KR20100135755A - 동물세포를 사용해서 외래유전자 유래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현 벡터, 및 그의 이용 - Google Patents

동물세포를 사용해서 외래유전자 유래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현 벡터, 및 그의 이용 Download PDF

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국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명자들은 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변하여, 발현을 미약화시킨 번역 장애성 약제 내성 유전자 시스토론을 포함하고, 추가적으로 고전사활성 프로모터와 고안정성 폴리아데닐레이션 시그널 사이에 외래유전자 삽입용 클로닝 사이트를 갖는 유전자 카세트로 되는, 포유동물 숙주세포에 있어서 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산을 가능하게 하는 발현 벡터를 구축하는 것에 성공하였다.

Description

동물세포를 사용해서 외래유전자 유래 단백질을 대량으로 생산하기 위한 발현 벡터, 및 그의 이용{Expression vector for mass production of foreign gene-derived protein using animal cell and use thereof}
본 발명은 포유동물세포 숙주에 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 부여하는 포유동물세포용 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 발현 벡터는, 특히, 대장균이나 효모를 숙주로 한 유전자 재조합에서는 충분한 활성이 얻어지기 어려워, 포유류 특유의 당쇄 수식이나 폴딩(folding)이 필요한 포유동물 단백질의 생산에 적합하다.
재조합 단백질 생산용 벡터는 다수 개발되어, 대장균을 대표로 하는 세균, 효모를 대표로 하는 진핵 미생물 및 곤충세포를 숙주로 하는 발현계에서는, 단백질의 발현량도 많다. 그러나 포유류 특유의 단백질을 발현시키는 경우, 정상의 입체구조를 취하지 않거나, 당쇄 부가 등의 번역 후 수식에 문제가 있는 경우가 많다. 이에 포유류세포를 숙주로 한 발현계의 확립이 필요해지나, 일반적으로 발현량이 낮은 경우가 많다. 또한, 곤충세포보다도 고등 동물세포에 대해서는 재조합 바이러스 벡터를 사용한 발현계도 사용되나, 재조합 바이러스 벡터를 발현 단백질로부터 제거하는 작업은 매우 번잡하고, 또한 바이러스 벡터 자체의 위험성도 부정할 수 없다.
포유동물세포를 숙주로 한 재조합 단백질 생산의 사례는, 조직성 플라스미노겐 액티베이터(특허문헌 1), 에리트로포이에틴(특허문헌 2, 비특허문헌 1-3), IFN-γ(비특허문헌 4), IFN-β(특허문헌 3, 비특허문헌 5) 등에 보인다. 또한, 단일클론항체의 유전자 재조합 생산에 관해서도 수많은 보고가 있다(특허문헌 4-6, 비특허문헌 6-8). 또한 포유동물세포용 고발현 벡터로서 pNOW/CMV-AA(특허문헌 7)를 들 수 있다. 이 벡터를 사용한 콘글루티닌(conglutinin)의 생산량은, 배양 4일간에 최대 11.8 ㎍/mL였다. 그러나, 이들의 사례에 있어서 재조합 단백질의 충분한 생산량이 얻어지고 있다고는 생각하기 어렵다.
또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌 정보를 이하에 나타낸다.
일본국 특허공개 소59-183693호 일본국 특허공개 제2002-45191호 일본국 특허공개 평7-265084호 일본국 특허공개 평7-67648호 일본국 특허공개 평6-30788호 일본국 특허공개 평6-217786호 일본국 특허공개 평10-179169호
Fermentation Bioengineering, 4, 257페이지, 1989년 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 6465페이지, 1986년 Biotechnology, 6, 67페이지, 1988년, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80, 4564페이지, 1983년 Cytotechnology, 4, 173페이지, 1990년 Biotechnology, 10, 169페이지, 1992년 J.Immunol.Methods, 125, 191페이지, 1989년 Biotechnology, 10, 1455페이지, 1992년
포유동물세포, 특히 차이니즈 햄스터 난소 세포(이하 CHO 세포)를 사용한 의약품의 제조는 안전이 확인되어 있어, 현재 일반적인 수법으로 되어 있다. 포유동물세포를 사용한 재조합 단백질 제조에 있어서, 그 생산성을 올리는 것은, 비용의 삭감·의료비의 억제 등의 측면에서 매우 중요하다. 그 때문에, 효율적인 유전자 도입에 의해 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체를 제작하기 위한 발현 벡터의 개발이 필수이다.
포유동물세포에 있어서 재조합 단백질의 고레벨 생산을 용이하게 행하기 위해서는, 효율적인 유전자 도입이 필요하다. 효율적인 유전자 도입이란, 클론의 선택이 용이함에도 불구하고, 고레벨 생산성 클론이 얻어지는 확률이 높은 것이다. 즉, 피형질전환세포 전체에 대해 약제 선택 후의 생존세포 클론 수가 상대적으로 적고, 그것에 의해 고레벨 생산성 클론의 선택이 용이한 것, 또한 목적으로 하는 단백질을 생산하는 세포의 수가 적음에도 불구하고 고레벨 생산성 클론이 출현할 기대치가 큰 것이다. 얻어지는 세포의 수가 크면 그만큼 선택에 시간과 노력을 필요로 하게 되어 효율이 나쁘고, 또한 잠재적으로 고레벨 생산능을 갖는 클론을 간과할 가능성도 높다.
고레벨 생산능이란, 유전자 도입에 의해 얻어진 형질전환세포 클론에 있어서의 재조합 단백질의 발현량이 많은 것으로, 이것은 주로 발현 벡터의 성질, 성능에 유래한다고 생각된다. 유전자 발현의 레벨은 염색체 상의 위치에 따라 현저히 상이한 것이 발견되어 있어(Annu.Rev.Cell Biol., 6, 679페이지, 1990년), 염색체 상의 전사활성이 높은 영역(이하, 전사 핫 스폿)에 목적 유전자가 도입됨으로써, 재조합 단백질의 생산 레벨이 높아질 것으로 예상된다.
본 발명은, 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 과제는, 포유동물세포 숙주에 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 부여하는 포유동물세포용 발현 벡터를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명은, 그 벡터를 이용한 형질전환체의 제조방법, 및 그 벡터를 이용한 외래유전자 유래 단백질의 생산방법을 제공하는 것도 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 숙주세포 염색체 상의 전사 핫 스폿에 플라스미드 DNA가 삽입되어, 약제(예를 들면, 네오마이신, 제오신, 또는 블라스티시딘) 내성주로서, 선택되는 구조를 갖는 발현 벡터의 개발에 성공하였다. 유전자 도입 후의 G418 내성주에 있어서의 초기 클론의 고생산성은 NPT 유전자 발현의 구조에 의존하고, 제오신 내성주에 있어서의 초기 클론의 고생산성은 제오신 내성 유전자 발현의 구조에 의존하며, 또한 블라스티시딘 내성주에 있어서의 초기 클론의 고생산성은 블라스티시딘 내성 유전자 발현의 구조에 의존한다. 결과, 고레벨로 안정적인 단백질의 생산을 가능하게 하는 발현 벡터를 구축할 수 있어, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 보다 구체적으로는, 하기 [1] 내지 [21]의 발명을 제공하는 것이다.
[1] 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 포유동물 숙주세포에 있어서 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산을 가능하게 하기 위한 발현 벡터.
(a) 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변하여 발현을 미약화시킨 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트
(b) 고전사활성 프로모터와 고안정성 폴리아데닐레이션 시그널 사이에 외래유전자 삽입용 클로닝 사이트를 포함하는 유전자 카세트
[2] [1] (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트의 코돈이, 인간에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈으로 개변된 것인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 발현 벡터.
[3] [1] (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트의 코돈이, 알라닌은 GCA, 아르기닌은 CGA, 아스파라긴은 AAU, 아스파라긴산은 GAU, 시스테인은 UGU, 글루타민은 CAA, 글루타민산은 GAA, 글리신은 GGU, 히스티딘은 CAU, 류신은 UUA, 리신은 AAA, 프롤린은 CCA, 페닐알라닌은 UUU, 세린은 UCA, 트레오닌은 ACU, 티로신은 UAU, 및/또는 발린은 GUA로 개변된 것인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 발현 벡터.
[4] [1] (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트가, 프로모터로서 발현 유도성이 낮은 프로모터를 사용하고 있는 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 발현 벡터.
[5] 상기 활성이 낮은 프로모터로서, 포유동물세포에서는 거의 발현하지 않는 유전자를 유래로 하는 프로모터, 또는 인핸서부분을 제거한 프로모터를 사용하는 것을 특징으로 하는 [4]에 기재된 발현 벡터.
[6] [1] (a)에 기재된 약제 내성 유전자 카세트에 있어서 코돈의 개변영역이 유전자 카세트 전장의 30% 이상인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 발현 벡터.
[7] [1] (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(NTP 유전자)인 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터.
[8] [7]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 네오마이신 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
[9] 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
(a) [7]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 네오마이신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
(d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
[10] [9] (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, [9]에 기재된 생산방법.
[11] 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
(a) [7]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 네오마이신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
[12] [1] (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 제오신 내성 유전자(Zeosinr 유전자)인 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터.
[13] [12]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 제오신 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
[14] 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
(a) [12]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 수주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 제오신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
(d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
[15] [14] (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, [14]에 기재된 생산방법.
[16] 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
(a) [12]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 제오신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
[17] [1] (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 블라스티시딘 내성 유전자(Blasticidin 유전자)인 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터.
[18] [17]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 블라스티시딘 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
[19] 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
(a) [17]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 블라스티시딘이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
(d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
[20] [19] (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, [19]에 기재된 생산방법.
[21] 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
(a) [17]에 기재된 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 블라스티시딘이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
도 1은 pNC1 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터(enhancer-deleted simian virus 40 promoter), NPT: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 2는 pNC2 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cdNPT: NPT의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 3은 pNC5 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd90NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 90염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 4는 pNC6 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd180NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 180염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 5는 pNC7 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd270NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 270염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 6은 pNC1/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, NPT: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 7은 pNC2/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cdNPT: NPT의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 8은 pNC5/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd90NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 90염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 9는 pNC6/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd180NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 180염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 10은 pNC7/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd270NPT: NPT의 염기서열을 5'말단에서 270염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 11은 pZC1 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자) cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 12는 pZC2 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cdZeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 13은 pZC5 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd90Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 90염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 14는 pZC7 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd180Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 180염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 15는 pZC1/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자) cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 16은 pZC2/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cdZeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 17은 pZC5/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd90Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 90염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 18은 pZC7/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd180Zeo: 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 180염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 19는 pBC1 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, Bsd: 블라스티시딘 내성 유전자(bsd 유전자) cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 20은 pBC6 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd120Bsd: 블라스티시딘 내성 유전자(bsd 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 120염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 블라스티시딘 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 21은 pBC1/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, Bsd: 블라스티시딘 내성 유전자(bsd 유전자) cDNA, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
도 22는 pBC6/hMBL 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, INRBG: 토끼 성장호르몬 인트론, hMBL: 인간 만노오스결합 렉틴 cDNA, PABGH: 소 성장호르몬 유전자 폴리A 부가 시그널, PdSV: 인핸서를 결실시킨 원숭이 바이러스40 프로모터, cd120Bsd: 블라스티시딘 내성 유전자(bsd 유전자)의 염기서열을 5'말단에서 120염기의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 블라스티시딘 내성 유전자, PASV: 원숭이 바이러스40 폴리A 부가 시그널, Ampr: 대장균 중에서의 선택 마커(암피실린 내성)를 나타낸다.
본 발명자들은 약제 내성 유전자(NPT 유전자, 제오신 내성 유전자, 또는 블라스티시딘 내성 유전자)의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변하여, 약제 내성 유전자의 발현성을 매우 감쇠시킨 것으로 함으로써, 삽입되는 플라스미드 유전자가 염색체 상의 매우 높은 발현성을 갖는 위치에 도입되지 않는 한, 형질전환체이더라도 배지 중의 약제 선택(네오마이신 선택(G418을 예시할 수 있다), 제오신 선택, 또는 블라스티시딘 선택)에 대해 생존이 곤란하도록 하였다.
즉, 본 발명은, 포유동물 숙주세포에 있어서 유전자 재조합 단백질의 고레벨 생산을 유도하기 위한 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터는, 백본 벡터 상에, 하기 (a) 및 (b)를 포함함으로써 구축된다.
(a) 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변하여 발현을 미약화시킨 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트
(b) 고전사활성 프로모터와 고안정성 폴리아데닐레이션 시그널 사이에 외래유전자 삽입용 클로닝 사이트를 포함하는 유전자 카세트
본 발명은, 약제 내성 유전자 카세트(시스트론)의 구성으로서, 약제 내성 유전자의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈으로 개변하여, 약제 내성 유전자의 발현 유도성을 저하시킨 프로모터를 사용해, 유전자 도입에 의해 형질전환된 숙주세포에 있어서의 약제 내성 유전자의 발현기구를 현저히 손상시키는 것이다. 본 발명에 있어서, 「유전자 카세트」란, 프로모터, 구조 유전자, 폴리아데닐레이션 시그널(polyA)을 기본 구성으로 하는 전사·번역에 의해 단백질을 발현하는 단위를 의미하나, 이들 중 어느 하나에 관련되거나 또는 임의의 DNA 서열을 삽입서열로서 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 약제 내성 유전자 카세트는 프로모터를 약화했을 뿐인 것과는 달리, 전사 핫 스폿에 플라스미드 유전자가 도입된 약제 내성주를 특이적으로 획득할 수 있도록 유도하는 것으로부터, 「번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트」라 정의한다. 본 발명에 있어서, 약제 내성 유전자는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 네오마이신 내성 유전자(네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, NTP 유전자), 제오신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자를 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서 「포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈」이란, 인간에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈을 바람직한 예로서 들 수 있다. 인간에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈으로서는, Kim 등의 문헌(Gene, 199, 293페이지, 1997년)에 개시된 코돈을 들 수 있다. 보다 구체적인 코돈으로서, 알라닌은 GCA, 아르기닌은 CGA, 아스파라긴은 AAU, 아스파라긴산은 GAU, 시스테인은 UGU, 글루타민은 CAA, 글루타민산은 GAA, 글리신은 GGU, 히스티딘은 CAU, 류신은 UUA, 리신은 AAA, 프롤린은 CCA, 페닐알라닌은 UUU, 세린은 UCA, 트레오닌은 ACU, 티로신은 UAU, 및/또는 발린은 GUA를 예시할 수 있으나, 코돈은 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 「발현을 미약화하는」이란, 유전자의 발현이 전사 및/또는 번역의 단계에서 약해져 있는 것을 나타내고, 구체적으로는 코돈을 상기 「포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈」으로 개변함으로써 얻을 수 있다.
그 「번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트」에 있어서, 코돈이 개변되는 영역은 특별히 제한되지 않으나, 유전자 카세트 전장의 30% 이상(예를 들면, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%)의 영역에 있어서의 코돈이 개변되는 것이 바람직하다. 코돈의 개변영역의 범위는, 벡터의 다른 조건을 고려하여 임의로 결정할 수 있다.
이 「번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트」의 프로모터로서는, 포유동물세포에서는 통상 발현하기 어려운 단백질 유전자의 프로모터를 유래로 하는 것, 또는 통상의 프로모터로부터 인핸서를 제거한 것을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로는, SV40의 바이러스 항원 프로모터로부터 인핸서영역을 제거한 것이나(Mol.Cell Biol., 6, 2593페이지, 1986년), 또는 이것과 동등하게 발현성이 매우 낮은 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.
플라스미드 DNA의 숙주세포 염색체 상의 전사 핫 스폿으로의 삽입은, 약제 내성 유전자 카세트가 갖는 특성으로부터 네오마이신(G418 선택, 제오신 선택, 또는 블라스티시딘 선택 등에 의해 결과적으로 달성되게 되나, 염색체 상의 전사 핫 스폿에 있어서의 외래유전자 유래 단백질의 발현 자체는 강력하게 유도될 필요가 있다. 이 때문에, 단백질 유전자를 삽입하는 멀티클로닝 사이트(이하, MCS로 기재한다)의 프로모터 및 폴리아데닐레이션 시그널(이하, polyA라 칭한다)은 가장 강한 발현 유도성을 갖는 것 중에서 선택한다. 프로모터로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 Immediate Early(hCMV MIE: Cell, 41, 521페이지, 1985년) 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터와 아데노바이러스 프로모터의 융합 프로모터인 CMV5 프로모터(Nucleic Acid Research, 30, 2페이지, 2002년), β-액틴 프로모터(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, 4831페이지, 1987년), polyA에는 소 성장호르몬 유래의 polyA 서열(DNA 5, 115페이지, 1986년) 등을 들 수 있다. 본 명세서 중에서는 이 목적으로 하는 단백질 유전자를 삽입하는 멀티클로닝 사이트를 갖는 DNA 단편을 「유전자 발현 카세트」라 칭한다.
본 발명의 발현 벡터로서는, 실시예에 구체적으로 기재한 발현 벡터를 예시할 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은, 상기 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 약제 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
구체적으로는, 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 외래유전자를 본 발명의 발현 벡터의 멀티클로닝 사이트(이하, MCS로 기재)에 삽입한 후, 트랜스펙션법(여기서 말하는 트랜스펙션법이란 리포펙틴법, 전기천공법, 인산칼슘법, 마이크로인젝션법 등 당업자가 주지의 방법을 들 수 있다)을 이용하여 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 약제(네오마이신, 제오신, 또는 블라스티시딘)에 대한 내성으로 선택을 행하여, 단백질의 고생산성 형질전환체를 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 숙주세포로서는, 외래유전자 유래 단백질의 발현에 적합한 세포이면 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 포유동물세포, 보다 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 들 수 있다.
약제 선택에서 생존한 형질전환세포의 대부분은 이미 상대적으로 단백질의 높은 발현 레벨을 달성하고 있으나, 그 중에서 더욱 고레벨 생산능을 갖는 형질전환세포를 선택하기 위해, 단백질의 발현 레벨을 측정해도 된다.
또한, 본 발명은, 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법을 제공한다.
(a) 본 발명의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 약제(네오마이신, 제오신, 또는 블라스티시딘)가 첨가된 배지에서 배양하는 공정
(d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
본 발명에 있어서, 상기 (c)의 공정에 있어서는, 약제(네오마이신, 제오신, 또는 블라스티시딘)가 첨가된 배지에서 배양을 행함으로써, 고효율의 단백질 발현을 나타내는 형질전환체(콜로니)를 선택할 수 있다. 선택된 형질전환체는, 계속해서 같은 배지에 있어서 배양을 계속해도 되고, 다른 배지, 예를 들면 대량 발현용 배지로 옮겨서 배양을 행해도 된다.
본 발명에 있어서, 형질전환체를 배양 또는 순화(馴化)시키는 배지는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 무혈청 배지, 보다 바람직하게는 CD 배지 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지를 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수할 때에는, 당업자에게 공지의 방법(여과(filtration), 원심분리, 및 칼럼 정제 등)으로 단백질을 정제해도 된다. 외래유전자 유래 단백질은, 정제를 용이하게 하는 등의 목적으로, 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) 본 발명의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
(b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
(c) 그 형질전환체를 약제(네오마이신, 제오신, 또는 블라스티시딘)가 첨가된 배지에서 배양하는 공정
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되지 않는다.
[실시예 1] pNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용하여 본 발명의 벡터인 pNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7을 구축하였다. 백본 벡터 pNC1의 전체 염기서열을 서열번호:1에 기재한다. pNC1은 염기서열 No 1784-No 2578 사이에 야생형 NPT의 cDNA를 갖는다(도 1).
pNC2는 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:2에 기재된 서열로 치환한 것이다. pNC2의 치환영역에는 NPT의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 NPT 유전자가 도입되어 있다(도 2).
pNC5는 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을, 서열번호:3에 기재된 서열로 치환한 것이다. pNC5의 치환영역에는 NPT의 염기서열을 5'말단에서 90염기(코돈 개변율 11.3%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자가 도입되어 있다(도 3).
pNC6은 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:4에 기재된 서열로 치환한 것이다. pNC6의 치환영역에는 NPT의 염기서열을 5'말단에서 180염기(코돈 개변율 22.6%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자가 도입되어 있다(도 4).
pNC7은 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:5에 기재된 서열로 치환한 것이다. pNC7의 치환영역에는 NPT의 염기서열을 5'말단에서 270염기(코돈 개변율 34.0%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 NPT 유전자가 도입되어 있다(도 5).
[실시예 2] pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용해서 본 발명의 벡터인 pNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7의 염기서열 No 1267-No 1275를 서열번호:6에 기재된 인간 만난결합 렉틴(MBL)을 코드하는 cDNA(이하 hMBL로 기재한다)로 치환하고, pNC1/hMBL(도 6), pNC2/hMBL(도 7), pNC5/hMBL(도 8), pNC6/hMBL(도 9), pNC7/hMBL(도 10)을 구축하였다.
[실시예 3] pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL의 CHO 세포로의 도입과, CD 배지 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지를 사용한, G418 선택
10 ㎍의 pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL을 리포펙틴법(LipofectamineTM LTX, Invitrogen을 사용)을 사용해서 25 ㎠의 배양플라스크 중의 5.0×105개의 CHO 세포(CHO DG44 cell)에 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 유전자 도입 48시간 후, 세포 수를 계측한 후, 세포를 4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)로 희석하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트 중에 1000 cells/well, 100 cells/well의 농도로 5장씩 합계 10장(960웰) 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양한 바, 생존한 세포가 보였다(G418 내성 클론). 생존세포로부터 임의로 G418 내성 클론을 선택하고, 4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan) 모두 24웰 플레이트로 옮겨, 세포가 각 웰의 1/3 이상을 차지할 때까지 배양하였다. 각 주에 0.4 mL를 멸균 튜브에 취하여, 200 g, 2분간 원심하였다. 상청을 버리고, 세포를 0.1 mL의 새로운 배지(4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan))에 현탁하고, 세포 수를 계측한 후, 세포 수를 5.0×105 cells/mL가 되도록 배지로 희석 후, 0.2 mL를 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 72시간 배양하여, 9300 g, 2분간의 원심 후에 상청을 회수하였다. 계속해서 배양상청 중의 MBL의 생산량을 측정하였다.
[실시예 4] pNC1/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL 형질도입 클론에 의한 MBL의 생산량의 측정
생산량의 검정은 ELISA로 실시하였다. 코팅 버퍼(15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05% NaN3, pH 9.6)로 희석한 1 ㎍/mL 항인간 MBL 항체(일본·아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)로 96웰 플레이트(F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate, Cat no. 442404, Nunc)에 4℃, 16시간 코트하였다. 4% Block Ace(다이닛폰 스미토모제약 주식회사)로 블로킹한 후, 72시간 배양상청(1/1000-1/100000 희석), 정제한 인간 MBL(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)의 CHO 세포용 무혈청배지 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)에 의한 2배 희석 계열(20~0.3125 ng/mL) 및 IS CHO with Hydrolysate 배지(IS Japan)를 각각 100 μL씩 어플라이하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 추가적으로 0.1 ㎍/mL의 비오틴화 인간 MBL 단일클론항체(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)와 37℃, 1시간 인큐베이트하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(Reagent A 2 drops, Regent B 2 drops/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 37℃에서 45분간 반응시켰다. 추가적으로 실온에서 30분간 인큐베이트한 PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후, 1 M 인산을 100 μL/well씩 넣어 반응을 정지시켰다. 단백질 농도의 측정은 마이크로플레이트 리더(Model680, BioRad사제)를 사용해서 행하였다. 표 1에 ELISA법으로 얻어진 결과, 인간 MBL 생산량이 높은 상위 3 샘플을 나타낸다. 가장 생산 레벨이 높았던 클론은, 코돈 미개변의 벡터와 비교하여 우위하게 높은 생산성이 얻어졌다.
Figure pct00001
[실시예 5] pNC1/hMBL, pNC2/hMBL, pNC5/hMBL, pNC6/hMBL, pNC7/hMBL 형질도입세포 클론에 의한 hMBL의 생산량
본 발명의 발현 벡터 pNC1, pNC2, pNC5, pNC6, pNC7에 의해 발현된 hMBL의 각 클론의 발현량의 분포를 표 2에 나타낸다.
pNC1에서는 50주의 G418 내성주 중, 72.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 14주(28.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 7주(14.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 15.0 ㎍/mL/3 day였다.
pNC2에서는 50주의 G418 내성주 중, 40.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 30주(60.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 14주(28.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 2주(4.0%)는 15 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 23.3 ㎍/mL/3 day였다.
pNC5에서는 50주의 G418 내성주 중 70%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 15주(30.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 9.9 ㎍/mL/3 day였다.
pNC6에서는 50주의 G418 내성주 중, 60.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 20주(40.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 4주(8.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 1주(2.0%)는 15 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 16.0 ㎍/mL/3 day였다.
pNC7에서는 50주의 G418 내성주 중, 56.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 22주(44.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 16주(32.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 놀랍게도 50주 중 13주(26.0%)는 15 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 46.1 ㎍/mL/3 day였다.
이것은 문헌 등에서 보고되어 있는 대표적인 발현 벡터에 의한 유전자 증폭 전의 초기 클론의 데이터와 비교해서 가장 높은 수준이었다(DNA, 7, 651페이지, 1988년; Biotechnology, 10. 1455페이지, 1992년; Biotechnology, 8, 662페이지, 1990년; Gene, 76, 19페이지, 1989년; Biotechnology, 9, 64페이지, 1991년).
유전자 증폭에 의한 재조합 세포의 스크리닝에는 통상 6개월에서 1년을 필요로 하고, 또한 배양조건이나 증폭 자극제 농도에 따른 차이가 크기 때문에, 발현 벡터의 기초적인 성능 비교는 증폭 전의 초기 클론의 발현 레벨에서 행하는 것이 적당하다고 생각된다. 이것에 의해 본 발명의 발현 벡터의 성능은 매우 높은 것이 판명되었다. 이 결과, 본 발명의 벡터는, 얻어지는 G418 내성주의 수가 매우 낮은 한편, 매우 높은 비율로 목적물질 단백질의 고생산성 세포주의 확립을 가능하게 하는 것이 확인되었다. 이것에 의해, 본 발명의 발현 벡터는 매우 높은 단백질 발현 레벨을 가능하게 하는 것이 증명되었다.
Figure pct00002
[실시예 6] pZC1, pZC2, pZC5, pZC7의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용해서 본 발명의 벡터인 pZC1, pZC2, pZC5, pZC7을 구축하였다. pZC1은 백본 벡터 pNC1의 서열번호 No 1784-No 2578 사이에, 서열번호:7에 기재된 야생형의 제오신 내성 유전자(Sh ble 유전자)의 cDNA를 갖는다(도 11). pZC2는 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:8에 기재된 서열로 치환한 것이다. pZC2의 치환영역에는 제오신 내성 유전자의 전체 염기서열의 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 전체 염기서열을 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자가 도입되어 있다(도 12).
pZC5는 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:9에 기재된 서열로 치환한 것이다. pZC5의 치환영역에는 제오신 내성 유전자의 염기서열을 5'말단에서 90염기(코돈 개변율 24.0%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자가 도입되어 있다(도 13).
pZC7은 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을 서열번호:10에 기재된 서열로 치환한 것이다. pZC7의 치환영역에는 제오신 내성 유전자의 염기서열을 5'말단에서 180염기(코돈 개변율 48.0%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 제오신 내성 유전자가 도입되어 있다(도 14).
[실시예 7] pZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용해서 본 발명의 벡터인 pZC1, pZC2, pZC5, pZC7의 염기서열 No 1267-No 1275를 서열번호:6에 기재된 인간 만난결합 렉틴(MBL)을 코드하는 cDNA(이하 hMBL로 기재한다)로 치환하고, pZC1/hMBL(도 15), pZC2/hMBL(도 16), pZC5/hMBL(도 17), pZC7/hMBL(도 18)을 구축하였다.
[실시예 8] pZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL의 CHO 세포로의 도입과, CD 배지 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지를 사용한, Zeocin 선택
10 ㎍의 pZC1/hMBL, pZC2/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL을 리포펙틴법(LipofectamineTM LTX, Invitrogen을 사용)을 사용해서 25 ㎠의 배양플라스크 중의 5.0×105개의 CHO 세포(CHO DG44 cell)에 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 유전자 도입 48시간 후, 세포 수를 계측한 후, 세포를 4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)과 200 ㎍/mL Zeocin(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)로 희석하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트 중에 4000 cells/well 농도로 5장씩(480웰) 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양한 바, 생존한 세포가 보였다(제오신 내성 클론). 생존 세포로부터 임의로 제오신 내성 클론을 선택하여, 4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)과 200 ㎍/mL Zeocin(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan) 모두 24웰 플레이트로 옮겨, 세포가 각 웰의 1/3 이상을 차지할 때까지 배양하였다. 각 주에 0.4 mL를 멸균 튜브에 취하여, 200 g, 2분간 원심하였다. 상청을 버리고, 세포를 0.1 mL의 새로운 배지(4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan))에 현탁하고, 세포 수를 계측한 후, 세포 수를 5.0×105 cells/mL가 되도록 배지로 희석 후, 0.2 mL를 새로운 24웰 플레이트로 옮겨, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 72시간 배양하여, 9300 g, 2분간의 원심 후에 상청을 회수하였다. 계속해서 배양상청 중의 MBL의 생산량을 측정하였다.
[실시예 9] pZC1/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL 형질도입 클론에 의한 MBL의 생산량의 측정
생산량의 검정은 ELISA로 실시하였다. 코팅 버퍼(15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05% NaN3, pH 9.6)로 희석한 1 ㎍/mL 항인간 MBL 항체(일본·아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)로 96웰 프레이트(F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate, Cat no.442404, Nunc)에 4℃, 16시간 코트하였다. 4% Block Ace(다이닛폰 스미토모제약 주식회사)로 블로킹한 후, 72시간 배양상청(1/1000-1/100000 희석), 정제한 인간 MBL(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)의 CHO 세포용 무혈청 배지 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)에 의한 2배 희석 계열(20~0.3125 ng/mL) 및 IS CHO with Hydrolysate 배지(IS Japan)를 각각 100 μL씩 어플라이하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 또한 0.1 ㎍/m의 비오틴화 인간 MBL 단일클론항체(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)와 37℃, 1시간 인큐베이트하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(Reagent A 2 drops, Regent B 2 drops/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 37℃에서 45분간 반응시켰다. 또한 실온에서 30분간 인큐베이트한 PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후, 1 M 인산을 100 μL/well씩 넣어 반응을 정지시켰다. 단백질 농도의 측정은 마이크로플레이트 리더(Model680, BioRad사제)를 사용해서 행하였다. 표 3에 ELISA법으로 얻어진 결과, 인간 MBL 생산량이 높은 상위 5 샘플을 나타낸다. 가장 생산 레벨이 높았던 코돈 개변의 벡터의 클론은, 코돈 미개변의 벡터와 비교해서 동등한 생산성을 나타내고 있었다.
Figure pct00003
[실시예 10] pZC1/hMBL, pZC5/hMBL, pZC7/hMBL 형질도입세포 클론에 의한 hMBL의 생산량
본 발명의 발현 벡터 pZC1, pZC5, 및 pZC7에 의해 발현된 hMBL의 각 클론의 발현량의 분포를 표 4에 나타낸다.
pZC1에서는 50주의 Zeocin 내성주 중, 70.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 15주(30.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 4주(8.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 1주(2.0%)는 15 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 15.1 ㎍/mL/3 day였다.
pZC5에서는 50주의 Zeocin 내성주 중 84.0%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 50주 중 8주(16.0%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 50주 중 1주(2.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 12.2 ㎍/mL/3 day였다.
pZC7에서는 49주의 Zeocin 내성주 중, 75.5%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 49주 중 12주(24.5%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 49주 중 1주(2.0%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 10.1 ㎍/mL/3 day였다.
pZC에 있어서 외래 단백질의 생산량이 가장 높은 클론의 생산량은 15.1 ㎍/mL/3 day이고, pNC에 있어서 외래 단백질의 생산량이 가장 높은 클론의 생산량은 46.1 ㎍/mL/3 day였다. 이 사실로부터 pNC는, 구성부위로서 포함하는 약제 내성 유전자의 코돈을 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변함으로써, 외래 단백질의 생산성을 현저히 높이는 것이 명백해졌다. 또한 pZC에 대해서는, 약제 내성 유전자의 코돈 개변영역을 C 말단측부터로 하는 것, 또는 서열의 중심부부터로 하는 것, 또는, 개변하는 코돈과 하지 않는 코돈을 번갈아 배치시키는 것 등이 생각되고, 어느 경우에도 개변되는 코돈을 조정함으로써 pNC의 경우와 마찬가지로 약제 선택효율이 올라가, 당해 벡터가 형질전환 수용성 세포의 염색체 상의 매우 높은 발현성을 갖는 위치에 삽입되는 것으로 생각된다.
Figure pct00004
[실시예 11] pBC1, pBC6의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용해서 본 발명의 벡터인 pBC1, pBC6를 구축하였다. pBC1은 백본 벡터 pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578 사이에, 서열번호:11에 기재된 야생형의 블라스티시딘 내성 유전자(bsd 유전자)의 cDNA를 갖는다(도 19).
pBC6는, pNC1의 염기서열 No 1784-No 2578의 서열을, 서열번호:12에 기재된 서열로 치환한 것이다. pBC6의 치환영역에는 블라스티시딘 내성 유전자의 염기서열을 5'말단에서 120염기(코돈 개변율 30.1%)의 범위에서, 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변한 번역 장애성 블라스티시딘 내성 유전자가 도입되어 있다(도 20).
[실시예 12] pBC1/hMBL, pBC6/hMBL의 구축
당업자에게 주지의 방법을 사용해서 본 발명의 벡터인 pBC1, pBC6의 염기서열 No 1267-No 1275를 서열번호:6에 기재된 인간 만난결합 렉틴(MBL)을 코드하는 cDNA(이하 hMBL로 기재한다)로 치환하고, pBC1/hMBL(도 21), pBC6/hMBL(도 22)을 구축하였다.
[실시예 13] pBC1/hMBL, pBC6/hMBL의 CHO 세포로의 도입과, CD 배지 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지를 사용한, 블라스티시딘 선택
10 ㎍의 pBC1/hMBL, pBC6/hMBL을 리포펙틴법(LipofectamineTM LTX, Invitrogen을 사용)을 사용해서 25 ㎠의 배양플라스크 중의 5.0×105개의 CHO 세포(CHO DG44 cell)에 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 유전자 도입 48시간 후, 세포 수를 계측한 후, 세포를 4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)과 200 ㎍/mL Zeocin(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)로 희석하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트 중에 4000 cells/well 농도로 5장씩(480웰) 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양한 바, 생존한 세포가 보였다(블라스티시딘 내성 클론). 생존세포로부터 임의로 블라스티시딘 내성 클론을 선택하여, 4 mM Gluta MAXTM-I (Invitrogen)과 10 ㎍/mL Blasticidin(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan) 모두 24웰 플레이트에 옮겨, 세포가 각 웰의 1/3 이상을 차지할 때까지 배양하였다. 각 주에 0.4 mL를 멸균 튜브에 취하여, 200 g, 2분간 원심하였다. 상청을 버리고, 세포를 0.1 mL의 새로운 배지(4 mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)을 포함하는 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan))에 현탁하여, 세포 수를 계측한 후, 세포 수를 5.0×105 cells/mL가 되도록 배지로 희석 후, 0.2 mL를 새로운 24웰 플레이트로 옮겨, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 72시간 배양하여, 9300 g, 2분간의 원심 후에 상청을 회수하였다. 계속해서 배양상청 중의 MBL의 생산량을 측정하였다.
[실시예 14] pBC1/hMBL, pBC6/hMBL 형질도입 클론에 의한 MBL의 생산량의 측정
생산량의 검정은 ELISA로 실시하였다. 코팅 버퍼(15 mM, Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 0.05% NaN3, pH 9.6)로 희석한 1 ㎍/mL 항인간 MBL 항체(일본·아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)로 96웰 플레이트(F96 MAXI SORP Nunc-Immuno plate, Cat no. 442404, Nunc)에 4℃, 16시간 코트하였다. 4% Block Ace(다이닛폰 스미토모제약 주식회사)로 블로킹한 후, 72시간 배양상청(1/1000-1/100000 희석), 정제한 인간 MBL(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)의 CHO 세포용 무혈청 배지 IS CHO-CD w/Hydrolysate 배지(IS Japan)에 의한 2배 희석 계열(20~0.3125 ng/mL) 및 IS CHO with Hydrolysate 배지(IS Japan)를 각각 100 μL씩 어플라이하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 또한 0.1 ㎍/mL의 비오틴화 인간 MBL 단일클론항체(아사히가와 의대·오오타니박사로부터 양도)와 37℃, 1시간 인큐베이트하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 VECTASTAION Elite ABC kit STANDARD(Reagent A 2 drops, Regent B 2 drops/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 37℃에서 45분간 반응시켰다. 추가적으로 실온에서 30분간 인큐베이트한 PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2 drops of Buffer, 3 drops of TMB, 2 drops of HYDROGEN PEROXIDE/5 mL, Vector)를 100 μL/well씩 어플라이하고, 실온에서 15분간 반응시킨 후, 1 M 인산을 100 μL/well씩 넣어 반응을 정지시켰다. 단백질 농도의 측정은 마이크로플레이트 리더(Model680, BioRad사제)를 사용해서 행하였다. 표 5에 ELISA법으로 얻어진 결과, 인간 MBL 생산량이 높은 상위 5 샘플을 나타낸다. 가장 생산 레벨이 높았던 코돈 개변의 벡터의 클론은, 코돈 미개변의 벡터와 비교해서 동등한 생산성을 나타내고 있었다.
Figure pct00005
[실시예 15] pBC1/hMBL, pBC6/hMBL 형질도입세포 클론에 의한 hMBL 생산량
본 발명의 발현 벡터 pZC1 및 pZC에 의해 발현된 hMBL의 각 클론의 발현량의 분포를 표 6에 나타낸다.
pBC1에서는 56주의 Blasticidin 내성주 중, 83.9%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 56주 중 9주(26.1%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 56주 중 1주(1.8%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 11.2 ㎍/mL/3 day였다.
pBC6에서는 59주의 Blasticidin 내성주 중 66.1%는 hMBL을 0 ㎍/mL 이상 5 ㎍/mL 미만에서 생산하고 있었다. 또한 59주 중 20주(33.9%)는 5 ㎍/mL 이상이었다. 또한 59주 중 3주(5.1%)는 10 ㎍/mL 이상이었다. 가장 높은 생산 레벨을 나타낸 것은 12.5 ㎍/mL/3 day였다.
pBC에 있어서 외래 단백질의 생산량이 가장 높은 클론의 생산량은 12.5 ㎍/mL/3 day이고, pNC에 있어서 외래 단백질의 생산량이 가장 높은 클론의 생산량은 46.1 ㎍/mL/3 day였다. 이 사실로부터 pNC는, 구성부위로서 포함하는 약제 내성 유전자의 코돈을 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변함으로써, 외래 단백질의 생산성을 현저히 높이는 것이 명백해졌다. 또한 pBC에 대해서는, 약제 내성 유전자의 코돈 개변영역을 C 말단측부터로 하는 것, 또는 서열의 중심부부터로 하는 것, 또는 개변하는 코돈과 하지 않는 코돈을 번갈아 배치시키는 것 등이 생각되고, 어느 경우에도 개변되는 코돈을 조정함으로써 pNC의 경우와 마찬가지로 약제 선택효율이 올라가, 당해 벡터가 형질전환 수용성 세포의 염색체 상의 매우 높은 발현성을 갖는 위치에 삽입되는 것으로 생각된다.
Figure pct00006
본 발명에 의해, 포유동물세포를 숙주로 하여 고레벨의 외래유전자 유래 단백질 생산을 가능하게 하는 발현 벡터를 제공할 수 있다. 또한, 포유동물 본래의 번역 후 수식 및 높은 생물활성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 그 때문에, 바이오 의약품 등의 단백질성 유용물질의 생산 원가를 대폭 낮출 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 단백질의 생산방법은, 바이러스나 미생물을 사용하지 않기 때문에, 안전성이 높은 단백질 생산이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Efficient expression vector for producing proteins encoded by an exogenous gene in mammalian cells and the use thereof <130> F2-A0801P <150> JP 2008-046782 <151> 2008-02-27 <160> 12 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 6078 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized vector sequence <400> 1 cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 120 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 180 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 240 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 300 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 360 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 420 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 480 cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 540 taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 600 aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgttaac tggcttatcg aaattgtcga 660 ggagaacttc agggtgagtt tggggaccct tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa 720 attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc 780 cttgtatcac catggaccct catgataatt ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca 840 accattgtct cctcttattt tcttttcatt ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt 900 gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt tgtttatttg tcagattgta agtactttct 960 ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg tatattatat tgtacttcag cacagtttta 1020 gagaacaatt gttataatta aatgataagg tagaatattt ctgcatataa attctggctg 1080 gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc 1140 tttatggtta caatgatata cactgtttga gatgaggata aaatactctg agtccaaacc 1200 gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 1260 gctggcggcc gccttctaga gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1320 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1380 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1440 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggaggatc 1500 tccgcggtgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 1560 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 1620 cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 1680 ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 1740 ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaaagctg cagatgattg aacaagatgg 1800 attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 1860 acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 1920 tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg 1980 gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 2040 agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 2100 ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 2160 tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 2220 tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 2280 gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 2340 gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 2400 catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 2460 tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 2520 cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaga 2580 tccgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa 2640 tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca 2700 acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt 2760 tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca acattctact 2820 cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga attgctaagt 2880 tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat ttacaccaca 2940 aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt aacctttata 3000 agtaggcata acagttataa tcataacata ctgttttttc ttactccaca caggcataga 3060 gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa 3120 ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac 3180 cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 3240 acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3300 ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 3360 tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg gcccatcgat gaattcaacg 3420 tacgtagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 3480 cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 3540 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc 3600 ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta 3660 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 3720 cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 3780 ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg acgaaagggc 3840 ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 3900 ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3960 tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 4020 aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 4080 tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 4140 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 4200 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 4260 gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 4320 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 4380 agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 4440 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 4500 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 4560 accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 4620 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 4680 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4740 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 4800 gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 4860 ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 4920 tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4980 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 5040 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 5100 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 5160 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 5220 ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 5280 atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 5340 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 5400 cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa 5460 agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 5520 acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5580 gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5640 ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 5700 gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 5760 gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 5820 gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 5880 tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 5940 gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 6000 ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 6060 gaatttcgta cgaagctt 6078 <210> 2 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 2 atgattgaac aagatggttt acatgcaggt tcaccagcag catgggtaga acgattattt 60 ggttatgatt gggcacaaca aactattggt tgttcagatg cagcagtatt tcgattatca 120 gcacaaggtc gaccagtatt atttgtaaaa actgatttat caggtgcatt aaatgaatta 180 caagatgaag cagcacgatt atcatggtta gcaactactg gtgtaccatg tgcagcagta 240 ttagatgtag taactgaagc aggtcgagat tggttattat taggtgaagt accaggtcaa 300 gatttattat catcacattt agcaccagca gaaaaagtat caattatggc agatgcaatg 360 cgacgattac atactttaga tccagcaact tgtccatttg atcatcaagc aaaacatcga 420 attgaacgag cacgaactcg aatggaagca ggtttagtag atcaagatga tttagatgaa 480 gaacatcaag gtttagcacc agcagaatta tttgcacgat taaaagcacg aatgccagat 540 ggtgaagatt tagtagtaac tcatggtgat gcatgtttac caaatattat ggtagaaaat 600 ggtcgatttt caggttttat tgattgtggt cgattaggtg tagcagatcg atatcaagat 660 attgcattag caactcgaga tattgcagaa gaattaggtg gtgaatgggc agatcgattt 720 ttagtattat atggtattgc agcaccagat tcacaacgaa ttgcatttta tcgattatta 780 gatgaatttt tttga 795 <210> 3 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 3 atgattgaac aagatggttt acatgcaggt tcaccagcag catgggtaga acgattattt 60 ggttatgatt gggcacaaca aactattggt tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 4 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 4 atgattgaac aagatggttt acatgcaggt tcaccagcag catgggtaga acgattattt 60 ggttatgatt gggcacaaca aactattggt tgttcagatg cagcagtatt tcgattatca 120 gcacaaggtc gaccagtatt atttgtaaaa actgatttat caggtgcatt aaatgaatta 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 5 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 5 atgattgaac aagatggttt acatgcaggt tcaccagcag catgggtaga acgattattt 60 ggttatgatt gggcacaaca 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cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg tgtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actga 375 <210> 8 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 8 atggcaaaat taacttcagc agtaccagta ttaactgcac gagatgtagc aggtgcagta 60 gaattttgga ctgatcgatt aggtttttca cgagattttg tagaagatga ttttgcaggt 120 gtagtacgag atgatgtaac tttatttatt tcagcagtac aagatcaagt agtaccagat 180 aatactttag catgggtatg tgtacgaggt ttagatgaat tatatgcaga atggtcagaa 240 gtagtatcaa ctaattttcg agatgcatca ggtccagcaa tgactgaaat tggtgaacaa 300 ccatggggtc gagaatttgc attacgagat ccagcaggta attgtgtaca ttttgtagca 360 gaagaacaag attga 375 <210> 9 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 9 atggcaaaat taacttcagc agtaccagta ttaactgcac gagatgtagc aggtgcagta 60 gaattttgga ctgatcgatt aggtttttca cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg tgtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actga 375 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 10 atggcaaaat taacttcagc agtaccagta ttaactgcac gagatgtagc aggtgcagta 60 gaattttgga ctgatcgatt aggtttttca cgagattttg tagaagatga ttttgcaggt 120 gtagtacgag atgatgtaac tttatttatt tcagcagtac aagatcaagt agtaccagat 180 aacaccctgg cctgggtgtg tgtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actga 375 <210> 11 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 11 atgcctttgt ctcaagaaga atccaccctc attgaaagag caacggctac aatcaacagc 60 atccccatct ctgaagacta cagcgtcgcc agcgcagctc tctctagcga cggccgcatc 120 ttcactggtg tcaatgtata tcattttact gggggacctt gtgcagaact cgtggtgctg 180 ggcactgctg ctgctgcggc agctggcaac ctgacttgta tcgtcgcgat cggaaatgag 240 aacaggggca tcttgagccc ctgcggacgg tgtcgacagg tgcttctcga tctgcatcct 300 gggatcaaag cgatagtgaa ggacagtgat ggacagccga cggcagttgg gattcgtgaa 360 ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc taa 393 <210> 12 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 12 atggcaaaac cattatcaca agaagaatca actttaattg aacgagcaac tgcaactatt 60 aattcaattc caatttcaga agattattca gtagcatcag cagcattatc atcagatggt 120 cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg 180 gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240 aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300 catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360 cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaa 399

Claims (21)

  1. 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 포유동물 숙주세포에 있어서 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산을 가능하게 하기 위한 발현 벡터.
    (a) 코돈을 포유동물에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 것으로 개변하여 발현을 미약화시킨 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트
    (b) 고전사활성 프로모터와 고안정성 폴리아데닐레이션 시그널 사이에 외래유전자 삽입용 클로닝 사이트를 포함하는 유전자 카세트
  2. 제1항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트의 코돈이, 인간에 있어서 사용 빈도가 가장 낮은 코돈으로 개변된 것인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트의 코돈이, 알라닌은 GCA, 아르기닌은 CGA, 아스파라긴은 AAU, 아스파라긴산은 GAU, 시스테인은 UGU, 글루타민은 CAA, 글루타민산은 GAA, 글리신은 GGU, 히스티딘은 CAU, 류신은 UUA, 리신은 AAA, 프롤린은 CCA, 페닐알라닌은 UUU, 세린은 UCA, 트레오닌은 ACU, 티로신은 UAU, 및/또는 발린은 GUA로 개변된 것인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트가, 프로모터로서 발현 유도성이 낮은 프로모터를 사용하고 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 활성이 낮은 프로모터로서, 포유동물세포에서는 거의 발현하지 않는 유전자를 유래로 하는 프로모터, 또는 인핸서부분을 제거한 프로모터를 사용하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 번역 장애성 약제 내성 유전자 카세트에 있어서 코돈의 개변영역이, 유전자 카세트 전장의 30% 이상인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(NTP 유전자)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 제7항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 네오마이신 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
  9. 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
    (a) 제7항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 네오마이신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
    (d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
  10. 제9항에 있어서,
    제9항 (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  11. 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
    (a) 제7항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 네오마이신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 제오신 내성 유전자(Zeosinr 유전자)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제12항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 제오신 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
  14. 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
    (a) 제12항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 제오신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
    (d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
  15. 제14항에 있어서,
    제14항 (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  16. 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
    (a) 제12항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 제오신이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 (a)에 기재된 약제 내성 유전자가, 블라스티시딘 내성 유전자(Blasticidin 유전자)인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 제17항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정, 및 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능 및 블라스티시딘 내성능을 갖는 형질전환체의 제조방법.
  19. 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 생산방법.
    (a) 제17항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 블라스티시딘이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
    (d) 배양된 형질전환체로부터 외래유전자 유래 단백질을 회수하는 공정
  20. 제19항에 있어서,
    제19항 (c)의 공정에 있어서, Chemically Defined medium(CD 배지) 또는 CD 배지에 비동물성의 첨가물을 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  21. 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 외래유전자 유래 단백질의 고레벨 생산능을 갖는 형질전환체의 스크리닝방법.
    (a) 제17항의 발현 벡터에 외래유전자를 삽입하는 공정
    (b) 그 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시키는 공정
    (c) 그 형질전환체를 블라스티시딘이 첨가된 배지에서 배양하는 공정
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