KR20100135887A

KR20100135887A - Ｂｃｌ-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 ｄｎａ 장해 방지제

Info

Publication number: KR20100135887A
Application number: KR1020107024913A
Authority: KR
Inventors: 마사오 다키타
Original assignee: 유겐가이샤 니시하라
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2008-05-23
Publication date: 2010-12-27
Also published as: CN102036674A; EP2305280A1; US20110059191A1; BRPI0822678A2; EP2305280A4; CN102036674B; WO2009141915A1

Abstract

자외선 등으로 직접적 또는 간접적으로 손상된 DNA를 갖는 세포의 아포토시스를 억제하며, 세포의 조직 수복성을 높여 여러가지 약제에 첨가할 수도 있어, 넓은 응용을 기대할 수 있는 아포토시스 억제제로 하는 것이다. 물 및 에탄올 가용성의 감초 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 표피 세포 등의 아포토시스 억제제로 한다. 아포토시스 억제제는, BCL-2 단백질의 발현에 의한 항아포토시스 인자를 가지고, 자외선에 의한 DNA 장해의 방지성을 갖는다. 표피 세포의 자외선 폭로에 의한 DNA 장해를 경감하고, 더구나 정상적인 피부 세포에 대해서는 이상 또는 나쁜 영향을 부여하지 않는다.

Description

ＢＣＬ-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 ＤＮＡ 장해 방지제{BCL-2 PROTEIN EXPRESSING AGENT, APOPTOSIS INHIBITING AGENT AND AGENT FOR PREVENTING ULTRAVIOLET DNA DAMAGE OF EPIDERMAL CELL}

본 발명은 피부 등의 세포에서의 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제에 관한 것이다.

생약으로서 잘 알려져 있는 감초는, 약용 또는 감미료 원료로서 이용되고, 화장료 등의 피부 외용제의 성분으로서도 이용되고 있다. 또한, 물이나 알코올 수용액 등의 수성 용매로 추출된 감초의 잎의 추출물은, 피부의 섬유 아세포의 콜라겐 산생을 촉진하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

이 작용에 의해 감초 추출물은, 진피 중의 섬유형 콜라겐의 산생을 촉진하여 피부 장력을 유지하고, 또한 콜라겐에 의한 수분 유지 기구를 유지함으로써 피부의 노화를 방지하고 있다(특허문헌 1).

또한, 감초 엑기스는, 피부에서 자외선 장해에 의해 생성되는 멜라닌의 생성을 억제하고, 멜라닌의 배설을 촉진하는 것도 알려져 있으며, 그와 같은 감초 추출물로서, 감초의 뿌리 및 근경을 물추출 여과하고, 분취한 물에 불용인 물추출 잔사를 원료에 이용하며, 그 에탄올 추출물을 유효 성분으로서 이용한 피부 화장료가 알려져 있다(특허문헌 2).

또한 본원의 발명자에 의한 선행기술로서, 감초에 포함되어 있는 미백 성분의 순도를 정제하여 높이고, 특히 리퀴리틴(liquiritin) 이외의 미백 성분을 정선하며, 즉 티로시나아제 저해 활성 이외의 작용에 의해 미백 효과를 높인 미백성 피부 외용제가 알려져 있다(특허문헌 3).

그런데, 피부 그 외의 세포사에 대한 아포토시스는, 프로그램 세포사라고도 칭해지는 것과 같이, 괴사와는 달리, 여러가지 질환의 원인이 되거나, 질환의 증상을 진행시키거나 하는 생명 현상이다. 이 때문에, 질환에 따른 아포토시스를 조정하기 위한 기술이 요망되고, 의약품의 개발도 이루어지고 있다.

예컨대, 암 질환의 치료 등에서 피부에 방사선을 조사할 때, 또는 일상적으로 자외선을 포함하는 강한 태양 광선이 피부에 조사될 때, 정상 세포에도 아포토시스가 유도되는 것이 주지이다.

이러한 정상 세포 및 질환 조직의 세포의 아포토시스를 억제할 수 있으면, 치료 효과나, 일상의 자외선 방지 대책에도 유용하다고도 생각되기 때문에, 아포토시스 억제제의 개발이 진행되고 있다.

아포토시스를 억제하는 유전자로서는, BCL-xL, BCL-2, BCL-w, IAP 등을 들 수 있다.

이 중, BCL-2 유전자는, 염색체 18q21.3에 있고, 당초에 발견된 여포성 림프종(Bcell lymphoma/leukemia)에 기인하여 「BCL」이라고 명명되어 있으며, 이 유전자가 코드하는 약 26 kD의 단백질은 「BCL-2 단백질」이라고 칭해지고 있다.

BCL-2 단백질은, 세포질(핵막 주위를 포함함)에서 발현되고, 정상 세포에서는 미토콘드리아의 외막 표면에 존재하여 아포토시스 억제 인자로서 작용하며, 특히 종양 세포 등의 이상이 있는 경우뿐만 아니라, 정상 세포에서도 신경계, 장 점막, 표피 기저층 등에서 볼 수 있다.

또한, BCL-2 유전자는, 색소 줄기 세포의 유지에 필수적인 유전자이고, 그 결손에 의해 털의 백발화가 일어나는 것이 알려져 있다. 즉, 모포의 색소 줄기 세포는, 멜라닌을 생성하는 성숙한 색소 세포와 함께 성장하지만, BCL-2 결손 마우스에 의한 실험 결과에 따르면, 발생을 거쳐 니치에 국재한 멜라닌 아세포가, 색소 줄기 세포로서 휴면 상태에 들어가는 순간에 BCL-2 유전자가 생존에 필수이다.

또한, BCL-2 유전자 결손 마우스에서는, 멜라노사이트의 아포토시스에 의한 체모의 백색화를 비롯하여, 신경계, 림프구, 소장 등의 여러가지 조직에서의 아포토시스의 항진이나 신부전 등의 증상도 보여지는 것이 알려져 있고, 이들 조직이나 세포의 유지에 BCL-2의 기능이 중요한 것이 알려져 있다(특허문헌 4).

또한, BCL-2는, 신체의 대부분의 조직에서 정상적으로 발현되고, 그곳에서 장수 세포의 생존을 유지하는 생리학적 역할을 담당하고 있다. 생존이 BCL-2에 의해 조절되고 있는 세포의 타입에는, 면역화의 사이에 형성되는 「기억(memory)」, 림프구, 뇌 내 및 근육, 및 기관의 기능을 제어하는 말초 신경 내의 대부분의 타입의 뉴런, 골수 세포, 피부, 위장관의 내측에 존재하는 흡수 세포가 되는 줄기 세포가 있는 것이 알려져 있다(특허문헌 5).

[특허문헌]

특허문헌 1: 일본 특허 공개 제2000-191498호 공보(청구항 1)

특허문헌 2: 일본 특허 공개 평성 제10-194959호 공보(단락 0005, 단락 0014)

특허문헌 3: 일본 특허 공개 제2006-028157호 공보(단락 0016)

특허문헌 4: 일본 특허 공개 제2002-080382호 공보

특허문헌 5: 일본 특허 공개 제2003-176236호 공보

그러나, 상기한 BCL-2 단백질의 발현성 또는 아포토시스의 억제성에 대해서, 상기한 감초 추출물에 관련된 지견은 없고, 특허문헌 1∼3에서 알려진 미백 작용이나 노화 방지 작용은, BCL-2 단백질의 발현(이하, BCL-2의 발현, 또는 BCL-2 발현이라고 약기하는 경우가 있음)에 의한 항아포토시스성에 의해 발휘되는 작용과는 달리, 생세포에 대한 콜라겐 산생의 촉진이나 멜라닌 산생을 억제하는 작용에 의한 것이었다.

이와 같이 감초의 수성 용매 추출물의 이용 기술로서는, 자외선 등으로 손상된 표피 세포의 BCL-2 단백질의 발현성이나 이상 아포토시스를 억제한다는 것에 대해서는 기술적으로 확립되어 있지 않다고 하는 것이 문제이다.

그래서, 본 발명의 과제는, 상기한 문제점을 해결하여 세포의 BCL-2 단백질의 발현을 항진시키고, 또한 자외선 등으로 직접적 또는 간접적으로 손상된 DNA를 갖는 세포의 아포토시스를 억제하며, 세포의 조직 수복성을 높여 여러가지 약제에 첨가할 수도 있어 넓은 응용을 기대할 수 있는 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제로 하는 것이다.

본 발명의 BCL-2 단백질 발현제 및 아포토시스 억제제는, 본원의 발명자가, 표피 세포의 증식성(PCNA), BCL-2의 발현, 표피 세포의 아포토시스 억제성이 각각 인정되는 것, 및 표피 세포의 자외선 폭로에 의한 DNA 장해를 경감하고, 더구나 정상적인 피부 세포에 대해서는, 이상 또는 나쁜 영향을 부여하지 않는다고 하는 성질을 후술하는 실험 방법과 그 결과에 기초하여 발견한 것에 의해 완성된 것이다.

즉, 본 발명에서는, 물 및 에탄올 가용성의 감초 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 또는 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제로 함으로써, 상기한 과제를 해결한 것이다.

본 발명에서의 유효 성분으로서 채용되는 감초 추출물은, 정상적인 표피 세포에 대하여 무해 또한 안전한 것이며, 즉 정상적인 표피 세포에서의 세포 증식능이나 아포토시스에 유의한 변화를 부여하지 않고, 화장료 등에 첨가하여도 정상적인 표피 세포에 대해서는 아포토시스를 억제하는 것과 같은 현저한 작용을 미치지 않는다.

즉, 종래의 화장료의 사용 방법에서는, 적극적으로 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 또는 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제로서 사용되지 않고, 그 작용은 확실하게는 달성되지 않았던 것이다.

그런데 자외선 조사에 의해 DNA 등에 장해를 일으킨 세포에 대하여, 본 발명의 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 또는 자외선 DNA 장해 방지제는, 유의하게 표피 세포를 증식시켜 조직을 수복하고, 아포토시스 억제 인자인 BCL-2를 발현시키며, DNA를 상처 입히는 티민 다이머(thymine dimer)의 형성을 저해한다.

표피 세포의 DNA 장해의 저지성에 대해서는, 후술하는 표 3에 나타내는 바와 같이, T-T 다이머 양성 세포의 출현이 무처치군보다 처치군에서 유의하게 저하하고 있는 것으로부터도 분명하다.

이러한 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 또는 DNA 장해 방지제는, 표피 세포에 대하여 유효하고, 표피 세포의 DNA 장해를 방지하며, BCL-2 단백질을 발현시키고, 아포토시스를 억제한다.

이와 같이 색소 줄기 세포에 대한 피부용 BCL-2 단백질 발현제에 따르면, BCL-2 유전자가 색소 줄기 세포의 생존에 필요한 시기에 공급되도록 작용한다고 생각되고, 결과적으로 보아도 표피 세포에서의 색소 줄기 세포가 유지됨으로써 멜라닌이 생성되어, 가령에 따른 생리적인 털의 백발화를 방지할 수 있다.

또한, 본 발명의 BCL-2 단백질 발현제는, 인간이나 동물의 여러가지 조직이나 세포에서의 BCL-2 유전자에 의한 단백질의 발현에 의해 개선이 인정되는 여러가지 처방에서 사용할 수 있는 것이고, 예컨대 장기 치료, 줄기 세포를 포함하는 여러가지 세포의 장수화에 의한 여러 증상의 개선이나 건강 유지, 피부나 모발 등의 미용적 개선 그 외 여러가지 처방에 적용할 수 있는 범용성을 갖는 것이다.

본 발명은 물 및 에탄올 가용성의 감초 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 BCL-2 단백질 발현제 또는 아포토시스 억제제로 하였기 때문에, 자외선 등으로 직접적 또는 간접적으로 손상된 DNA를 갖는 세포의 아포토시스를 억제하고, 세포의 조직 수복성을 높여 여러가지 약제에 첨가하여 넓은 응용을 기대할 수 있는 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 또는 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제가 된다고 하는 이점이 있다.

또한, 본 발명의 BCL-2 단백질 발현제는, 피부 세포 이외의 체세포에 대해서도 장수화 효과가 있고, 그와 같은 세포의 소재에 따라 건강 상의 개선 효과가 있다고 하는 이점도 있다.

본 발명에 이용하는 감초는, 스페인, 시베리아, 중국 등에 생산되는 콩과의 약용 식물인 감초를 건조하여 보존성을 높인 생약이며, 그 학명은 글리실리자 우라렌시스 피셔(Glycyrrhiza urarelensis Fischer) 또는 글리실리자 글라브라 엘 바 글란더리페라 레그 에 헤르드(Glycyrrhiza glabra l var. glandulifera REG.Et HERD)라고 칭해지는 식물 또는 그 근연종이다. 이 식물의 바람직하게는 뿌리 또는 근경(포복경 또는 스톨론(stolon)이라고도 불림)을 껍질이 붙은 상태, 또는 코르크 껍질을 제거하여 분쇄 혹은 마쇄하여 분말형으로 한 것, 이들을 물 혹은 에탄올 또는 그 외의 수성 용매로 추출한 것을 유효 성분의 추출 재료로서 이용할 수 있다. 일반적인 감초 추출물의 피부에 대한 안전성은 잘 알려져 있는 바이다.

본 발명에서 유효 성분을 추출하기 위해 이용하는 용매는, 물(중성, 약산 또는 약알칼리성 중 어느 것이어도 좋음) 또는 물을 주성분으로 하여 적절히 다른 용매(유기 용매여도 좋음)를 첨가한 수성의 추출 용매이며, 알코올 함유의 수용액 등도 채용할 수 있다. 알코올로서는, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, t-부탄올 등의 주지의 알코올 용매를 들 수 있다. 또한, 이들 용매로 추출된 유효 성분은, 모두 물 및 에탄올(=에틸 알코올)에 가용성이다.

이러한 수성 용매에 의한 추출 조작은, 추출 효율을 높이기 위해 온수 또는 열수의 상태에서 행하는 것이 바람직하다. 특히 100℃ 이상, 바람직하게는 100∼130℃에서 추출 조작을 행하면, BCL-2 단백질 발현, 아포토시스 억제 또는 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지에 유효한 성분이 효율적으로 추출된다.

추출 공정에서, 추출액을, 활성탄 등의 흡착제로 여과하거나, 또는 고체와 액체의 비중차, 중력 또는 원심력에 의한 침강 속도의 차를 이용하여 고액(固液) 분리하고, 현탁 물질을 제거하는 것이 바람직하다.

흡착제로서는, 활성탄 등과 같이 다량의 정흡착을 일으키게 하는 것과 같은 계면을 제공하는 물질이면 좋고, 상기한 바와 같이 하여 얻어진 투명성 액체를 농축하여 재차 물이나 에탄올 등으로 희석한 뒤, 농축에 의해 생긴 불용물을 여과 등으로 분리 제거하여, 정제를 보다 완전한 것으로 하는 것이 바람직하다. 흡착제의 구체예로서는, 활성탄과 같은 다공질체로 이루어지는 무기계 흡착제 외에도 합성 흡착제(유기계 흡착제)를 들 수 있다.

무기계 흡착제로서는, 활성 알루미나, 실리카 겔, 산화 티탄 등의 금속 산화물, 환원물, 수산화물, 벤토나이트, 산성 백토 등의 점토 광물, 규조토, 탈크 등의 벽개성이 있는 함수 규산염 광물을 들 수 있다.

활성탄은, 그 재질을 특별히 엄선하여 사용하는 것은 아니지만, 목탄, 대나무 또는 야자 껍질을 원료로 한 것은, 미소 입자로 이루어지는 현탁 물질의 흡착 효율이 좋아 바람직한 것이다.

합성 흡착제는, 미세한 연속 구멍이 입자의 내부까지 형성된 이온 교환 수지제의 입자로 이루어지고, 방향족계의 가교 스티렌계의 다공질 중합체, 방향족 중합체의 방향핵에 브롬 원자를 화합시킨 치환 방향족계의 것, 또는 메타크릴산에스테르 중합체를 골격으로 하는 친수성 흡착재로 하는 아크릴성의 것 등을 들 수 있다.

이와 같이 현탁 물질을 제거하는 고액 분리 그 외의 조작으로서는, 활성탄의 입자를 채운 컬럼 등의 용기에 추출액을 통과시키거나, 또는 추출액에 활성탄 분말(필요에 따라 탈크 등의 여과 보조제)을 부가하여 교반하고, 그 혼합물을 여과지나 여포 등의 상기 활성탄의 분말 입자를 포착하는 필터로 여과하는 방법도 채용할 수 있으며, 그 외에도 원심 분리나 침강 속도차에 의한 주지의 고액 분리 수단을 채용하여도 좋다.

수성 용매 추출물에 대한 농축 조작은, 감압 조작이나 가열 농축 등의 주지의 농축 수단을 채용할 수 있다. 농축 비율은, 2∼100배 정도, 특히 5∼50배 정도인 것이 바람직하고, 통상, 10배 정도 농축하는 것이 바람직하다.

얻어진 농축물은, 상기한 수성 용매 추출액 또는 그에 상당하는 수성 용매로 재차 희석하는 것이 바람직하다. 희석률은 특별히 한정할 필요는 없지만, 예컨대 농축 전의 용적으로 되돌리는 정도의 희석률이 바람직하다고 생각되고, 예컨대 2∼100배 정도이다. 그리고, 상기 농축과 희석의 조작을 1공정으로 하여, 2공정 이상 반복하여 행하는 것이 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어진 액체를, 더욱 정제하기 위해서는, 농축한 후, 추출 용매로서 에탄올 농도 99.5％ 이상의 무수 알코올을 이용하는 것이 바람직하다.

고액 분리하여 얻어진 에틸알코올 가용성 성분을 피부 외용제로서 조제하기 위해서는, 적당한 친수성·친유성이 있으며, 피부 부착성이 좋은 피부 외용제용의 기제에 혼화하거나, 또는 추출액을 크림, 연고, 유액 등의 기재에 혼합하면 피부에 도포할 수 있는 제제 형태로 조제할 수 있다.

본 발명의 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제의 제제 형태로서는, 특별히 한정하는 것은 아니며, 예컨대 외용제로서 주지의 형태를 취할 수 있고, 수용성액, 유액, 크림, 연고, 파우더 등과 같이 피부에 대하여 도포가 용이한 제제 형태로 하는 것은 바람직한 것이다.

또한, 상기 화장료로서의 사용의 외에, 본 발명의 BCL-2 단백질 발현제는, 예컨대 주사제, 흡입제, 경구제, 좌제, 연고 등의 의약품, 의약 부외품의 제제 형태로 할 수도 있고, 각 제제에 통상 이용되는 주지의 성분을 혼합하여 사용할 수도 있다.

후술하는 바와 같이, 물 및 에탄올 가용성의 감초 추출물의 BCL-2 단백질 발현제, 아포토시스 억제제 및 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제로서의 유효 성분은, 최종 농축물을 건조시킨 물(건조 고형물)로서의 배합 중량％이며. 피부에 대하여 0.1∼10 중량％라고 하는 농도로 처방되도록 배합하는 것이 바람직하다.

<실시예>

[감초 추출액(T) 실생산의 제조 방법]

1) [동북 감초각 200 ㎏에 물 2000 리터(이하, 리터를 L로 나타냄)를 부가하고, 95℃에서 2.5시간 추출하며, 추출액을 제진동체(300 메시, 스테인레스제)로 여과하였다. 얻어진 추출 여액을 농축(액온 60℃ 이하, 감압)하고, 농축액(스프레이드라이 원액)을 분무 건조하여, 건조 엑기스를 얻었다. 이것을 체질(60 메시, 스테인레스제)하여, 수량 20 ㎏의 감초 건조 엑기스(T원)를 얻었다.

2) 1)에서 얻은 동북 감초 건조 엑기스(T원) 20 ㎏에 약전 에탄올 100 L를 부가하고, 6시간 교반하고, 2호 여과지로 여과하였다.

3) 여액에 약전 에탄올을 부가하여 100 L로 하고, 활성탄(입자형 백로 KL) 4.5 ㎏를 부가하여 3시간 교반하고, 2호 여과지로 여과하였다. 이 공정을 3회 반복하여 행하였다.

4) 3)에서 얻어진 여액에 약전 에탄올을 부가하여 100 L로 하고, 이것을 10 L로 농축(50℃ 이하, 감압)하였다. 더욱 활성탄(입자형 백로 KL) 400 g을 부가하여 2시간 교반하고, 2호 여과지로 여과하였다. 이 공정을 6회 반복하여 행하였다.

5) 4)에서 얻어진 여액에 약전 에탄올을 부가하여 10 L로 하고, 2 L까지 농축하였다. 이것에 약전 에탄올 1 L와 활성탄(입자형 백로 KL) 100 g을 부가하여 3시간 교반하고, 2호 여과지로 여과하였다.

6) 5)에서 얻어진 여액에 약전 에탄올을 부가하여 2 L로 하고, 활성탄(입자형 백로 KL) 100 g을 부가하여 3시간 교반하고 2호 여과지로 여과하였다.

7) 6)에서 얻어진 여액에 약전 에탄올을 부가하여 2 L로 하고, 5호 여과지로 여과하였다.

8) 7)에서 얻어진 여액을 농축(40℃ 이하, 감압) 건고한 후 물 300 mL를 부가하여 추출(진탕, 실온)하고 5호 여과지로 여과하였다. 이 공정을 3회 행하였다.

9) 8)에서 얻어진 여액은 1 L로 하였다.

9)에서 얻어진 여액 250 mL를, 중탕에 의해 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(37.1 g)에 99.5％ 무수 에탄올(고니시 가부시키가이샤) 1 L를 부가하고, 에탄올 가용성 분획을 취하여 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(21.5 g)로 하였다. 이것에 정제수 50 mL와 활성탄(와코쥰야쿠샤 제조: 활성 탄소 분말) 50 g을 부가하여 교반하며, 75 g의 탈크(마루이시세이야쿠샤 제조)를 부가하여 추가 교반한 후, 여지로 여과하였다. 얻어진 여액을 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(14.7 g)에 99.5％ 무수 에탄올(고니시 가부시키가이샤) 400 ㎖를 부가하고, 에탄올 가용성 분획을 취하여, 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(11.7 g)에, 정제수 50 mL와 활성탄(와코쥰야쿠샤 제조: 활성 탄소 분말) 30 g을 부가하여 교반하며, 50 g의 탈크(마루이시세이야쿠샤 제조)를 부가하여 더욱 교반하였다. 그 후, 여지로 여과하고, 얻어진 여액을 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(8.6 g)에 99.5％ 무수 에탄올(고니시 가부시키가이샤) 400 ㎖를 부가하여 에탄올 가용성 분획을 취하여, 95∼100℃로 가열하여 얻은 농축물(5.2 g)로 하였다. 이 농축물 2.0 g에 정제수를 부가하여 60 g로 한 것을 시료로 하였다.

감초 추출물의 유효 성분에 대해서는, 상기 최종 농축물(5.2 g)을 건조시킨 물의 배합 중량％로서 환산하면, 피부에 대하여 0.1∼10 중량％라고 하는 농도의 범위에서 접촉시키는 것이 본 발명의 효과를 얻기 위해 유효하다고 생각된다.

[평가 실험(1) 방법]

1) 4주 연령의 C56BL6 웅성 마우스(니혼 SLC)를 일주일 순화한 후, 제모 후 군 나누기를 행하였다. 실험군은 제1군부터 제5군까지의 5군이며, 각 군 마우스 15마리를 이용하였다.

제1군(비교예): 자외선 조사 전후 PBS 도포

제2군(실시예): 자외선 조사 전 시료 도포

제3군(실시예): 자외선 조사 후 시료 도포

제4군(실시예): 자외선 조사 전후 시료 도포

제5군(비교예): 제모만

2) 시료는 4℃ 보존하여 도포 전에 실온으로 되돌렸다.

3) 자외선 조사에서는, 전체 파장 자외선(UV-A, -B, -C)을 조사하여 피부에 급성 자외선 장해를 야기시키지만, 그때, 시료를 자외선 조사 전 24시간 혹은 조사 직후에 마우스 피부에 도포하여 급성 자외선 장해의 변화를 검토하였다.

4) 제모 부위는 늑골이 있는 흉추 하연과 척추의 교점을 중심으로 하는 2 ㎝ 평방이며 제모 면적은 4 ㎠이다. 제모는 전동 면도기(내셔널)를 이용하여 행하고, 면도칼은 사용하지 않았다.

5) 자외선 조사는, 자외선 발생 장치(XX-15BLB, UVP Co, Tokyo, Japan)를 이용하고, 자외선 강도 11 ㎽/㎠(조사 거리 5 ㎝)로 1.5분간 조사하였다. 이때의 자외선 조사량은 1.0 J/㎠이다.

6) 조사 시에는 넴부탈(mg/mouse 피하 주사)로 마우스에게 마취를 건 뒤에, 사지를 테이프 고정하여 조사 중의 체위의 안정을 유지하였다.

7) 시료는 200 ㎕를 면봉으로 제모부에 전량을 건조시키면서 도포하였다.

8) 마우스는 자외선 조사 후 24시간 뒤에 경추 탈구에 의해 도살하고, 제모부 피부를 그 주위 비제모부를 포함하여 근막 상에서 박리하며, 고무 플레이트 상에 진전하고, 10％ 포르말린으로 24시간 고정하였다.

9) 피부 절편은 표본 중앙부로부터 폭 4 ㎜의 조직을 추출하여 파라핀 포매 블록을 제작하고, 3 ㎛ 두께의 박절 표본을 제작하였다.

10) 박절 표본으로부터, 헤마톡실린핵 염색(이하, HE 염색이라고도 약칭함) 및 면역 염색을 행하였다.

11) 면역 염색에는 이하의 항체를 사용하고, 표와 같이 항원 부활, 희석을 행하였다. 항체 희석, 세정에는 Optimax Wash Buffer(Biogenex)를 사용하였다.

항체명 클론 처리 농도

PCNA(DAKO) PC10 시트르산-MW 1/50

BCL-2(DAKO) 펩신 1/100

ss-DNA(IBL) 펩신 1/200

T-T 다이머(공여) 펩신 1/200

12) 면역 염색의 프로토콜은 이하와 같다.

1: 탈파라핀, 가수

2: 항원 부활

3: 0.3％ H2O2-메탄올 처리

4: 1차 항체 처리

5: 세정

6: 2차 항체 처리

7: 세정

8: DAB 발색

9: 헤마톡실린핵 염색

10: 봉입

13) HE 염색에 의한 조직 병리 평가에는 독성 병리 인정의의 확인을 얻었다.

14) 면역 염색의 판정

(1) PCNA, ssDNA 및 D-D 다이머에 대해서는 표피 세포 전층을 포함하여 500 세포를 현미경 하에 관찰하여 핵에 양성 소견이 있는 것을 양성으로 하였다.

이와 관련하여, PCNA(증식 세포핵 항원)는, 세포 증식능을 나타내고, 세포 주기를 통해 비교적 안정적이며, 비증식 세포 중에서는 매우 낮은 레벨로 안정되고 있지만, 세포 분열 주기에 들어서면 급격히 증가하기 때문에, 비증식 세포 집단으로부터 증식 세포 집단에의 이행을 검출할 수 있는 표지가 된다.

(2) BCL-2에 대해서는 표본 내의 비제모부 피부(=비자외선 조사부)에서의 BCL-2 발현과 비교하여 면역 반응이 강한 것을 양성으로 하였다. 염색 강도가 비조사부 표피보다도 낮은 경우를 음성, 같은 정도부터 2배 이하를 양성, 2배 이상을 강양성으로 하였다.

[실험 결과]

상기 실험 방법에 따른 형태학적 변화에 대해서, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 즉, 마우스 피부 자외선 조사에서의 표피 세포의 변화에 미치는 시료의 영향을 형태 변화에 대해서 조사하였다.

표 1에 나타낸 결과로부터도 알 수 있듯이, 정상 마우스 표피는 1층의 기저 세포층과 1-2층의 유극층으로 이루어져 있었다. 제5군(제모만)에서는, 이 정상 소견이 유지되며 염증 세포도 보이지 않았다.

제1군(조사+PBS 처리)에서는, 표피의 기본적 구축은 유지되고, 명확한 미란 형성, 표피 세포 괴사는 보이지 않았다. 그러나, 진피 표층으로부터 표피 내에 경도의 염증 세포 침윤이 보여지고, 자외선 조사에 따른 염증성 변화로 간주되었다.

제2군(조사+시료 전도포)에서는, 표피의 형태적 변화는 보이지 않고, 염증 세포 침윤은 제1군보다도 경도였다.

제3군(조사+시료 후도포) 및 제4군(조사+시료 전후도포)에서는, 표피는 주로 유극층의 증가에 따라 8-10층으로 비후하고 있지만, 구성 세포에 이형성은 보이지 않고, 조직 구축도 유지되고 있다. 염증 세포 침윤도 제1군(조사+PBS 처리)보다도 경도였다.

또한, 염증 세포 침윤에 대해서는, 제1군(조사+PBS 처리)에 보여지는 것으로부터 자외선 조사에 의한 세포 장해에 의한 염증 반응이라고 생각되었다. 한편, 시료 도포군, 특히 조사 후 도포를 행한 제3군, 제4군에서 염증 세포 침윤이 감소하고 있어, 시료 도포에 의해 염증이 억제되고 있는 것으로 보여졌다.

표피 세포 증식 능력에 대해서, 마우스 피부 자외선 조사에서의 표피 세포의 변화에 미치는 시료의 영향을 세포 증식능과 아포토시스에 대해서 조사하였다.

즉, 표피 세포 증식능은 면역 염색에 의한 PCNA 양성 세포수에 의해 검토하였다.

또한 표피 세포의 아포토시스는, single strand DNA(ssDNA) 면역 염색법에 따라 DNA가 단편화한 양성 세포 빈도(아포토시스 세포(％))를 구하고, 그 결과를 표 2 중에 병기하였다.

표 2의 결과로부터도 알 수 있듯이, PCNA 양성 세포가 제5군(제모만)에서는, 기저 세포층에만 보이며 양성 빈도는 6±4％였다. 이에 대하여, 자외선 조사를 행한 제1군(조사+PBS 처리), 제2군(조사+시료 전도포), 제3군(조사+시료 후도포) 및 제4군(조사+시료 전후도포)에서는, PCNA 양성 빈도는 각각 14±5％, 13±4％, 15±6％, 17±6％이고, 제5군(제모만)과 다른 군의 사이에 유의차가 보여졌다(P<0.001). 그러나, 시료를 도포한 제2∼4군에서는, 도포하지 않은 제1군과 같은 PCNA 양성 세포의 증가가 보여지고, 그것으로부터 자외선 조사를 행하면 세포 장해에 대한 세포의 조직 수복 반응이 어떠한 경우도 일어나는 것으로 생각되었다.

표피 세포의 아포토시스에 대해서는, ssDNA 양성 세포는 제5군(제모만)에서는 유극층에 극히 소수만 보이며 3±2％였다. 이에 대하여, 자외선 조사를 행한 제1군(조사+PBS 처리)에서는 32±12％로 고빈도였다.

한편, 시료를 조사 전에 도포한 제2군(조사+시료 전도포)에서는, ssDNA 양성 아포토시스 세포 빈도는 24±8％로 비조사 컨트롤의 제5군보다 유의하게 고빈도였다.

또한, 시료를 조사 후에 도포한 제3군(조사+시료 후도포) 및 제4군(조사+시료 전후도포)에서는, ssDNA 양성 아포토시스 세포 빈도는 각각 6±6％, 4±4％로 제1군(조사+PBS 처리), 제2군(조사+시료 전도포)보다도 유의하게 저하하고 있으며, 제5군(제모만)과의 사이에 유의차는 보이지 않았다.

이들 결과를 종합하면, 실시예의 시료를 조사 후에 도포한 제3, 4군에서는, 표피 세포의 아포토시스가 억제되고, 또한 반응성 증식성 변화의 양자가 상승적으로 작용하여 표피의 비후가 보인 것으로 생각되었다.

다음에, 표피 세포에서의 BCL-2의 발현에 대해서, 마우스 피부 자외선 조사에서의 표피 세포의 변화에 미치는 시료의 영향을, Bcl-2 발현과 자외선 DNA 장해에 대해서 조사하고, 또한, 아포토시스를 억제하는 인자로서 널리 인식되어 있는 BCL-2의 발현을 면역 염색에 의해 조사하여, 결과를 표 3에 나타내었다.

BCL-2 발현은, 제5군(제모만)에서는 기저층에 극히 미약하게 보였다. 자외선 조사를 행한 제1군(조사+PBS 처리)에서도 기저층에 미약한 발현이 보였지만, 제5군과의 분명한 차이는 보이지 않았다.

한편, 시료를 조사 전에 도포한 제2군(조사+시료 전도포)에서는, BCL-2 발현은 양성이며 컨트롤의 제5군 및 조사만한 제1군보다 발현 강도·양성 세포수 모두 유의하게 증강하고 있었다. 이에 대하여, 시료를 조사 후에 도포한 제3군(조사+시료 후도포) 및 제4군(조사+시료 전후도포)에서는, BCL-2 발현은 모두 강양성이고, 제1군(조사+PBS 처리), 제2군(조사+시료 전도포), 제5군(제모만)의 사이에 명료한 차이가 보여졌다.

표피 세포에서의 자외선 조사에 의한 DNA 장해에 대해서는, 자외선, 특히, 고에너지의 UVC에 의해 핵내 DNA에 티민 다이머(T-T 다이머)의 형성이 생기는 것이 알려져 있기 때문에, 항T-T 다이머 항체를 이용하여 조사 후의 T-T 다이머의 형성을 검토하였다.

T-T 다이머 양성 세포는, 제5군(제모만)에서는 전혀 보이지 않았다. 이에 대하여, 자외선 조사를 행한 제1군(조사+PBS 처리)에서는 16±8％로 고빈도였다.

한편, 시료를 조사 전에 도포한 제2군(조사+시료 전도포)에서는, T-T 다이머 세포 빈도는 9±6％로 비조사 컨트롤의 제5군보다 유의하게 고빈도였다.

이에 대하여, 시료를 조사 후에 도포한 제3군(조사+시료 후도포) 및 제4군(조사+시료 전후도포)에서는, T-T 다이머 세포 빈도는 각각 4±4％, 4±3％로 제1군(조사+PBS 처리), 제2군(조사+시료 전도포)보다도 유의하게 저하하고 있으며, 제5군(제모만)과의 사이에 유의차는 보이지 않았다.

이상의 것으로부터, BCL-2는 시료의 도포에 의해 유의하게 발현하고, 시료 도포(특히 자외선 조사 후의 시료 도포)에 의해 자외선 조사에 의한 DNA 장해를 저지하고 있다고 보여졌다. 또한, BCL-2는, DNA 장해를 저지하는 효력은 없기 때문에, 시료 도포는 BCL-2 발현과 DNA 장해의 저지 효과를 각각 별개로 가져오는 것으로 생각되었다.

그리고, 자외선 조사에 의해 표피에는 T-T 다이머의 형성에 의한 DNA 장해가 야기되고, 그 때문에 아포토시스가 유도되어, 수복 반응으로서 증식능이 항진되고 있는 것이 확인되었다.

한편, 시료를 조사 후 도포한 제3군·제4군에서는, 아포토시스의 억제가 보이고, 그 원인으로서 항아포토시스 작용을 갖는 BCL-2 발현의 항진, 및 T-T 다이머의 감소가 생각된다. 그 반면, 표피 증식능은 비도포군과 마찬가지로 항진되고 있으며, 형태학적인 표피의 과형성성 변화, 즉 비후를 나타내고 있다고 생각되었다.

조사 전에 시료를 도포한 제2군에서는, 조사 후 도포만의 제3군과 비도포 조사의 제5군과의 중간적인 값이었다. 또한, 조사 전후에 도포를 행한 제4군에서는 제3군과 비교하여 상가적 효과는 보이지 않았다. 이 원인으로서, 도포 후의 핥아 없애는 행동 등에 의한 투여의 불완전함도 가능성으로서 생각되었지만, 비자극 시의 표피에는 작용이 경미하게 그친다고도 생각되었다.

(평가 실험 2): 정상 피부에 대한 시료의 효과

실험 1에서는, 자외선 조사라고 하는 스트레스 상태의 피부에서의 시료의 효과를 검토하였지만, 시료의 비스트레스 시의 작용을 보기 위해, 제모만을 행한 피부에 대하여 시료를 도포하였다. 시료 도포를 3회/주, 4주간 시행한다고 하는 비교적 장기간 연속적인 투여 프로토콜에서의 변화를 형태학적 및 실험 1에서의 면역 염색에 의한 검토를 행하여 평가하였다.

[실험 방법]

1) 4주 연령의 C56BL6 웅성 마우스(니혼 SLC)를 1주일 순화한 후, 제모 후 군 나누기를 행하였다. 실험군은 시료 도포군, PBS 도포군의 2군이며, 각 군 마우스 15마리를 이용하였다.

제1군(비교예): PBS 도포

제2군(실시예): 시료 도포

2) 시료는 4℃ 보존하여 도포 전에 실온으로 되돌렸다.

3) 제모 부위는 늑골이 있는 흉추 하연과 척추의 교점을 중심으로하는 2 ㎝ 평방이며 제모 면적은 4 ㎠이다. 제모는 전동 면도기(내셔널)를 이용하여 행하고, 면도칼은 사용하지 않았다.

4) 시료는 200 ㎕를 면봉으로 제모부에 전량을 건조시키면서 도포하였다. 도포는 1일 1회, 활동성이 높지 않은 9시에 행하고 3회/주, 4주간 행하였다.

5) 마우스는 자외선 조사 후 24시간 후에 경추 탈구에 의해 도살하고, 제모부 피부를 그 주위의 비제모부를 포함하여 근막 상에서 박리하며, 고무 플레이트 상에 진전하고, 10％ 포르말린으로 24시간 고정하였다.

6) 피부 절편은 표본 중앙부로부터 폭 4 ㎜의 조직을 추출하여 파라핀 포매 블록을 제작, 3 ㎛ 두께의 박절 표본을 제작하였다.

7) 박절 표본으로부터, HE 염색 및 면역 염색을 행하였다.

8) 면역 염색은 실험 1과 동일한 검토를 행하였다.

9) 면역 염색의 프로토콜은 실험 1과 동일하다.

10) HE 염색에 의한 조직 병리 평가에는 독성 병리 인정의의 확인을 얻었다.

11) 면역 염색의 판정. 실험 1과 동일하게 행하였다.

[실험 결과]

1) 형태학적 변화에 대해서, 마우스의 정상적인 피부에서의 표피 세포의 변화에 미치는 시료의 영향을 형태 변화에 대해서 조사하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

1) 형태학적 변화

시료 도포군과 컨트롤의 PBS 도포군을 비교하면, 표피의 형태에 차이는 없고, 정상의 구축을 유지하고 있었다. 도포군에서는 표피의 과형성성 변화나 과각화는 보이지 않고, 염증 세포 침윤 등 염증성 변화도 보이지 않았다.

2) 표피 세포 증식능

제1군(PBS 도포)과 제2군(시료 도포)에서의 PCNA 양성 세포 빈도는 각각 6±4％, 5±4％이며 유의차는 보이지 않았다. 이들 값은 실험 1의 제5군(제모만)과 동등하며, 시료 도포는 자외선 비조사 상태에서는 세포 증식 능력에 유의한 변화는 부여하지 않는 것으로 생각되었다.

3) 표피 세포의 아포토시스에 대해서, 정상 피부에 대한 시료가, 세포 증식과 아포토시스에 미치는 영향에 대해서 조사하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

표 5의 결과로부터도 알 수 있듯이, 제1군(PBS 도포)과 제2군(시료 도포)에서의 ssDNA 양성 아포토시스 세포 빈도는 각각 8±5％, 4±4％이며 양자에 차이는 보이지 않았다. 또한, 실험 1의 제5군(제모만)과 동등한 값이며, 시료 도포는 자외선 비조사 상태에서는 아포토시스에 유의한 변화는 부여하지 않는다고 생각되었다.

표피 세포에서의 BCL-2의 발현에 대해서, 정상 피부에 대한 시료의 효과를 Bcl-2 발현과 자외선 DNA 장해(T-T 다이머의 형성)에 대해서 조사하고, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

표 6의 결과로부터도 알 수 있듯이, 시료 도포군에서는 컨트롤의 PBS 도포군과 비교하여 경도의 BCL-2 발현의 항진이 보이지만, 실험 1의 자외선 조사 후 도포군과 비교하여 BCL-2 발현 항진은 극히 경도이며, 아포토시스의 빈도에 현저한 변화가 없다는 것과 잘 상응하고 있었다.

표피 세포에서의 T-T 다이머의 형성에 대해서는, 자외선 조사를 행하고 있지 않은 조건에서는 어떤 군에서도 표피에 T-T 다이머의 형성은 보이지 않았다.

이상의 결과로부터도 분명한 바와 같이, 실시예의 시료는, 생체의 표피 세포에 BCL-2 단백질을 발현시키며, 아포토시스도 억제하고 있다고 보여진다. 또한, 실시예에서는, 자외선의 조사된 표피 세포에서의 T-T 다이머의 형성량이 감소하고, 자외선 조사에 의한 DNA 장해를 예방하고 있다고 보여진다.

Claims

물 및 에탄올 가용성의 감초 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 BCL-2 단백질 발현제.
제1항에 기재된 BCL-2 단백질 발현제에 있어서, BCL-2 단백질의 발현이 표피 세포에서의 BCL-2 단백질의 발현인 피부용 BCL-2 단백질 발현제.
제2항에 있어서, 표피 세포가 색소 줄기 세포인 피부용 BCL-2 단백질 발현제.
제1항 또는 제2항에 기재된 BCL-2 단백질 발현제를 유효 성분으로서 함유하는 아포토시스 억제제.
제1항에 기재된 감초 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 표피 세포의 자외선 DNA 장해 방지제.