KR20100103512A

KR20100103512A - 객체에서 땅콩 내성을 증대시키기 위한 면역치료학적 방법

Info

Publication number: KR20100103512A
Application number: KR1020107013051A
Authority: KR
Inventors: 루시 몽더블릿; 크리스토프 듀퐁; 피에르-앙리 벤하모우; 벨트란드 듀퐁
Original assignee: 디비브이 테크날러지즈
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2010-09-27
Also published as: US20220241405A1; IL206028A0; WO2009080934A2; EP2214704A2; EP2214704B1; JP5732681B2; CN101883584B; WO2009071599A1; CN101883584A; ES2441580T3; JP5941246B2; CA2707013A1; KR20110015408A; CN101951952A; IL205822A0; US20200353072A1; AU2008339833A1; US8202533B2; US10022439B2; US20100136093A1

Abstract

본 발명은 땅콩에 대한 객체의 점진적 탈감작화의 신규 방법을 개시한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 경피적 투여법을 이용한 알러지성 객체에서의 땅콩 내성을 증가시키기 위한 면역치료학적 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 땅콩에 대한 점진적 탈감작화를 위한 피부 패취 기구의 용도에 관한 것이다.

Description

객체에서 땅콩 내성을 증대시키기 위한 면역치료학적 방법 {Immunotherapeutic method for increasing groundnut tolerance in a subject}

본 발명은 객체에서 땅콩 내성을 증대시키기 위한 면역치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 땅콩에 대한 객체의 진행성 탈감작화를 위한 피부 패취 기구의 용도를 개시한다.

땅콩 알레르기는 반응의 지속성 및 심각도 면에서 식품에 대한 즉각적 과민성 반응의 가장 흔하고 심각한 질병 중 하나이다. 사실상, 이러한 알레르기는 모든 연령 군에서 치명적이고 거의-치명적인 식품-관련 과민반응의 대부분과 관련되는 것으로 추정된다. 이러한 알레르기의 발병은 최근 10년간 2배로 증가하고 전체 인구 중 0.6% 내지 1.2% 범위로 지금 영향을 미친다 (Sicherer et al., 2003).

이러한 알레르기는 일생 초반에 나타나는 경향이 있으며 단지 20%의 알러지 소아환자만이 땅콩에 내성(tolerant)을 갖게 된다 (Skolnick et al., 2001). 일반적으로 감작화(Sensitization)는 소화기계에서 발생하나 땅콩에 대한 흡입성 노출 또는 화분과 같은 교차-반응성 환경적 항원에 흡입성 노출에 의한 직접적 또는 교차-감작화(cross-sensitization)의 결과로서 발생가능하다.

땅콩에 의해 유발되는 알러지 반응은 바로 IgE 매개형 I형 (type I) 과민 반응이다. IgE-알레르겐(allergen) 복합체는 비만 세포 수용체(mast cell receptors)가 땅콩 과민반응을 야기하는 다양한 매개물질의 탈과립화 및 분비를 초래하는 신호 전달 케스케이드(signal transduction cascade)를 유도하는 교차-결합을 유도한다.

주요 땅콩 알레르겐은 종자 저장 단백질(seed storage proteins)이다. 비록 9개 땅콩 알레르겐들, 소위, Ara h 1 내지 Ara h 9들이 보고된 바 있다(Burks et al., 1992; Burks et al., 1991; Rabjohn et al., 1999; Koppelman et al., 2005; Mittag et al., 2004; Becker et al., 2001, Lauer et al., 2008), Ara h 1, Ara h 2, 및 Ara h 3은 일반적으로 50% 이상의 땅콩-알러지 환자에서 발견되므로 주요 땅콩 알레르겐으로 분류된다 (Koppelman et al., 2001).

이러한 알레르기의 예방적 치료법은 식품업계에서 널리 분포하고 종종 땅콩의 위장된 사용 때문에 매우 어려운 회피법(avoidance)으로 구성된다. 현재의 약학적 치료법 (항히스타민 및 코르티코스테로이드(corticosteroids))은 알러지 반응을 예방하는 것이 아니고 알러지 질환의 증상을 경감시키는 데에 사용된다.

면역요법(Immunotherapy)은 알레르겐에 대한 민감성을 감소시킴으로서 알러지 질환의 자연적 과정을 변화시킬 수 있는 유일한 허용가능한 치료법이다. 면역요법을 위하여, 일정량의 항원을 탈감작화(desensitization)라고도 지칭되는, 항원/알레르겐에 대한 내성(tolerance)으로 특징화되는 면역 반응을 점차적으로 유도시키기 위하여 투여한다. 이 방법은 특히, 극심한 알러지성 IgE-의존성 반응을 갖는 객체 치료에 권장된다.

비록 면역요법이 90년 이상 시행되었음에도 불구하고, 그 작용의 정확한 기전은 아직 밝혀지진 않았다. 인간에서, 이는 (i) 비만 세포 및 호염기구로부터 염증성 매개체의 분비를 억제함으로서 IgE 매개성 기전을 차단할 수 있는 차단성 항체인, IgG, 특히 IgG4 의 증가, (ii) Th2 / Th1 양상의 보다 우수한 균형을 주도하는 조절성(regulatory) T 세포 (Treg)의 증가, 및 (iii) 비만세포의 염증 효과에 대응하고 IgG4 생산을 촉진시키는, 인간 시토킨 합성 저해 인자(human cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)로도 지칭되는, IL-10을 생산하는 T 세포 생산과 관련된다.

지금까지, 면역요법은 경피적(subcutaneous), 설하적(sublingual) 또는 비강내(intra-nasal) 경로로 투여가능하다.

경피적 면역요법은 알러지 전문가에 가장 통상적으로 사용되는 치료법이다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 개개 주사에 매우 고비용이고 전문적 전문가가 요구된다. 경피적 면역요법의 주요한 단점은 이의 알러지성 부작용이다. 이러한 부작용은 국소적 또는 전신적일 수 있다. 경피 경로를 이용한 땅콩 알레르기 면역요법은 높은 발생비를 갖는 전신적 부작용을 유도함이 입증되었고(50%까지) (Nelson et al., 1997 및 Oppenheimer et al., 1992). 전신적 부작용은 부주의하게 소량이 경피적으로 혈관에 주사된 알레르겐 또는 경피적으로 혈관으로 분산된 알레르겐에 의하여 유발된다. 알레르겐은 폐 또는 피부와 떨어진 영역과 같은 기타 기관에 수송될 수 있으며, 이는 천식 또는 두드러기를 유발할 수 있다. 이들은 또한 사망에 이를 수 있는 과민반응을 유발할 수도 있다. 결론적으로, 땅콩 알레르기와 같은 높은 과민반응 위험성을 갖는 알레르기는 경피적 경로로 치료가 불가능하다.

설하적 면역요법은 경피적 경로에 대한 유효한 대체 수단으로 국제보건기구(WHO)로부터 인정받았으며 면역용법이 필요하고 경피적 경로의 알레르겐 투여법이 받아 들여지지 않는 모든 환자에게 사용되어야 한다. 그러나, 설하적 면역요법에 요구되는 알레르겐의 용량은 경피적 면역요법보다 큰 용량이 사용되며 본 방법은 때때로 경구 소양증, 기도 자극, 혀 또는 기도 부종과 같은 약간의 국소적 부작용을 유발한다.

비강내 면역요법은 계절성 비염 및 천식 치료에 유효한 것으로 입증된, 경피적 경로에 대한 또 다른 대체요법이다 (Hufnagl et al., 2008). 그럼에도 불구하고, 상기 경로는 일반적으로 환자에 의하여 잘 순응적이지 않고 이들 중 대부분은 조기에 그 치료를 방해한다 (Pajno et al., 2005).

결론적으로, 안전하고, 효과적이고 환자에 의해 순응적인 땅콩 알레르기 치료를 위한 면역요법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 땅콩 알레르기에 대한 신규 면역요법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 최초로 땅콩 알레르기의 효과적인 면역요법이 경피적 경로를 통하여 달성될 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 배킹부(backing)를 포함하는 피부 패취 기구에 의한 경피적 경로를 통하여 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 객체에 반복적으로 투여함을 포함하는, 땅콩에 대한 객체의 내성을 증가시키기 위한 신규 면역치료학적 방법을 제공하며, 상기 배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되며, 피부에 상기 패취 기구를 적용한 후에 상기 배킹부가 객체에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 단백질을 챔버 내 피부 배향 측면 상에 함유하고, 상기 하나 이상의 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되며, 상기 투여는 반복적 투여로 땅콩에 대한 객체의 내성을 점진적으로 증가시키는 결과를 초래하는 것이다.

본 발명의 두 번째 측면에서, 본 발명은 배킹부(backing)를 포함하는 피부 패취 기구(skin patch device)를 제공하는 것으로, 상기 배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되며, 상기 배킹부가 피부에 상기 패취 기구를 적용하고 객체에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 챔버 내 피부 배향 측면 상에 함유하며, 상기 하나 이상의 상기 땅콩 유래 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 땅콩에 대한 객체의 내성을 점진적으로 증가시키기 위한 (조성물의 제조를 위한) 배킹부(backing)를 포함하는 피부 패취 기구(의 용도)를 제공하며, 상기 배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되며, 피부에 상기 패취 기구를 적용하고 상기 배킹부가 객체에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 챔버 내 피부 배향 측면 상에 함유하고, 상기 하나 이상의 땅콩 유래 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되는 것이다

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 다수의 피부 패취 기구들을 포함하는 키트(kit)를 제공하며, 상기 개개의 기구는 배킹부(backing)를 포함하며, 상기 배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되며, 피부에 상기 패취 기구를 적용하고 상기 배킹부가 객체에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 챔버 내 피부 배향 측면 상에 함유하고, 상기 하나 이상의 땅콩 유래 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되는 것이다.

상기 키트의 서로 상이한 패취들은 동일하거나 서로 상이한 양의 땅콩 알레르겐을 포함하여 본 발명의 면역치료학적 방법 기간 이후에도 알레르겐의 용량을 유지 또는 증가/감소시키는 것이 가능하게 할 수 있는 것이다.

본 발명은 임의의 객체, 특히 소아 및 성인을 포함하는 임의의 인간에 사용가능하다. 바람직하게는 상기 객체는 땅콩에 알러지 증상을 나타내는 객체인 것이다.

본 발명은 경피 투여법을 이용하여 객체에서의 땅콩 내성을 증가시키기 위한 면역치료학적 방법에 관한 것이다. 본 방법은 알레르겐이 피부를 거쳐 혈류로 통과하지 않았다는 점을 고려하면 환자에게 특히 안전하다. 따라서 본 접근법은 면역요법 프로토콜 도중에 전신적 또는 과민성 반응의 중요한 위험성으로부터 심각한 알러지 환자를 방지할 수 있다. 게다가, 본 발명자로부터 얻은 결과는 본 발명에 따른 경피적 경로를 통한 땅콩에 대한 탈감작화가 기타 다른 투여경로, 특히 피내 경로를 이용한 탈감작화와 적어도 동일한 효과 이상을 발휘함이 밝혀졌다.

특히 본 발명은 본 발명에 따른 땅콩 알레르겐의 피부 적용으로 야기되는 특이적인 면역 반응이 객체 면역 체계상의 변화를 유도하고 땅콩에 대한 객체의 내성을 점진적으로 증가시키는 결과를 초래함을 나타낸다.

본 발명의 면역 치료적 방법은 내성을 주도하는, 특정한 패취 기구를 이용한 경피적 경로를 통한 객체로의 땅콩 알레르겐 조성물의 투여와 관련된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “경피적 경로(epicutaneous route)”는 피부상에 이러한 알레르겐을 객체에 적용하는 것을 의미한다. 상기 경피적 경로는 표피 최상층을 천공하거나 그 강도를 변화시키기 위한 침, 주사 또는 기타 다른 수단의 사용을 필요로 하지 않는다. 상기 알레르겐은 표피의 각질층으로 알레르겐이 침투하도록 허용하기에 충분한 조건하에서 일정 기간 동안 피부와의 접촉을 유지시킨다. 이러한 분산(diffusion)은 랑거한스 세포 (Langerhans cells)로의 이동 및 활성화를 유도하고 결국 면역반응을 촉진시킨다.

본원에서 정의된 바와 같은 용어 “내성(tolerance)”은 특정한 알레르겐, 본원에서 “땅콩 알레르겐(groundnut allergens)”으로의 객체의 면역반응성을 감소시키는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “땅콩(groundnut)” 또는 “낙화생(peanut)”은 예를 들어, 아라키스(Arachis)속과 같은 콩과(Fabaceae) 종(species)들을 의미한다. 낙화생은 또한 어쓰너트(earthnuts), 구버(goobers), 구버 피(goober peas), 핀다스(pindas), 잭 너트(jack nuts), 핀더스(pinders), 마닐라 너트(manila nuts) 및 멍키 너트(monkey nuts)로도 지칭된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “땅콩 알레르겐(groundnut allergen)”은 알러지 반응을 야기할 수 있는 땅콩 유래의 임의의 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 이러한 알레르겐은 천연(natural) 또는 자연(native) 알레르겐, 변형된 천연 알레르겐(modified natural allergens), 합성 알레르겐(synthetic allergens), 재조합 알레르겐 (recombinant allergens), 변성 알레르겐(allergoids), 및 혼합물 또는 이들의 조합으로부터 선택가능하다. 바람직하게는, 선택된 알레르겐은 IgE-매개 즉각형 과민반응(mediated immediate type hypersensitivity)을 야기할 수 있는 것이다. 용어 “폴리펩티드(polypeptide)”, “펩티드(peptide)” 및 “단백질(protein)”은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하며 상호 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 천연적으로 발생되는 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 잔기 또는 천연적으로 발생되는 아미노산과 상응하는 인공적 화학 모방체(chemical mimetic)와 같은, 비-천연적으로 발생되는 잔기인 마미노산 중합체로 적용된다.

본원에서, 용어 “땅콩 유래 단백질 (protein derived from groundnut)”은 땅콩으로부터 수득가능하고 땅콩으로부터 수득가능한 단백질 일부 또는 서열을 포함하는 임의의 단백질을 의미한다. 본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 단백질은 종자 저장 단백질들(seed storage proteins)로부터 선택되는 것이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 땅콩(Arachis hypogaea)으로부터 분리되는 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8 및 Ara h 9으로부터 선택되는 것이다. 가장 바람직한 구현예로서, 상기 땅콩 유래 단백질은 적어도 Ara h 1, Ara h 2 또는 Ara h 3 또는 이들의 이형(isoforms)을 포함하는 것이다. Ara h 1, Ara h 2 및 Ara h 3 의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 설명하자면, Ara h 1 단백질, 2개의 Ara h 2 이형 및 2개의 Ara h 3 이형의 유전자은행 접근번호(Genbank accession numbers)은 각각 AAL27476, AAM78596, AAN77576, AAT39430 및 AAC63045이다. 이러한 단백질들은 땅콩 추출물로부터 생산가능하거나 또는 유전적으로 변형된 박테리아, 효모 등과 같은 재조합 유기체 또는 당업자에게 공지된 기타 방법으로 생산가능하다. 이러한 단백질들은 조합하거나 분리하여 사용가능하다. 용어 “땅콩 유래 단백질(protein derived from groundnut)”도 또한 에피토프-함유 단편(epitope-containing fragments)과 같은 상기 항원의 단편 또는 변이체 또는 땅콩으로부터 수득된 단백질 및 이들의 연속적인 효소분해법, 화학처리, 기계적 또는 열변성으로 변성된 단백질도 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 땅콩으로부터 유래되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 Ara h 1, Ara h 2 및 Ara h 3로부터 선택되는 땅콩 유래 하나 이상의 단백질 및 임의적으로 땅콩 유래 기타 단백질을 조합하여 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 땅콩 유래 단백질 자원으로서 땅콩 추출물 (groundnut extract)을 포함한다.

땅콩 추출물(groundnut extract)은 땅콩으로부터 수득되는 임의의 제제(용해물(lysate), 여과물(filtrate), 균질화물(homogenate) 등)를 의미한다. 상기 땅콩 추출물은 직접 사용가능하거나 상기 추출물을 적어도 일부 정제할 수도 있다. 이러한 정제 공정은 여과법, 원심분리법, 침전법 또는 당업자에게 공지된 기타 방법일 수 있다. 바람직하게는, 개체에 투여되는 땅콩 유래 단백질은 적어도 일부가 정제된 것이다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 액제(solution) 또는 입자 분산액(dispersion)과 같은 액체 상태인 것이다. 이러한 경우에, 효과적인 경피적 투여는 알레르겐이 표피 각질층으로 침투되도록 허용하게 하도록 피부에 상기 알레르겐 조성물의 액체 상(liquid phase)으로부터의 알레르겐의 이동에 의하여 확보된다. 본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 알레르겐 조성물의 액체 상(liquid phase)으로부터의 알레르겐의 이동은 예를 들어, 땀흘리기의 결과와 같은, 밀폐적으로 밀봉된 챔버 내에서 형성된 응결을 통한 알레르겐의 분산(diffusion)에 의하여 확보되는 것이다.

본 발명의 또 하나의 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 예를 들어, 동결건조에 의하여 수득되는 건조 형태, 바람직하게는 미립화 형태(particulate form)인 것이다. 본 발명은 땅콩에 대한 유효한 내성은 고체 형태(예를 들어, 건조)의 땅콩 알레르겐을 이용하여 달성할 수 있음을 확인하였다. 미립화 형태의 단백질 사용이 유리하다. 사실상, 이러한 미립화된 알레르겐은 기구의 배킹부(backing)에 직접 부착가능하고 결국 이러한 단백질의 면역원성을 교란시킬 수 있는 어떠한 화학적 상호작용 또는 어떠한 반응도 회피할 수 있다. 게다가, 상기 입자의 사용은 일시적 사용을 더 이상 수행할 필요가 없도록 적절한 포장으로 상기 물질을 보관할 수 있게 한다. 이러한 경우에, 패취의 배킹부상에 고착된 땅콩 알레르겐의 경피적 투여는 밀폐적으로 밀봉된 챔버 내에서 형성된 응결물(condensation)에서의 이러한 알레르겐의 용해로 확보될 수 있다.

본 발명의 개개 구현예로서, 밀폐적으로 밀봉된 챔버 내에 존재하는 상기 응결물은 피부에 의하여 분비되는 응결된 땀으로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “땀흘리기(perspiration)”, “발한(sweating)” 또는 “증산(transpiration)” 들은 포유동물의 피부에서 땀샘에 의하여 분비되는 액체 생산을 의미한다. 이 액체는 주로 물이나 다양한 용해된 미네랄 및 미량원소도 포함한다. 본 발명에서, 피부로부터 분비되는 땀은 밀폐적으로 밀봉된 챔버 내에서 증발하고 응결된다.

본원 명세서에서 용어 “응결(condensation)”은 가스상으로부터 액체상으로의 물리적 상태의 변화, 특히 증발된 땀으로부터 액체상으로의 변화를 의미한다. 피부로의 패취 기구의 적용 후에 챔버 내에서 땀흘리기에 의해 형성되는 응결물은 알레르겐의 제거 및 경피적 전달을 야기 또는 증강시킨다. 사실상, 상기 알레르겐은 응결된 땀에 포함된 물에 용해가능하고 경피적 경로로 객체에 전달될 수 있다.

상기 알레르겐 조성물은 추가로 보체와 같은 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다.

본 발명의 구현예로서, 본원에서 사용되는 땅콩 알레르겐 조성물은 어떠한 보체도 없이 제형화될 수 있다. 본 발명은 사실상 땅콩 면역요법이 추가적인 보체(adjuvant)가 필요없이 경피적 경로를 통하여 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 본원에서 사용되는 땅콩 알레르겐 조성물은 보체를 포함하거나 보체로 적용되는 것이다. 본 발명의 문맥 내에서, 상기 보체는 특이적 항원과 조합하여 사용시에 항원-특이적인 면역 반응을 활성화(activate), 가속화(accelerate), 연장화(prolong) 또는 증진화(enhance)시키는 작용을 갖는 임의의 물질을 의미한다. 땅콩 알레르겐과 조합하여 사용가능한 보체 화합물(Adjuvant compounds)은 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 알루미늄 포스페이트(aluminium phosphate), 및 알루미늄 히드록시드(aluminium hydroxide) 등과 같은 미네랄 염(mineral salts); CpG 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)와 같은 면역자극성(immunostimulatory) DNA 또는 RNA; 항체(antibodies) 또는 톨-유사 수용체 결합 단백질 (Toll-like receptor binding proteins)과 같은 단백질; 예를 들어, QS21와 같은 사포닌; 시토킨(cytokines); 무라밀 디펩티드 유도체(muramyl dipeptide derivatives); LPS; MPL 및 3D-MPL을 포함한 이의 유도체; GM-CSF (과립구대식세포 집락자극인자; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor); 이미퀴모드(imiquimod); 콜로이드성 입자(colloidal particles); 완전 (complete) 또는 불완전 (incomplete) 프러운트 보체(Freund’s adjuvant); 리비 보체 (Ribi’s adjuvant) 또는 예를 들어, 콜레라 독소 (cholera toxin) 또는 엔테로톡신 (enterotoxin, LT)와 같은 박테리아 독소(bacterial toxin)를 포함한다. 본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 엔테로톡신으로 제형화 된 것이다.

본 발명의 방법에서 사용된 피부 패취 기구는 배킹부 경계가 피부에 밀폐적으로 밀봉된 챔버가 창제되는, 배킹부(backing)를 함유하는 것이다. 상기 배킹부는 챔버 내에서 피부 배향 측면에 포함되고 상기 땅콩 알레르겐 조성물은 면역 반응을 유도하는데 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 “밀폐적으로 밀봉된 챔버 (hermetically closed chamber)”은 상기 패취의 배킹부가 습기에 비침투성이고 이러한 배킹부의 경계가 밀폐성 장벽을 구성하여 에워싸인 공간을 구성하는 것을 의미한다. 상기 챔버의 습기 비침투성은 상기 챔버 내에서 습기의 효과를 통하여 배킹부로부터 알레르겐이 제거, 즉, 용해 또는 추출로 제거되어 객체에게 전달되도록 하는 것이 요구된다. 상기 패취의 유효성은 상기 알레르겐이 용액 또는 현탁액에 존재하여 구멍을 통하여 이의 통과를 촉진시키는, 액체상의 창제로 크게 조절되는 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 “습기(moisture)”는 수분 또는 액체 또는 증기 상의 기타 액상의 존재를 의미한다.

바람직하게는, 상기 배킹부의 경계는 점착 특성을 갖고 피부 밀폐적으로 밀봉된 챔버를 창제하기 위한 밀폐된 조인트(joint)을 형성한다.

본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐은 정전기 력(electrostatic force) 및/또는 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)으로 배킹부 상에 유지되는 것이다. 이러한 구현예는 상기 알레르겐이 액체 형태에서 간접적으로 사용가능함에도 불구하고 상기 땅콩 알레르겐이 고체 형태(예를 들어, 입자)인 곳에 특히 적합하다.

본 발명의 문맥 내에서, 용어 “정전기 력(electrostatic force)”은 전하와 관련한 임의의 비-공유결합력을 의미한다. 용어 “반 데어 발스 력(Van der Waals forces)”은 배킹부 표면 및 고체 알레르겐 사이에 형성된 비-공유결합력을 의미하고 3가지 형태, 즉 영구 쌍극자 력(permanent dipoles forces), 유도성 쌍극자 력(induced dipoles forces), 및 런던-반 데어 발스 력 (London-Van der Waals forces)으로 분류가능하다. 정전기 력(electrostatic force) 및/또는 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)은 개별적으로 또는 같이 작용할 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 패취 기구는 정전기적 배킹부(electrostatic backing)를 포함하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 “정전기적 배킹부(electrostatic backing)”는 예를 들어, 마찰법 (rubbing), 가열법 (heating) 또는 이온화법(ionization)으로 정전기 력(electrostatic force) 및/또는 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)을 축적하거나 이러한 전하를 보존할 수 있는 재료로 제조된 임의의 배킹부를 의미한다. 정전기적 배킹부는 전형적으로 균일하거나 그렇지 않게 분산 가능한 공간 전하를 갖는 표면을 포함한다. 배킹부 표면의 한면 또는 다른 면에 발생하는 전하는 상기 배킹부를 구성하는 재료 및 전하를 생성하는 데 사용된 방법에 따라 양성 또는 음성일 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 배킹부 표면에 걸쳐 분산된 양성 또는 음성 전하는 전도성(conducting) 또는 비전도성(non-conducting) 재료에 끄는 힘을 유발하여, 알레르겐을 유지하게 한다. 또한 상기 입자는 이온화됨으로서, 입자 및 배킹부 사이에 동일한 형태의 끌어 당기는 정전기 력을 유발할 수 있다.

정전기적 배킹부를 제공하기에 적합한 재료의 예로는 유리 또는 셀룰로오스 플라스틱 (cellulose plastics; CA, CP), 폴리에틸렌 (polyethylene; PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (polyethylen terephtalate; PET), 폴리비닐 클로리드 (polyvinyl chlorides; PVCs), 폴리프로필렌 (polypropylenes), 폴리스티렌 (polystyrenes), 폴리카르보네이트 (polycarbonates), 폴리아크릴레이트 (polyacrylics)을 포함하는 군으로부터 선택된 중합체, 특히, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate); PMMA) 및 플루오로폴리머(fluoropolymers; 에를 들어, PTFE)을 들 수 있다. 전기한 리스트(list)들은 그 범위를 이로 제한하고자 함이 아니다.

배킹부의 후면은 적용 직전에 벗겨 낼 수 있는 라벨(label)로 덮여 있을 수 있다. 이 라벨은 예를 들어, 배킹부가 적어도 일부가 투명한 경우에 암소에서 땅콩 알레르겐을 저장하는 것이 가능한 것이다.

표면 및 입자 사이의 힘의 강도는 습기에 의한 얇은 필름 존재로 증가 또는 감소될 수 있다. 일반적으로, 상기 패취는 건조한 장소에서 제조 및 보관된다. 습도는 활성 성분이 보관되기에 충분하게 낮아야 한다. 습도 비율은 최대한의 점착 력을 수득하기 위하여 조절가능하다.

상술한 바와 같이, 정전기적 배킹부의 사용은 특히 예를 들어, 입자 형태인 건조한 형태인 것이 유리하다. 게다가, 상기 입자 크기는 지지체 상에서 입자가 유지되게 하기 위하여 정전기 력(electrostatic force) 및/또는 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)의 효과를 증대시키기 위하여 당업자에 의해 조정가능하다. 바람직하게는, 상기 입자 크기는 1 내지 60 마이크로미터(micrometer) 범위 내인 것이다.

본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 패취는 중합체성 (polymeric) 또는 금속성 (metal) 또는 금속 피복된 중합체성(metal coated polymeric) 배킹부를 포함하는 것이며 상기 땅콩 알레르겐 입자는 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)에 의해 필수적으로 배킹부에 유지되는 것이다. 바람직하게는, 반 데어 발스 력(Van der Waals forces)에 의해 지지체 상에 상기 입자를 유지시키기 위해, 상기 입자들의 평균 크기는 60 마이크로미터 이하인 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 땅콩 알레르겐은 배킹부 상에 피복된 점착제에 의하여 배킹부에 유지되는 것이다. 상기 배킹부는 점착성 재료로 완전히 또는 일부만이 덮여 질 수 있다. 서로 상이한 밀폐형 배킹부를 알루미늄으로 피복된 폴리에틸렌(polyethylene) 또는 PET 필름, 또는 점착성 층(아크릴성, 실리콘 등)을 갖는 PE, PVC, 또는 PET 발포체(foams)와 같은 소재로 사용가능하다.

특정 형태의 땅콩 알레르겐 조성물을 프랑스 특허출원 제08 50406호에 개시된 바와 같은, 전기분사 이온화법(electrospray process)과 같은 분무건조 공정으로 배킹부상에 적재가 기능하다. 전기분사 이온화 기구는 액체를 미세한 에어로졸로 분산시키는 고전압을 이용한다. 그리고 용매에 용해된 알레르겐을 용매가 증발되고 입자형 알레르겐만 남도록 패취 배킹부 상에서 분말화시킨다. 상기 용매로는 예를 들어, 원하는 증발 기간에 따라 수분 또는 에탄올일 수 있다. 기타 용매들은 당업자에 의해 선택가능하다. 패취 배킹부 상에 물질을 적용하기 위한 이러한 형태의 공정은 배킹부 상의 규칙적이고 일률적인 재분할 방법으로 나노크기 입자 및 단일크기 입자의 제조를 가능하게 한다. 이러한 기법은 전도층으로 덮여 있는 절연성 중합체(insulating polymer), 도핑된 중합체(doped polymer) 또는 중합체를 포함하는 배킹부를 갖는 패위와 같은 임의 형태의 패취에 적용되는 것이다. 비람직하게는, 상기 배킹부는 전도성 재료를 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 배킹부의 경계는 습기찬 피부와의 접촉으로 점착성 히드로겔 필름(adhesive hydrogel film)을 형성할 수 있는 (프랑스 특허출원 제 07 57970호에 개시), 건조한 친수성 중합체(hydrophilic polymer)로 덮여 있는 것이다. 본 발명의 이러한 구현예로서, 상기 피부는 패취 적용 전에 습기찬 상태여야 한다. 히드로겔이 습기찬 피부에 접촉시에, 상기 중합체 입자들은 액체에 용해되고 점착성을 갖게 되고 결국 상기 패취가 피부에 적용되는 경우에 밀폐적으로 밀봉된 챔버를 창제하게 된다. 상기 히드로겔로의 예로는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrolidone), 나트륨성 폴리아크릴레이트 (polyacrylate of Na), 에틸메틸비닐 (ether methyl vinyl) 및 말레익 안하이드라이드(maleic anhydride)와의 공중합체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특정한 구현예로서, 상기 액상 땅콩 알레르겐 조성물 (liquid groundnut allergen composition)은 흡수성 재료의 저장소에서 패취의 지지체상에 고착되는 것이다. 상기 조성물은 알레르겐 용액 또는 예를 들어 글리세린 중에 알레르겐이 분산된 분산액으로 구성될 수 있다. 상기 흡수성 재료로는 예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate)로 제조될 수 있다.

상기 배킹부는 구성 재료에 따라, 견고하거나 유연하거나, 또는 친수성이거나 아니거나 또는 투명하거나 아닐 수 있다. 유리인 경우에, 상기 지지체는 유리에 플라스틱 시이트 (sheet)를 접착시켜 붙임으로서 내파열성(break-resistant)으로 제조가능하다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 패취의 배킹부는 패취를 반드시 제거할 필요없이, 염증 반응을 직접 관찰하고 조절할 수 있는 투명한 영역을 포함하는 것이다. 상기 적절한 투명한 재료로는 폴리에틸렌 필름(polyethylene film), 폴리에스테르(폴리에틸렌-테레프탈레이트) 필름 (polyester (polyethylene-terephtalate) film), 폴리카르보네이트 (polycarbonate) 및 임의의 투명 또는 반투명 생체적합성(biocompatible) 필름 또는 재료를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정한 구현예로서, 알레르겐을 함유한 배킹부 부분은 피부와 직접적으로 접촉되지 않는 것이다. 이러한 구현예로서, 상기 배킹부, 배킹부 경계 및 피부로 정의되는 챔버의 높이는 0.1 mm 내지 1 mm 범위인 것이다.

본 발명의 방법은 전형적으로 상술한 바와 같이 객체에 하나 이상의 땅콩 알레르겐을 반복투여함으로써, 객체에서 점진적인 내성 증가를 초래하는 방법에 관한 것이다.

적용횟수 및 접촉 기간뿐만 아니라 알레르겐의 특정 용량은 객체, 알레르겐의 특성, 패취 기구의 형태 등에 따라, 당업자에 의하여 조정될 수 있다.

일반적으로, 상기 방법은 상술한 바와 같이 적어도 2개 이상, 바람직하게는 3, 5, 10 또는 15개 이상의 패취 기구를 몇 주 내지 몇 년 사이의 기간 동안 적용함을 포함한다. 상기 치료법은 언제라도, 예를 들어, 유효한 내성이 달성되면 중지가능하다.

본 발명의 구현예로서, 본 발명의 방법은 1 달 내지 몇 년 동안, 적어도 주당 1회 이상, 1 내지 4개 패취/일로 반복적용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 방법은 1 달 내지 몇 년 동안, 매일 또는 적어도 주당 1회 이상, 1개 패취/일로 적용하는 것이다. 개개 적용에 있어서, 피부와의 패취 접촉 기간은 1 내지 24 시간, 바람직하게는 약 8시간 동안의 기간인 것이다.

개개 패취에 대한 땅콩 알레르겐의 양은 전형적으로 0.1 내지 1000 ㎍/㎠(패취 표면적), 바람직하게는 20 내지 500 ㎍/㎠ (패취 표면적), 보다 바람직하게는 20 내지 200 ㎍/㎠ (패취 표면적)의 범위인 것이다. 상기 패취 표면적은 1 ㎠ 내지 10 ㎠, 바람직하게는 1 ㎠ 내지 5 ㎠의 범위인 것이다.

적용을 위하여, 상기 패취 기구는 어떠한 전처리가 없이, 피부, 바람직하게는 신체 무모 부위상에 직접 적용가능하다. 호환적으로, 상기 피부는 패취 기구와 접촉하는 부위에서, 각질층을 교란시키고, 털을 제거하고자 또는 단순하게 피부의 수화를 유발시키기 위하여 기구의 적용 전에 처치될 수 있다. 효과적으로 땅콩 알레르겐에 대한 객체의 내성을 증가시키기 위하여, 땅콩 알레르겐은 바람직하게는 객체에서 면역반응을 유도하기에 적절한 양으로 투여되는 것이다.

이러한 면역 반응은 국소적 혈관 체계 및 면역 체계와 관련된 생화학적 이벤트(event)의 케스케이드(cascade)를 주도하는 염증 반응과 관련될 수 있다. 염증 반응은 중등 정도의 홍반 형태 (염증 반응의 최초 임상 요소), 또는 국소적 부종 존재를 의미하는 구진 형태 (염증 반응의 또 다른 구성요소)일 수 있다. 경피적 경로를 통한 땅콩 알레르겐의 적용으로 유도되는 염증 반응은 시각화가 가능하거나 시각적으로 보이지 않을 수 있다.

하기 실험예에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 땅콩에 대한 점진적 내성을 주도하는, 특이적 IgE 수준 감소 및 몇 종의 특이적 IgG 수준, 특히 IgG4 수준의 증가를 초래하는 것이다. 본원에서 정의되는 용어 “특이적 (specific) Ig”은 알러지 환자에 대하여 1개 이상의 알레르겐에 특이적인 면역글로불린(immunoglobulins)을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 이러한 면역글로불린은 땅콩으로부터 유래되는 1개 이상의 단백질, 특히 Ara h 1, Ara h 2 또는 Ara h 3 또는 이들의 이형(isoform)에 특이적인 것이다.

본 발명의 방법은 또한 우세한 Th2 양상으로부터 보다 균형화된 Th1/Th2 양상으로의 면역 편향을 초래한다. 환원하면, 본 발명의 방법은 투여된 단백질에 대하여 Th1 반응 증가를 야기한다. Th1 및 Th2 세포들은 시토킨 생성 양상이 상이한 2개 형태의 CD4+ 헬퍼(helper) T-세포들이다. Th1 세포는 매개성 자가면역성에는 치명적이나, 세포간 발열원 및 악성 세포에 대하여 숙주-방어면에서 유리한 세포-매개성 면역 반응과 관련되는 IFN-γ, IL-2 및 TNF-β을 생산한다. Th2 세포는 알러지 및 천식을 또한 야기할 수 있으나, IgE 생성을 포함하는 항체 반응을 증가시키는 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13을 분비한다. Th1 및 Th2 반응들은 이들이 통상 평형 상태 및 상호 교차-조절 상태가 되도록 상호 길항적이다. 알러지 객체에 있어서, Th1/Th2 균형은 변환되고 상기 Th2 양상이 우세하다. 우세한 Th2 양상으로부터 보다 균형화된 Th1/Th2 양상으로의 면역 편향(immune deviation)은 알러지 상태에서 내성 상태로 편향됨을 의미한다. Treg 세포 증가에 의해 매개되는, 이러한 편향은 IgG1/IgG4 비 감소 또는 시토킨 생성 분석과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 방법은 전신성 효과(systemic effect)가 없는 것이다. 상기 염증 반응은 경피적 투여 부위 또는 이 부위의 직접적 경계에서만 객체 피부상에서 관찰되는 것 같다. 이 염증 반응은 배킹부상에 놓인 알레르겐의 용량으로 조절가능하다.

본 발명은 또한 상술한 바와 같은 배킹부(backing)를 포함하는 피부 패취 기구를 제공하며, 상기 배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되며, 피부에 상기 패취 기구를 적용한 후에 상기 배킹부가 객체의 피부에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 본원에서 상술한 바와 같은 하나 이상의 땅콩 알레르겐을 챔버 내 피부 배향 측면상에 함유하고, 상기 하나 이상의 알레르겐이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되는 것이다.

본 발명은 또한 땅콩에 알러지 증상을 갖는 객체에게 내성을 증가시키기 위한 조성물 제조에 대한 상술한 바와 같은 피부 패취 기구의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 땅콩에 알러지 증상을 갖는 객체에게 땅콩에 대한 Th1-형 면역 반응을 증가시키기 위한 조성물 제조에 대한 상술한 바와 같은 피부 패취 기구의 용도를 제공한다.

본 발명은 서로 동일하거나 상이한 양의 땅콩 알레르겐을 포함하는, 상술한 바와 같은 다수 패취 기구를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 또한 상기 키트의 패취에 사용된 알레르겐 조성물은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 상이한 땅콩 단백질이 보체와 함께 또는 보체없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 동일한 조성물은 탈감작화 치료 기간을 넘어서 사용되는 것이다.

본 발명은 배킹부(backing)를 포함하는 피부 패취 기구에 의한 경피적 경로를 통하여 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 객체에 반복적으로 투여함을 포함하는, 땅콩에 대한 객체의 내성을 증가시키기 위한 신규 면역치료학적 방법을 제공하며, 상기 하나 이상의 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되며, 객체의 내성을 점진적으로 증가시킨다.

본 발명의 상기한 목적들 및 장점들은 하기한 발명의 상세한 설명뿐만 아니라, 명세서 전반에 걸친 설시되는 일부들을 의미하는 참고 기호 및 이에 제한되지 않은 첨부되는 하기 도에 대한 설명란을 고려한다면 보다 명확히 설명될 것이다.
도 1은 탈감작화 종료시에 마우스 혈청내 특이적 IgE, IgG1, IgG2a 수준을 나타낸 도이며 (43일째);
도 2는 경구적으로 감작화된 PPE-감작화 마우스로부터 분리된 재활성화된 비장임파구로부터 분비되는 시토킨을 나타낸 도이며 (경구적으로 감작화된 BALB/c 마우스로부터 분리된 비장 세포를 분리하고 60시간 동안 PPE로 생체 외에서 재활성화시켰다. 시토킨을 효소 면역어세이법으로 상등액에서 정량화하였다);
도 3은 경구적으로 도전된 후에, 감작화 마우스 및 대조군 마우스로부터 얻은 혈장 시료에서의 히스타민 수준을 나타낸 도이며(히스타민은 경쟁적 EIA로서 분석되었다);
도 4는 발바닥에 단회 땅콩 도전 24시간 후에 측정되고 발바닥 부종의 평균 증가율로 표시된(SEM) DPH 반응을 나타낸 도이며 (Init.: PPE 또는 PBS 주사 전 발바닥 측정을 의미함. PBS는 우측 발바닥에 PPE는 다른 발바닥 상에 주사하였다. 개개 발바닥의 부종을 주사 24시간 후에 측정함);
도 5는 PPE 제형의 전기영동실험 결과(변성 및 환원 조건하) 양상을 나타낸 도이며;
도 6은 대조군 및 경피적 경로에 의한 탈감작화군(EP) 또는 비처치군 (NT)에서의 특이적 IgE 농도를 나타낸 도이며 (결과는 ㎍.ml^-1 +/- SD의 평균으로 표시함);
도 7은 대조군 및 경피적 경로에 의한 탈감작화군(EP) 또는 비처치군 (NT)에서의 특이적 IgG2a 농도를 나타낸 도이며 (결과는 ㎍.ml^-1 +/- SD의 평균으로 표시함);
도 8은 탈감작화군(EP), 비처치군 (NT) 및 대조군 (C)에 대한 IgG1/IgG2a 비를 나타낸 도이며 (결과는 탈감작화 8주 및 16주 이후 결과를 나타냄);
도 9는 대조군 마우스 및 경피적 경로에 의한 탈감작화군(EP), 비처치군 (NT)에서의 경구 도전 후에 혈장 시료 중의 히스타민 농도를 나타낸 도이며(결과는 nM +/- SD으로 표시함. * p<0.05, ** p<0.001, *** p<0.001);
도 10은 PPE로 처치된 마우스(EP) 또는 비처치군 (NT) 및 대조군 마우스의 혈청 시료에서 땅콩 특이적 IgA 농도를 나타낸 도이다(감작화된 마우스(W0), 및 탈감작화 후 8주 (W8) 및 16주 (W16)된 마우스에서의 결과는 450nm에서의 광학밀도(OD)로 표시함. * p<0.05, ** p<0.001, *** p<0.001).

하기한 실시예들은 본 발명의 범위를 한정함이 아니고 설명하고자 하는 것으로 간주되어야 한다.

실시예 1-실험방법

동물 및 단백질 추출물

회사 (Charles River Laboratories, 프랑스)로부터 구입한 4주령 암컷 BALB/c 마우스를 땅콩 단백질에 감작화시켰다. 땅콩 단백질에 대한 탈감작화의 설치류 모델로서 BALB/c 마우스의 사용은 문헌 (Adel-Patient et al., 2005)에 개시되었다. 본 모델은 IgE 미세 특이성을 나타내고 도전(challenge)시 알러지 증상을 갖는 인간에서 관찰되는 증상을 나타냈다. 모든 실험은 유럽 공동체 동물 관리 규정(European Community rules of animal care)에 따라 수행하였다.

땅콩 추출물은 상온에서 4시간 동안 1 M NaCl을 함유한 20 mM 인산 완충액 (pH 7.4)에 땅콩 분말 (Allergon, Sweden)을 혼합하여 제조하였다. 원심분리 후에, 상등액을 땅콩 단백질 추출물(PPE)로서 보관하였다. 그리고 PPE를 투석하고 단백질 양을 BCA 어세이법으로 정량화하고 SDS PAGE으로 분석하였다. 내독소(Endotoxin) 수준은 0.06 ng/ml이하로 나타났다 (E-toxate kit, Sigma, 프랑스).

감작화 프로토콜

8마리 BALB/c 마우스에 위관내 투여법으로 1, 6, 12, 18, 24, 30 일째에 10 ㎍ 콜레라 독소 (CT)와 혼합된 1 mg 균질화된 PPE을 투여하였다. 혈청을 안와하정맥총으로부터 0, 18 및 43일째 채취하고, 원심분리하고, 시료를 추가적인 어세이를 수행 전까지 -20℃에서 보관하였다. 무처치군 마우스도 동일째에 채혈하였다(n=8). 감작화는 상기한 바와 같은 생물학적 매개변수로 조사되었다.

탈감작화 프로토콜

탈감작화는 하기와 같이 경피적 경로(EP)로 8주 및 6주간 주 1회 수행되었다:

마우스를 케타민(ketamine) 및 자일라진(xylazine)으로 복강내 투여하여 마취시키고 전기 면도기 및 제모 크림으로 면도하였다. 다음날, 배킹부 경계가 마우스 피부와 밀폐적으로 밀봉한 챔버를 창제하도록 적용된, 건조 형태의 100 ㎍ PPE를 포함하는 배킹부를 갖는 피부 패취 기구를 마우스 등에 위치하고 48시간 동안 붕대로 유지하였다.

알레르겐 도전 및 히스타민 분비 정량

마우스를 하룻밤 동안 절식하고 301ns 간격으로 2개 용량군으로 구분한 마우스당 10 mg PPE를 위관내로 도전(challenge)하였다. 무처치군 마우스를 유사한 방법으로 도전하였다. 혈장 히스타민 수준을 측정하기 위하여, 혈액을 2차 위관 영양 도전을 수행 10분후에 회수하고 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. 히스타민 수준을 제조업자의 지침대로 효소 면역-어세이 키트(enzyme immuno-assay kit, SPI-BIO, 프랑스)을 이용하여 측정하였다.

특이적 IgE, IgG1, IgG2a의 정량

혈액 시료를 면역 치료법 전 및 도중에 안와하정맥총으로부터 채혈하고 혈장을 추후 분석 전까지 -30℃에 보관하였다.

ICH 지침을 이용하여 입증된, 정량적 ELISA 방법을 특이적 IgE, IgG1 및 IgG2a 분석을 위하여 사용하였다. 요약하면, 미세적정판(microtiter plates)을 10㎍/ml 농도에서 PPE로 피복하였다. 100 ㎕ 개개 혈청의 일련의 희석용액을 개개 웰(well)에 분산하고 4℃에서 24시간 동안 배양하였다. 포스파타제 알칼린(phosphatase alkaline, Serotec, 잉글랜드)로 표지된 항-마우스 IgG1 또는 IgG2a 항체를 추적자(tracer)로 사용하였다. 시약 (pNPP, Sigma, 프랑스)을 효소 기질로 사용하였다. 특이적 IgE, IgG1 및 IgG2a을 추적자에 상보적인, 땅콩 단백질을 대체한 항-마우스 IgE, IgG 또는 IgG2a 항체 (Serotec, 잉글랜드)로 피복된 고체상을 이용한 동일한 조건하에서 수행된 총 IgE, IgG1 또는 IgG2a 어세이법에서 얻은 농도-반응 곡선과 비교하여 정량화하였다. 마우스 면역글로불린 표준품을 회사(Serotec)으로부터 구입하였다.

IgA 어세이

특이적 IgA를 혈청 시료에서 측정하였다. 0.1% BSA를 함유한 PBS 완충액에서 희석한 혈청(1/50)을 10 ㎍.ml^-1로 PPE로 피복한 플레이트에서 배양하였다. 특이적 IgA를 포스파타제 알칼린(phosphatase alkaline)으로 표지된 염소 항-마우스 IgA (Southern Biotechnology Associated, 미국)을 이용하여 상술한 바대로 탐지하였다. 결과는 405nm에서 흡광도 단위(absorbance unit)로 표시하였다.

시토킨 생성

마지막 채혈후에, 마우스를 경추도살하고 비장을 멸균 조건하에서 회수하였다. PPE(2.5250 ㎍.ml^-1), PBS (음성 대조군) 또는 코카발라민(concanavalin) A (1 ㎍.ml^-1, 양성 대조군) 존재하에 세포 배양을 수행하였다. IL-4, IL-5, IL-10, IFNγ 및 TGFβ에 대한 어세이를 키트(CytoSetTM kits, BioSource International Europe, 벨기에)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.

지연형 과민 반응 (DTH)

DTH 반응을 나타내기 위하여, 최종 경구적 면역화 후에, 마우스의 뒤 발바닥에 PBS중 100 ㎍ 땅콩 단백질을 주사하여 도전하였다. PBS를 다른 발바닥에 주사하였다. 양쪽 발바닥의 순 부종(net swelling)을 상기 도전 24시간 후에 미세캘리퍼(microcalliper)를 이용하여 측정하고 상호 비교하였다.

통계학적 분석

통계분석을 위하여 소프트웨어(The Graph Pad Software, San Diego, USA)을 이용하였다. 데이터는 대조군과 처치군을 비교시에는 편차 분석 (ANOVA) 및 시험법(Dunnett’s test)을 사용하고 모든 그룹간을 비교시에는 편차 분석 (ANOVA) 및 시험법(Tukey’s test)을 사용하였다.

결 과

예비 검토의견

마우스 및 인간에서의 면역반응 및 Th1 및 Th2 반응과 같은 기전상의 유사성 및 상이성에 대한 연구를 계속하였다. 경피성 면역요법 개념의 근거로 개발된 모델을 분석하기 위하여 인간 및 마우스에서의 주요 알러지성 바이오마커(biomarker) 및 이들에 대한 판단의 일부 요소, 특히 Th1/Th2 균형에 관한 요소를 관찰하였다.

비만 세포의 탈과립화: 마우스에서, 비만 세포의 탈감작화는 IgE와 함께 IgG1으로 촉발되는데 반하여, 인체에서는 IgE가 비만세포의 탈과립화 및 연속적인 아나필락시스(anaphylaxis)의 증상을 직접 촉발시키는 유일한 면역글로불린 이형이다.

IgG 항체 생성: 인간에서, IgG 항체, 주로 IgG4 아형(subtype)의 생성은 IgE에 의한 항원 인지를 초래하는 알러지성 염증 케스케이드를 길항하고 차단할 수 있다. 마우스에서는, 동등한 항체가 개시되지는 않고 Th2로부터 Th1으로의 전환 양상은 IgG2a 항체의 증가로 구성된다.

인체에서, IgG1 및 IgG3 생성이 Th1 세포에서 자극되는데 반하여, IgE 및 IgG4 생성은 Th2 세포에서 자극된다.

마우스에서, IgG2a 및 IgG3 생성이 Th1 세포에서 자극되는데 반하여, IgE 및 IgG1 생성은 Th2 세포에서 자극된다.

정리하면, 설치류 모델에서, 면역요법의 유효성은 필수적으로 특이적 IgG2a의 증가로 분석된다.

1. 감작화의 확인

1.1 감작화 중 특이적 IgE , IgG1 , IgG2a

영양법(gavage)에 의한 PPE 투여후 BALB/c 마우스에서 유도된 PPE 특이적 항체를 분석하였다. 마우스에서의 땅콩-탈감작화법은 도 1에 나타난 바와 같이 특이적 IgE 및 IgG1 생성에 의하여 확인된다. 특이적 IgG1 보다 적은 수준이나 또한 IgG2a 도 생산된다. 특이적 항체는 비처치군 마우스에서는 발견되지 않았다.

1.2 비장 임파구의 시험관내 재활성화후 분비된 시토킨

CT 및 PPE로 감작화된 마우스 유래 비장임파구는 고량의 알레르겐-특이적 IL-4 및 IL-5, 및 소량의 IL-10, IFNγ 및 TGFβ를 분비하였다 (도 2). 시토킨은 대조군 마우스에서 발견되지 않았다. 이러한 결과는 PPE-특이적 Th2 반응은 영양법에 의해 땅콩 단백질을 받은 BALB/c 마우스에서 유도되었음을 입증하였다.

1.3 경구 도전 후 히스타민 수준

증가된 히스타민 수준은 비만세포 탈과립화를 반영하고 이는 과민 반응의 주요 매개물의 하나이므로, 히스타민은 경구 도전 후 혈장에서 분석되었다. 히스타민은 감작화된 마우스로부터 얻은 혈장 시료에서만 감지 가능하였다 (도 3).

1.4 지연형 과민반응 ( DTH )

땅콩 알레르겐에 대한 탈감작화를 나타낸 이전의 결과를 완성하기 위하여, DTH 반응을 조사하였다. 발바닥 도전(footpad challenge)을 감작화 종료시에 수행하였으며 감작화된 마우스만이 부종화가 나타났음을 증명한다 (도 4). PBS로 처치된 발바닥에는 DTH 반응이 나타나지 않았다.

2. 땅콩 면역요법

2.1 면역요법의 제형화

면역요법을 위한 제형의 단백질 함량을 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 5).

2.2 면역요법 중 특이적 IgE , IgG1 , IgG2a

IgE 및 IgG1: 땅콩 감작화는 특히, 특이적 IgE 및 IgG1 생성에 의해 분석된다. 면역요법 중, 특이적 항체들의 발생을 조사하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 특이적 IgE의 생성은 탈감작화 6주 및 16주 동안에 안정화되었다. 특이적 IgE의 감소는 몇 개월 후에만 관찰할 수 있는 장기간 과정이다. 게다가, 면역요법 도중에, 특이적 IgG1의 변화가 관찰되지 않았다 (데이타 표시안함).

IgG2a : 특이적 IgG2a가 탈감작화 8주 및 1주 이후에 처치된 마우스에서 유의적으로 증가되었다 (도 7).

우세한 Th2 양상으로부터 균형화된 Th2/Th1 양상으로의 면역편향을 확인하기 위하여, IgG1/IgG2a 비를 개개 그룹에서 평가되었다: EP (탈감작화군: desensitization), NT 및 대조군(control) (도 8). IgG1/IgG2a 비가 보다 균형화된 Th2 / Th1 양상을 얻기 위하여, Th1 양상의 신장(boosting)을 나타내는 처치군 마우스에서만 감소되었다.

2.3 히스타민

히스타민은 과민반응의 주요 매개물질 중의 하나이다. 히스타민은 비만 세포의 마커(marker)로써 경구 도전 30분 후에 회수된 혈장 시료에서 분석하였다. 탈감작화 16 주 후에, 히스타민 분비를 개개 그룹(처치군 또는 비처치군) 마우스에서 정량화되었다 (도 9). PPE로 경피적으로 처치된 마우스는 보다 유의적으로 낮은 히스타민 분비를 나타냈다. 이러한 결과는 마우스의 알러지 상태의 증상 개선을 확인해 준다.

2.4 면역요법 중 특이적 IgA

특이적 IgA의 적정을 탈감작화 8주 후에 혈청 시료 상에서 수행하였다 (도 10). 특이적 IgA 는 탈감작화 8주 후에 PPE로 경피적 투여경로에 의해 처치된 마우스에서 유의적으로 증가하였다. 비처치군 마우스에서 변화는 관찰되지 않았다.

특이적 IgA가 면역요법 도중에 IgG4 와 유사한 작용을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 면역조절 효과는 IL-10 생성 및 TGFβ 발현을 초래할 수 있다 (Francis et al., 2008).

결 론

경피적 경로는 땅콩-감작화된 마우스에 대한 강력하고 근원적인 탈감작화 방법을 발휘한다.

경피적 탈감작화는 우세한 Th2 양성으로부터 재균형화된 Th2/Th1 양상으로의 면역 편향 및 특이적 IgA 증가를 초래하였다. 알레르겐의 마커로서(비만세포의 탈과립화), 히스타민 분비가 경피적 경로에 의해 처치된 마우스에서 감소하였다.

참고 문헌

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Claims

배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버를 창제하도록 적용되며, 피부에 상기 패취 기구를 적용하고 상기 배킹부가 객체에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 단백질을 챔버 내 피부 배향 측면 상에 함유하고, 하나 이상의 단백질이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되며, 투여는 반복적 투여로 땅콩에 대한 객체의 내성을 점진적으로 증가시키는 결과를 초래하는, 배킹부를 포함하는 피부 패취 기구에 의한 경피적 경로를 통하여 하나 이상의 땅콩 유래 단백질을 객체에 반복적으로 투여함을 포함하는, 땅콩에 대한 객체의 내성을 증가시키기 위한 신규 면역치료학적 방법.
제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 ARAh1, ARAh2 및 ARAh3로부터 선택되며 임의적으로 땅콩 유래 기타 단백질과 조합된 것인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 땅콩의 적어도 일부가 정제된 추출물 형태로 투여되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 건조 형태인 방법.
제 4항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 미분화된 형태이고 정전기력 및/또는 반 데어 발스 력으로 점착제 없이 배킹부에 투착되는 것인 방법.
제 4항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 미분화된 상태이고 상기 배킹부 상에 피복된 점착제로 배킹부에 부착되는 것인 방법.
제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 분무-건조 공정으로 배킹부에 적재되는 것인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 액체에서 용해되거나 또는 분산되는 방법.
제 8항에 있어서,
액체 상태의 상기 하나 이상의 단백질은 흡수성 재료 저장소에 배킹부상에 고착되는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 응결은 피부에 패취 기구를 적용한 후에 챔버 내에서 형성되어, 단백질의 제거 및 경피적 전달을 야기하거나 증진시키는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 응결은 땀흘리기의 결과로 형성되는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 임의의 보체없이 제형화되는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 단백질은 하나 이상의 보체로 제형화되는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유도된 면역반응은 관찰 가능한 염증 반응이며 상기 배킹부는 바람직하게는, 염증반응의 시각화를 허용하는 투명한 영역을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배킹부 경계는 점착 특성을 갖는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배킹부 경계는 습기찬 피부 상에서 점착 특성을 갖는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 1개월 내지 수년간에 걸쳐 주 1회 이상, 1개 패취 이상/일을 반복적으로 적용하는 방법.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 특이적 IgG 수준의 증가를 야기하는 방법.
제 18항에 있어서,
상기 방법은 특이적 IgG4 수준의 증가를 야기하는 방법.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 투여된 단백질에 대한 Th1 반응의 상승을 야기하는 방법.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 우세한 Th2 양상으로부터 보다 균형화된 Th1 / Th2 양상으로의 면역 편향을 야기하는 방법.
배킹부 경계가 피부에 밀폐성 밀봉 챔버를 창제하도록 적용되며, 피부에 패취 기구를 적용한 후에 상기 배킹부가 객체의 피부에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양의 하나 이상의 땅콩 유래 알레르겐을 챔버 내 피부 배향 측면상에 함유하고, 상기 하나 이상의 땅콩 유래 알레르겐이 피부에 상기 패취 기구가 적용된 후에 배킹부로부터 제거되고 경피적 경로를 통하여 객체에게 전달되는, 배킹부를 포함하는 피부 패취 기구.
땅콩에 알러지 증상을 갖는 객체에게 내성을 증가시키기 위한 조성물 제조를 위한 제 22항에 따른 피부 패취 기구의 용도.
서로 동일한 양의 땅콩 알레르겐을 포함하는, 제 22항에 따른 다수 패취 기구를 포함하는 키트.