácido, um aza-aminoácido ou um p-aza-aminoácido; desde que o peptídeo não seja QRFSR, QHNPR, YQRFSR ou GlpRFSR.

[048] O dito derivado de peptídeo de fórmula (III) é um peptídeo opiorfina modificado e é vantajosamente um inibidor da NEP humana. Em particular, ele pode ter uma potência inibidora em relação à endopeptidase NEP e/ou à(s) atividade carboxidipeptidase mais elevada que (de preferência pelo menos 6 vezes, 8 vezes, ou 10 vezes sua potência inibidora em relação à AP-N.

[049] Em um modo de realização, a presente invenção trata de um derivado de peptídeo de fórmula (IIIa): AA1-R-AAn3-S(OAlk)-AAn5-OH (IIIa), em que: - AA1 é Q ou Glp, - AAn3 é F ou F(X), - AAn5 é K ou R, de preferência R, desde que o peptídeo não seja QRFSR, QHNPR, YQRFSR ou GlpRFSR.

[050] Os derivados de peptídeos preferidos de fórmula (III) ou (IIIa) são: QRYSR, QRF(X)SR, QKFSR, QRFSK, QRFS(OAlk)R, de preferência QRFS(O-octanoil)R e Y-[NH-(CH2)12-CO]-QRFSR.

[051] Em um modo de realização, a presente invenção trata de um derivado de peptídeo de fórmula (IV):

em que: - Zm é um átomo de hidrogênio, ou um grupo quelante de Zn, tal como cisteína, C-[ligante]-, N-acetil-cisteína, N-mercaptoacetil (HS-CH2-CO-), ácido hidroxâmico (HO-NH-CO-) ou uma hidroxiquinolina opcionalmente substituída, - AAm3 é F ou F(X), de preferência F(X), AAm4 é S ou S(OAlk), de preferência S ou S(OAlk), os ditos Q, R, AA3, AA4, e R podem estar independentemente na Configuração-L ou na configuração-D, qualquer um entre Q, R, AA3, AA4, e R pode ser opcionalmente um p-aminoácido, um aza-aminoácido ou um β-aza- aminoácido; em que se o derivado de peptídeo compreender uma cisteína, o dito derivado de peptídeo é opcionalmente um dímero, desde que o peptídeo não seja QRFSR ou YQRFSR.

[052] Os derivados de peptídeos de fórmula (IV) são peptídeos opiorfinas modificados que são vantajosamente inibidores duplos da NEP humana e da AP-N humana, pelo fato de apresentarem uma potência inibidora significativa em relação à NEP humana e à AP-N humana.

[053] Os derivados de peptídeos preferidos de fórmula (IV) são: CQRFSR, [CQRFSR]2, C-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR; C-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR; C-[ligante]-QRF-S(O-octanoil)-R, de preferência C-(-HN-(CH2)6- CO-)-QRF-S(O-octanoil)-R, C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRF-S(O-octanoil)-R ou C-(- HN-(CH2)12-CO-)-QRF-S(O-octanoil)-R; QRF(X)SR e QRFS(OAlk)R, de preferência QRFS(O- octanoil)R.

[054] De preferência, o derivado de peptídeos da presente invenção são aqui peptídeos opiorfinas modificados e possuem uma potência inibidora contra a endopeptidase neutra NEP e/ou aminopeptidase AP-N. Mais preferencialmente ainda, os peptídeos opiorfinas modificados da presente invenção possuem potência inibidora contra a endopeptidase NEP e aminopeptidase AP-N.

[055] Os derivados de peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser preparados em um modo convencional por síntese peptídica em fase líquida ou sólida por acoplamentos sucessivos dos diferentes resíduos aminoácidos a serem incorporados (da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal na fase líquida, ou da extremidade C-terminal para a extremidade N-terminal na fase sólida) em que as extremidades N-terminais e as cadeias laterais reativas são previamente bloqueadas por grupos convencionais.

[056] Para a síntese da fase sólida, pode ser utilizada em particular a técnica descrita por Merrifield. De modo alternativo, a técnica descrita por Houbenweyl em 1974 também pode ser utilizada.

[057] Os derivados de peptídeos de acordo com a presente invenção podem também ser através de métodos de engenharia genética, desde que eles sejam constituídos de aminoácidos naturais.

[058] As modificações nos peptídeos opiorfínicos compreendem químicos (por exemplo, que contêm frações químicas adicionais, tais como metila, polietileno C2, C4, C6, C8, C10, C12 e polietilenoglicol dos mesmos, e/ou formas glicosiladas, e peptidomiméticas (por exemplo, um composto de baixo peso molecular que imita um peptídeo na estrutura e/ou função (ver, e.g., Abell, Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press (1997); Gante, Peptidmimetica - massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106: 1780-1802 (1994); e Olson et al., J. Med. Chem. 36: 3039-3049 (1993)).

[059] Outras modificações que podem ser introduzidas no derivado de peptídeos da presente invenção compreende o uso de aminoácidos não naturais, D-aminoácido, e2-aminoácido, e3-aminoácido, Aza aminoácido ou β-Aza aminoácido em vez de L aminoácido, restrições conformacionais, substituição isostérica, ciclização, ou outras modificações. Outros exemplos são aqueles em que uma ou mais ligações amida é substituída por uma ligação não- amida, e/ou um ou mais cadeias laterais de aminoácidos são substituídas por uma fração química diferente, ou um ou mais do N-terminus, o C-terminus ou uma ou mais cadeias laterais são protegidos por um grupo de proteção, e/ou ligações duplas e/ou ciclização e/ou estereospecificidade é introduzido na cadeia de aminoácidos para aumentar a rigidez e/ou a afinidade da ligação.

[060] Com base na estrutura cristalina do domínio de ligação da metaloectopeptidase alvo do derivado de peptídeo da presente invenção, miméticos também podem ser obtidos por desenho de desenvolvimento de drogas assistido por computador (Oefner et al. J. Mol. Biol. (2000) 296(2):341-9; Gomeni et al. Eur. J. Pharm. Sci. (2001) 13(3):261-70; Kan, Curr Top Med Chem (2002), 2(3):247-69).

[061] Outras modificações compreendem ainda: - proteger os grupos hidrófilos NH2 e COOH por esterificação (COOH) com álcoois lipófilos ou por amidação (COOH) e/ou por acetilação (NH2) ou cadeia hidrófoba adicionada carboxialquila ou aromática no NH2 terminus; - isômeros de retroinversão das ligações amida CO-NH ou metilação (ou cetometileno, metilenoxi, hidroxietileno) dos grupos amida; - inserção de frações -[HN-(CH2)n-CO-]- entre dois aminoácidos, sendo n um inteiro de 1 a 20, de preferência 6, 8 ou 12.

[062] Os ácidos nucleicos, também chamados polinucleotídeos, tais como as moléculas DNA ou RNA, também codificam os peptídeos, incluindo os derivados de peptídeos que contêm aminoácidos naturais, definidos acima são também parte da presente invenção, ao mesmo tempo em que levam em conta a degeneração do código genético. De preferência, o ácido nucleico compreende uma sequência que codifica um derivado de peptídeo que é constituído de aminoácidos naturais.

[063] Os ácidos nucleicos da presente invenção compreendem sequências que são hibridizáveis para qualquer uma das sequências acima ou suas sequências complementares sob condições muito rigorosas de hibridização que se referem a condições de hibridização e/ou lavagem a 68°C em 0,2 X SSC, a 42°C em 50% de formamida, 4 X SSC, ou sob condições que suportam níveis de hibridização equivalentes aos observados sob uma dessas duas condições.

[064] A presente invenção trata ainda de vetores para clonagem e/ou expressão que compreendem uma sequência de ácido nucleico da presente invenção e da célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou o dito vetor, isto é, uma célula hospedeira em que pelo menos um desses vetores foi transferida. O vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para um peptídeo, incluindo um derivado de peptídeo, ou proteína da presente invenção, e a dita sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a elementos que permitem sua expressão. O vetor contém vantajosamente uma sequência promotora, sinais para iniciação e término da translação, bem como regiões apropriadas para regulação da transação. Sua inserção na célula hospedeira pode ser transitória ou estável. O vetor também pode conter sinais específicos para secreção da proteína transladada.

[065] As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas, e incluem, mas sem se limitar bactérias, leveduras, células vegetais, células de insetos, células de mamíferos, inclusive linhagens celulares que estão comercialmente disponíveis. Como exemplos preferidos de células hospedeiras podem ser citadas COS-1, células HEK, células 293, ou células CHO.

[066] A presente invenção propõe ainda anticorpos, monoclonais ou policlonais, ou seus fragmentos especificamente dirigidos contra (isto é, que reconhece especificamente) os peptídeos opiorfinas modificados descritos na presente invenção. Tais anticorpos podem ser úteis, por exemplo, para estudar as propriedades farmacocinéticas do derivado de peptídeos da presente invenção.

[067] O termo "anticorpo" em suas diversas formas gramaticais é usado aqui para indicar moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um anticorpo que combinam sítio ou paratopo. Como exemplos de moléculas de anticorpos podem ser citadas as moléculas de imunoglobulinas intactas, as moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e porções de uma molécula de imunoglobulina, incluindo aquelas porções que são conhecidas no estado da técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v).

[068] Os procedimentos para a criação de anticorpos policlonais são também bem conhecidos. Tipicamente, esses anticorpos podem ser criados pela administração dos derivados de peptídeo, incluindo o derivado conjugado de peptídeo, da presente invenção subcutaneamente a coelhos brancos da Nova Zelândia que foram primeiramente sangrados para obter soro pré-imune. Os antígenos podem ser injetados a um volume total de 50 μl por sítio em dez sítios diferentes ou pelo menos em cinco sítios diferentes. Os coelhos foram então cinco semanas após a primeira injeção e receberam reforços periódicos do mesmo antígeno administrado subcutaneamente a uma concentração cinco vezes mais baixa que a injeção primária no máximo dependendo da qualidade da resposta imune três vezes a cada seis semanas. Uma amostra de soro é então coletada a cada 10 dias após cada reforço. Os anticorpos policlonais são então recuperados a partir do soro por cromatografia de afinidade utilizando o antígeno correspondente para capturar o anticorpo. Esses procedimentos e outros para a criação de anticorpos policlonais estão descritos E. Harlow, et. al., editors, Antibodeis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988).

[069] Um "anticorpo monoclonal" em suas diversas formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpos que contêm apenas uma espécie de anticorpos que combina sítio capaz de imunorreação com um epitopo particular. Um anticorpo monoclonal apresenta assim tipicamente uma afinidade de ligação única com qualquer epitopo com o qual imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode, portanto conter uma molécula de anticorpos que possui uma pluralidade de anticorpos que combinam sítios, cada um deles imunoespecífico para um epitopo diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífico.

[070] Os métodos laboratoriais para preparar anticorpos monoclonais são bem conhecidos do estado da técnica (ver, por exemplo, Harlow et al., supra). Os anticorpos monoclonais (Mabs) podem ser preparados imunizando um mamífero, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cabra, seres humanos, etc., contra os derivados de peptídeos da presente invenção, inclusive os derivados conjugados de peptídeos. As células produtoras de anticorpos no mamífero imunizado são isoladas e fundidas com células de mieloma ou heteromieloma para produzir células híbridas (hibridoma). As células de hibridoma que produzem os anticorpos monoclonais são usadas como uma fonte dos anticorpos monoclonais desejados.

[071] Embora os Mabs possam ser produzidas por cultura de hibridomas, a presente invenção não se limita a isso. É também contemplado o uso de Mabs produzidos pela expressão de um ácido nucleico clonado a partir de um hibridoma. Isso significa que o ácido nucleico que expressa as moléculas secretadas por um hibridoma pode ser transferido para outra linhagem celular para produzir um transformante. O transformante é genotipicamente distinto do hibridoma original, mas é também capaz de produzir moléculas de anticorpos da presente invenção, incluindo fragmentos imunologicamente ativos do anticorpo de moléculas total, que correspondem aos secretados pelo hibridoma. Além disso, a literatura propõe métodos para formar anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única e as variações similares em um fragmento de anticorpos imunorreativos básicos. Todos estes são considerados no âmbito da presente invenção na medida que uma classe e especificidade de anticorpos é descrita e reivindicada, independentemente da estrutura variante precisa que o técnico no assunto possa construir.

[072] Os peptídeos opiorfinas modificados podem ser formulados em composições farmacêuticas em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições farmacêuticas são apropriadas para uma administração tópica, oral, sublingual, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transcutânea ou intraocular e outras.

[073] Os peptídeos opiorfinas modificados descritos acima são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios, em que a modulação da atividade de uma membrana metalo-ectopeptidase é buscada, mais particularmente uma zinco- metalopeptidase, tal como NEP e AP-N.

[074] Os substratos NEP naturais são principalmente os hormônios de peptídeos: Encefalinas, Substância P, Bradiquinina, Angiotensina II e Peptídeo Natriurético Atrial que desempenha um papel essencial no controle da percepção da dor central e periférica, dos fenômenos inflamatórios, da troca mineral e/ou do tônus arterial (Roques et al., Pharmacol Rev. 1993;45(1):87- 146).

[075] Mais particularmente, endopeptidase neutra, NEP 24-11, está distribuídas nos tecidos nervosos e periféricos de mamíferos, e na periferia é particularmente abundante no rim e na placenta. Nesses tecidos a metalopeptidase de superfície celular NEP participa do processamento pós- secretório e do metabolismo de neuropeptídeos, dos peptídeos imunorregulatórios sistemas e dos hormônios-peptídeos. Controlando os níveis ativos dos peptídeos regulatórios circulantes ou secretados, a NEP modula sua ação mediada por receptores fisiológicos. Portanto, a NEP ancorada na membrana está envolvida na regulação da atividade de: peptídeos vasoativos potentes tais como Substância P, Bradiquinina (BK), Peptídeo Natriurético Atrial (ANP), e Angiotensina II (AII); peptídeos potentes informatórios/imunorregulatórios tais como Substância P e BK e fMet-Leu-Phe (fMLP); neuropeptídeos opioides potentes tais como as Encefalinas Met e Leu- (Enk) e troca mineral potente e peptídeos regulatórios da homeostase dos fluidos tais como ANP, Peptídeo Natriurético tipo C (CNP) Peptídeo Natriurético tipo B (BNP). Entretanto, os níveis desses peptídeos são alterados através da formação/degradação induzida por NEP somente em regiões em que são tonicamente liberados ou em que sua liberação é desencadeada por um estímulo.

[076] De um ponto de vista integrativo, a atividade biológica NEP destina-se a controlar os níveis ativos de sinais peptidérgicos envolvidos na regulação da tensão arterial, em fenômenos inflamatórios, estados emocionais e na homeostase hídrica e mineral, bem como no controle do processamento da dor. De um ponto de vista clínico, isso comprova o fato de a NEP é um alvo importante de drogas em vários estados de doença. Por exemplo, inibindo NEP e APN, aumentando assim os níveis e a duração da ação dos opioides endógenos centrais ou periféricos, um efeito analgésico ou um efeito antidepressivo ou psicoestimulante pôde ser obtido. A principal vantagem de modificar as concentrações de peptídeos regulatórios endógenos pelo uso de inibidores NEP e/ou AP-N é que os efeitos farmacológicos são induzidos apenas nos sítios receptores ativados pelos ligantes naturais, e são criticamente dependentes de sua liberação tônica ou evocada por estímulos que ocorre em situações estressantes específicas ambientais, comportamentais e fisiopatológicas (Roques et al, 1993).

[077] Exemplos de metalopeptidases membranares de mamíferos, além de NEP são NEP2, ECE (Enzimas Conversoras de Endotelina), em particular ECE1 e ECE2, o antígeno de superfície de eritrócito KELL e o produto de gene PEX associado com o raquitismo hipofosfatêmico ligado ao X (Aminopeptidase N).

[078] A NEP2 está distribuída especificamente no sistema nervoso e nos tecidos genitais.

[079] A AP-N é uma resina ubíqua presente em uma ampla variedade de órgãos, tecidos e tipos de células humanos (endoteliais, epiteliais, fibroblastos, leucócitos) e é em particular abundante nos rins e no sistema nervoso central. Os substratos identificados incluem a Angiotensina III (Ang III); os neuropeptídeos, inclusive as encefalinas e endorfinas; e os hormônios, incluindo o kallidan e a somatostatina. A AP-N uma enzima multifuncional, relacionada com a tumorigênese, o sistema imune, a dor, a regulação da pressão sanguínea arterial etc. A AP-N está também envolvida no processamento de antígenos e no processo de apresentação de antígenos. Essas funções facilitam a modulação de respostas peptídicas bioativas (gerenciamento da dor liberação de vasopressina) e influenciam as funções imunes e os principais eventos biológicos (proliferação celular, secreção, invasão, angiogênese) fornecendo assim opções de tratamento para muitos tipos de doenças.

[080] A inibição das ECE possui uma aplicação significativa no tratamento da hipertensão e na prevenção e no tratamento da aterosclerose.

[081] A inibição da AP-N conjuntamente com NEP possui uma aplicação significativa no tratamento da dor e da depressão, da ansiedade, na sedação e no tratamento dos distúrbios sociossexuais e emocionais.

[082] A inibição das metalopeptidases membranares relacionadas tem efeitos terapêuticos no tratamento de tumores, ou seja, nos cânceres ovarianos, colorretais, do cérebro, dos pulmões, do pâncreas, gástricos e melanoma, e na redução da incidência de metástese, aterosclerose e/ou hipertensão.

[083] A inibição das metalopeptidases membranares relacionadas tem efeitos no alívio da dor. Esses efeitos antinociceptivos sobre a dor aguda são efeitos analgésicos, mas também efeitos sobre a dor inflamatória crônica tal como artrite ou doença inflamatória do intestino, lesão pós-inflamatória e dor neuropática severa associada ou não com câncer e/ou terapia contra o câncer.

[084] Além disso, é esperado que a inibição da metalopeptidase bacteriana ou viral possua efeitos anti-infecção.

[085] As metalopeptidases desempenham um papel importante na invasão dos tecidos do hospedeiro patogênico e nos processes imunológicos e inflamatórios, por exemplo, os de Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas gingivalis e Legionella pneumophila.

[086] Além disso, as metalopeptidases bacterianas, especialmente as zinco-metalopeptidases desempenham um papel importante nas doenças causadas por toxinas proteolíticas, tais como as toxinas de B. anthracis (Anthrax Lethal factor) e as neurotoxinas de C. tetanum e botulinum.

[087] Outras metalopeptidases desempenham um papel importante em várias infecções tais como as infecções causadas HIV (FR 2 707 169).

[088] A importância dos inibidores da proteinase para o tratamento de doenças bacterianas ou virais pode ser encontrada em J. Potempa e J. Travis.

[089] Os diferentes papéis das metalopeptidases estão descritos em Turner et al, 2001; Kenny et al, 1977; Kenny et al, 1987; Beaumont et al, 1996.

[090] Um objeto da presente invenção é propor uma terapia analgésica ou antidepressiva com os peptídeos opiorfinas modificados que atuam inibindo a NEP e a AP-N nos níveis periférico, espinhal e/ou supraespinhal e aumentam assim os níveis e a duração da ação dos opioides endógenos centrais ou periféricos, inclusive as encefalinas.

[091] O tratamento da dor, especialmente da dor aguda e crônica, da dor visceral inflamatória e da dor neuropática, é contemplado.

[092] O tratamento de qualquer desequilíbrio hídrico-mineral é também um objetivo da presente invenção. Entre os distúrbios visados podem ser citados os distúrbios dos ossos, dentes, rins, paratireoide, pâncreas, intestinos, mucosas estomacais, próstata, e das glândulas salivares que são causados por desequilíbrio hídrico-mineral.

[093] Em particular, o distúrbio pode ser escolhido entre o hiper ou hipo-paratireodismo, a osteoporose, a pancreatite, a litiase da glândula submandibular, a nefrolitíase e a osteodistrofia.

[094] O tratamento de distúrbios comportamentais e interpessoais prejudicados é também de interesse. Vários distúrbios mentais estão descritos na publicação WO 02/051434.

[095] Em particular a presente invenção visa qualquer distúrbio escolhido no grupo constituído por transtorno de evitação, transtorno de redução da consciência, transtorno autista, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, excitação, hospitalismo, funcionamento interpessoal e relacionamento com o mundo externo prejudicados, transtorno de personalidade esquizoide, esquizofrenia, transtorno depressivo, interesse diminuído pelo ambiente, atividade social prejudicada relacionada com a sexualidade, e comportamento sexual prejudicado, incluindo ejaculação precoce, sexualidade hiperativa e disfunção erétil.

[096] A presente invenção trata também do uso de peptídeos ou derivados de peptídeos de acordo com a presente invenção como agentes psicoestimulantes. Consequentemente a prevenção ou o tratamento de uma narcolepsia, hipersônia, transtornos compulsivos obsessivos, transtornos de humor tais como transtornos depressivos ou transtorno depressivo grave, tanto o transtorno depressivo grave com episódio único ou o transtorno depressivo grave recorrente, o transtorno bipolar tipo I ou II, o transtorno distímico e o distúrbio ciclotímico.

[097] Doenças em que a modulação de uma metalopeptidase membranar é procurada também incluem a hipertensão, a aterosclerose, tumores, a artrite inflamatória e a doença dos intestinos.

[098] O tratamento de infecções está também englobado. Em particular, a importância dos inibidores da proteinase para o tratamento de doenças bacterianas ou virais pode ser encontrada em J. Potempa e Travis.

[099] Os peptídeos opiorfinas modificados descritos são também úteis para controlar as respostas imunoinflamatórias.

[100] Os peptídeos opiorfinas modificados tais como definidos acima são também úteis como agente natriurético ou agente diurético.

[101] Assim, a presente invenção vantajosamente propõe um derivado de peptídeos tal como definido acima para uso no tratamento de uma doença ou transtorno escolhido no grupo constituído por dor, transtornos depressivos, atividade social prejudicada relacionada com a sexualidade, e comportamento sexual prejudicado.

[102] Outro objeto da presente invenção é o uso dos derivados de peptídeos ou ácidos nucleicos descritos acima como substituto no tratamento de abuso de drogas, em particular do abuso de drogas de morfina.

[103] De fato, estudos sugeriram que a vulnerabilidade ao abuso de drogas e o desenvolvimento de recompensa e dependência de drogas é pelo menos em parte, um resultado de modificações preexistentes ou induzidas e/ou do defeito do sistema opioide endógeno. Nesse sentido, o uso de peptídeos opiorfínicos modificados ou ácido nucleico para potencializar os efeitos de encefalinas endógenas reduzirá os diversos efeitos colaterais (sinais somáticos de abstinência) produzidos pela interrupção da administração crônica de morfina ou heroína.

[104] As doenças ou distúrbios preferidos que podem ser tratados com o derivado de peptídeos da presente invenção compreendem dor, transtornos depressivos, atividade social prejudicada relacionada com a sexualidade, e comportamento sexual prejudicado.

[105] A presente invenção trata ainda do uso de um agente que modula a interação entre a proteína BPLP endógena ou produto de maturação, por exemplo, a opiorfina natural QRFSR, e a metalopeptidase membranar para a preparação de uma composição terapêutica para prevenir ou tratar doenças em que a modulação da atividade da dita metalopeptidase membranar é procurada.

[106] A presente invenção propõe um método in vitro de triagem de compostos em relação à sua capacidade de ligar-se com o sítio de ligação NEP e/ou APN para a proteína BPLP ou o peptídeo QRFSR. Detalhes desse processo estão descritos, por exemplo, no pedido U.S. 10/593,071 depositado em 15 de setembro de 2006, também publicado como WO 2005/090386, bem como no pedido de patente internacional PCT/EP2009/050567, cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência.

[107] Outro objeto da presente invenção é um processo para determinar a afinidade relativa dos peptídeos de opiorfinas modificados que ligam aos sítios de ligação NEP e/ou AP-N para a proteína BPLP, ou produtos de maturação (ou o peptídeo que retém a especificidade de ligação ou a atividade fisiológica da proteína BPLP ou de seu produto maturado) tal como descrito por exemplo no pedido U.S. 10/593,071 depositado em 15 de setembro de 2006, cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MÉTODOS PARA ENSAIOS BIOQUÍMICOS

[108] Uma análise cinética formal para cada ensaio utilizando um monitoramento de fluorescência em tempo real da hidrólise do substrato específico. Para cada modelo fluorimétrico adaptado com 96 poços, todos os parâmetros que permitem a análise da atividade da enzima NEP humana e AP- N humana foram definidas sob condições de medida de velocidade inicial.

1- FONTES DE ECTOPEPTIDASES HUMANAS, HNEP E HAP-N

[109] A NEP recombinante humana e a AP-N recombinante humana (destituídos de seus respectivos citosol N-terminal e segmento transmembrana) comprados da R&D Systems, foram usados como fonte pura de peptidase.

2- SUBSTRATOS E INIBIDORES SINTÉTICOS

[110] In vitro, atividade Amino-, CarboxiDi- e Endo- Peptidase foram testadas medindo a quebra dos substratos seletivos sintéticos indicados a seguir: - o peptídeo Abz-dR-G-L-EDDnp FRET que é um substrato fluorescente suprimido (quenched) internamente específico para a atividade NEP-EndoPeptidase, foi sintetizado pela Thermo-Fisher Scientific (Alemanha), - o peptídeo Abz-R-G-F-K-DnpOH FRET que é um substrato fluorescente suprimido internamente específico para NEP-CarboxiDiPeptidase atividade, foi sintetizado pela Thermo-Fisher Scientific (Alemanha), - o peptídeo Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET- (Mca-BK2) que é um peptídeo fluorogênico intramolecularmente suprimido estruturalmente relacionado com a bradiquinina, que é um substrato seletivo para medir a atividade NEP e ECE, foi comprado da R&D Systems, - FRET é a transferência de energia dependente da distância de um fluóforo doador (Abz=orto-aminobenzoil ou Mca=7-metoxicumarina-4-il- acetil) para um receptor fluóforo (DnpOH=2,4-dinitrofenil ou EDDnp=2,4- dinitrofenil etilenodiamina), - L-alanina-Mca, Ala-Mca, um substrato fluorogênico para medir a atividade aminopeptidase foi comprado da Sigma.

[111] Medir a taxa de hidrólise desses substratos por ectopeptidases solúveis na presença e ausência de diferentes inibidores sintéticos seletivos da peptidase disponíveis avaliou a especificidade de cada ensaio com enzimas: - Tiorfano (inibidor NEP) (Bachem), - Bestatina (inibidor AP) (Calbiochem).

3- MEDIDA DAS ATIVIDADES PEPTIDASE USANDO ENSAIOS FLUOROMÉTRICOS ADAPTADOS COM 96 POÇOS

[112] De acordo com as condições de medida da velocidade inicial: o tempo, o pH e a temperatura de incubação bem como as concentrações de enzima e substrato foram definidas para cada ensaio. A hidrólise de substratos foi medida por monitoramento em tempo real de sua taxa de metabolismo pelas duas peptidases na presença e ausência do composto inibitório testado (concentrações que variam de 1 a 50 μM). Estas foram adicionadas ao meio de pré-incubação. A taxa de base da autólise do substrato que representa o sinal fluorescente obtido na ausência de enzima foi subtraída para calcular as velocidades iniciais em RFU (Unidade de Fluorescência Relativa)/min.

[113] Medida da atividade NEP-endopeptidase usando substratos de peptídeo FRET específico, Abz-dR-G-L-EDDnp. Usando uma microplaca de 96 poços com metade da área preta (black half area 96 well microplate), a reação padrão constituída de enzima (12,5 ng) em 100 mM Tris-HCl pH 7 contendo 200 mM NaCl (volume final 100 μl). O substrato (concentração final 15 μM) foi adicionado após a pré-incubação por 10 min a 28°C e a cinética da aparência do sinal fluorescente (RFU) foi analisado diretamente por 40 min a 28°C (medidas sucessivas de intervalos de 2,3 min) usando um leitor fluorímetro de microplacas (monochromator Infinite 200-Tecan) a 320 nm e 420 nm de excitação e comprimentos de ondas de emissão, respectivamente.

[114] Em condições de medida da velocidade inicial, a intensidade do sinal foi diretamente proporcional a quantidade de metabólitos formados durante o período de tempo de 20-40 min da reação. Assim, na ausência de inibidor, a velocidade inicial da endoproteólise mediada por rhNEP específica de Abz-dR-G-L-EDDnp, foi calculada a partir de uma regressão linear (inclinação = atividade NEP na presença de veículo / tempo de incubação) como 8218 ± 2878 RFU/min/μg rhNEP, n=3 determinações independentes.

[115] Medida da atividade NEP-CarboxiDiPeptidase usando FRET um substrato de peptídeo FRET específico Abz-R-G-F-K-DnpOH. Usando uma microplaca de 96 poços com metade da área preta, a reação padrão constituída de enzima (2,5 ng) rm 100 mM Tris-HCl pH 6,5 contendo 50 mM NaCl (volume final 100 μl). O substrato (concentração final 4 μM) foi adicionado após pré- incubação durante 10 min e a cinética da aparência do sinal fluorescente (RFU) foi diretamente analisada durante 40 min a 28°C (medidas sucessivas de intervalos de 2,3 min) usando o leitor fluorímetro a 320 nm de excitação e 420 nm de comprimentos de ondas de emissão. Nessas condições de medida da velocidade inicial, a hidrólise específica mediada por NEP humana de Abz-R-G- F-K-DnpOH foi avaliada a 59796 ± 18685 RFU/min/μg rhNEP, n= 4 determinações independentes. A atividade NEP-CarboxiDiPeptidase testada com o substrato Abz-R-G-F-K-DnpOH é referida como “atividade NEP-CDP1” nas Figuras 5-8.

[116] Além disso, o peptídeo fluorogênico apagado intramolecularmente, Mca-BK2 (10 μM), foi submetido à hidrólise por 5 ng rhNEP nas mesmas condições experimentais que as descritas anteriormente. Nessas condições a enzima hNEP atuou sobre Mca-R-P-P- G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH, sobretudo como uma CarboxiDiPeptidase preferencialmente clivando ligação a A-F, mas também como uma EndoPeptidase clivando a ligação G-F. Nessas condições de medida da velocidade inicial, hidrólise específica mediada por NEP humana de Mca- BK2 foi avaliada a 121910 ± 24755 RFU/min/μg rhNEP, n= 3 determinações independentes. A atividade NEP-CarboxiDiPeptidase testada com o substrato Abz-R-G-F-K-DnpOH é referida como “atividade NEP-CDP2” nas Figuras 5-8.

[117] Medida da atividade AP-N-ectopeptidase usando um substrato Ala-Mca. Usando uma microplaca de 96 poços com metade da área preta a reação padrão constituída de enzima (4 ng) em 100mM Tris- HCl pH 7,0 (volume final 100 μl). O substrato Ala-Mca (concentração final 25 μM) foi adicionado após pré-incubação durante 10 min a 28°C e a cinética de aparência do sinal foi monitorado durante 40 min a 28°C usando o leitor fluorímetro a 380 nm de excitação e 460 nm de comprimentos de ondas de emissão. A intensidade do sinal foi diretamente proporcional à quantidade de metabólitos formada durante o período de tempo de 10-40 min da reação. Nessas condições de medida da velocidade inicial, a aminoproteólise mediada por AP-N humana de Ala-Mca foi calculada diretamente (a partir da inclinação: atividade AP-N na ausência de inibidor em função do tempo de incubação) como 147042 ± 44657 RFU/min/μg rhAP-N, n = 3 determinações independentes.

[118] Outros substratos de peptídeo FRET para testar a atividade carboxidipeptidase NEP foi descrita em Barros et al. Biol. Chem., 2007, 388:447-455.

EXEMPLO 2 RESULTADOS DOS ENSAIOS BIOQUÍMICOS 1- VARREDURA DE DERIVADOS PEPTÍDICOS OPIORFÍNICOS EM HNEP E HAP-N

[119] Os compostos foram testados 3 vezes a uma concentração final de 50 μM.

[120] As Figuras 1 a 9 apresentam os resultados dos ensaios bioquímicos nas atividades endopeptidase e carboxidipeptidase NEP e atividade na AP-N com vários derivados de peptídeos da presente invenção.

[121] Vários análogos de peptídeos Opiorfinas foram testados quanto à potência inibidora em relação às duas ectoenzimas ancoradas na membrana, NEP (atividades endopeptidase e carboxidipeptidase específicas) e APN usando ensaios seletivos com enzimas baseadas em fluorescência: modelos in Vitro da Enzima baseada em FRET previamente desenvolvidos e validados no laboratório (PCT pedido PCT/ depositado em 18 de janeiro de 2009, incorporado aqui por referência).

[122] Foram analisados os seguintes compostos. Nos compostos a seguir, NH2 representa a amina terminal do peptídeo e COOH o ácido carboxílico terminal do peptídeo: - NH2-QRFSR-CONH2 (Opiorfina); NH2-QRGPR-COOH; NH2- QHNPR-COOH; - NH2-QR(4BromoF)SR-COOH (i.e. QRF(4Br)SR); NH2-QRFPR- COOH: apresentaram uma preferência inibidora para a AP-N humana e uma baixa potência inibidora em relação à NEP humana; - N-(Acetil)QRFSR-COOH; N-(C8-polietileno)QRFSR-COOH; N- (biotina-C6-polietileno)QRFSR-COOH: apresentaram uma baixa potência inibidora em relação à AP-N e NEP humanas com uma preferência pela atividade NEP endopeptidase; - NH2-dRdSdFdRdQ-COOH (retroinversão D-enatiômero): Não apresentou uma atividade inibidora significativa em relação às AP-N e NEP humanas com uma preferência pela atividade AP-N; - NH2-YQRFSR-COOH; NH2-Y-(C6-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-Y-(C12-polietileno)QRFSR-COOH: apresentaram uma preferência inibidora pela atividade endopeptidase NEP humana em particular Y-(C12- polietileno)QRFSR; - NH2-QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-CQRFSR-COOH: Foram dois inibidores potentes da NEP humana (atividades endopeptidase e carboxidipeptidase específicas) e AP-N.

[123] Outros peptídeos opiorfinas modificados são: NH2-CQRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-CQRF[S-O-C12-polietileno]R-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-C-(C12-polietileno)QRFSR-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-polietileno]R-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFS[β3R]-COOH; NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-polietileno][dR]-COOH; NH2-C-(C8-polietileno)QRFS[dR]; NH2-[dC]QRF[S-O-C8-polietileno][dR]-COOH; NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-polietileno][β3R]-COOH; [CQRFSR]2 como dipeptídeo cistina através de ligação dissulfeto.

2- CONCENTRAÇÃO DEPENDENTE DA INIBIÇÃO DE DERIVADOS DE PEPTÍDEOS OPIORFINAS SELECIONADOS - EM HNEP E HAP-N PEPTÍDEO CQRFSR-COOH (FIGURAS 9 E 18)

[124] O peptídeo CQRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade rhNEP-Endopeptidase: r2 = 0,97, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 7 ± 3 μM.

[125] O peptídeo CQRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0.99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 6 ± 1 μM.

[126] O peptídeo CQRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP- N: r2 = 0.99, n = 30 pontos de determinação, com um IC50 a 0,8 ± 0.1 μM.

[127] O peptídeo CQRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem do peptídeo FRET Mca-R-P-P-G-F-S-A-F- K-(Dnp)-OH (Mca-BK2) mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 16 pontos de determinação, com um IC50 a 17 ± 2 μM.

[128] Portanto, a modificação da posição N-terminal do peptídeo NH2-QRFSR por formação de uma ligação amida com um aminoácido de Cisteína (o grupo funcional tiol é um grupo Zn-quelante forte) levou a um composto (Peptídeo CQRFSR) que apresenta uma potência inibidora reforçada em relação a hAP-N (10 vezes em comparação com o peptídeo nativo QRFSR) e em relação a hNEP (5 vezes).

EPTÍDEO QRF[S-O-OCTANOIL]R (FIGURA 10)

[129] O peptídeo QRF[S-O-C8]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade rhNEP-Endopeptidase: r2 = 0,98, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 2,8 ± 0,2 μM.

[130] O peptídeo QRF[S-O-C8]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 12 ± 5 μM.

[131] O peptídeo QRF[S-O-C8]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem Ala-AMC mediada pela atividade rhAP-N: r2= 0,99, n = 20 pontos de determinação, com um IC50 a 10 ± 1 μM.

[132] O peptídeo QRF[S-O-C8]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem do peptídeo FRET Mca-R-P-P-G-F-S-A-F- K-(Dnp)-OH (Mca-BK2) mediada pela atividade rhNEP: r2= 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 14 ± 4 μM.

PEPTÍDEO Y-[ ESPAÇADOR ÁCIDO AMINO DODECANOICO]-QRFSR (FIGURAS 11 E 19)

[133] O peptídeo Y(PE12)QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade rhNEP-Endopeptidase: r2 = 0,98, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 10 ± 1 μM.

[134] O peptídeo Y(PE12)QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2= 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 24 ± 2 μM.

[135] O peptídeo Y(PE12)QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP-N: r2= 0,99, n = 20 pontos de determinação, com um IC50 a 122 ± 20 μM.

[136] O peptídeo Y(PE12)QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem do peptídeo FRET Mca-R-P-P-G-F-S- A-F-K-(Dnp)-OH (Mca-BK2) mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 31 ± 2 μM.

[137] Por conseguinte, a preferência inibidora pela atividade endopeptidase NEP humana de Y-(C12-polietileno)QRFSR foi confirmada.

PEPTÍDEO C[PE6]QRFSR (PE6=ÁCIDO AMINO-HEXANOICO) (FIGURA 20)

[138] O peptídeo C[PE6]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade Endopeptidase rhNEP: r2= 0,98, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a 40 ± 5 μM.

[139] O peptídeo C[PE6]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a aproximadamente 217.

[140] O peptídeo C[PE6]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP- N: r2 = 0,99, n = 20 pontos de determinação com um IC50 a 0,8 ± 0,1 μM.

[141] O peptídeo C[PE6]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem do peptídeo FRET Mca-R-P-P-G-F-S-A-F- K-(Dnp)-OH (Mca-BK2) mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 18 pontos de determinação, com um IC50 a cerca de 227 μM.

PEPTÍDEO C-[ESPAÇADOR ÁCIDO AMINO-DODECANOICO]-QRFSR (FIGURA 21)

[142] O peptídeo C[PE12]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade Endopeptidase rhNEP: r2 = 0,96, n = 24 pontos de determinação, com um IC50 a 5,7 ± 0,5 μM.

[143] O peptídeo C[PE12]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,97, n = 30 pontos de determinação, com um IC50 a 19 ± 2 μM.

[144] O peptídeo C[PE12]QRFSR-COOH impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP-N: r2 = 0,98, n = 27 pontos de determinação, com um IC50 a 0,8 ± 0,1 μM.

PEPTÍDEO C-[ESPAÇADOR ÁCIDO AMINO-HEXANOICO]-QRFS[O-OCTANOIL]R (FIGURA 22)

[145] O peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade Endopeptidase rhNEP: r2 = 0,99, n = 27 pontos de determinação, com um IC50 a 759 ± 56 nM.

[146] O peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 27 pontos de determinação, com um IC50 a 848 ± 58 nM.

[147] O peptídeo C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP-N: r2 = 0,99, n = 24 pontos de determinação, com um IC50 a 1,7 ± 0,1 μM.

[148] Em um ensaio in vitro biologicamente relevando, usando o substrato fisiológico NEP da substância P e membranas de células humanas como fonte de hNEP, o C[PE6]QRF[S-O-Octanoil]R o peptídeo derivado impediu em um modo de concentração dependente a clivagem da Substância P mediada pela atividade Endopeptidase hNEP ligada à membrana: r2 = 0,95, n = 13 pontos de determinação, com um IC50 a 1,6 ± 0,4 μM (aumento de pelo 5 vezes da potência inibidora em comparação com o peptídeo Opiorfina nativo para o mesmo teste) (figura 23).

[CQRFSR] DIPEPTÍDEO ([CQRFSR]2)

[149] O dipeptídeo impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-dR-G-L-EDDnp mediada pela atividade Endopeptidase rhNEP: r2 = 0,87, n = 24 pontos de determinação, com um IC50 a 1,4 ± 0,5 μM. [

[150] O dipeptídeo [CQRFSR] impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Abz-R-G-F-K-DnpOH mediada pela atividade rhNEP: r2 = 0,99, n = 27 pontos de determinação, com um IC50 a 3,3 ± 0,2 μM.

[151] O dipeptídeo [CQRFSR] impediu em um modo de concentração dependente a clivagem de Ala-AMC mediada pela atividade rhAP- N: r2= 0,99, n = 24 pontos de determinação, com um IC50 a 0,8 ± 0,1 μM. TABELA 1 SUMÁRIO DOS VALORES IC50 DE PEPTÍDEOS E DERIVADOS DE PEPTÍDEOS NAS ATIVIDADES NEP E AP-N

[152] Todos os dados conjuntamente mostraram a importância do grupo α amina N-terminal do peptídeo NH2-QRFSR para a potência inibidora das opiorfinas em relação à AP-N humana.

[153] De fato, quando comparado com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR, sua acetilação (Ac-QRFSR) ou ciclização (pGlu-RFSR), sua octanoilação (C8-QRFSR) ou biotinilação (biotina-C6)QRFSR, levou a compostos que apresentam uma baixa potência inibidora em relação a hAP-N.

[154] Entretanto, quando comparados com o peptídeo nativo Opiorfina QRFSR, os dois compostos: pGlu-RFSR e C8-QRFSR apresentaram uma potência pelo menos equivalente se não melhor para a hNEP humana.

[155] Esses dados demonstram ainda a importância do terminal carboxila livre do peptídeo QRFSR-COOH por sua potência inibidora em relação a hNEP, especialmente em relação à atividade CarboxiDiPeptidase da NEP em comparação com o peptídeo nativo Opiorfina (QRFSR), a amidação (QRFSR- CONH2) levou a um composto que apresentou uma baixa potência inibidora em relação à atividade hNEP.

[156] O resíduo Phe do peptídeo QRFSR é importante para a potência inibidora da Opiorfina em relação às atividades hNEP e hAP-N peptidase. De fato, quando comparado com o peptídeo nativo Opiorfina (QRFSR), a substituição do resíduo Tyr por Phe (QRYSR) levou a um composto que apresentou uma diminuição de 6 vezes na potência inibidora para hAP-N e uma ligeira redução da potência inibidora em relação à NEP humana.

[157] Entretanto, de modo interessante a substituição do resíduo 4-Fluoro-Phe para Phe (QR[4F]FSR) levou a um composto que apresentou uma diminuição de apenas 2 vezes na potência inibidora em relação a hNEP e uma potência inibidora equivalente em relação a hAP-N em comparação com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR. Inversamente, a substituição do resíduo (4Bromo-Phe) ou Phe (QR[4Br]FSR) levou a um composto que apresentou uma baixa potência inibidora em relação à NEP humana.

[158] A modificação dos resíduos centrais RFS do peptídeo QRFSR afetam a potência inibidora da Opiorfina em relação a hNEP, uma vez que, quando comparados com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR, os compostos QRGPR, QHNPR, e QRFPR apresentaram uma potência inibidora equivalente para a AP-N humana e uma baixa potência inibidora em relação à NEP humana.

[159] Os resultados demonstram ainda a importância do íon guanidínio do resíduo Arg na posição 2 do peptideo QRFSR para a potência inibidora da Opiorfina em relação a hAPN. Em comparação com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR, a substituição da ε-amina do resíduo Lys (QKFSR) para Arg2 levou a um composto que apresentou uma diminuição de mais de 10 vezes na potência inibidora em relação a hAP-N e uma ligeira diminuição na potência inibidora em relação à NEP humana.

[160] De modo similar, o íon guanidínio do resíduo Arg na posição 5 do peptídeo QRFSR é importante para a potência inibidora da Opiorfina em relação a hAPN, em comparação com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR, a substituição de um a ε-amina resíduo de Lys para Arg5 (QRFSK) levou a um composto que apresentou uma diminuição de 10 vezes na potência inibidora para hAP-N e uma potência inibidora equivalente para a NEP humana.

[161] De modo interessante, a esterificação do grupo hidroxila do resíduo serina do peptídeo QRFSR pelo ácido octanoico (QRF[octanoil- Serina]R) levou a um composto que apresentou uma potência inibidora equivalente em relação a hAP-N em comparação com o peptídeo nativo Opiorfina-QRFSR e uma potência inibidora reforçada em relação às atividades hNEP-Endo e CarboxiDi-peptidase (pelo menos 10 vezes mais potência inibidora do que o peptídeo nativo Opiorfina) (ver a Figura 19).

EXEMPLO 3 IDENTIFICAÇÃO DOS BIOATIVOS PEPTIDOMIMÉTICOS POTENTES IN VITRO DE OPIORFINA QUE POTENCIALMENTE APRESENTARIAM PROPRIEDADES DE BIODISPONIBILIDADE IN VIVO SUPERIORES AOS PEPTÍDEOS NATIVOS 1. GANHO POTENCIAL EM ADSORÇÃO BIOLÓGICA: TRANSPORTE TRANSMEMBRANA (PASSAGEM NA MEMBRANA CELULAR EPITELIAL E ENDO-EPITELIAL)

[162] Modificações no peptídeo Opiorfina por adição de frações hidrófobas químicas tais como espaçadores polietileno C6, C8, C10 ou C12 permitiriam aumentar sua potência de adsorção biológica in vivo em relação às membranas. Entre todos os compostos testados, NH2-QRF[S-O-Octanoil]R- COOH - NH2-Y(PE12)QRFSR-COOH (PE= [CH2]n; PE12=ácido amino- dodecanoico) mostraram ser inibidores potentes duplos das atividades NEP (atividades específicas Endopeptidase e CarboxiDiDeptidase) e AP-N humanas.

2- GANHO POTENCIAL EM ESTABILIDADE METABÓLICA: DIPEPTÍDEO CISTINA: [CQRFSR]2

[163] O dipeptídeo [CQRFR] apresentou uma potência inibidora pelo menos 2 vezes aumentada em relação às atividades hNEP-Endo e CarboxiDi-peptidase em comparação com o peptídeo monomérico CQRFSR. A sequência dipeptíca permitiria proteger o composto derivado contra a degradação pela aminopeptidase circulante.

[164] Obviamente, diversas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. É, todavia, importante entender que dentro do âmbito das reivindicações anexas, a presente invenção pode ser praticada de uma maneira diferente da que está especificamente descrita aqui.

Claims (6)

1. DERIVADO DE PEPTÍDEO, caracterizado por consistir em: Y-(-HN-(CH2)6-CO-)-QRFSR, ou Y-(-HN-(CH2)12-CO-)-QRFSR.

2. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender pelo menos um derivado de peptídeo, conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. USO DE UM DERIVADO DE PEPTÍDEO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de dores em um sujeito que necessita de tal tratamento, em que o medicamento inibe a atividade de uma membrana metalo-ectopeptidase selecionada a partir do grupo consistindo em NEP e AP-N.

4. USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela dor ser crônica, dor aguda, dor visceral inflamatória ou dor neuropática.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado pela dor ser dor crônica inflamatória selecionada a partir do grupo consistindo em dor de artrite, dor visceral inflamatória, dor da doença inflamatória do intestino, dor de lesão pós-inflamatória e dor neuropática.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a dor neuropática é resultante de um câncer e/ou terapia contra o câncer.

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