CN101883584B - 过敏原脱敏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对过敏患者进行脱敏的方法。更具体来说，它涉及适用于任何类型的过敏原和患者的表皮脱敏方法。本发明的方法基本上是非侵入性的，并且不需要使用佐剂。此外，它可以由实际患者容易地使用和监控。

Description

过敏原脱敏方法

本申请涉及对过敏患者进行脱敏的方法。更具体来说，涉及适用于任何类型的过敏原和患者的表皮脱敏方法。本发明的方法基本上是非侵入性的，并且不需要使用佐剂。此外，它可以由实际患者容易地使用和进行。

过敏在日常医疗实践中占据越来越大的比例。它是世界范围的公共卫生现象，被WHO分类为全世界第四普遍的病患。在法国，每三个法国人中有一个过敏，呼吸和食物过敏二者影响越来越多的成年和儿童人群。

脱敏方法是一种技术，根据这种技术，通过给药极少量的过敏原，可能或多或少地抑制过敏现象。从21世纪初起，WHO已经认识到脱敏方法是根治过敏的唯一方法。

已经确立，脱敏方法从第一步起就影响对致敏原的免疫应答(Tij等，2004)，这意味着它不仅减轻与短期过敏反应有关的症状，而且也修改过敏性疾病的自然史，并且既防止对新过敏原发生过敏，也防止症候学向更严重的临床征象发展，例如过敏性鼻炎转变成哮喘。

免疫疗法已证明在患有严重的IgE依赖性过敏、对有限数量的过敏原过敏的患者中有效。

尽管对于免疫治疗疗法的作用机制还不完全理解，但它可能通过下述方面起作用：

·增加体外阻断IgEs的生物学效应的抗体IgGs、特别是IgG4级份，尽管这些效应在体内的重要性仍有待评估，

·改变TH1/TH2平衡，促进TH1应答，

·生产产生白介素10(IL-10)的T细胞。后者对肥大细胞、某些T淋巴细胞和嗜酸性细胞具有许多抗过敏性质，并且也促进IgG4的生产。

通过皮下途径的免疫疗法，是大多数变态反应学家的标准途径，仍然广泛使用。尽管昂贵并且在每次注射时需要专业医师的参与，但目前它仍被当作儿童中的标准脱敏途径(Pajno等，2005)。但是，它不是没有风险的，因为据估计死亡率是250万次注射中1次，平均每年死亡3.4人。

某些具有高危反应的致过敏过敏原不用于皮下脱敏治疗的范围内。这是落花生和大多数食物过敏原的情况。

现在，舌下免疫疗法被WHO当作经皮下途径的免疫疗法的令人满意的替代方案。它正在许多国家进行评估。第一种打算用于公众的商业化舌下给药片剂制剂，正在某些欧洲国家销售，并在美国试销。

据许多作者报道，舌下免疫疗法的患者耐受性好得多，并且与其他给药途径相比，成本效果比更好，因为它不需要医生的参与，可以由患者自己给药，使他们更愿意采用它而不是其他途径(Pajno等，2005)。

经舌下途径的治疗中副作用少见，据估计为1000个给药剂量0.1到0.2次反应。反应大部分轻微，影响口腔或舌下区域或胃肠区域(LaRosa等，1999)。

然而，就有效性来说，某些人认为舌下途径不如皮下途径有效；它需要使用较大量的过敏原，并且不能被批准用于所有过敏原，尽管通过这条途径对落花生和牛奶进行脱敏的试验正在进行之中。该技术用于食物过敏原的安全性仍有待评估。

鼻内免疫疗法，在18项受控研究中的17项中，已被证明有效。因此，至少在过敏性鼻炎中，这是有效安全的途径。但是，它一般不易被患者耐受，从而增加了其临床应用的限制。在比较不同脱敏途径的研究中，在接近50％的病例中，经鼻途径的治疗在不到1年内提前中断，而通过皮下或舌下途径治疗的儿童中，只有不到10％提前终止了(Pajno等，2005)。

这些脱敏方法的有利的替代方案，在于通过表皮途径进行免疫治疗的可能性，即通过在皮肤上反复施用过敏原，典型情况下导致过敏原扩散到皮肤的表层中，一般没有任何明显的透皮通过。

长期以来，已经在动物中证实了在皮肤上反复施用过敏原，能够引起动物对所述过敏原的敏化(Golovanoff，1926)。获得的反应是系统性的，影响整个身体，因此完全超出了仅仅皮肤区域。

更近些时候，开发了经表皮途径对牛奶致敏的小鼠模型(Chang)。已经显示，在这些情况下，引发的免疫应答涉及不同细胞群体，导致了TH2淋巴细胞的活化，促进了过敏原的特异性IgE类型抗体的产生。

某些研究能够确定，如果皮肤在刺激条件下的自发应答实际上是TH2类型的，那么有可能通过向皮肤施加下列不同刺激而改变应答的免疫情况：

·通过物理因子例如紫外线攻击

·通过改变角质层结构的反复的剥层对皮肤进行机械攻击

·通过微生物因子例如霍乱毒素的攻击

·改变皮肤通透性。

对过敏原接触产生的免疫应答的类型可以通过这些不同的因子而改变，导致优选活化TH1淋巴细胞，促进了IgG4类型抗体的产生。

表皮途径由变态反应学家在50年代期间使用。它由一周几次滴加过敏原在皮肤上进行划破构成(Pautrizel等，1957)。该技术由有经验的变态反应学家执行，提供了有效性和安全性。但是，由于仅在非常小的规模下进行，并且不是非常标准化，这种方法传播不广。最后，由反复划破导致的痛苦通常非常广泛，毁伤无疑是该方法今天被废弃的原因。

专利申请EP 1031346提出了含有透皮装置和抗原或过敏原、以便获得脱敏的疫苗，专利申请WO 2007/122226提出了用于对过敏对象进行脱敏的皮肤装置的使用。但是，在这些文献中描述的方法使用了诱导细胞因子活性的化合物(例如佐剂)，不是靶向允许对过敏对象进行有效脱敏的致耐受性类型的炎性反应。

本发明在于开发有效的表皮脱敏方法，使用这种脱敏方法可以克服现有技术的缺点和限制。

更具体来说，本发明部分在于证明了由过敏原的皮肤施加所引起的特异性炎性反应，极大地影响并参与了免疫细胞在耐受性意义上的反应。

本发明包括以反复和长期的方式在皮肤上施用过敏原以便引起炎性反应，该炎性反应由施用的时间长度和重复度所导向的情况是致耐受性类型的。因此，本发明不仅涉及引发炎性反应，而且涉及对它进行导向。

本申请显示，控制该炎性反应的条件和获得的耐受性的程度，代表了表皮脱敏方法的基本要素。本发明显示，反复地引发这种特异性炎性反应，对于使免疫应答的耐受性逐渐转向是重要的，这使得即使在不存在任何佐剂或皮肤的预处理的情况下，也可能进行表皮脱敏。

因此，本发明第一次提出了一种皮肤脱敏方法，包括在允许由在皮肤上施用过敏原所产生炎症在治疗过程中得以维持的条件下，在对象的皮肤上反复地皮肤施用过敏原。有利情况下，方法包括至少一个用于监测和/或评估由在皮肤上施用过敏原而产生的炎症的程度的步骤，该反应的引发、维持和/或控制，为引导身体对过敏原在耐受性意义上的反应，提供了可能性。

因此，本发明的目的在于使用过敏原来制备通过在对所述过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对所述对象进行表皮脱敏的组合物，其特征在于过敏原在允许炎性反应在治疗过程中得以维持的条件下施用在皮肤上。本发明事实上显示出，这种炎性反应的持续，促进了免疫系统针对过敏原的致耐受性类型的应答。

本发明的另一个目的在于使用过敏原来制备通过在对所述过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对所述对象进行表皮脱敏的组合物，其特征在于在治疗过程中，优选在每次施用过敏原的过程中，它包含用于控制和/或维持由在皮肤上施用过敏原而产生的炎性反应的步骤。

本发明的另一个目的在于使用过敏原来制备通过在对所述过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对所述对象进行表皮脱敏的组合物，其特征在于在治疗过程中，它包含控制和/或维持由在皮肤上施用过敏原而产生的炎性反应。

本发明的另一个目的在于使用过敏原来制备用于在耐受性的意义上改变对所述过敏原过敏的对象的免疫应答的组合物，包括在允许炎性反应在治疗过程中维持的条件下，在对象的皮肤上反复地施用过敏原。

本发明还涉及通过在对过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对对象进行表皮脱敏，其特征在于在允许炎性反应在治疗过程中维持的条件下，在皮肤上施用过敏原。

正如随后将在本申请中详细描述的，有利情况下，通过控制或调节治疗过程中过敏原的剂量或频率或施用时间和/或其本性，来维持炎性反应。

本发明的另一个目的在于对过敏原过敏的个体的表皮脱敏方法，其特征在于它包含至少一个用于在治疗过程中评估由在皮肤上施用过敏原所产生的炎症的程度的步骤。通过评估炎性反应的程度，如果需要，可以调整脱敏的条件。

本发明还涉及通过在对过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对对象进行脱敏的方法，其特征在于在每次施用过敏原时，它包含控制炎性反应的步骤。

本发明还涉及通过在对过敏原过敏的对象的皮肤上反复地施用过敏原，对对象进行脱敏的方法，其特征在于在治疗过程中，它包含维持由在皮肤上施用过敏原所产生的炎性反应。

本发明还涉及使用由在患者的皮肤上施用过敏原所产生的炎性反应作为标志物，以便调整所述患者的治疗，用于对所述过敏原的表皮脱敏。

正如随后将在申请中描述的，本发明可应用于任何类型的过敏原，可以使用任何皮肤给药装置进行施用。它不需事先对患者的皮肤进行处理就允许有效的脱敏。此外，它不需共同给药佐剂化合物。

使用沉积在过敏对象皮肤上的过敏原是非常安全的，正如由诊断领域中使用过敏斑贴试验而积累的经验所证明的。根据我们在法国使用

从2004年开始销售的第一种即用型过敏斑贴试验的经验，没有报道有不利效应，无论是严重的局部作用还是全身类型的一般化反应。

在将过敏原施用到皮肤上之后，免疫系统可能不与也可能与系统性免疫反应的局部(皮肤)炎性反应进行反应。

在本发明的具体实施方案中，在对过敏原过敏的对象的皮肤上施用所述过敏原，诱导了皮肤反应、特别是炎性类型的皮肤反应，这是通过过敏原与皮肤表面上存在的角质细胞和朗格汉斯细胞的接触而触发的。

在通过本发明的方法进行的表皮免疫治疗中，这种由在对过敏原过敏的对象的皮肤上施用所述过敏原所引起的反应，在治疗过程中被维持和/或控制。本发明事实上显示，这种反应的维持和控制，导致了免疫应答在对象对所述过敏原的耐受性的意义上的逐步定向定向。这种应答在临床上体现为皮肤反应性的逐渐降低或完全消失，以及对所述过敏原的耐受阈值的增加。

上面陈述的机制适用于任何过敏原，尤其是作用于消化区域(食物过敏，例如卵清蛋白、落花生、贝类等)，作用于肺部区域(呼吸过敏例如对花粉)或皮肤区域的过敏原。

因此，本发明方法所基于的、并由后文中讨论的实验数据所充分说明的原理，在于通过皮肤途径，有可能诱导以前对过敏原过敏的对象的耐受性。这种效应是通过将过敏原维持在对所述过敏原过敏的对象的皮肤上，并由此引起、维持和控制对过敏原的炎性反应，以在耐受性的意义上指导身体对过敏原的反应，来获得的。

因此，本发明的表皮免疫疗法是用于过敏的治疗性方法，由使皮肤的免疫细胞(例如朗格汉斯细胞，肥大细胞，巨噬细胞，白细胞)与过敏原在对所述过敏原过敏的对象中相接触，以及通过特异性的、受控的和持续性的细胞炎性反应引发免疫应答的转变，导致过敏患者对所述过敏原的耐受。在本发明的方法中，与所有现有的脱敏手段不同，脱敏过程在患者的炎性反应的性质和程度方面受到监测和引导。这种方法提供了可以根据每个患者的需要和特征进行调节的有效的脱敏方法，并且不需要使用佐剂化合物或对皮肤进行预先的穿孔或磨损处理。

总的来说，本发明的方法包括以反复、长期和受控的方式，在允许特异性针对过敏原的炎性反应在治疗过程中得以维持的条件(例如剂量和/或频率和/或施用时间条件)下，将过敏原施用在对所述过敏原过敏的对象的皮肤上。在有利的实施方案中，不使用任何佐剂化合物和/或在健康皮肤上，就可以实现施用。

一般来说，本发明的方法包括下列阶段：

a.任选地选择患者和/或过敏原(剂量，本质，剂型等)；

b.向患者施用过敏原；以及

c.控制炎性反应；在治疗过程中，有利情况下，步骤b.和c.重复一次或几次，在治疗过程中调整过敏原的条件(剂量，本质，剂型，施用频率，暴露时间等)，以便维持炎性反应。

由于本发明是基于对炎性反应的控制，因此重要的是进行治疗的过敏患者，在第一次在皮肤上施用过敏原的过程中具有这样的应答。为此，有利情况下，进行第一次(一系列)过敏原施用，以便确定过敏原制备物在治疗开始时给出最适合的反应性。

为此，在有利情况下，以预定的形式和单个剂量进行第一次过敏原施用。

如果对象发生了适合的炎性反应，可以在该过敏原剂量/形式的基础上进行治疗。适合的反应是指例如可以通过肉眼观察到的炎性反应，典型情况下作为浸润性红斑损伤，带有或不带有丘疹或可能的湿疹型特点。

如果确定的反应强度很强，包括了囊泡或甚至水疱，或者广泛传播到附近的皮肤区域，或强烈引起痒疹，那么用于引发治疗的过敏原浓度将被降低，以便获得适合的应答，或可选地减少过敏原在皮肤上的施用时间。

相反，当确定的反应强度太低时，过敏原的剂量和/或施用时间和/或同时使用的装置的数量将被增加，以便获得如上定义的显著的初始反应。在这种情况下，测试其他形式的过敏原，以便鉴定能够给出更好的对象反应性的制备物，也是可能的。因此，过敏原可以在不同形式下存在(完整食品，蛋白提取物，肽，重组或合成产品等)，这些形式可以在过敏患者中引起不同炎性应答。因此，该治疗的第一个阶段允许确定最适合形式的过敏原，以开始治疗。

就此而言，在具体实施方案中，在治疗开始时，给患者使用一系列含有不同浓度和/或形式的过敏原的装置。通过该第一次治疗，有可能在患者的基础上确定剂量和/或最适形式，用作开始治疗的参照。如果需要，可以在治疗过程中反复使用这些具有不同浓度和/或形式的装置，以便根据对象反应性的变化调整在治疗过程中使用的剂量/形式。

当初始剂量/形式已被确定时，可以进行表皮免疫治疗。该治疗包括在皮肤上反复地施用过敏原。有利情况下，施用在对象背部的上方部分或手臂或前臂的内侧面进行。在已经事先检查过针对过敏原的局部反应性的优选条件下，它也可以在身体的任何其他区域进行。应该理解，在治疗过程中，过敏原可以施用在身体的不同区域上。施用以可变的频率更新，这取决于使用的治疗程序(典型的程序包括大约6到72小时之间的初始施用时间)。它们可以连续或分批施用，在施用之间观察可变的时间间隔(可以在例如1天到三周的范围内)。反复和长期施用几个月过敏原，导致炎性介导物的局部释放以及炎性细胞的流入，这在耐受性的意义上影响了免疫细胞的反应。典型的程序包括在对对象进行脱敏所需的时间跨度内，该跨度可以超过几个月，反复地施用过敏原，每次施用时间为大约6到72小时，间隔大约5-15天。

本发明证明，为了确保适合的脱敏，重要的是在治疗过程中控制和维持(通过调整剂量或暴露于过敏原的时间或频率，或其形式)局部炎性反应。因此，本发明的方法包括定期评估由反复地在皮肤上施用过敏原所产生的炎症的程度。因此，在治疗过程中，过敏原剂量和/或时间，和/或同时使用的装置的数量，将根据皮肤反应性的程度进行调整。治疗过程中皮肤反应的强度的降低，导致施用频率和/或同时使用的装置的数量和/或过敏原剂量的增加，和/或导致其形式的改变。相反，皮肤反应强度的增加，导致施用频率和/或同时使用的装置的数量和/或所述装置中过敏原的浓度，和/或其形式的降低。

炎性反应、特别是皮肤反应的强度的评估，可以由医生和/或实际的患者进行。该评估可以通过任何方法进行，通常是通过目测检查或通过接触，例如通过使用EAACI的经双方同意的评估网格(参见Allergy 61(2006)1377-1384)。因此，皮肤炎性反应存在不同的程度：红斑-红斑和浸润-红斑和几个丘疹-红斑伴有许多丘疹-红斑和囊泡。适合的炎性反应典型为III型炎性反应，即含有红斑和几个丘疹。只要可能，这是人们在治疗中试图维持的反应类型。当然，当患者从开始就发生不太强的反应时，参比反应将必然不太强，并且它将在患者的基础上进行调整。此外，在治疗过程中，由于对象的脱敏，炎性反应将会降低。

为了使用本发明，通过炎性标志物例如细胞因子或干扰素的定剂量来评估炎性反应，也是可能的。

为了尽可能好地调整治疗，在本发明的具体实施方案中，在治疗过程中通过使对象与一定剂量范围的过敏原相接触，对炎性反应性进行一次或几次评估，以允许为后续治疗选择最适合的剂量。

炎性反应的评估可以都伴随着治疗，即在每次新施用过敏原时进行。

仅在某些间隔时间而不是每次施用时进行这种评估，也是可能的。

此外，如果优选在整个治疗过程中维持炎性反应，但这并不是强制性的，并且当第一次已建立免疫接触，而且当特异性级联反应(有免疫能力的细胞的活化和细胞因子与抗体的产生)已经被足够地引发时，也可以获得有效的脱敏。因此，在实践中，当炎性反应已经达到足够的水平，例如表现出所需强度的皮肤反应时，可以移除装置，然后在确定时间的延迟后，在另一个皮肤区域上放置另一个装置。

在本发明的可选方案中，至少在炎性反应达到参比的程度之前，将过敏原(或施用装置)维持在皮肤上。当这种程度达到时，可以移除过敏原(或装置)，经过一段等待时间后进行新的施用。参比反应典型地是可以通过肉眼观察到的反应，例如作为浸润性红斑损伤，或具有湿疹型特点。

过敏原(或装置)也可以维持在皮肤上，以便维持炎性反应。典型地，在这种情况下，当所有过敏原都已经扩散，或如果炎性反应达到太强的强度时，移除施用装置。

应该理解，在治疗过程中，这些可选方案可以轮流使用。

在实施方案中，留给装置的设置之间的间隔时间是1到21天之间。

当对过敏原的任何皮肤反应性都已消失或已经非常明显地降低时，治疗被认为已经完成并成功地进行。治疗的成功可以用过口服引发试验或任何其他在变态反应学中承认的手段来验证。因此，治疗的时间长度是可变的，取决于皮肤对过敏原的反应性的演变。本发明方法的脱敏治疗的目的，是使对过敏原的局部皮肤反应在长期接触后完全消失，或使反应性降低，以便估计出对象对过敏原的反应性已经被表皮免疫治疗显著地降低了，在意外接触过敏原的过程中发生过敏性休克的风险显著地降低了。

本发明可以使用任何确保皮肤与过敏原接触的皮肤给药装置来实行。它们优选为贴片类型的装置、贴片或绷带，优选为贴片，例如封闭性(occlusive)贴片。

这样的装置典型地包含支持物，其上固定有过敏原，和/或包含含有过敏原的储存器或腔室。

使用的装置典型为具有被动扩散的透皮性质，即它不含任何能够引起皮肤穿孔或磨损的手段。事实上，获得的数据显示，即使不预先进行皮肤处理，本发明的方法也允许诱导表皮脱敏。但是，使用提供有旨在利用物理、化学或生物学手段增加皮肤的表面层对过敏原的通透性，和/或旨在增加皮肤反应性的性质的装置，也是可能的。因此，在一个可选方案中，施用装置可以利用微针或电学手段对通透性起作用，促进过敏原通过，远达表皮的基底层。此外，尽管不是必需的，但可以在每次施用装置之前对皮肤进行预处理(例如通过磨损处理)，以便进一步促进脱敏治疗。在优选实施方案中，使用了封闭性贴片类型的装置，例如在专利申请WO02/071950中描述的静电贴片

此外，在优选实施方案中，装置被提供有确保其维持在皮肤上的手段。为此目的，可以使用任何黏附性手段，包括具有强的黏附性的胶、聚合物或塑料类型的材料。也可以使用提供有腕带(bracelet)的装置，如同在例如专利申请No.FR0753787中描述的，或具有剥落页片的装置，如同在例如专利申请No.FR0753265中描述的。

应该理解，装置的具体性质和形式可以由本技术领域的专业人员进行改造，所必需的性质是确保过敏原与施用位点处皮肤的接触。

在具体实施方案中，治疗通过提供有至少部分透明的背衬的装置(例如装置)来进行，以便可以通过透明的膜直接观察到炎性反应(例如红斑的出现)。装置的背衬甚至可以被改造，以便帮助患者确定皮肤反应的阈值水平，从该水平他/她能够移除装置。因此，在特别有利的实施方案中，使用了背衬具有透明区域，其上印有监测图案例如红色网格或红色同心圆的装置。当皮肤没有反应时，图案可以很好地观察到，而当获得皮肤反应时，它们被擦除。采用透明背衬系统具有许多优点，尤其是：

-这避免了与过敏原不必要的延长的接触，增加了皮肤耐受性，最小化了瘙痒类型的令人不悦的次级效应，事实上提高了接受性和遵从性；

-这增加了方法在安全性方面的性能，并进一步最小化了系统性反应的风险，这种系统性反应对于许多过去用于对落花生进行脱敏的方法来说是致命的；

-这提供了一种解决方案，由此可以将暴露于过敏原的时间可变的观念整合到工业过程中。

在这种情况下，本发明的一个目的涉及用于将过敏原施用到对象皮肤上的皮肤装置，其特征在于包含提供有透明区域的背衬，通过背衬可以观察到由过敏原施用在皮肤上所引发的炎性皮肤反应。有利情况下，装置是封闭类型的和/或具有被动扩散的装置。装置典型为贴片。

此外，本发明的另一个目标涉及含有几种用于过敏原的皮肤施用的装置的试剂盒，装置含有不同剂量的过敏原和/或不同形式的过敏原。

在本发明的范围内使用的过敏原可以是各种不同的本质、形式和来源。因此，它可以是例如食物、呼吸或皮肤过敏原。它们可以是蛋白(或多肽或肽)，脂类，糖等，可以为提取产物的形式，重组体的形式，和/或合成来源的，例如如果需要，进行化学或免疫学修饰以便改变它们的性质。过敏原可以是整体的、天然的形式，或采取片段化的、变性的形式等。典型使用的制备物含有几种致敏性抗原的组合，和/或作为偶联物或复合物的过敏原。应该理解，本发明的方法基本上不依赖于过敏原的本质，因此可以适用于任何含有过敏原的制备物，例如食物过敏原(例如落花生，贝类，牛奶，蛋，鱼，小麦，大豆等)或皮肤或呼吸过敏原(螨，花粉，动物毛发等)。

有利情况下，过敏原与任何适合于药用的赋形剂或载体一起进行配制。施用的致敏性制备物可以不同的形式出现，例如液体或固体的形式出现。在优选实施方案中。过敏原采取干燥形式，即脱水的形式，尤其是粉末、颗粒、聚集物、干胶片、干燥形式等。干燥形式可以通过冷冻干燥，通过简单的蒸发获得。

在具体实施方案中，过敏原采用粉末形式。

正如前面指出的，本发明的优点在于，使用它，即使不共同给药佐剂也可能获得对过敏原的脱敏。此外，在优选实施方案中，施加到患者皮肤上的致敏性制备物不含任何添加的佐剂化合物。在本发明的意义上，术语佐剂是指任何对皮肤行使生理化学和/或生物学作用，促进抗原透入到皮肤中，以及增加针对抗原的免疫应答的化合物。就生理化学和/或生物学作用而言，正如上面定义的，佐剂是通过扰乱角质层而改变表皮的通透性，从而允许抗原通过及其与表皮的免疫活性细胞接触的化合物。佐剂化合物的例子尤其是霍乱毒素(CT)或大肠杆菌的热不稳定毒素(LT)。其他的例子是Paul等(Paul A，Cevc G，Bachhawat BK.Transdermal immunization with large proteins byultradeformable drug carriers.(通过超级可变形药物载体使用大蛋白进行透皮免疫)Eur.J.Immunol.1995，25(12)：3521-4)所描述的传递体，它允许将抗原运输到膜中。

然而，在一种可选方案中，过敏原可以与佐剂化合物组合使用，和/或提供有用于扩大对所述过敏原的炎性反应的性质，例如与佐剂或具有免疫调节活性的化合物组合，所述具有免疫调节活性的化合物例如为细胞因子、化合物、Toll受体配体等。表述“组合使用”表示将过敏原与化合物给药到同一对象，以便在体内诱导协同效应。但是，它们可以根据不同的程序和途径给药。因此，它们可以都通过表皮途径施用，或化合物通过另一种途径施用。此外，它们不是必需在同时施用，而是可以相继地施用，重复或不重复，以类似的频率或不以类似的频率施用。典型情况下，佐剂化合物在过敏原之前或同时施用。

在通常的实施方案中，装置包含的过敏原的量在0.1到1,000μg/cm²装置表面积之间，优选在20到500μg每cm²装置表面积之间，更优选在20到200μg每cm²装置表面积之间。应该理解，该量可以由本技术领域的专业人员根据治疗的目标、病理学和时间长度、对象等进行调整。

下面的实验实施例显示了这种反应性的降低可以通过使用本发明的剂量控制来获得。本发明的表皮免疫治疗方法与现有技术状态相比，包含了许多优点。

这是一种原创方法，旨在通过定期、长期地在对过敏原过敏的对象的皮肤上施用所述过敏原，来引发和控制炎性反应，目的在于将身体对该过敏原的反应导向耐受。

这是一种非常安全的方法，正如由特应性斑贴试验领域中积累的经验，以及自从在法国引入

分发了超过100,000份的第一种即用型的特应性斑贴试验后收集的数据所证实的。由于本发明的方法的这种极大的使用安全性，有可能用于脱敏对过敏原例如落花生或贝类过敏的对象，由于招致的风险，这些过敏原不能使用标准的脱敏方法进行处理。

免疫治疗可以在任何时间通过移除施加在皮肤上的装置来终止，这对于在其过程中抗原被给药到体内的传统脱敏方法来说是不可想象的。

在方法的第一步中，一方面可以证实对象对表皮免疫疗法的合格性(具有皮肤反应的对象是合格的)，另一方面可以测量对象对过敏原的皮肤反应的程度，以便最好地指导表皮免疫治疗的进行。因此，有可能选择最适合于患者的程序，以便最适化皮肤耐受性并维持最好的效能水平。

在治疗过程中，可以根据连续测量到的皮肤反应性的演变，调整给药的剂量和/或频率。因此，可以在整个治疗过程中永久性地最适化治疗作用并维持最高的效能水平。

治疗的时间长度取决于在治疗开始时设定的治疗目标，以及针对过敏原的皮肤反应性的演变。当在皮肤上获得了确定的降低对过敏原的反应性的目标，并通过引发试验或任何其他的变态反应学手段证实时，或当确定皮肤反应性完全消除时，治疗被认为已经完成。

在阅读了下面的实施例后，本发明的其他特点和优点将变得明显，这些实施例应该被当作是说明性的而不是限制性的。

附图说明

图1：对鸭茅属植物的花粉脱敏8周(a)或16周(b)后获得的体积描记术结果。C：对照，ND：未脱敏，SCD：皮下脱敏，EPD：表皮脱敏。

图2：对卵清蛋白脱敏8周(a)或16周(b)后获得的体积描记术结果。C：对照，ND：未脱敏，SCD：皮下脱敏，EPD：表皮脱敏。

图3：使用落花生蛋白脱敏之前和脱敏8周后监测的抗体水平。左图：IgE特异性，右图：IgG1和IgG2a特异性。EP：表皮，ID：真皮内，ND：未脱敏。

图4：引发试验后释放的组胺。EP：表皮，ID：真皮内，ND：未脱敏。结果用nM表示。

图5：特异性IgEs比率的演变(V0，初始样品，V1，第一个月时的样品，V3，第三个月时的样品)。

图6：在治疗过程中观察皮肤炎性反应。A：显著的；B：中等的；C：减弱的。

图7A：使用

施用过敏原24小时和48小时后朗格汉斯细胞的活化和炎性细胞的流入。在施用24小时后，朗格汉斯细胞细胞被活化并开始它们向淋巴结的迁移。48小时后，炎性细胞活跃，炎性肉芽肿可以很好地观察到。

图7B：使用

施用过敏原(卵清蛋白)不同时间后局部细胞应答的演变。在施用6小时后，不能察觉细胞应答。24小时后，炎性细胞的局部比率的升高在移除

后继续。在施用48小时后，这种演变更强。

图8：在用

敏化的动物的皮肤上长期施用(6和12周)过敏原后局部应答情况的演变。在反复施用24小时后，应答主要是TH2类型的。在反复施用48小时后，应答是混合的，随后主要是TH1类型的。

实施例

实施例1.对卵清蛋白和花粉的脱敏

1.1.方法

在OVA和POL的情况下，通过连续两周(D0和D7)皮下注射10μg过敏原联合氢氧化铝，对BALB/c小鼠进行致敏。在D14时，对小鼠进行单独的10μg过敏原鼻部滴注。

从D21起，对小鼠进行脱敏处理或不进行脱敏处理。处理的小鼠在8周时间内，每周一次接受100μg过敏原给药，给药在确保皮肤炎性反应得以维持的条件下利用

系统通过表皮途径进行，或者通过皮下途径与氢氧化铝联合进行(阳性对照)。未脱敏的小鼠维持在动物房的正常条件下。

使用在脱敏8周和16周后取样的、冰冷的血清，跟踪了抗体(IgE和IgG特异性)水平的演化。

也通过能够评估脱敏或未脱敏小鼠的支气管高反应性的体积描记术测量，研究了OVA和POL脱敏治疗的效能。

1.2.结果

对用

处理或未处理的小鼠测量了支气管高反应性(图1和2)。

在确保皮肤炎性反应得以维持的条件下使用

处理的小鼠的支气管高反应性，与未处理小鼠相比，明显降低了3.7到2.6倍。皮下处理的小鼠的支气管高反应性，与用

处理的小鼠相比，没有明显差异。

实施例2.对落花生的脱敏

2.1.方法

对于ARA(落花生)来说，在6周时间内，通过每6天(D1，D7，D13，D19，D25，D33)胃内给药1mg ARA蛋白联合10μg霍乱毒素，对小鼠进行致敏。

脱敏步骤在D75开始，为期8周。在确保皮肤炎性反应得以维持的条件下，每周一次通过给药100μg ARA制剂对小鼠进行脱敏，给药通过真皮内途径或使用

系统通过表皮途径进行。未脱敏小鼠在致敏后不进行任何特别处理。

通过在口服引发试验后测量抗体(IgE、IgG1和IgG2a特异性)水平以及通过测量组胺的释放，追踪了脱敏的效能。组胺是肥大细胞或嗜碱性细胞类型的免疫细胞脱粒过程中释放的介导物。这种脱粒作用是诱导过敏性应答的标志。

2.2.结果

通过分析小鼠中特异性抗体的水平，验证了ARA脱敏处理的分析(图3)。通过表皮途径或通过真皮内途径脱敏的小鼠具有降低的特异性IgE(对ARA过敏的标志物)水平和升高的特异性IgG2a水平。在未脱敏小鼠中可以检测到的特异性IgE水平保持较高，特异性IgG2a水平低于脱敏小鼠中的。在表皮和真皮内脱敏途径之间没有观察到显著差异。

对于脱敏或未脱敏小鼠进行了口服引发试验。通过真皮内途径或通过表皮途径脱敏的小鼠与未脱敏小鼠相比具有较低的组胺释放。该结果显示出脱敏小鼠过敏反应性的降低。

讨论

通过不同的研究模型和所研究的不同过敏原，显示出：

-基于维持炎性应答的表皮免疫治疗方法能够触发全身类型的临床和生物学应答；

-在通过口服或皮肤途径预先致敏后，获益于基于维持炎性应答的表皮免疫治疗方法的动物，与通过皮下或真皮内途径进行免疫治疗的动物相比，对引发试验具有减弱的应答；

-获得的血清学响应证实通过表皮免疫疗法诱导了耐受过程。

实施例3.临床数据

患者的特征：儿童，年龄6岁5个月，体重18.3kg。慢性腹泻，呕吐，全身性湿疹。对牛奶针刺试验阳性。总IgE 486IU。牛奶特异性IgE 32.7IU。

0.6mL牛奶引发试验阳性(咽喉瘙痒，咳嗽，腹痛，荨麻疹)。

治疗：在确保与过敏原接触后的皮肤反应得以维持的条件下，施用含有130μg牛奶蛋白的

每两天更换，持续3个月。

结果：结果显示在图5和6中。与治疗过程中对炎性反应的监测相关联，它们说明对牛奶的耐受性阈值非常显著地增加了。在免疫治疗结束时，皮肤反应的减弱是确定的。在3个月时进行的口服引发试验显示，耐受阈值高达64.6mL而没有任何临床反应。

实施例4.在致敏小鼠中施用过敏原后细胞应答的演化

在事先致敏的小鼠的皮肤上施用过敏原，活化了朗格汉斯细胞及其朝向淋巴结的迁移(图7A)。

同时，活化的细胞产生例如前炎性细胞因子，它们吸引炎性细胞朝向皮肤的表面层。这种“第一阶段”反应发生在致敏对象中，因为它具有针对过敏原的记忆细胞和特异性IgEs。因此，在与过敏原接触后，它们发生了排斥过敏原的初始反应。

在第二阶段中，出现了局部炎性反应，其特征为急性炎性细胞(肥大细胞，巨噬细胞)和慢性细胞(白细胞)的流入(图7A和7B)。在事先致敏的小鼠中，使用

在皮肤上施用过敏原(卵清蛋白)，在接触24小时后表现出轻微的炎性反应，另一方面，在接触24小时后，随着皮肤区域被多核细胞侵入，表现出显著的炎性反应。治疗所靶向的正是这种更复杂的反应。

在致敏小鼠中进行的研究中，施用过敏原6小时、24小时和48小时，确定了炎性反应(在这里体现为局部巨噬细胞水平的增加)在施用48小时后更明显(图7B)。

讨论：

在表皮脱敏治疗过程中，目的是再生炎性细胞反应，其作用在耐受过程中是必不可少的。

事实上，随时间改变的不是炎性反应的强度，而特别是其本质。

免疫荧光研究证实了炎性的中心作用，以及炎性反应的情况依赖于施用时间的完全不同的特点。

过敏原的施用时间是用于引发细胞反应的基本因素。

实施例5.在长期施用过敏原后局部应答情况的演化

施用时间不是获得所需治疗(产生耐受性的)反应类型的充分条件。在小鼠中，在皮肤上反复给药过敏原，不论施用是“短的”(24小时)还是“长的”(48小时)，都引起该过敏原的特异性抗体的升高。在接受

48小时的对象中，当施用是连续的(多达88天)时，抗体的水平仍然还高，但是Th1/Th2淋巴细胞的相对比例朝向Th1淋巴细胞升高的方向变化(图8)。

讨论

实验数据证实，本发明的方法旨在诱导反应，其特征与通常情况下通过将过敏原简单地沉积在过敏人员的皮肤上而获得的反应不同。它是在利用

“长期”施用后获得的唯一反应，使用它可以获得“致耐受性”效应，体现为Th1淋巴细胞的活化，而在“短期”施用后获得的反应是Th2类型的。

在通过

进行的脱敏治疗过程中，将过敏原反复施用到事先致敏的患者的完整皮肤上，引发了炎性细胞反应，与目前使用特应性斑贴试验在临床上观察到的相同。

通过反复地长期施用过敏原而引发和维持炎性反应，产生了特异性的局部炎性条件。在该反应过程中，平衡移向有利于Th1淋巴细胞。

因此，似乎长期和反复地在皮肤上施用过敏原，不仅能够引起炎性反应，而且能够对该反应进行定向。

Claims (15)

1.过敏原在制备对所述过敏原过敏的对象进行表皮脱敏的组合物中的应用，包含通过确保所述过敏原与皮肤接触的不预先穿孔的皮肤装置、在允许全部或部分治疗过程中诱导在施用位点处的炎性反应的条件下、在对象的皮肤上反复地施用过敏原，以及包含在治疗过程中用于控制或维持由在皮肤上施用过敏原而产生的炎性反应的步骤。

2.权利要求1的应用，用于在耐受性的意义上改变对所述过敏原过敏的对象的免疫应答，其中所述免疫应答平衡移向有利于Th1淋巴细胞。

3.权利要求1或2的应用，其特征在于炎性反应的程度通过目测来评估。

4.前述权利要求任一项的应用，其特征在于过敏原施加在对象的完整皮肤上。

5.前述权利要求任一项的应用，其特征在于过敏原采用干燥形式。

6.前述权利要求任一项的应用，其特征在于施用无任何佐剂化合物的过敏原。

7.前述权利要求任一项的应用，其特征在于确保过敏原与皮肤接触的皮肤装置是被动扩散的皮肤装置。

8.权利要求7的应用，其中所述皮肤装置为皮肤封闭性装置。

9.前述权利要求任一项的应用，其特征在于过敏原或装置至少在炎性反应达到参比的程度之前维持在皮肤上。

10.权利要求9的应用，其特征在于参比的程度是能通过肉眼观察到的具有浸润性红斑损伤或湿疹型特点的炎性反应。

11.前述权利要求任一项的应用，其特征在于装置的背衬包含允许对炎性反应进行观察的透明区域。

12.权利要求11的应用，其中在所述透明区域上印有网格，从而能够评估炎性反应的程度。

13.前述权利要求任一项的应用，其特征在于它包含用于确定对预定浓度的过敏原过敏的对象的初始炎性反应的预备步骤。

14.前述权利要求任一项的应用，其特征在于，在治疗开始时和/或其过程中，它包含用于确定对象对不同剂量的过敏原或对不同形式的过敏原的炎性反应的步骤，以便选择剂量或治疗形式。

15.前述权利要求任一项的应用，其特征在于过敏原是食物、呼吸或皮肤过敏原。

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