KR20100120714A

KR20100120714A - 발아 현미 유래의 신규 화합물 및 그것을 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제

Info

Publication number: KR20100120714A
Application number: KR1020107022264A
Authority: KR
Inventors: 세이고 우스키; 로버트 케이 유; 게이코 모리카와; 미츠오 기세
Original assignee: 가부시키가이샤환케루
Priority date: 2008-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2010-11-16
Also published as: WO2009110612A1; JPWO2009110612A1; CN101959899A

Abstract

본 발명은 발아 현미 함유 성분의 새로운 기능을 발견하는 것을 과제로 하며, 안전성이 높고, 계속적인 섭취도 가능하고, 대량으로 제조할 수도 있고, 식품 등에 첨가하는 것이 용이하고 유효한 신경 장해 또는 당뇨병성 신경 장해 예방 또는 개선제 또는 기능성 식품의 제공을 과제로 한다. 본 발명은, 발아 현미 유래 스테롤 배당체(아실화 스테릴-β-글루코시드(ASG))를 유효 성분으로 하는 신경 장해 또는 당뇨병성 신경 장해 예방 또는 개선제 또는 기능성 식품을 제공한다.

Description

발아 현미 유래의 신규 화합물 및 그것을 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제{NEW COMPOUND DERIVED FROM GERMINATED BROWN RICE, AND AGENT CONTAINING SAID COMPOUND AS AN ACTIVE INGREDIENT FOR PREVENTION OR AMELIORATION OF NEUROPATHY}

본 발명은 발아 현미에 포함된 신규 화합물에 관한 것이며, 상기 신규 화합물의 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 상기 신규 화합물의 당뇨병성 신경 장해를 예방 또는 개선하는 용도에 관한 것이다.

당뇨병 환자수는, 2000년 통계에서는, 아시아에서는 8,450만명, 전세계에서는 1억 5,100만명이다. 2002년의 후생노동부 당뇨병 실태 조사에 의하면, 일본에서는 당뇨병 환자와 그 예비군이 1,620만명에 이르러, 실로 성인 6.3명당 1명에 해당한다. 또, 환자수는 2015년에는, 아시아에서는 1억 3,230만명, 전세계에서는 2억 2,100만명에 도달한다고 예측되고 있다(비특허문헌 1 참조).

당뇨병(DiabetesMellitus: DM)은, 당대사의 이상(異常)에 의해 일어난다고 알려져 있고, 혈액 중의 글루코오스 농도가 병적으로 높아지는 것에 의해, 여러가지 특징적인 합병증을 초래하거나, 초래할 위험성이 있는 병이다. 여기서, 합병증이란 그 병이 원인이 되어 발생하는 병이나 증상을 말한다. 당뇨병 자체에는 심각한 자각 증상이 없어, 합병증을 야기할 때까지 치료를 받지 않고 병의 용태를 악화시키는 경우가 많다.

당뇨병의 합병증으로는, 뇌경색, 뇌졸중, 심근 경색, 당뇨병 신증, 하지 폐색성 동맥 경화증, 당뇨병 망막증, 피부 질환, 감염증, 당뇨병성 신경 장해, 고지혈증, 뇌혈관성 치매증 등이 있고, 그 중에서도 당뇨병 신증, 당뇨병 망막증, 당뇨병성 신경 장해는 3대 합병증이라고 불린다.

당뇨병의 원인으로는, 유전적인 요인에 의한 것도 있지만, 식사 등의 생활 습관에 기인하는 것이 대부분을 차지하여, 건강 식품ㆍ기능성 식품에 대한 기대가 높아지고 있다. 최근, 발아 현미의 당뇨병 합병증에 대한 유용성이 주목받고 있고, 고지혈증의 개선 효과, 심장혈관계 질환의 예방(혈전 형성 억제), 당뇨병 신증의 예방 효과 등이 보고되고 있다.

여기서, 발아 현미란 현미를 발아시킨 것으로, 출아(出芽)의 상태가 대략 1 mm 미만인 것을 말한다. 발아의 과정에서, 강압 작용이나 항스트레스 작용이 알려져 있는 γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid(GABA))이 생성되는 것이 특징적이다. 또한, 발아 현미는 풍부한 식물 섬유, 비타민, 미네랄, 미지의 지질을 쌀겨층이나 싹에 포함하고 있어, 일본에서는 새로운 전립 곡물로서, 나아가 주식으로 하기 위한 연구 대상으로서 일반적이다. 발아 현미에서는 여러가지 건강에 대한 유용성이 연구되고 있고, 동물실험에서는, 스트렙토조토신(Streptozotocin(STZ))에 의해 유도된 당뇨병 래트의 혈중 글루코오스 농도를 저하시키는 작용이 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2 참조). 또, 백미와 비교하여 발아 현미의 식사는 정상인(비특허문헌 3 참조) 및 고혈당 환자(비특허문헌 4 참조)에 있어서, 식후의 혈중 글루코오스 농도 및 인슐린을 저하시키는 것이 알려져 있어, 당뇨병 예방을 위한 주식으로서의 의의가 높다고 평가되고 있다.

발아 현미는, 종래부터 건강 식품으로서 이용되어 왔기 때문에, 안전성도 높고 장기 운용이 가능한 제제나 식품을 제공할 수 있을 가능성을 갖는다. 최근, 발아 현미의 고지혈증에 대한 개선 효과, 심장혈관계 질환의 예방(혈전 형성 억제), 당뇨병 신증의 예방 효과 등이 주목받고 있다.

또한, 발아 현미의 당뇨병성 신경 장해에 대한 개선 효과가 조사되고 있지만(비특허문헌 5), 그 유효 성분에 관해서는 전혀 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은, 발아 현미에 포함되는 당뇨병성 신경 장해에 대한 개선 효과를 갖는 유효 성분을 확인하고, 그것에 의해 신규 화합물을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

특허문헌 1 : 일본 특허 공개 제2001-352916호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공개 제2002-136263호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 제2002-360192호 공보

비특허문헌 1 : Zimmet P, AlbertiKG, Shaw J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 2001 Dec 13; 414(6865):782-7. Review 비특허문헌 2 : Hagiwara H, Seki T, Ariga T. The effect of pre-germinated brown rice intake on blood glucose and PAI-1 levels in streptozotocin-induced diabetic rats. Biosci Biotechnol Biochem. 2004 Feb; 68(2):444-7. 비특허문헌 3 : Ito Y, Mizukuchi A, Kise M, Aoto H, Yamamoto S, Yoshihara R, Yokoyama J. Postprandial blood glucose and insulin responses to pre-germinated brown ricein healthy subjects. J Med Invest. 2005 Aug; 52(3-4):159-64. 비특허문헌 4 : Ito Y, Shen M, Kise M, Hayamizu K, Yoshino G, Yoshihara R, Yokoyama J. Effect of pre-germinated brown rice on postprandial blood glucose and insulin level insubjects with hyperglycemia. Jpn J Food Chem 2005; 12(2):80-4. 비특허문헌 5 : Usuki S, Ito Y, Morikawa K, Kise M, Ariga T, Rivner M, Yu RK. Effect of pre-germinated brown rice intake on diabetic neuropathy instreptozotocin-induced diabetic rats. Nutr Metab(Lond). 2007 Nov 23; 4(1):25 비특허문헌 6 : Abbott CA, Mackness MI, Kumar S, Boulton AJ, Durrington PN. Serumparaoxonase activity, concentration, and phenotype distribution in diabetesmellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995 Nov; 15(11):1812-8. 비특허문헌 7 : Silva IV, Caruso-Neves C, Azeredo IM, Carvalho TL, Lara LS, de Mello MC, Lopes AG. Urea inhibition of renal(NA+ + K+) ATPase activity is reversed by cAMP. Arch Biochem Biophys. 2002 Oct 15; 406(2):183-9. 비특허문헌 8 : Chung BH, Wilkinson T, Geer JC, Segrest JP. Preparative and quantitative isolation of plasma lipoproteins: rapid, single discontinuous density gradientult racentrifugation in a vertical rotor. J Lipid Res. 1980 Mar; 21(3):284-91. 비특허문헌 9 : Coste T, Pierlovisi M, Leonardi J, Dufayet D, Gerbi A, Lafont H, Vague P, Raccah D. Beneficial effects of gamma linolenic acid supplementation on nerveconduction velocity, Na+, K+ ATPase activity, and membrane fatty acidcomposition in sciatic nerve of diabetic rats. J Nutr Biochem. 1999 Jul; 10(7):411-20. 비특허문헌 10 : Shaheen Faizi, Muhammad Ali, Rubeena Saleem, Irfanullah, Sarah Bibi, Complete 1H and 13C NMR assignments of stigma-5-en-3-O-β-glucoside and its acetylderivative. Magnetic Resonance in Chemistry, 39(7):399-405 (2001)

발아 현미는 종래부터 건강 식품으로서 이용되어 왔기 때문에, 안전성도 높고 장기 운용이 가능한 제제나 식품을 제공할 수 있을 가능성을 갖는다. 즉, 본 발명의 당뇨병 신경 장해의 개선 효과를 얻기 위해서는, 유효 성분을 단리하여 섭취할 필요없이, 발아 현미 전체를 그대로 섭취함으로써 일정한 효과를 얻을 수 있다. 또, 상기 개선 효과는 복수의 인자가 협동적으로 작용함으로써 부여될 가능성이 있다.

한편, 만약 상기 효과를 갖는 유효 성분의 확인에 성공하면, 발아 현미 그대로에서는 불가능한 대량 또는 고농도의 투여가 가능해질 뿐만 아니라, 당뇨병성 신경 장해의 발증 메커니즘의 해명으로 이어지는 것도 기대된다.

따라서, 본 발명은 발아 현미에 포함되어 당뇨병성 신경 장해를 개선하는 기능을 갖는 유효 성분의 확인을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 한 결과, 발아 현미 또는 발아 현미의 겨의 층에 포함되는 스테롤 배당체(아실화 스테아릴-β-글루코시드(ASG: Acylated steryl-β-glucoside). 본 출원에서는, 스테롤 배당체, 아실화 스테아릴-β-글루코시드, ASG의 용어를 동의로 사용함)에 당뇨병성 신경 장해를 개선하는 것을 발견하여 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.

(1) 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해 예방 및 개선 조성물.

(2) (1)에 기재된 스테롤 배당체의 스테롤 골격이 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올인 것을 특징으로 하는 신경 장해 예방 및 개선 조성물.

(3) 지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.

(4) 스테롤 골격으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.

(5) 지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하고, 스테롤 골격으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.

(6) 지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 호모시스테인 티오락토나아제 활성화 조성물.

(7) (6)에 기재된 스테롤 배당체의 스테롤 골격이 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올인 것을 특징으로 하는 호모시스테인 티오락토나아제 활성화 조성물.

(8) 이하의 (i) 또는 (ⅱ) 중 어느 하나의 조건을 만족하는 하기 화학식 (A)로 표시되는 스테롤 배당체.

(i) 상기 화학식 (A) 중의 X는 이하의 군에서 선택되고, Y는 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올임:

[팔미트산(16:0),

스테아르산(18:0),

2-히드록시-옥타데칸산(18:0(2h)),

올레산(18:1),

리놀레산(18:2), 또는

리그노세르산(24:0)],

(ⅱ) 상기 화학식 (A) 중의 X는 2-히드록시-옥타데칸산(18:0(2h))이고, Y는 이하의 군에서 선택됨

[캄페스테롤,

스티그마스테롤,

5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올, 또는

β-시토스테롤].

본 발명의 발아 현미 또는 발아 현미의 겨의 층을 원료로 한 (아실화 스테릴-β-글루코시드, ASG)는, 당뇨병성 신경 장해 개선 효과를 갖는다.

따라서, 본 발명에 의하면 당뇨병성 신경 장해의 예방제 또는 개선제로서 이용할 수 있다.

그리고, 안전성이 높고, 계속적인 섭취도 가능하고, 정제 또는 합성하여 대량으로 제조할 수도 있고, 식품 등에 첨가하는 것이 가능하다는 점에서도, 사람 또는 동물의 건강 증진이나 질병 예방 등에 공헌할 수 있을 가능성이 크다.

도 1a은 아실화 스테릴-β-글루코시드(ASG)의 구조.
도 1b는 캄페스테롤 및 스티그마스테롤의 구조.
도 1c은 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올 및 β-시토스테롤의 구조.
도 2는 호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL(HT-변성된 LDL) 존재 하에서, 발아 현미 유래 ASG가 신경 축색막 유래 나트륨/칼륨 ATPase(Na/KATPase) 활성에 미치는 영향.
도 3은 발아 현미 지질 획분의 각 분류를 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 더 분획하여, 오르시놀(Orcinol) 염색한 결과.
도 4는 A2를 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 유래의 지질 H4(아실화 스테릴-β-글루코시드)와 비교한 결과.
도 5a은 발아 현미 유래 ASG(A2 획분)를 핵자기공명 분석법(NMR)으로 해석한 스펙트럼(1).
도 5b는 발아 현미 유래 ASG(A2 획분)를 핵자기공명 분석법(NMR)으로 해석한 스펙트럼(2).
도 6은 발아 현미 유래 ASG(A2 획분)를 핵자기공명 분석법(NMR)으로 해석한 결과.
도 7은 가스 크로마토 질량 분석법(GCMS)에 의한 해석의 결과.
도 8은 ASG가 HTase 활성에 미치는 영향.
도 9는 각 분류의 HPTLC 전개 이미지-1.
도 10은 각 분류의 HPTLC 전개 이미지-2.
부호의 설명
A2 : 발아 현미의 겨의 추출 분리 획분 Fr.2에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
A3 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.2에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
A4 : 발아 현미의 겨의 추출 분리 획분 Fr.2에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
A5 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.2에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
B1 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.3에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
B2 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.3에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
B3 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.3에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
B4 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.3에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
B5 : 겨의 추출 분리 획분 Fr.3에 포함되며, TLC-오르시놀 발색으로 검출되는 당지질 성분.
A2(알칼리) : 정제한 A2를 알칼리 처리한 것
Fr : 발아 현미 또는 현미의 겨의 조지질 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 더 분획한 것.
GSL St : 표준 글리코스핑고리피드
Cer : 세라미드
GlcCer : 글루코실세라미드
GalCer : 갈락토실세라미드
LacCer : 락토실세라미드
Gb3 : 글로보트리아오실세라미드
Gb4 : 골보테트라오실세라미드
C/M/W : 클로로포름/메탄올/물
C:M:W : 클로로포름:메탄올:물
Glc : 글루코스
Lac : 락토스
Suc : 수크로스
BBG : 소 뇌 강글리오시드 혼합물
ASG : 아실화 스테릴-β-글루코시드, 스테롤 배당체
H4(헬리코박터) : 헬리코박터 파일로리로부터 유도된 아실화 스테릴-β-글루코시드
H6(헬리코박터) : 헬리코박터 파일로리로부터 유도된 스테릴-β-글루코시드
ASG-matreya : 대두로부터 유도된 ASG의 상업적 표준
16:0 : 팔미트산(palmitic acid)
18:0 : 스테아르산(stearic acid)
18:0(2h) : 2-히드록시-옥타데칸산(2-hydroxy-octadecanoic acid)
18:1 : 올레산(oleic acid)
18:2 : 리놀레산(linoleic acid)
22:0 : 베헨산(behenic acid)
24:0 : 리그노세르산(lignoceric acid)
HTase : 호모시스테인ㆍ티오락톤(homocysteine thiolactone)의 가수분해 효소
HT : 호모시스테인ㆍ티오락톤(homocysteine thiolactone)
LDL : 저밀도 리포단백질
HT-변성된 LDL : 호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL
HT-LDL : 호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL
Na/KATPase : 나트륨/칼륨 ATPase
SG : 발아 현미 유래 ASG에서 지방산을 제거한 것
S-ASG : 대두에서 정제한 ASG

[정의]

당뇨병성 신경 장해란, 당뇨병이 원인이 되어 발생하는 합병증의 하나이며, 말초 신경 장해와 자율 신경 장해를 말한다. 임상적으로는 초기에는 수족 등의 저림이나 통증, 만성기에는 감각 마비, 운동신경 실조를 야기하는 장해이다. 병리학적으로는, 신경 조직의 미엘린초와 축색의 변성과 손상을 들 수 있다. 이러한 신경 장해는, 말초 신경 전도 속도의 저하, 신경 축색막 유래 나트륨/칼륨 ATPase(Na, K-ATPase) 활성의 저하로서 관찰, 정량할 수 있다.

당뇨병성 신경 장해의 개선 효과란, 발아 현미 유래 ASG 또는 발아 현미 유래 ASG의 유효 성분이 갖는 효과로서, 사람 또는 동물의 개체, 조직 또는 세포에 있어서, 당뇨병성 신경 장해가 원인이 되어 저하된 나트륨/칼륨 ATPase 활성 또는 HTase 활성을 정상치에 가까워지도록 상승시키는 효과 또는 운동신경 전도 속도의 저하를 방지하는 효과를 말한다.

본 발명에서 말하는 신경 장해란, 당뇨병성 신경 장해와 동일 또는 유사한 생리학적, 세포 조직학적 또는 생화학적 소견을 나타내는 병의 용태를 말하지만, 당뇨병을 원인으로 하는 것에 한정되지 않는다. 즉, 중추 및 말초 신경에 있어서, 병리 조직학적으로는, 특히 신경 축색의 손상, 미엘린초 탈수(脫髓), 신경 생리학적으로는, 운동신경 전도 속도의 저하, 생화학적으로는, 신경막 유래 나트륨/칼륨 ATPase 활성의 저하, 또는 혈청중의 고밀도 리포 단백(HDL) 분획에 포함되어 있는 HTase 활성의 저하로서 관찰, 정량할 수 있는 모든 신경 장해를 말한다.

HTase란, 동맥 경화의 위험 인자인 호모시스테인ㆍ티오락톤(homocysteine thiolactone)의 가수분해 효소를 말하며, 파라옥소나제(paraoxonase) 패밀리로 분류된다. 신경 장해를 수반한 환자에서는 파라옥소나제 활성이 저하되는 것이 보고되어 있기 때문에(비특허문헌 6 참조), HTase 활성의 저하는 동맥 경화의 위험 인자가 될 뿐만 아니라, 신경 장해의 진행 정도에도 관련된다고 생각되고 있다.

[실험 재료 및 방법]

<발아 현미>

공지의 방법(특허문헌 1-3 참조)으로 조정했다.

<분획-지질 획분의 추출>

지질 획분은 5 g의 발아 현미 또는 현미의 겨로부터, 30 ㎖ 및 20 ㎖의 클로로포름ㆍ메탄올(1:1 및 2:1, 용적비)을 이용하여 2회 추출하여 지질 획분으로 했다.

<분획-실리카겔 크로마토그래피>

당지질의 조성 분석과 각 성분의 정제

발아 현미 및 현미의 지질 획분을 또한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(1×15 cm)에 반응시켜, 용매 클로로포름:헥산(1:1) 40 ㎖, 클로로포름:헥산(9:1) 70 ㎖를 통과시켜 얻은 분획을 Fr.1로 한다. 이어서, 용매 클로로포름:메탄올(9:1) 80 ㎖를 통과시켜 얻은 분획을 Fr.2로 한다. 또한 용매 클로로포름:메탄올:물(7:3:0.1) 80 ㎖, 용매 클로로포름:메탄올:물(3:6:0.8) 120 ㎖를 통과시켜 얻은 각각의 분획을 Fr.3과 Fr.4로 한다. 각 분획을 로터리 증발기로 농축 건고시켰다. 각 분획 1 ㎍을 실리카겔 박층(TLC) 플레이트에 스폿하여, 용매 클로로포름:메탄올:물(70:30:0.1)로 전개시킨다. 전개 후, TLC 플레이트에 오르시놀 시약을 스프레이한다. TLC 플레이트를 핫 플레이트에 얹어 110℃에서 5분간 가열한다. 오르시놀 발색으로 검출된 각 당지질 성분을 덴시토미터로 정량하여 조성을 구했다.

A2 획분의 정제

발아 현미 및 현미의 겨의 추출 분리 획분 Fr.2 및 Fr.3에 포함되는 각 당지질 성분(A2, A4, B1, B2, B3, B4, B5)을 또한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(1×15 cm)에 반응시키고, 용매(클로로포름:메탄올:물(70:30:0.1), 유속 0.2 ㎖/min)를 이용하여 분류 콜렉터로 단리 정제를 했다.

<알칼리 분해>

A2(0.1 mg)에 0.5 ㎖의 0.5 M NaOH/메탄올:물(4:1)을 첨가하고 용해하여 실온에서 20시간 교반한다. 교반 후에 2.5 ㎖의 클로로포름:메탄올(2:1)을 첨가하여 폴치 분배한다.

하층을 모아 농축시킨다. 분배한 하층을 소량의 클로로포름 TLC 플레이트에 스폿하여, 용매 클로로포름:메탄올:물(70:30:0.1)로 전개시킨다. 전개후, TLC 플레이트에 오르시놀 시약을 스프레이한다. TLC 플레이트를 핫 플레이트에 얹어 110℃에서 5분간 가열한다. 오르시놀 발색시켜, 알칼리 처리 전후의 A2 및 A4의 TLC 전개 이동도를 비교했다.

<분획-박층 크로마토그래피>

실리카겔을 코팅한 시판하는 세로 10 cm 의 TLC 플레이트(Silica gel 60, Merck)의 아래로부터 1.5 cm의 위치에 마이크로 시린지로 샘플을 도포한다. 전개 용매 클로로포름:메탄올:물(70:30:0.1)로 전개시켰다. 전개 후 바람으로 건조시켰다.

<오르시놀(orcinol) 염색>

0.2% 오르시놀/2N 황산을 스프레이에 의해 TLC 플레이트에 균일하게 스프레이한다. 스프레이를 받은 TLC 플레이트를 110℃로 가열된 핫 플레이트 상에서 가열한다. TLC 플레이트 상에서 분리된 당을 포함하는 각 성분은 특이적인 검붉은 색을 발색하는 것으로 확인되었다.

<가스 크로마토 질량 분석법(GCMS)>

A2(50 ㎍)를 1.0 ㎖의 1 N 염산/메탄올에 녹여, 86℃에서 16 내지 24시간 가수분해했다. 반응 후 실온까지 냉각시킨 후에, 1.0 ㎖의 헥산을 첨가하여 교반, 원심하여 2층으로 분리했다. 하층에 다시 1.0 ㎖의 헥산을 첨가하여 2층 분리를 했다. 또한 하층에 대하여 1회 더 2층 분리를 했다. 헥산을 많이 포함하는 상층만을 모아 질소 가스로 건조시켜 지방산 분획으로 했다. 헥산층은 지방산의 GCMS 분석에 이용되었다. 한편, 남은 염산메탄올층에 등량의 에틸에테르를 첨가하여 2층 분배를 했다. 에테르층은 질소 가스로 건조시켜 스테롤 분획으로서 스테롤의 GCMS 분석에 이용되었다. GCMS 분석은 Hewlett-Packard GC-MS (5972 MS & 5890 GC)에 장착한 모세관 칼럼 DB-1(50 m×0.25 mm)에 의해 실시되었다. 지방산의 분석은 초기 온도 70℃(5분), 10℃/분(18분), 최종 온도 250℃(15분)의 10℃/분의 변화 승온 프로그램으로 실시되었다. 스테롤의 분석은 초기 온도 70℃(1분), 10℃/분(18분), 최종 온도 250℃(21분)의 변화 승온 프로그램으로 실시되었다.

<핵자기공명 분석법(NMR)>

A2(1.0 mg)를 0.5 ㎖의 CD₂Cl₂에 용해하여 예비적인 NMR 데이터를 취한 후에, CD₂Cl₂를 질소 가스로 건조 제거했다. 다시 0.5 ㎖의 CDCl₃에 용해하여 본격적인 측정을 했다. 데이터는 25℃에서 800 MHz와 900 MHz로 행했다. 데이터의 수집은 ¹HNMR의 스펙트럼에 더하여, 2차원 스펙트럼[COSY, HSQC(carbon-proton one-bond correlated data), HMBC(carbon-proton multiple bond correlated data)]으로도 수집되었다.

<리포단백질의 분리>

리포단백질은 이전에 보고된 과정(비특허문헌 8 참조)으로 준비했다. 간단히 설명하면, 정상 래트로부터 채취한 신선한 혈청을 모아, 고체 KBr을 이용하여 밀도를 1.3 g/㎖로 맞추었다. 상기 조제한 혈청(1.5 ㎖, 1.3 g/㎖) 위에 통상의 생리식염수(3.5 ㎖, 1.006 g/㎖)를 중층하여, 초원심에 의해 원심관 중에 불연속의 밀도 구배를 제작했다. 리포단백질은 TV865 로터로 369548 g, 4℃, 45분간의 초원심에 의해 분리했다. 3종의 주요 리포단백질 획분(VLDL, LDL, HDL)을 회수하여, PBS에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석했다. 본 명세서에서는 LDL은 상기 방법으로 얻어진 획분을 의미한다.

래트 혈청 HDL 중의 HTase 활성은 시판하는 측정 키트를 이용하여 측정했다(AlfresaAuto HTLase; Alfresa Pharma Corp., Osaka, Japan). 이 키트는γ-티오부티로락톤(thiobutyrolactone)을 기질로서 이용한다. HTase는 락톤 고리를 가수분해하여, 유리(遊離) 티올(thiol)기를 생성한다. 티올기는 5,5'-디티오비스(5,5'-dithiobis(2-netrobenzoic acid))와 반응함으로써, 450 nm의 흡수로 측정되는 5-티오-2-니트로벤조산(5-thio-2-netrobenzoic acid)을 생성했다. 450 nm의 흡수를 측정하여 효소 활성을 산출했다.

<나트륨/칼륨 ATPase 활성을 위한 조정제 좌골 신경막의 조제>

조정제막은 이전에 보고된 과정(비특허문헌 7 참조)으로 조제했다. 간단히 설명하면, 래트의 좌골 신경을, 냉각 등 침투압 용액(250 mM 수크로스, 10 mM HEPES-Tris 완충액(pH 7.6), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF) 중에서 파쇄 균질화했다. 상기 균질화한 액을 10분간 4℃에서 3000 rpm으로 원심 분리하여, 상등액을 회수하고, 45분간 45000 rpm으로 더 원심 분리했다. 상등액을 버린 후에, 침전을 100 ㎕의 250 mM 수크로스 용액(10 mM HEPES-Tris 완충액(pH 7.6)에 용해)에 현탁했다.

<호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL의 조정>

시험관 내에서의 LDL의 호모시스테인ㆍ티오락톤화는 이전에 보고된 실험조건으로 행했다(비특허문헌 5). 간단히 설명하면, 적량의 LDL 용액(LDL 단백질, 100 ㎍)을 10 mM PBS(pH 8.2)에 현탁하고, 전체를 37℃에서 조심스럽게 저어 혼합하면서 호모시스테인ㆍ티오락톤(100 ㎛ol/L) 및 표시한 양의 전체 지질 획분(TLp) 또는 ASG(0.01 내지 10.0 ㎍)와 2 시간 항온 처리했다. 항온 처리 후에, 미반응의 호모시스테인ㆍ티오락톤을 제거하기 위해, 10 mM PBS(pH 8.2)로 평형시킨 Bio-gelP-2 칼럼에 상기 혼합액을 통과시켰다.

나트륨/칼륨 ATPase 활성은 이전의 보고(비특허문헌 7 참조)와 같이 측정했다. 간단히 설명하면, 나트륨/칼륨 의존적 활성을 측정하기 위한 나트륨/칼륨 ATPase 활성 측정 용액(0.2 ㎖)의 조성은 10 mM MgCl₂, 20 mM HEPES-Tris(pH 7.0), 120 mM NaCl, 30 mM KCl, 0.5 mg/㎖의 조정제막 단백질 및 25 mM[γ-³²P]ATP(10,000 cpm)였다. 측정 용액을 37도에서 15분 항온 처리한 후, 0.1 mg/㎖의 활성탄을 첨가하여, 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리했다. 상등액을 회수하고, 무기의 ³²P 방사 활성을 신틸레이션 카운터로 측정했다.

[결과 및 고찰]

<발아 현미 유래의 유효 성분의 분획>

발아 현미의 겨의 층에 포함되는 지질 획분을 분류 1, 2, 3 및 4로 분획하고, 또한 박층 크로마토그래피를 이용하여 분획함으로써, 비특허문헌 5에 나타낸 당뇨병성 신경 장해의 개선 기능을 갖는 유효 성분은 아실화 스테릴-β-글루코시드(ASG)인 것이 판명되었다.

유효 성분이 단일 획분 A2(이하, A-2로 표기하는 경우도 있지만, 특별히 구별하지 않음)에만 포함되어 있었던 것은 특필해야 한다. 즉, 발아 현미와 같은 천연 식품에 특정한 약학적 효과가 보이는 경우에, 복수의 인자가 협동적으로 작용하여 효과를 발휘하고 있다 하더라도 이상하지 않기 때문이다. 단일 획분 A2는 복수 종류의 ASG를 포함하고 있지만, 박층 크로마토그래피를 이용한 분획에서는 각각을 분리할 수는 없었다. 이것은, 각각의 ASG의 구조 및 화학적 성질이 서로 유사하기 때문이라고 생각된다.

본 명세서에서 「ASG」라고 할 때에는, 일반 명칭으로서의 ASG를 나타낸다. 「발아 현미 유래(의) ASG」라고 할 때에는, A2 획분에 해당하는 복수 종류의 ASG의 집합을 나타낸다. 단, 문맥상 명확한 경우에는 「ASG」가 A2 획분에 해당하는 복수 종류의 ASG의 집합을 나타내는 경우도 있다.

본 발명은 상기 발아 현미 유래의 ASG에 관한 것이며, 또 상기 발아 현미 유래의 ASG를 이용한 당뇨병성 신경 장해의 개선 또는 예방제에 관한 것이다.

<발아 현미 유래의 유효 성분의 확인>

A2 획분에 관해 NMR을 이용하여 해석을 한 결과, 예상대로 A2 획분은 ASG로 구성되는 것이 확인되고, A2를 구성하는 ASG의 스테롤은 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올 및 β-시토스테롤인 것이 판명되었다. 또, A2를 구성하는 ASG의 지방산은 팔미트산(16:0, 이하 약칭으로 나타내는 경우가 있음. 다른 지방산에 관해서도 동일함), 스테아르산(18:0), 2-히드록시-옥타데칸산(18:0(2h)), 올레산(18:1), 리놀레산(18:2) 및 리그노세르산(24:0)인 것이 판명되었다. ASG의 일반 구조 및 A2를 구성하는 ASG의 스테롤의 구조를 도 1에 나타낸다.

도 1에서 알 수 있듯이, A2 획분의 ASG는, 당(Sugar)의 골격에 상기 4종류의 스테롤 중 어느 하나가 결합하고, 상기 6종류의 지방산 중 어느 하나가 결합하고 있다. 이론적으로는 24종류의 조합이 있고, 따라서, 24종류의 ASG가 포함될 수 있지만, 현실의 A2 획분의 ASG는 보다 적은 종류에 한정되어 있을 가능성이 있다. 당과 스테롤의 결합 양식에는 α결합과 β결합이 있지만, 발아 현미 유래 ASG의 경우에는 β결합만인 것이 판명되었다(하기 참조).

<발아 현미 유래 ASG의 HTase 활성에 대한 효과>

HTase란, 동맥 경화의 위험 인자인 호모시스테인ㆍ티오락톤(homocysteine thiolactone)의 가수분해 효소를 말하며, 파라옥소나제(paraoxonase) 패밀리로 분류된다. 신경 장해를 수반한 환자에서는, 파라옥소나제 활성이 저하되는 것이 보고되어 있기 때문에(비특허문헌 5 참조), HTase 활성의 저하는 동맥 경화의 위험 인자가 될 뿐만 아니라, 신경 장해의 진행 정도에도 관련된다고 생각되고 있다. 본 원 발명의 ASG는 래트 혈청 LDL 중의 HTase 활성을 상승시키기 때문에, 신경 장해의 개선 또는 예방제로서의 기능을 갖는 것을 시사한다.

<발아 현미 유래 ASG에 특이적인 HTase 활성에 대한 효과>

발아 현미 유래 ASG(ASG)를 첨가한 경우에는 양(量)의존적인 HTase의 활성 상승이 보이는 데 대하여, SG(발아 현미 유래 ASG에서 지방산을 제거한 것) 및 대두 유래 ASG(S-ASG)를 첨가한 경우에는 HTase의 활성 상승은 보이지 않았다(표 6). 이것은, 양의존적으로 HTase의 활성을 상승시키는 효과는, 발아 현미 유래 ASG에 특이적인 것이라는 것을 나타내고 있다.

<발아 현미 유래 ASG의 신경 장해의 개선 효과>

신경 장해는, 말초 신경 전도 속도의 저하 또는 신경 축색막 유래 나트륨/칼륨 ATPase(Na, K-ATPase) 활성의 저하로서 관찰, 정량할 수 있는 것이 알려져 있지만(비특허문헌 5 및 9), 본 연구에서는, 다수의 샘플을 처리하기 위한 편리성 등의 관점에서, 나트륨/칼륨 ATPase 활성을 신경 장해의 지표로서 이용했다. 즉, 나트륨/칼륨 ATPase 활성이 보다 낮은 쪽이, 신경 장해의 정도가 심한 것을 나타낸다.

신경 축색막 유래 나트륨/칼륨 ATPase 활성의 저하는, 호모시스테인ㆍ티오락톤에 의해 LDL이 수식되어 LDL의 기능이 저해되는 것이 원인이라고 생각되고 있다. 본 연구에서는, 신경 장해를 재현하기 위해, 정상 래트로부터 조정한 조정제 좌골 신경막의 나트륨/칼륨 ATPase 활성을 호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL(HT-변성된 LDL) 존재 하에 측정했다.

호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL(HT-변성된 LDL) 존재 하에, 발아 현미 유래 ASG는 신경 축색막 유래 나트륨/칼륨 ATPase(Na/KATPase) 활성을 양의존적으로 상승시켰다(도 2). 이 때문에, 발아 현미 유래 ASG가 신경 장해를 개선시키는 기능을 갖는 것이 나타났다.

<발아 현미 유래 ASG에 특이적인 신경 장해의 개선 효과>

발아 현미 유래 ASG(ASG)를 첨가한 경우에는 양의존적인 나트륨/칼륨 ATPase의 활성 상승이 보이는 데 비해, SG 및 대두 유래 ASG(S-ASG)를 첨가한 경우에는 나트륨/칼륨 ATPase의 활성 상승은 보이지 않았다(표 7). 이것은, 양의존적으로 나트륨/칼륨 ATPase의 활성을 상승시키는 효과는, 발아 현미 유래 ASG에 특이적인 것이라는 것을 나타내고 있다.

<발아 현미 유래 ASG의 유효 성분(S-ASG와의 비교)>

상술한 바와 같이, 발아 현미 유래 ASG는 단일 ASG가 아니라, 복수 종류의 ASG의 혼합물이다(표 4 및 표 5). 발아 현미 유래 ASG에는, 스테롤 부분으로서 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤 또는 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 갖는 것이 포함되어 있다. 한편, 대두 유래 ASG에는 스테롤 부분으로서 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 β-시토스테롤을 갖는 것만 포함되어 있다. 이것은, 발아 현미 유래 ASG의 진정한 유효 성분이, 스테롤 부분으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 갖는 ASG일 가능성을 강하게 시사한다. 이론적으로는, 약한 작용을 갖는 복수의 인자가 협동적으로 작용하여 강한 효과를 만들어 낼 수도 있지만, 현실적으로는 생각하기 어렵다.

또, 발아 현미 유래 ASG에는, 지방산 부분으로서 16:0, 18:0, 18:0 (2h), 18:1, 18:2 또는 24:0을 갖는 것이 포함되어 있다. 한편, 대두 유래 ASG에는 지방산 부분으로서 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 22:0(베헨산) 또는 24:0을 갖는 것만 포함되어 있다. 이것은, 발아 현미 유래 ASG의 진정한 유효 성분이, 지방산 부분으로서 18:0(2h)을 갖는 ASG일 가능성을 강하게 시사한다. 역시, 이론적으로는, 약한 작용을 갖는 복수의 인자가 협동적으로 작용하여 강한 효과를 만들어 낼 수도 있지만, 현실적으로는 생각하기 어렵다.

따라서, 발아 현미 유래 ASG에 포함되는 진정한 유효 성분은, 스테롤 부분으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 갖거나 또는 지방산 부분으로서 18:0(2h)을 갖는 ASG일 가능성이 매우 높다. 이론적으로는, 발아 현미 유래 ASG에는 4×6=24종류의 ASG가 포함될 수 있지만, 본 연구에 의하면, 발아 현미 유래 ASG에 포함되는 진정한 유효 성분의 후보는, 6+4-1=9종류의 ASG에 한정된다. 즉, 스테롤 부분으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 가지며 지방산 부분으로서 16:0, 18:0, 18:0(2h), 18:1, 18:2 또는 24:0을 갖는 6종류의 ASG, 또는 스테롤 부분으로서 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤 또는 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 가지며, 지방산 부분으로서 18:0(2h)을 갖는 4종류의 ASG이다(1종류는 중복하여 카운트되었음).

본 원 발명은, 이 발아 현미 유래 ASG의 진정한 유효 성분에 관한 것이며, 진정한 유효 성분을 포함하는 발아 현미 유래 ASG에 관한 것이다.

<발아 현미 유래 ASG의 유효 성분(SG와의 비교)>

본 연구에서는, 발아 현미 유래 ASG를 가수분해하여 지방산 부분을 제거함으로써 조정한 SG와의 비교도 행했다. 지방산 부분을 상실한 SG는 신경 장해의 개선 작용을 갖지 않아(표 6 및 표 7), 지방산 부분의 존재는 필수라는 것을 알 수 있었다.

<산업상 응용>

본 발명의 발아 현미 유래 ASG(단일 또는 복수 종류)는, 상기 방법으로 얻어진 획분을 그대로 직접 사용해도 되지만, 일반적으로는 적당한 액체에 용해하거나 또는 분산시켜, 또는 적당한 분말 담체와 혼합하거나 또는 이것에 흡착시켜, 경우에 따라서는 이들에 유화제, 분산제, 현탁제, 전착제, 침투제, 습윤제, 안정제 등을 더 첨가하여, 유제, 오일제, 수화제, 산제, 정제, 캡슐제, 액제 등의 제제로서 사용한다.

제제로서 사용하는 경우의 획분의 사용량은, 제제의 형태에 따라서도 다르지만, 유효한 투여량이면 되고, 안전성에 문제가 없기 때문에 특별히 상한은 규정하지 않는다.

또, 본 발명에서 말하는 기능성 식품이란, 발아 현미 유래 ASG를 유효 성분으로 하여, 신경 장해를 예방하는 기능 또는 개선하는 기능을 갖는 식품, 또는 식품의 섭취에 의해 이러한 기능의 발휘가 기대되는 식품을 말하며, 건강 식품, 특정 보건용 식품, 영양 기능 식품 모두를 포함한다.

식품으로는, 츄잉검, 캔디, 정과, 구미젤리, 쵸콜렛, 비스킷 또는 스낵 등의 과자, 아이스크림, 셔벗 또는 빙과 등의 냉과, 음료, 푸딩, 잼, 유제품, 조미료 등을 들 수 있고, 이들 식품을 일상적으로 섭취하는 것이 가능하다. 이들 식품에 대한 본 발명의 지질 획분의 첨가량으로는, 식품의 형태에 따라서도 다르지만, 안전성에 문제가 없기 때문에 그 농도에 상한을 설정할 필요는 없다.

[참고예 1]

[발아 현미 유래의 유효 성분의 분획]

실험 재료 및 방법에 기재된 방법으로 발아 현미 지질 획분을 분류 1, 2, 3 및 4(Fr1, Fr2, Fr3 Fr4)로 분획했다. 각 분류에 관해 HTase 활성 측정을 한 결과, Fr2가 활성을 가지며(표 1), 당뇨병성 신경 장해를 개선하는 기능을 갖는 유효 성분은 상기 Fr2에 포함되는 것을 알 수 있었다. 즉, 첨가물(Additive)로서 1.0 ㎍의 Fr.2를 첨가한 경우에만, 아무것도 첨가하지 않는 경우(None)와 비교하여 HTase의 활성의 상승이 관찰되었다.

표 1

^a수치는 개별 실험(n=4)에서의 평균임.

^b수치는 첨가제(전체 TLp 또는 TLp의 Fr 1∼4의 각각의 분류)가 1.0 μg인 HTase 활성의 개별 실험(n=2)에서의 평균이며 첨가제가 없는 대조 HTase 활성의 %로 표시함.

각 분류를 또한 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 분획하고, 오르시놀(Orcinol) 염색한 결과를 도 3A에 나타낸다. Fr1, Fr2, Fr3의 순으로, TLC 전개의 위에서 아래로 향하여 극성이 상이한 성분이 이동도의 순서로 용출되어 있는 것이 관찰된다. GSLSt를 마커로서 이용했다. Fr2 및 Fr3의 주요 밴드를 위로부터 순서대로, 각각 A1-A5 및 B1-B5로 이름붙였다. 각 밴드에 관해 HTase 활성 측정을 한 결과, A2가 활성을 가지며(표 2), 당뇨병성 신경 장해를 개선하는 기능을 갖는 유효 성분은 상기 A2에 포함되는 것을 알 수 있었다. 즉, 첨가물(Additive)로서 0.1 ㎍의 A2(발아 현미의 지질(TLp) 유래)를 첨가한 경우에만, 아무것도 첨가하지 않는 경우(None)와 비교하여 현저한 HTase의 활성의 상승이 관찰되었다. 통상의 현미의 지질(TLb)을 분획한 경우에는 A2에 해당하는 밴드는 보이지 않았다(ND, not determined의 약칭).

표 2

^a수치는 개별 실험(n=4)에서의 평균이며 TLb에서의 전체 글리코리피드 또는 TLb의 %로 표시함.

^b수치는 첨가제(각각 글리코컨쥬게이트; A2∼B5)가 0.1 μg인 HTase 활성의 개별 실험(n=2)에서의 평균이며 첨가제가 없는 대조 HTase 활성의 %로 표시함.

정제한 A2, A4 및 알칼리 처리한 A2에 관해, TLC 전개한 결과를 도 3B에 나타낸다. A2를 알칼리 처리하면 A4와 동일한 이동도를 나타낸다. A4는 알칼리 처리에 의해 이동도가 변화하지 않았다. Matreya사에서 시판하고 있는 대두 유래의 ASG가 A2와 동일한 이동도를 나타내고, 알칼리 처리함으로써 A4와 동일한 이동도를 나타내게 되었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이 헬리코박터균(Helicobacter pylori) 유래의 지질 H4(아실화 스테릴-β-글루코시드)와 동일한 이동도를 나타내는 것을 알 수 있었다. H4도 알칼리 처리에 의해 헬리코박터균 유래의 H6과 동일한 이동도를 나타내게 되었다. A4와 H6을 비교한 경우에는, 약간 이동도가 상이했지만, 거의 동일한 이동도를 나타냈다. 이것으로부터 A2도 H4도 A4와 H6이 아실화한 구조라는 것이 판명되었다. 이동도의 근소한 차이는 스테릴-β-글루코시드와 스테릴-β-글루코시드의 상이점, β결합인지 α결합인지의 입체 이성체의 특성에 의해 발생했다고 생각된다. 즉, A2는 아실화 스테릴-β-글루코시드라는 것을 알 수 있었다. ASG는 도 1의 화학식으로 표시되며, 중심이 되는 당에 스테롤과 지방산(도면 중 R로 표시됨)이 결합한 구조를 갖는다.

실시예 1

[발아 현미 유래의 유효 성분의 확인]

<NMR에 의한 구조 해석>

발아 현미 유래 ASG를 구성하는 스테롤 및 지방산의 구조 및 상기 결합 양식(α 결합 또는 β결합)을 밝히기 위해, 본 발명자들은 핵자기공명 분석법(NMR)을 행했다. 그 결과를 도 5 및 표 3에 나타낸다.

A2의 알칼리 분해 전후의 TLC 플레이트 상의 이동도의 변화, 그 밖의 샘플(A4, H6, A4, S2 등)과의 TLC 플레이트 상에서의 이동도(거동)의 비교에서, A2가 ASG인 것이 예상되었지만, A2가 어떠한 ASG인지를 NMR 해석으로 밝혔다. NMR 데이터의 해석 방법은 비특허문헌 10을 참조한 것. NMR에서 밝혀진 것은 이하의 4가지이다: (1) A2에는 글루코오스와 지방산과 스테롤이 1분자 포함되어 있다. (2) 글루코오스의 6위에 지방산이 에스테르로서 결합하고 있다. (3) 글루코오스는 스테롤에 β결합하고 있다. (4) 주요 스테롤은 시토스테롤이다.

¹H-¹³C NMR의 2차원 스펙트럼의 시그널을 글루코오스, 시토스테롤, 지방산에 포함되는 개개의 프로톤의 시그널에 할당할 수 있었다(표 3).

글루코오스의 프로톤(글루코스 1 ∼글루코스 6), 시토스테롤(시토스테롤 C, 시토스테롤 CH, 시토스테롤 CH2, 시토스테롤 CH3), 지방산(아실기 CH2, 아실기 H1)으로서 표 3에 시그널값이 기록되어 있다. 번호는 도 6에 나타내는 바와 같다.

표 3

글루코스 1의 H1은 4.359 ppm이며, H2에 스칼라 커플링(7.7 Hz)하고 있는 것에서 글루코오스는 β결합인 것이 판명되었다. 글루코오스에 관해서는 글루코스 6의 H6과 H6'가 저자장으로 시프트하고 있는 것에서 6위에 아실화가 되어 있는 것이 판명되었다. 6위의 아실화는 2.32 및 1.59 ppm의 시그널이 동일한 카르보닐기에 결합한 CH2 프로톤인 것에서 6위에는 장쇄의 지방산이 결합하고 있는 것이 판명되었다. 스테롤 골격에 특징적인 시그널도 표 3에 있는 바와 같이 발견되어, 주요 성분으로서 시토스테롤을 거의 검증할 수 있는 결과를 나타냈다.

<GCMS에 의한 구조 해석>

NMR 구조 해석에서는 스테롤 및 지방산에 포함되는 성분 모두를 확인할 수 없기 때문에 A2를 구성하는 스테롤 성분 및 지방산 성분으로서의 조성비를 GCMS 구조 해석으로 구했다.

A2를 구성하는 ASG의 스테롤의 조성 및 대두 유래 ASG의 스테롤의 조성을 표 4에 나타낸다.

표 4

캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 β-시토스테롤은 대두 유래 ASG에도 포함되며, 이미 잘 알려져 있다. 주목해야 할 점은, A2에는 신규 스테롤인 「5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올」이 비교적 높은 비율로 포함되어 있는 것이다. 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올의 구조를 확인한 GCMS의 데이터를 도 7A에 나타내고, 그 구조를 도 1에 나타냈다.

다음으로, NMR을 이용한 해석에 의해 분명해진 A2를 구성하는 ASG의 지방산의 조성 및 대두 유래 ASG의 지방산의 조성을 표 5에 나타낸다.

표 5

16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 22:0 및 24:0은 대두 유래 ASG에도 포함되며, 이미 잘 알려져 있다. 주목해야 할 점은, A2에는 신규 지방산인 「18:0(2h)」이 포함되어 있는 것이다. 18:0(2h)를 확인한 GCMS 스펙트럼을 도 7B에 나타낸다.

실시예 2

[발아 현미 유래 ASG의 혈청 HDL 유래 HTase 활성에 대한 효과]

발아 현미 유래 ASG가 HTase 활성에 미치는 효과를 조사했다. 실험 방법을 간단히 설명한다. 정상 래트의 혈청 급원으로부터 HDL을 조제하고, 그것을 HTase의 효소원으로서 ASG를 첨가하여 HTase의 활성화를 조사했다.

그 결과를 도 8에 나타낸다. 첨가하는 ASG의 양이 0 내지 0.1 ㎍의 사이에서, 양의존적인 HTase 활성의 상승이 보였다. 이 HTase의 활성 상승은, 첨가하는 ASG의 양이 0.5 ㎍에서 포화하고, 그 이상 첨가한 경우도 큰 변화는 없었다.

실시예 3

[발아 현미 유래 ASG에 특이적인 HTase 활성에 대한 효과]

상기 발아 현미 유래 ASG의 HTase 활성에 대한 효과가, 발아 현미 유래 ASG에 특이적인 것인지의 여부를 밝히기 위해, 본 발명자들은 도 8과 동일한 시험을 반복했다. 발아 현미 유래 ASG(ASG), 발아 현미 유래 ASG에서 지방산을 제거한 것(SG) 및 대두 유래 ASG(S-ASG)에 관해, HTase 활성의 변화를 조사한 결과를 표 6에 나타낸다. ASG, SG 또는 S-ASG의 어느 것도 첨가하지 않은 경우의 HTase 활성을 100으로 하여 상대값으로 나타낸다.

표 6

발아 현미 유래 ASG(ASG)를 첨가한 경우에는, 도 8과 동일한 결과를 얻을 수 있었던 데 비해, SG 및 대두 유래 ASG(S-ASG)를 첨가한 경우에는, 양의존적인 HTase의 활성 상승은 보이지 않았다.

실시예 4

[발아 현미 유래 ASG의 신경 장해의 개선 효과]

발아 현미 유래 ASG가 발아 현미와 동일한 당뇨병성 신경 장해의 개선 효과(비특허문헌 5)를 갖는지의 여부를 확인하기 위해, 호모시스테인ㆍ티오락톤 수식 LDL(HT-변성된 LDL) 존재 하에서, 발아 현미 유래 ASG가 나트륨/칼륨 ATPase(Na/K ATPase) 활성에 미치는 영향을 조사했다. 실험 방법을 간단히 설명한다. 정상 래트의 좌골 신경으로부터 Na/KATPase 조분획을 조제했다. 정상 래트 혈청으로부터 조제한 LDL을 호모시스테인화하고, ASG와 함께 첨가하여 Na/K ATPase의 활성에 미치는 영향을 조사했다.

그 결과를 도 2에 나타낸다. 첨가하는 ASG의 양이 0 내지 1.0 ㎍의 사이에서, 양의존적인 Na/KATPase 활성의 상승이 보였다. 이 Na/K ATPase의 활성 상승은, 첨가하는 ASG의 양이 1.0 ㎍에서 포화하고, 그 이상 첨가한 경우도 큰 변화는 없었다.

실시예 5

[발아 현미 유래 ASG에 특이적인 신경 장해의 개선 효과]

상기 발아 현미 유래 ASG의 나트륨/칼륨 ATPase 활성에 대한 효과가, 발아 현미 유래 ASG에 특이적인 것인지의 여부를 밝히기 위해, 본 발명자들은 도 2와 동일한 시험을 반복했다. 발아 현미 유래 ASG(ASG), 발아 현미 유래 ASG에서 지방산을 제거한 것(SG) 및 대두 유래 ASG(S-ASG)에 관해, 나트륨/칼륨 ATPase 활성의 변화를 조사한 결과를 표 7에 나타낸다. ASG, SG 또는 S-ASG의 어느 것도 첨가하지 않은 경우의 나트륨/칼륨 ATPase 활성을 100으로 하여 상대값으로 나타낸다.

표 7

발아 현미 유래 ASG(ASG)를 첨가한 경우에는, 도 2와 동일한 결과를 얻을 수 있었던 데 비해, SG 및 대두 유래 ASG(S-ASG)를 첨가한 경우에는, 양의존적인 나트륨/칼륨 ATPase의 활성 상승은 보이지 않았다.

실시예 6

[용매 추출법에 의한 ASG의 추출 방법]

발아 현미의 겨 5 g을 칭량하여, 30 mL의 헥산으로 15분간 교반, 세정한 후, 부흐너 깔때기(Buechner funnel)로 여과하여, 잔류물을 얻었다. 여과액은 폐기했다. 잔류물을 상기 조건으로 2회 더 세정한 후, 잔류물에 에탄올 또는, 에탄올과 증류수의 혼합액(에탄올:물=2:1 또는 1:1. 이하 각각, 에탄수(2:1) 또는 에탄수(1:1)로 약기하는 경우가 있음) 또는 클로로포름과 메탄올의 혼합액(클로로포름:메탄올=2:1. 이하, 클로메타(2:1)로 약기하는 경우가 있음) 30 mL를 첨가하고, 30분간 교반, 추출하여 부흐너 깔때기로 여과하여, 여과액을 얻었다. 잔류물은 폐기했다. 에탄올, 에탄수(2:1), 에탄수(1:1) 또는 클로메타(2:1)의 여과액은 전량을 가지형 플라스크로 옮기고, 증발기를 이용하여 농축 건고시켜, 발아 현미 유래의 ASG 농축물 E(에탄올 추출), F(에탄물(2:1) 추출), G(에탄물(1:1) 추출), H(클로메타(2:1) 추출)를 얻었다.

상기 ASG 농축물 E, F, G는, 클로메타(2:1) 30 mL를 첨가하여 15분간 다시 용해시킨 후, 클로메타(2:1)를 이용하여 500 mL로 메스업했다. 상기 ASG 농축물 H는, 클로메타(2:1) 30 mL를 첨가하여 15분간 다시 용해시킨 후, 클로메타(2:1)를 이용하여 1500 mL로 메스업했다. 메스업한 각 농축물 E, F, G, H 2 mL를 1500 g×10분의 조건으로 원심하여, 상등액을 측정 샘플로 했다. 각 회수물 중의 ASG는 고속 액체 크로마토(HPLC)를 이용하여, ASG의 함유율을 구했다. ASG의 분석 방법의 상세한 것은 이하와 같다.

[ASG의 분석 방법]

ASG의 HPLC 분석은, 표 8의 분석 조건을 이용하여 행했다.

표 8

이동상 및 변화 조건은, 표 9에 나타낸다.

표 9

[분석 결과]

각 추출 획분 중의 ASG 함유율의 분석 결과는, 표 10에 나타낸다.

표 10

실시예 7

[이아트로비즈(입상 다공성 미립자 실리카겔) 크로마토그래피에 의한 ASG의 정제]

고순도의 ASG를 얻을 목적으로 상기 실시예 6의 분석 결과에 기초하여 이아트로비즈 크로마토그래피법으로 추출 정제했다.

발아 현미의 겨 25 g을 칭량하여, 이아트로비즈 크로마토그래피(Iatrobeads chromatography)에 의해 분획을 회수하여, 분류 2를 얻었다. 또한 분류 2를 농축 건고시키고, 이아트로비즈 크로마토그래피에 의해 분류 8∼12를 분취하고, 이들을 건고시켜 농축 건고 I(알파벳 I)를 얻었다.

<칼럼>

Φ2 cm×30 cm(실리카겔(이아트로비즈 6RS-8060, 주식회사 미쓰비시카가쿠야토론 제조)에 충전)

<방법>

1. 발아 현미의 겨 25 g을 헥산으로 세정한 후, 클로로포름:헥산=1:1로 총지질 획분(TL)을 추출한다.

2. TL을 로터리 증발기로 완전히 건고시킨다.

3. 건고시킨 TL을 30 ㎖의 클로로포름:헥산(C:H)=1:1에 용해한다.

4. C:H=9:1을 200 ㎖씩 통과시켜 통과액을 회수한다(분류 1).

5. 클로로포름:메탄올=9:1을 200 ㎖ 통과시켜 통과액을 회수한다(분류 2).

6. 클로로포름:메탄올:물(C:M:W)=7:3:0.1을 통과시켜 통과액을 회수한다(분류 3).

7. C:M:W=30:60:0.8을 200 ㎖ 통과시켜 통과액을 회수한다(분류 4).

8. 각 분류를 HPTLC(실리카겔 60, Merck사 제조)에 반응시켜, ASG 용출 분류를 확인했다.

각 분류 5 ㎕를 실리카겔 코팅한 시판하는 세로 10 cm의 HPTLC 플레이트(Silicagel 60, Merck)의 아래로부터 1.5 cm의 위치에 마이크로 시린지로 샘플 도포하고, 전개 용매 클로로포름으로 전개한 후 바람으로 건조시키고, 다시 클로로포름:메탄올(95:5)로 2차 전개를 하여 바람 건조시켰다.

<결과>

각 분류를 상기 조건으로 박층 크로마토그래피에 반응시켜, ASG의 존재를 확인한 결과, TL에 포함되어 있는 ASG는 모두 분류 2에 용출되었다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.

[이아트로비즈 크로마토그래피에 의한 ASG의 정제 2]

<칼럼>

Φ1 cm×40 cm(이아트로비즈 20 cm 충전)

<방법>

1. 상기 분류 2를 증발기로 건고시킨 후, 10 ㎖의 클로로포름:헥산=1:1에 용해한다.

2. 용해액을 칼럼에 적용시킨다.

3. 클로로포름:헥산(C:H)=1:1을 75 ㎖ 통과시킨다.

4. 클로로포름(C)을 75 ㎖ 통과시킨다.

5. C:M=95:5를 통과시켜, 2 ㎖/분류씩 분취한다.

6. 분류 No.30까지 분취하고, 상기와 동일한 조건으로 HPTLC에 의해 ASG의 용출을 확인한다.

<결과>

분류 No.10∼12 주변에 ASG의 밴드가 확인되었다. 또, 1 분류당 용출 시간은 5분이었다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.

[ASG의 분석 방법]

ASG 함유율의 분석은, 실시예 6과 동일하게 행했다. 즉, 표 8의 분석 조건 및 표 9의 이동상 및 변화 조건을 이용하여 행했다.

[분석 결과]

ASG의 분석 결과는, 표 11에 나타낸다.

표 11

본 발명의 발아 현미 유래 ASG는 당뇨병성 신경 장해를 예방 또는 개선하는 효과를 갖는다.

따라서, 본 발명에 의하면 당뇨병성 신경 장해의 예방 또는 개선제로서 이용할 수 있다.

그리고, 발아 현미는, 종래부터 건강 식품으로서 이용되어 왔기 때문에, 발아 현미 유래 ASG는 안전성이 높고, 계속적인 섭취도 가능하고, 대량으로 제조할 수도 있고, 식품 등에 첨가하는 것이 용이하다는 점에서도, 사람 또는 동물의 건강 증진이나 질병 예방 등에 공헌할 수 있을 가능성이 크다.

Claims

2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해 예방 및 개선 조성물.
제1항에 있어서, 스테롤 배당체의 스테롤 골격이 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올인 것을 특징으로 하는 신경 장해 예방 및 개선 조성물.
지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.
스테롤 골격으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.
지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하고, 스테롤 골격으로서 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 신경 장해의 예방 또는 개선제.
지방산 부분으로서 2-히드록시-옥타데칸산을 포함하는 스테롤 배당체를 유효 성분으로 하는 호모시스테인 티오락토나아제 활성화 조성물.
제6항에 있어서, 스테롤 배당체의 스테롤 골격이 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올인 것을 특징으로 하는 호모시스테인 티오락토나아제 활성화 조성물.
이하의 (i) 또는 (ⅱ) 중 어느 하나의 조건을 만족하는 하기 화학식 (A)로 표시되는 스테롤 배당체:

ㆍㆍㆍ(A)
(i) 상기 화학식 (A) 중의 X는 이하의 군에서 선택되고, Y는 5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올임
[팔미트산(16:0),
스테아르산(18:0),
2-히드록시-옥타데칸산(18:0(2h)),
올레산(18:1),
리놀레산(18:2), 또는
리그노세르산(24:0)],
(ⅱ) 상기 화학식 (A) 중의 X는 2-히드록시-옥타데칸산(18:0(2h))이고, Y는 이하의 군에서 선택됨
[캄페스테롤,
스티그마스테롤,
5α-콜레스트-8(14)-엔-3β-올, 또는
β-시토스테롤].