KR20110002738A

KR20110002738A - 초임계 이산화탄소를 이용하여 제조한 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 멜라닌합성 저해 활성을 갖는 화장료조성물

Info

Publication number: KR20110002738A
Application number: KR1020090060358A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 문성준; 윤명석; 변상요
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2011-01-10
Also published as: KR101046166B1

Abstract

본 발명은 초임계 이산화탄소를 이용하여 제조한 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 멜라닌합성 저해 활성을 갖는 화장료조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 갯기름나물 뿌리로부터 멜라닌합성 저해활성을 갖는 유용물질을 추출할 때 전통적인 일반 용매(에탄올, 메탄올, 물) 추출방법의 경우보다 더 높은 활성을 나타냄과 동시에 색조성은 향상되고 세포독성은 완화시키는 초임계 이산화탄소를 이용한 방법에 의하여 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것이다.

갯기름나물, 초임계추출, 멜라닌, 색조성, 세포독성, 화장료

Description

초임계 이산화탄소를 이용하여 제조한 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 멜라닌합성 저해 활성을 갖는 화장료조성물 {Cosmectic composition for improving an anti-melanogenesis activity comprising Peucedanum japonicum Thunb. root extract manufactured by Supercritical Carbon dioxide extraction}

본 발명은 초임계 이산화탄소를 이용하여 재조한 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 멜라닌합성 저해 활성을 갖는 화장료조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 갯기름나물 뿌리로부터 유용물질을 추출할 때 멜라닌합성 저해활성은 높아지고, 색조성은 향상되며, 세포독성은 완화시키는 초임계 이산화탄소를 이용하는 방법에 의하여 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것이다.

갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.)은 산형과에 속하는 다년생 식물로서 세계적으로 일본, 대만, 중국, 필리핀등 동아시아의 해변에 자생하고 우리나라에서는 대개 제주도 해안, 서해안의 강하언구나 바닷가 습지에 자생한다. 갯기름나물의 어린 순은 나물등의 식용으로 사용되며 뿌리는 갯방풍(Glehnia littoralis Fr. Schm.)과 함께 한약재의 방풍대용으로 이용하는 약용식물의 하나이고, 이러한 갯기름나물에서 분리된 coumarin계의 물질들은 항경련, 항알레르기 효과(Aida Y et al., Pharmacol, 20, 343-351, 1998)와 항혈소판 활성(Chen IS et al., Phytochemistry, 41, 525-530, 1996)등의 약리활성이 있다고 보고되어 지고 있다. 또한 이것의 잎으로부터 Rutin, Neochlorogenic Acid, Cryptochlorogenic Acid, Chlorogenic Acid 등이 동정되어 보고되었는데, 이들은 항산화 활성을 나타내는 성분들이다(Masashi H et al., J. Agric. Food Chem., 51, 5255-5261, 2003).

멜라닌은 동물, 식물 등에 널리 분포하는 색소로서 사람의 경우 피부색을 결정하는 동시에 유해한 자외선이나 유리기(free radical)로부터 인체를 보호하는 중요한 역할을 담당하고 있다.(Jong Eon Chin et.al., 2006) 멜라닌 색소는 여러 단계의 산화반응을 거쳐 L-티로신(L-tyrosine)으로부터 합성되어지며, 이것의 생합성 기작에는 티로시나아제(tyrosinase) DHICA oxidase(tyrosinase related protein-1, TRP-1), DOPAchrome tautomerase(tyrosinase related protein-2, TRP-2), Catechol-O-methyltransferase(COMT)와 같은 여러 효소들이 관여하고 있다.(Arcoa P. et.al., 1993, Paval S. et. al., 1993, Jimenez Cervants et.al.,1994) 이 중 티로시나아제(tyrosinase)는 L-티로신(L-tyrosine)과 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine,DOPA)를 산화시켜 도파(DOPA)와 도파퀴논(DOPA-quinone)을 생성한다. 각질형성세포에 있는 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색 및 피부색소 침착의 대부분이 결정되므로, 미백소재의 미백효과를 검정하기 위해서는 멜라닌 형성을 억제하는지 여부가 중요하다. 멜라닌 색소의 생합성 기작에 관련된 타이로시나아제의 활성을 저해하는 물질로 arbutin(Maeda K. et al., 1996, Chakraborty AK. et al., 1998), ascorbic acid 및 그 유도체들(Ando S. et al., 1993, Kameyama K. et al., 1996), kojic acid(Cabanes J et al., 1991) 등과 그밖에 많은 천연물들이 보고되고 있으나 이러한 물질들은 불안정하거나 효능이 낮은 단점이 있다.

한편, 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해활성이 존재한다는 일본특허(출원번호: 2002184099)가 이미 보고되어 있다. 하지만, 본 발명자들이 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물을 수득하여 화장품 원료로 사용하기에 적합한 농도 수준인 0.5 ~ 1.0 % (weight/volume) 수준으로 농축한 후, 미백 화장품의 주요 효능 원료로 사용가능 한지 확인하여 본 결과, 몇 가지 문제점들을 발견하게 되었다. 먼저, 미백 화장품에서 충분한 효능을 발휘하기 위해서는 높은 농도로 원료를 처방할 수 없는 한계성이 있었다. 즉, 미백활성을 갖는 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물을 함유한 미백 화장료 개발시 세포실험에서의 유효 농도보다 통상적으로 10배 이상의 더 높은 농도로 처방되어야 인체피부에서도 미백효능이 발휘될 수 있다는 견해가 지배적이다. 그런데 화장품 원료로 사용하기위해 준비된 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물은 검붉은 색조성을 갖고 있었으며, 이것을 미백 화장료 개발을 위해서는 약 5 ~ 10% 수준으로 처방해야 했고, 그 결과 개발된 미백 화장품의 제형은 어둔운 색조를 띠었다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물로부터 멜라닌 합성 저해 활성이 가장 높게 나타나는 정제 분획들을 조사하였다. 그 결과 비극성 성분들이 농축 정제된 헥산(Hexane) 분획이 에틸아세테이트, 부탄올, 물 등을 이용하여 얻은 분획들에 비교하여 가장 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 나타내었는데, 에탄올 추출물 보다 약 17배의 멜라닌 합성 저해 활성이 증가된 것으로 나타났다. 헥산분획을 0.5 ~ 1.0 % (weight/volume) 수준의 농도로 준비하였을 때, 비록 색조는 크게 개선되지 않았지만, 활성의 증가로 인하여 미백 화장료 조성에 더 낮은 농도로 처방은 가능하였다. 그러나 이 경우에는 배양된 피부세포 조건에서 세포독성이 약 10배 이상 증가되는 문제점이 발생하게 되었다. 즉, 높은 농도의 추출물 처방에 의한 피부안전성 문제가 야기될 가능성이 있었다. 이러한 현 문제점들 때문에 갯기름나물 뿌리 추출물은 우수한 미백활성이 확인되었음에도 불구하고 미백 화장품의 주요 효능원료로서 원활히 사용되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 갯기름나물 뿌리로부터 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 갖으면서 색조성은 향상되고, 반면에 세포독성은 완화된 화장품 원료 개발이 필요하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 갖으면서 색조성은 향상되고, 반면에 세포독성은 완화된 고순도 정제 화장품 원료를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 초임계 이산화탄소를 이용하여 갯기름나물 뿌리추출물을 제조할 경우, 에탄올을 이용한 유기용매 추출의 경우에 나타났던 검붉은 추출물 색조성은 완화시키고 또한 헥산을 이용한 유기용매 정제의 경우에 나타났던 세포독성 증가는 감소시키며, 동시에 멜란닌 합성 저해 활성은 향상됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자는 갯기름나물 뿌리를 미백 화장품 원료로 사용 가능한지 검토하기 위하여, 이것의 에탄올 추출물 및 헥산 정제 분획을 준비한 후 멜라닌 합성 억제 효능과 세포독성을 각각 조사하고 또한, 이들을 화장품 원료로 사용하기 위한 적정농도로 농축한 상태에서의 색조성을 조사하였다. 그리고 이들 결과에서 나타난 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물 및 헥산분획의 문제점인 검붉은 색조성과 세포독성 증가를 극복하고자 연구를 계속 한바, 본 발명자는 초임계 이산화탄소를 이용하여 제조한 갯기름나물 뿌리추출물이 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 갖으면서 색조성은 향상되고, 반면에 세포독성은 완화되어 화장품 원료로 사용하기에 적합함을 발견하였다.

즉, 갯기름나물 뿌리 생체원료에 300bar, 60℃의 조건으로 초임계 이산화탄소를 가하여 추출시간 경과에 따른 멜라닌 합성 저해 활성 및 세포독성 그리고 초임계 추출 분획물의 색조성 등을 앞의 유기용매(에탄올, 헥산) 추출물의 경우와 비교 조사하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 최적 추출조건을 규명하였다.

본 발명의 초임계 이산화탄소 추출조건은 갯기름나물 뿌리의 비극성 성분을 추출하는 조건임을 앞선 유기용매 종류별 분획실험에서 간접 확인할 수 있었다. 즉, 갯기름나물 뿌리의 헥산 분획에서 가장 우수한 멜라닌 합성 저해 활성을 나타내었는데, 일반적으로 헥산을 이용하여 얻은 식물 생체 분획물에는 식물의 지질성분을 포함한 물에 녹지 않는 비극성 성분들이 대부분 포함된다고 알려져 있다. 따라서 이번 발명에서 적용된 초임계 이산화탄소 추출조건은 식물 소재로부터 지질성분을 효율적으로 추출할 수 있는 300bar, 60℃의 조건을 적용하게 되었다. 이를 위 하여 유럽특허 제925,724호에 개시된 바와 같이 추출조, 열교환기, 펌프, 이산화탄소 저장조, 칠러(냉각응축기), 감압 분리기 및 감압밸브로 구성된 추출장치를 사용한다. 상기 추출장치에 있어서, 추출조는 갯기름나물 뿌리를 투입하여 추출되도록 하는 역할을 수행하고, 펌프는 초임계 이산화탄소에 압력을 가하는 역할을 수행하며, 열교환기는 초임계 이산화탄소를 가열하는 역할을 수행하고, 감압밸브는 추출기에서 방출된 초임계 이산화탄소를 감압시키는 역할을 수행하며, 감압분리기는 초임계 이산화탄소를 완전히 감압시켜서, 기체상의 이산화탄소를 분리하는 역할을 수행하고, 칠러는 감압된 이산화탄소를 초임계 이산화탄소로 전환시키는 역할을 수행하며, 이산화탄소 저장조는 초임계 이산화탄소를 저장하는 역할을 수행한다.

상기 추출장치를 사용하여 갯기름나물 뿌리로부터 특정성분을 추출하기 위해서는, 먼저 추출조에 원료를 투입하고, 펌프 및 열교환기를 통과한 초임계 이산화탄소를 추출조의 하단에 투입한 다음, 원료에서 추출된 성분과 이산화탄소의 혼합물을 추출조의 상단으로 배출하고, 배출된 혼합물을 감압밸브를 통하여 감압시킨 후, 감압분리기에서 이산화탄소를 기체상으로 분리하여 수거하고, 추출된 성분을 수거하는 단계를 수행하게 된다. 이때, 분리된 이산화탄소는 칠러를 통하여 액체 이산화탄소로 전환되고, 이산화탄소 저장조에 보관되었다가, 다시 펌프 및 열교환기를 이용하여 추출기에 공급하는, 순환 방식으로 특정성분을 추출하게 된다.

본 발명에 의해 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물은 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 갖으면서 색조성은 향상되고, 반면에 세포독성은 완화된 고순도 정제 추출물로서 유기용매를 사용하는 일반적인 추출방법에 비교하여 보다 인체에 무해하고, 자연 환경에 친화적인 초임계 추출방법을 사용함으로서 화장품 원료는 물론 식품 원료로도 활용될 수 있을 것이다.

본 발명은 초임계 이산화탄소를 이용하여 재조한 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 멜라닌합성 저해 활성을 갖는 화장료조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 초임계 이산화탄소를 이용하여 갯기름나물 뿌리로부터 멜라닌합성 저해활성을 갖는 유용물질을 추출할 때 전통적인 일반 용매(에탄올, 메탄올, 물) 추출방법의 경우보다 더 높은 활성을 나타냄과 동시에 색조성은 향상되고 세포독성은 완화시키는 초임계 이산화탄소를 이용한 방법에 의하여 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것이다. 본 발명의 갯기름나물 뿌리의 초임계 이산화탄소 추출방법은 유기용매를 사용하는 일반적인 추출방법에 비교하여 보다 인체에 무해하고, 자연 환경에 친화적인 것으로서 개발된 추출물은 기능성 화장품 원료는 물론 식품 원료로도 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 제조

갯기름나물 뿌리는 제주도 해안가에 자생하는 것을 채취하여 실험에 사용하였다. 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 갯기름나물 뿌리 150g을 80% 에탄올 3L로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과하였다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 건조중량 34.7g 을 얻었다.

실시예 2: 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 용매분획물 제조

실시예 1에서 얻은 갯기름나물 뿌리 에탄올추출물에 대해 용매분획을 실시하였다.

갯기름나물 뿌리의 에탄올추출물 10g을 헥산과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 이용하여 통상적인 방법으로 용매분획을 실시하여 헥산 분획물 3.45g, 클로로포름 분획물 0.19g, 에틸아세테이트 분획물 0.047g, 부탄올 분획물 0.30g, 물 분획물 4.19g을 얻어냈다.

실시예 3: 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물에 대한 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM) 합성 저해 효과

실시예 1에서 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물에 대한 extra-cellular melanin 저해 효과는 다음과 같이 하여 측정하였다. 본 실험에서는 미백효과를 확인하고자 현재 식약청 고시 미백 기능성 원료인 알부틴을 양성대조군으로 하여 실험을 수행하였다. 마우스 유래 B16 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 5 × 10³ 세포 가 되도록 접종하고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양 후 갯기름나물 뿌리 추출물을 농도별로 첨가한 배지로 교체하였다. 72시간 추가 배양한 후 배지로 방출된 멜라닌을 microplate reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물에 대한 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM) 합성 저해 효과

시료	멜라닌 합성 저해 효과 (%)					IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도 (㎍/㎖)
	10	30	50	80	100
갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물	6.4	11.3	26.8	73.6	88.4	58.5
알부틴	18.4	-	39.3	-	55.7	78.7

표 1에서 나타난 바와 같이 식약청에 고시된 미백 기능성 원료인 알부틴보다 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물은 더 우수한 멜라닌 합성 저해 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물에 대한 B16 melanoma 세포에서 intra-cellular melanin (ICM) 합성 저해 효과

실시예 1에서 제조된 갯기름나물 뿌리 추출물에 대한 intra-cellular melanin 합성저해 효과는 다음과 같이 하여 측정하였다. 본 실험에서는 미백효과를 확인하고자 현재 식약청 고시 미백 기능성 원료인 알부틴을 양성대조군으로 하여 실험을 수행하였다. 마우스 유래 B16 흑색종 세포를 6-웰 플레이트에 1 × 10⁵ 세포가 되도록 접종하고 37℃ CO₂인큐베이터에서 24시간 동안 배양 후 갯기름나물 뿌리 추출물을 농도별로 첨가한 배지로 교체하였다. 48시간 추가 배양한 후 각 웰에서 세포를 수확하고 1200rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 상등액을 제거하고 1N NaOH/10% DMSO 용액을 가하여 80℃ 수욕상에서 멜라닌을 녹여내고 microplate reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물에 대한 B16 melanoma 세포에서 intra-cellular melanin (ICM) 합성 저해 효과

시료	멜라닌 합성 저해 효과 (%)			IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도 (㎍/㎖)
	10	50	100
갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물	4.94	31.28	56.80	86.45
알부틴	1.30	8.86	23.56	>100

표 2에서 나타난 바와 같이 B16 melanoma 세포내에서도 식약청에 고시된 미백 기능성 원료인 알부틴보다 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물은 더 우수한 멜라닌 합성 저해 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5: 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 세포 독성 측정

마우스 유래 B16 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 5 × 10³ 세포가 되도록 접종하고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양 후 갯기름나물 뿌리 추출물을 농도별로 첨가한 배지로 교체하였다. 48시간 추가 배양한 후 배지를 제거하고 DPBS(D-phosphate buffered saline)로 세척한 후 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 500 ㎍/㎖를 웰 당 50 ㎕ 씩 첨가하였다. 37 ℃의 10 % CO₂ 조건하에서 4시간 동안 반응시킨 후 MTT 용액을 제거하고 웰 당 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 200 ㎕ 씩 첨가하여 살아있는 세포와 반응하여 생긴 formazan 침전물을 용해시킨 다음 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과가 세포 독성에 의한 오류인지 여부를 판단하기 위하여 B16 melanoma 세포에서 MTT 실험을 수행한 결과, 도 1 에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물은 100㎍/㎖의 농도내에서는 세포독성이 없음을 확인하였다.

실시예 6. 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM)과 합성 저해 효과

실시예 2에서 제조된 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 용매분획물에 대한 extra-cellular melanin (ECM) 저해 효과를 측정한 결과 Hexane 분획물을 제외한 다른 분획물에서는 에탄올 추출물 보다 낮은 멜라닌 합성 저해 효과를 보이거나 세포독성이 매우 강하게 나타났지만, 반면에 Hexane 분획물에서는 세포독성이 나타나지 않는 농도범위에서 에탄올 추출물 보다 훨씬 높은 멜라닌 합성 저해 효과를 보였다.

갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM) 합성 저해 효과

갯기름나물 뿌리 Hexan 분획물	멜라닌 합성 저해 효과 (%)					IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도 (㎍/㎖)
	1	2	4	8	10
ECM	5.25	25.66	55.88	88.86	92.40	3.6

표 3에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 extra-cellular에서 melanin 합성 저해 효과가 동시료의 에탄올 추출물 경우보다 약 17배 이상 높게 향상됨을 확인 하였다.

실시예 7. 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 세포 독성 측정

갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 멜라닌 합성 저해 효과가 세포 독성에 의한 오류인지 여부를 판단하기 위하여 B16 melanoma 세포에서 MTT 실험을 수행한 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리의 Hexane 분획물은 10㎍/㎖의 농도내에서는 세포독성이 없음을 확인하였다.

실시예 8: 갯기름나물 뿌리의 초임계 이산화탄소 추출

초임계 이산화탄소를 이용하여 갯기름나물 뿌리로부터 멜라닌 합성 저해 활성을 갖는 유효 분획을 분리 추출하였다. 실시예 1에서 사용된 동일한 갯기름나물 뿌리의 건조 분쇄된 시료를 이용하여, 300bar, 60℃의 초임계 이산화탄소 추출조건에서 일정 추출시간별로 분획물을 얻고, 이 분획물들의 멜라닌 합성 저해 활성 및 세포독성 그리고 초임계 추출 분획물의 색조성 등을 앞의 유기용매(에탄올, 헥산) 추출물의 경우와 비교 조사하였다. 도에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리의 초임계 이산화탄소 추출의 경우 추출 시간에 따른 수득율은 약 10.4 %로 나타났다. 이러한 결과는 hexane 유기용매 추출의 경우 7.0 ~ 8.8 % 보다 높은 수준 이였다.

실시예 9: 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM) 합성 저해 효과

실시예 8에서 제조된 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 초임계 이산화탄소추출물은 추출시간 경과에 따라서 분획들로 준비하였다. 이들 분획들 중에서 추출시간 17.4분까지 얻은 분획(Fraction 1)과 그 이후로부터 34.8분까지 추출하여 얻은 분획(Fraction 2)에서 가장 높은 extra-cellular melanin (ECM) 저해 효과를 나타내었다. 표 4에서 나타난 바와 같이 fraction 1에서 가장 높은 멜라닌 합성 저해율을 나타내었고, 이러한 결과는 비록 동시료의 hexane 분획보다는 다소 낮지만, 에탄올 추출물 보다는 약 16배 이상 향상된 효과였다.

갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.) 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물에 대한 B16 melanoma 세포에서 extra-cellular melanin (ECM) 합성 저해 효과

갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출 분획	멜라닌 합성 저해 효과 (%)						IC₅₀ (㎍/㎖)
	처리농도 (㎍/㎖)
	5	10	20	40	80	100
Fraction 1	48.34	66.07	89.97	96.88	100.29	97.37	5.4
Fraction 2	1.25	21.30	60.93	90.64	97.18	91.61	17.2

실시예 10: 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 B16 melanoma 세포에 대한 세포독성 측정

갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물에 대한 멜라닌 합성 저해 효과가 세포 독성에 의한 오류인지 여부를 판단하기 위하여 B16 melanoma 세포에서 MTT 실험을 수행한 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출과정에서 선발된 멜라닌 합성 저해 활성이 우수한 분획들(Fraction 1, Fraction 2) 모두 40㎍/㎖의 농도내에서는 세포독성이 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 멜라닌 합성 저해 효능이 가장 우수했던 hexane 분획의 경우에서 문제로 지적되었던 세포독성의 증가를 추출물 농도대비로 약 4배 완화시키는 결과였다. 즉, hexane 분획과 유사한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타낸 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물(Fraction 1)은 미백 화장료 조성물로 처방할 경우 약 4배 더 높은 농도로 처방하여도 피부 안전성을 확보할 수 있게 되었다. 또한 도 5 에서 확인할 수 있듯이 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물은 에탄올 추출물 및 hexane 분획 보다 동일 농도 (화장품 원료로 사용할 수 있는 농도 범위, 0.5 ~ 1%) 조건에서 더 엷은 색조성을 갖는다. 이와 같은 결과들을 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물이 미백 화장료의 주요 활성원료로 사용될 수 있기 위한 조건들을 충족시켜주고 있음을 의미하는 것이다.

실시예 11: 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 B16 melanoma 세포에서 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2의 mRNA 발현 저해 효과

Total RNA 추출은 TRIzol-reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리(12000rpm, 15min)하였다. 상등액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 원심분리(12000rpm, 5min)하여 RNA를 침전시키고 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonat)가 처리된 75%에탄올로 세척한 후 건조시켜 0.1% DEPC 증류수로 녹였다. 260nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, 흡광도260/흡광도280nm의 비율이 1.6~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 선발하여 사용하였다. cDNA 합성은 Improm-Ⅱ^TMcDNA kit (promega, USA)를 이용하여 1㎍의 total RNA를 oligo(dT) primer, dNTP(0.5μM), 1unit RNase inhibitor 그리고 Improm-Ⅱ^TMreverse transcriptase(2U)로 25℃ 에서 5분, 42℃에서 60분, 그리고 75℃에서 10분간 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다.

Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β-actin을 증폭하기 위하여 1㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10X buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl₂, 1unit Taq poylmerase (promega, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃ 30초, 57~62℃ 45초, 72℃ 45초 25 cycles로 반응시켰다. PCR에 의해 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고, 각 밴드의 density는 Quantity One 1-D Image Analysis Software (Bio-rad. USA)를 이용하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 β-actin의 primer 서열은 아래와 같다.

Tyrosinase:

Forward primer; 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3'

Reverse primer; 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3'

TRP-1:

Forward primer; 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3'

Reverse primer; 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3'

TRP-2:

Forward primer; 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'

Reverse primer; 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'

β-actin:

Forward primer; 5'-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3'

Reverse primer; 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3'

도 6에서 나타난 바와 같이 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물은 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 Tyrosinase와 TRP-1의 유전자 발현을 억제하여 멜라닌 합성 저해 효과가 나타나는 것으로 조사되었다.

도 1은 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 세포 독성을 보여주는 그래프이다.

도 2는 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물의 Hexane 분획물에 대한 세포 독성을 보여주는 그래프이다.

도 3은 추출시간 경과에 따른 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 수율변화을 보여주는 그래프이다.

도 4는 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 대한 세포 독성 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물과 동시료의 에탄올 추출물 및 hexane 분획물의 동일농도 조건에서 색조성 비교.

도 6은 갯기름나물 뿌리 초임계 이산화탄소 추출물의 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2 mRNA발현 저해 효과를 보여주는 그래프이다.

Claims

다음단계를 포함하는 제조공정으로 제조된, 색조성이 우수하고 세포독성이 완화된 갯기름나물 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물.

① 35 내지 80℃ 및 200 내지 700 bar의 조건에서 갯기름나물 뿌리에 초임계 이산화탄소를 적용하여 유효성분을 추출하는 단계;

② 상기 갯기름나물 뿌리 추출물과 초임계 이산화탄소의 혼합물로부터 이산화탄소를 기체상으로 분리하여 수거하는 단계.
제1항에 있어서, 추출단계에서 온도는 60℃ 내지 80℃이고, 압력은 300 내지 600 bar의 조건인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.