CN1516595A - 用于经皮免疫的贴剂 - Google Patents

Abstract

本发明所述的用于经皮免疫的含蛋白粘合剂贴剂由至少四种不同的成分组成：(1)衬垫层；(2)粘附于衬垫层的压敏粘合剂层；(3)致免疫制剂的至少一种免疫活性蛋白，将此制剂涂敷于压敏粘合剂层与衬垫层相对的面上和/或掺入压敏粘合剂层中，以便至少一种蛋白与粘合剂保持接触；和(4)稳定剂，它使此至少一种蛋白在室温条件下保持免疫活性。

Description

用于经皮免疫的贴剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2001年3月19日提交的美国临时申请No.60/276,497的优先权。

本发明的技术领域

本发明涉及用于经皮免疫的含蛋白质粘合剂贴剂，它们在治疗疾病中的应用以及它们的生产。

本发明的背景技术

通过经皮免疫(经皮免疫)可有效地应用各种抗原诱导抗原特异性免疫反应。参见WO 98/20734、WO 99/43350和WO 00/61184；美国专利5,910,306和5,980,898；美国专利申请09/257,188、09/309,881、09/311,720、09/316,069、09/337,746和09/545,417。这种免疫反应可能需要应用佐剂(例如ADP核糖基化外毒素)。与通过肠内、粘膜、经真皮或其它胃肠外途径(例如皮下、肌内、腹膜内、动脉内、静脉内)应用时某些佐剂相关的缺点相比，皮外应用时，疫苗是安全有效的。在不引起不需要的免疫反应(例如特异反应性、皮炎、湿疹、银屑病和其它变应性或过敏性反应)的情况下，可活化皮肤抗原呈递细胞，而且抗原得到处理。在这里我们描述用于经皮免疫的贴剂，其中在将与被免疫的人或动物的皮肤接触的粘合剂成分中掺入蛋白抗原。

含药物粘合剂贴剂已经做过描述，但是大多数局限在将被引入体循环的小分子量药物(例如雄激素、尼古丁、硝酸甘油)的经真皮给药上。但是将蛋白掺入经皮免疫贴剂中的粘合剂部分尚未描述过，蛋白比上述药物大很多，而且化学和物理结构更不稳定。蛋白质佐剂和抗原经受变性作用和降解作用。在此，我们指出本发明的贴剂及其致免疫蛋白两者在物理和化学上均是稳定的。另外，即使是在室温下长时间贮藏后，这种致免疫蛋白的生物活性仍得到保持，并且微生物污染仍可得到避免。

在此公开用于经皮免疫的含蛋白粘合剂贴剂，以及生产和使用它们的方法。特别是举例说明此制剂中蛋白的稳定性和此贴剂在经皮免疫中的应用。应用一种或多种稳定剂可避免蛋白聚集、降解、变性或它们复合物的形成。下面论述本发明的其它优势，或者从本说明书中可清楚地看到本发明的其它优势。

本发明的总结

用于经皮免疫的含蛋白粘合剂贴剂由至少四种不同的成分组成：(1)衬垫层；(2)粘附于衬垫层的压敏粘合剂层；(3)致免疫制剂的至少一种免疫活性蛋白，它涂敷于压敏粘合剂层与衬垫层相对的面上和/或掺合在压敏粘合剂层中，以便至少一种蛋白与粘合剂保持接触；和(4)稳定剂，它使至少一种蛋白在室温条件下保持免疫活性。

衬垫层可以是封闭的或半封闭的(例如敷料)。可选择地包含释放衬垫。通过将贴剂装入足以在室温条件下贮藏的包装材料中可生产单个单位。

压敏粘合剂层可包含至少一个水基粘合剂(例如丙烯酸酯或硅氧烷)。稳定剂可为保护此蛋白的糖或聚合物：例如可应用非还原二糖、蔗糖或海藻糖。诸如增塑剂、增粘剂和增稠剂等其它赋形剂可包括在含有粘合剂、佐剂或抗原的制剂中。增塑剂可为短链三烷基柠檬酸酯。增粘剂可为乙二醇和/或丁二酸。增稠剂可为短链羟烷基纤维素或淀粉。

此蛋白可具有佐剂活性，抗原活性，或者两者均有。此蛋白可以是诱导免疫反应的抗原，或者它可充当佐剂，以促进异种抗原诱导的免疫反应。ADP-核糖基化外毒素(例如霍乱毒素、白喉毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素、假单胞菌属外毒素A、百日咳毒素)、趋化因子、细胞因子、其它已知佐剂或者它们的衍生物可以为这种蛋白。其衍生物的实例为具有佐剂活性的片断(包括已与野生型佐剂的部分进行化学缀合或基因熔融的那些)或突变体(包括为天然的变异体或在氨基酸序列中的其它改变、插入或缺失的那些)。

此贴剂提供有效量的蛋白。例如此贴剂包含的蛋白量可在1μg至1mg之间、5μg至500μg之间、10μg至100μg之间，或者在其中间范围。根据此蛋白的免疫活性，特定蛋白的有效量可以不同。

经皮免疫可用于诱导抗原特异性免疫反应、治疗现有疾病或预防受试者有患病危险的疾病。应用贴剂的位点的皮肤，其水化作用或穿透作用可提高抗原特异性免疫反应，或者防止不需要的免疫反应。抗原活化和/或呈递的可能目标是皮肤下面的树突状细胞。

可配制含有粘合剂和稳定的蛋白的湿掺合物，然后它可用于生产贴剂。可将蛋白涂敷于粘合剂层的表面，掺入为悬浮液的粘合剂中，或者含粘合剂制剂和含蛋白制剂可分别生产，然后再混合或层压在一起。可使用浇铸、包被、压出、层压和印染，使蛋白与粘合剂保持接触。

可通过一种或多种临床或实验室指标、与健康相关的替代指标、发病率或死亡率指标评价其有效性。通过下面的详细说明和权利要求，以及对它们的概括，本领域普通技术人员可更清楚地理解本发明。

附图的说明

附图1是含蛋白粘合剂(PIA)贴剂10横断面的部分图解。衬垫层12和压敏粘合剂层14彼此粘附。贴剂10的皮肤侧在使用前可选择地用释放衬垫18覆盖。致免疫制剂16通过涂敷在压敏粘合剂层14的皮肤侧，而位于贴剂10的暴露面上。不需要显示比例。

附图2是含蛋白粘合剂(PIA)贴剂20横断面的部分图解。衬垫层22和压敏粘合剂层24彼此粘附。贴剂20的皮肤侧在使用前可选择地用释放衬垫28覆盖。致免疫制剂26通过涂敷在压敏粘合剂层24的皮肤侧，因此位于贴剂20的暴露面上。不需要显示比例。

本发明特殊实施方式的描述

通过在非变性条件下用稳定剂分散或增溶蛋白，可将经皮免疫中所用的一种或多种活性致免疫蛋白涂敷和/或掺入至贴剂的粘合剂部分，或者粘合剂制剂中。与糖浆或其它粘性溶液相反，此粘合剂是压敏性的。此含蛋白致免疫制剂是稳定的，可防止降解和佐剂和/或抗原活性的丧失。如果它不溶于水性粘合剂，可加入此稳定的蛋白或含此稳定蛋白的颗粒，成为淤浆或悬浮液。我们称此为“含蛋白粘合剂”(PIA)贴剂。

由于含药物粘合剂中粘合剂的增溶作用通常是在被认为不适宜无保护性蛋白的有机溶剂中进行的，因此典型的用于含药物粘合剂产品的制剂是不能接受蛋白的。将此粘合剂的基质改变为水基粘合剂制剂，并将蛋白混合至此水基粘合剂制剂中，这样可将这种用于经皮免疫的活性组分混合入贴剂的粘合剂部分或者粘合剂制剂本身中。

已将此含药物粘合剂概念用于经真皮药物传送中，它与经皮免疫在几个特征上存在差异(Glenn et al.，Exp.Opin.Invest.Drugs，8：797-805，1999)。因此，PIA制剂和贴剂用于经皮免疫代表一个新颖而且非显而易见的发明。

此粘合剂可用于下面一种或多种目的：使贴剂保持在受试者的适当位置；混合此制剂的其它成分，诸如可选择的皮肤渗透增强剂化学品或非活性成分；使此制剂的不稳定成分稳定；以及本领域普通技术人员所熟知的其它目的。这种用于经皮免疫的粘合剂贴剂的使用为疫苗的应用提供一个方便而实用的方法。

皮肤结构及免疫生物学

皮肤是人体最大的器官，它在机体抵御感染性物质入侵和与有毒物质接触方面发挥重要作用。但皮肤的这个屏障功能阻碍了技术上实现有效的经皮免疫方法，以替代疫苗的肠内、粘膜及其它胃肠外给药途径。最近看到疫苗的皮外应用靶向特异性抗原呈递细胞，并诱导强烈的免疫反应。

结构上，皮肤由三层组成：表皮、真皮和皮下脂肪。表皮由基底层、棘细胞层、颗粒层和角化层组成；角质层包括角化层和脂质。据报道，皮肤的主要抗原呈递细胞，朗罕氏细胞位于人表皮的中间至上部棘细胞层中。真皮主要含有结缔组织。血管及淋巴管局限于真皮和皮下脂肪中。

角质层是一层死亡的皮肤细胞和脂质，通常将它看作是对有害环境的一个屏障，它使生物体和有毒物质接触不到角质层下面的活细胞。角质层也是防止皮肤水分丢失的一个屏障：据报告相对干燥的角质层的水含量是5％至15％，而深层表皮和真皮层水化相对较好，其水含量为85％至90％。角质细胞间的广泛交联使皮肤的屏障功能得到加强。最近才认识到抗原呈递细胞(例如朗罕氏细胞)提供第二级保护作用。而且，最近描述了应用皮肤活性佐剂，在有或无渗透增强剂的情况下通过皮肤免疫的能力(即经皮免疫)。尽管诸如特应性和皮炎等不良皮肤反应已为本领域技术人员所熟知，但因为相信皮肤可阻碍大于500道尔顿左右分子的通过(Bos et al.，Exp.Dermatol.，9：165-169，2000)，所以过去可能没有认识到经皮免疫的治疗优势。

表皮主要由角化细胞组成，但也含有显著数量(约1％至3％)的分布在活角化细胞之间的免疫监视细胞，它们称为朗罕氏细胞。尽管朗罕氏细胞在皮肤中数量相对较小，但它们占据人皮肤总表面积的25％。朗罕氏细胞代表免疫细胞广泛表浅的网络屏障，它们成为疫苗递送的吸引人的靶位。它们是迁移至上皮表面的骨髓衍生的树突状细胞，在此它们执行免疫监视功能。在正常环境下，从皮肤至引流淋巴结存在朗罕氏细胞的基线运输量。在诸如感染微生物等刺激的情况下，迁移出皮肤的朗罕氏细胞数量大大增加，以完成抗原呈递细胞的免疫监视功能。朗罕氏细胞受到与微生物、外来物质或佐剂相互作用产生的危险信号的刺激，通过其抗原呈递功能产生的高特异性和放大的反应，在淋巴结中协调一种效应子免疫反应。

提供一个经皮免疫(经皮免疫)的系统，它在人或动物中诱导免疫反应(例如对抗原特异的体液和/或细胞效应子)。此传送系统提供简单的，在皮肤外应用制剂的方法，此制剂由至少一种佐剂和一种或多种人或动物受试者皮肤的抗原组成(Glenn et al.，J.Immunol.，161：3211-3214，1998a；Glenn et al.，Nature，391：851，1998b；Glenn et al.，Nature Med.，6：1403-1406，2000；Hammond et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.，43：45-55，2000；角质层harton-Kersten et al.，Infect.Immun.，68：5306-5313，2000)。因此，只要没有穿透皮肤真皮层，在用或不用化学和/或物理渗透增强的情况下诱导抗原特异性免疫反应。这个传送系统也可与肠内、粘膜或其它胃肠外免疫技术联合使用。因此，在此描述的贴剂技术可用于人和动物的治疗，例如免疫治疗和免疫保护：治疗性地治疗现有疾病、保护性地预防疾病、减轻疾病的严重性和/或缩短疾病的持续时间、改善疾病的一种或多种症状、或者这些的组合应用。

目前尚不清楚抗原所利用的穿过角质层的途径。角质层是药物和抗原通过皮肤传送的主要障碍。普遍认为极性药物的经真皮传送是通过角质细胞间形成的水性细胞间通道进行的(《经真皮和局部药物传送系统》，Eds.Ghosh et al.，Buffalo Grove：Interpharm Press，1997)。尽管角质层对渗透来说是一个限制性障碍，但它是被毛囊和汗腺导管穿破的。抗原是直接穿透过角质层，还是经过表皮附器通过可能依赖于宿主的因素。认为这些附器在经真皮药物传送中只起较小的作用(Barry et al.，J.Control Rel.，6：85-97，1987)。尽管小鼠中的一些证据表明应用DNA的经皮免疫可利用毛囊作为皮肤渗透的途径(Fan et al.，Nature Biotechnol.，17：870-872，1999)，但强烈的免疫反应更可能利用较大的皮肤表面积。因为仅仅通过皮肤的水化作用就可破坏角质层屏障(Roberts et al.，In：Pharmaceutical Skin Penetration Enhancement，Eds.Walters et al.，New York：Marcel Dekker，1993)，所以经皮免疫就应用了这种情况。

一种或多种佐剂、抗原和抗原呈递细胞的活化可促进免疫反应的诱导。抗原呈递细胞处理抗原，然后将一种或多种表位呈递给淋巴细胞。活化可促进制剂与抗原呈递细胞(例如：朗罕氏细胞、其它树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞)之间的接触、抗原呈递细胞对此制剂的吸收、抗原呈递细胞对抗原的处理和/或对表位的呈递、抗原呈递细胞的迁移和/或分化、抗原呈递细胞与淋巴细胞之间的相互作用、或者上述的组合。佐剂本身可激活抗原呈递细胞。例如，趋化因子可募积和/或活化抗原呈递细胞至一个位点。特别是，抗原呈递细胞可从皮肤迁移至淋巴结，然后将抗原呈递给淋巴细胞，由此诱导抗原特异性免疫反应。另外，此制剂可直接与识别抗原的淋巴细胞接触，由此诱导抗原特异性免疫反应。

除了引起导致抗原特异性B细胞和/或T细胞群体(包括抗体和细胞毒T淋巴细胞(CTL))活化和/或扩大的免疫反应外，通过应用经皮免疫影响抗原特异性辅助细胞(Th1和/或Th2)或延迟型超敏反应T细胞亚群(T_DTH)，本发明可正向和/或反向调节免疫系统的一种或多种成分。所需要诱发的免疫反应优选是系统性或区域性的(例如粘膜)，但它通常不是不良的免疫反应(例如特应性、皮炎、湿疹、银屑病和其它变应性或过敏性反应)。如此处所见，所诱导的免疫反应在数量和质量上足以提供用于治疗疾病的治疗性或预防性免疫反应。

优选在此制剂皮外应用之前、期间或应用后即刻进行完整或已穿透皮肤的水化作用，而且它可能在某些或许多情况下需要。例如水化作用可将皮肤最顶层(例如角质层或渗透增强技术暴露的表浅表皮层)的水含量提高25％、50％或75％以上。可用10％甘油、70％异丙醇和20％水的水溶液水化皮肤。添加封闭敷料或半液体制剂(例如霜剂、乳剂、凝胶、洗剂、糊剂)的应用可增加皮肤的水化作用。例如，可将脂小泡或糖加入此制剂中，使液体或悬浮液变稠。只要不穿破真皮，水化发生时此制剂应用位点的角质层，也可能有一部分表皮，全部或至少一部分可有或无破裂。此目的是为了此制剂作用于皮肤抗原呈递细胞，而不是将制剂的免疫活性成分引入体循环，尽管此制剂的某些部分可在末梢位点起作用。

可用含有水化或化学渗透剂的涂药器(例如垫或棒上的吸附物质)拭抹皮肤，或者可直接将它们应用于皮肤。例如可应用水溶液(例如水、生理盐水、其它缓冲剂)、丙酮、醇(例如异丙醇)、去污剂(例如十二烷基硫酸钠)、脱毛剂或角质溶解剂(例如氢氧化钙、水杨酸、尿素)、湿润剂(例如甘油、其它二醇)、聚合物(例如聚乙二醇或丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮)、或者它们的组合，或者将它们加入此制剂中。类似地，摩擦皮肤(例如象指甲砂锉或砂纸的磨擦剂、沙纸、纤维垫、磨石)、除去皮肤的表层(例如用胶带去皮或剥离)、用能源(例如热、光、声、电、磁)或破屏装置(例如刀片、针、射弹、喷雾器、尖齿)使皮肤出现微孔，或者组合应用它们，这些可充当物理渗透增强方法。参见WO 98/29134、WO 01/34185和WO 02/07813；美国专利5,445,611、6,090,790、6,142,939、6,168,587、6,312,612、6,322,808和6,334,856对微型刀片或微型针、枪或喷雾注射器的描述，以及对可适合于经皮免疫的皮肤成微孔和技术的描述。化学或物理渗透增强与经皮免疫联合应用的目的是，在没有穿透皮肤真皮层的情况下，至少除去角质层，或者表皮层的表层或深层。优选在大多数情况下它对人或动物受试者有较小的不适，同时在作用位点不引起出血的情况下完成。例如，将此制剂应用于完整皮肤可以或可以不包括使热能、光能、声能或电磁能用于穿破角质层或表皮下的皮肤层。

WO 98/20734和99/43350中的经皮免疫的差别是全部角质层或其至少一部分是否破裂。此处所用的术语“渗透增强剂”是指应用于此制剂中时，在应用之前、应用期间或应用之后引起这种角质层破裂的那些化学品。根据它们所应用的强度(例如用足够的压力拭抹或摩擦)，某些化学品(例如醇)可能或者不能使角质层破裂。例如，包括醇，此制剂中的O/W或W/O乳剂、脂微胶粒或脂囊泡可增强同一制剂中一种或多种免疫活性成分通过完整皮肤的渗透性，而且同时使角质层没有可观察到的破裂。

还提供用于疫苗接种的制剂，以及它们的生产方法。此制剂可以是液体或半液体形式。例如，此制剂可以为液体形式：霜剂、乳剂、凝胶、洗剂、软膏、糊剂、溶液、悬浮液或其它液体形式。可通过风干；升高温度进行干燥；冷冻干燥或喷雾干燥；；涂或喷在固体物质上然后干燥；撒在固体物质上，快速冷冻，然后在真空下缓慢干燥；或者这些的组合，对制剂进行干燥，使制剂的水分含量较小。通过选择适宜的引发剂、加速剂或减速剂、以及终止剂，可将粘合剂制剂固化，使交联的量达到所需要的量。

“贴剂”指包括固体衬垫(例如封闭或不封闭外科敷料)，以及至少一种活性成分的产品。可将液体或半液体制剂加入贴剂中。这里，贴剂含有衬垫层、压敏粘合剂层和致免疫制剂。固体衬垫至少为衬垫层，但如果将它们适当地干燥和固化，粘合剂和致免疫制剂也可形成固体衬垫的部分。可将此致免疫制剂的一种或多种活性成分粘附在粘合剂层上，掺入粘合剂层中，或者两者组合进行。可形成这些层，然后粘附或层压在一起。

粘合剂层的水分含量大于0.5％、大于1％、大于2％，小于10％、小于5％、小于2％，及它们的中间范围。此贴剂为一个柔顺而呈平面的基底，大小约为1cm²至100cm²。单个贴剂含有有效量的蛋白。例如此贴剂含有的蛋白量可为1μg至1mg，5μg至500μg，10μg至100μg，或者它们的中间范围。特殊蛋白的有效量根据此蛋白的免疫学活性而不同。可将此蛋白贮存在防潮包装中(例如泡罩型包装、铝箔袋)，在室温下(例如20℃制30℃)贮存至少1或2年，并使此贴剂的免疫学活性保持在其初始活性的85％至115％之间。

液体或半液体形式的制剂可与一种或多种佐剂和/或抗原一起应用，可在同一位点或不同位点应用，或者同时或频繁重复应用。此贴剂可包括控释储器，或者可使用速率控制基质或膜，它可逐步地释放佐剂和/或抗原。它可含有含佐剂和/或抗原的单储器，或者含有将抗原和佐剂分开的多个储器。此贴剂可包括附加的抗原，这样应用此贴剂可诱导对多抗原的免疫反应。在这种情况中，抗原可来源相同，或者可以来源不同，但是它们将具有不同的化学结构，以便诱导对于不同抗原的特异免疫反应。可同时应用多个贴剂；单个贴剂可含有多个储器。为了获得有效地治疗，可在一段时间内间断或不断地应用多个贴剂；可在不同的时间、部分重叠的时间或者同时应用它们。

也可在此制剂中掺入固体(例如纳米或微米大小的颗粒)。固体形式(例如纳颗粒或微颗粒)可有助于活性成分的分散或增溶；辅助将此制剂运送过皮肤的表层；为佐剂、抗原或两者在可被抗原呈递细胞调理的基底上提供附着点，或者这些情况的组合。可将水溶液中不溶解或溶解性差的成分配制在乳剂、脂囊泡或微胶粒中。

可在适当的生物制品和疫苗的管理机构(例如食品药品监督管理局)可接受的条件下生产此制剂。可选择地，象结合剂、缓冲剂、着色剂、干燥剂、稀释剂、湿润剂、防腐剂、稳定剂、其它赋形剂、粘合剂、增塑剂、增粘剂、增稠剂、贴剂原料的成分，或它们的组合可包括在此制剂中，即使它们在免疫学上是无活性的。但是，它们具有其它所需要的特性或特点，这些可提高此制剂的有效性。

提供了适宜给药的单个或单位剂量的制剂。单位剂量中佐剂或抗原的量可在约0.001μg至10mg较宽的范围内任意选择。此范围可为约0.1μg至1mg；较窄的范围约为5μg至500μg。其它适宜的范围在约1μg至10μg之间，在约10μg至50μg之间，在约50μg至200μg之间，以及在约1mg至5mg之间。毒素优选的剂量约为50μg或100μg，或者更小(例如约1μg至50μg或100μg)。抗原与佐剂的比例可约为1∶1(例如ADP-核糖基化外毒素，当它既是抗原，又是佐剂时)，但是较高的比例可适于较差的抗原(例如约1∶10或更小)，或者也可应用较小的抗原/佐剂比例(例如约10∶1或者更高)。

可将含有佐剂和抗原或多核苷酸的制剂应用于人或动物受试者的皮肤，将抗原呈递给免疫细胞，并诱导抗原特异性免疫反应。这可发生在病原体感染之前、期间或者之后。如果此制剂的致免疫性足以不需要佐剂活性，所需要的可仅仅是抗原或多核苷酸编码抗原，而不需要附加的佐剂。此制剂可包括附加的抗原，这样应用此制剂可诱导对多抗原(即多价)的免疫反应。在这种情况下，抗原可来源相同，或者可以来源不同，但是它们将具有不同的化学结构，以便诱导对于不同抗原的特异免疫反应。抗原特异性淋巴细胞可参与在此免疫反应中，而且在B淋巴细胞参与的情况下，抗原特异性抗体可为免疫反应的一部分。上面描述的制剂可包括本领域中已知的结合剂、缓冲剂、着色剂、干燥剂、稀释剂、湿润剂、防腐剂、稳定剂、其它赋形剂、粘合剂、增塑剂、增粘剂、增稠剂和贴剂原料。

本发明用于治疗受试者(例如需要接受治疗的人或动物，诸如疾病的预防、防止感染的影响、现有疾病或症状的治疗、或者它们的组合)。除了感染外的疾病包括癌症、变态反应和自身免疫性疾病。当抗原源于病原体时，此治疗可使受试者获得预防接种，以预防此病原体的感染，或者预防其病原效应，诸如毒素分泌所引起的那些效应。本发明可用于治疗性地治疗现有疾病，保护性地预防疾病，减轻疾病的严重性和/或缩短疾病的持续时间，改善疾病的症状，或者它们的组合。

可用抗炎皮质类固醇，诸如氢化可的松、氟羟强的松龙和莫米他松，或者非甾类抗炎药物(NSAID)保护应用位点，以减轻可能的局部皮肤反应或调节免疫反应的类型。类似地，抗炎类固醇或NSAID可包括在此贴剂原料、或液体或固体制剂中；而且，皮质类固醇或NSAID可在免疫之后应用。可使用IL-10、TNF-α、其它免疫调节剂替代抗炎药物。而且，既可用单帖，也可用多帖，将此制剂粘附于皮肤，覆盖在大于一个引流淋巴结的区域上。此制剂可包括附加抗原，这样可诱导对于多抗原的免疫反应。在这种情况下，抗原可来源相同，或者可以来源不同，但是它们将具有不同的化学结构，以便诱导对于不同抗原的特异免疫反应。多室贴剂可使多价疫苗获得更有效的传送，因为每个室覆盖不同的抗原呈递细胞。因此，抗原呈递细胞将仅仅与一个抗原相遇(有或无佐剂)，并且可排除抗原竞争，因此可增强对多价疫苗中每单个抗原的反应。

可在皮外将此制剂应用于皮肤，以刺激或增强免疫反应，并与穿透技术或者其它免疫途径联合，或者不联合使用。在用单帖或用多帖的经皮免疫的引发之后，可应用肠内、粘膜、经真皮和/或其它胃肠外技术，以增强相同或不同抗原诱导的免疫。在用肠内、粘膜、经真皮和/或其它胃肠外途径用单一或多次应用后，可用具有相同或不同抗原的经皮免疫技术以增强免疫反应。应当注意到经皮免疫与诸如经粘膜或经真皮免疫等的常规局部技术完全不同，这是因为其前者需要的粘膜(例如肺、口腔、鼻腔、直肠)在皮肤中没有，而后者需要穿透皮肤的真皮。此制剂可包括附加抗原，使得应用到皮肤，这样可诱导多抗原的免疫反应。

除了抗原和佐剂外，此制剂可包含载体。例如，此制剂可包含AQUAPHOR，Freund，Ribi，或Syntex乳剂；油包水乳剂(例如水性霜剂，ISA-720)、水包油乳剂(例如油性霜剂，ISA-51，MF59)、微乳状液、无水类脂和水包油乳剂、其它类型的乳剂；凝胶、脂肪、蜡、油、硅氧烷和湿润剂(例如甘油)。

抗原可来源于感染人或动物受试者的任何病原体(例如细菌、病毒、真菌或原虫)、变应原和自体抗原。可将抗原的化学结构描述为一种或多种碳水化合物、脂肪酸和蛋白(例如糖脂、糖蛋白、脂蛋白)。优选蛋白质抗原。抗原的分子量可大于500道尔顿、800道尔顿、1000道尔顿、10千道、100千道或1000千道(包括其中间范围)。对于大分子结构，如细胞、病毒颗粒和大于1兆道的分子，可优选化学或物理渗透增强作用，但是象水化和用溶剂擦拭的技术足以诱导皮肤的免疫。抗原可通过重组技术、化学合成或从天然抗原至少部分纯化而获得。它可以是化学或重组缀合物：例如化学反应基团之间的键合或蛋白融合。抗原可提供为活细胞或病毒、减毒的活细胞或病毒、死亡的细胞或者灭活的病毒。可替代地，可将抗原至少部分纯化为非细胞形式(例如细胞或病毒溶解产物、膜或其它亚细胞成分)。因为大多数佐剂也将具有致免疫活性，并被认为是抗原，所以也将期望佐剂具有前面所述的抗原的特性和特征。例如，可应用相同的技术制备佐剂和抗原(见上文)。

佐剂的选择可允许免疫反应的增强或调节。而且，选择适宜的佐剂可引起体液或细胞免疫反应、特异性抗体同位型(例如IgM、IgD、IgA1、IgA2、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4)和/或特异性T细胞亚群(例如CTL、Th1、Th2和/或T_DTH)的优先诱导。优选佐剂为化学致活(例如蛋白酶水解)或基因致活(例如熔合、删除或点突变)的ADP-核糖基化外毒素或其B亚基。

“抗原”是此制剂的活性成分，在免疫或接种后它可被人或动物受试者的免疫系统特异性地识别。抗原可含有单个或多个被B细胞受体(即分泌型或膜结合抗体)或T细胞受体识别的致免疫表位。根据它们是否与抗原呈递细胞上I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，T细胞受体识别的蛋白质表位具有典型的长度和保守的氨基酸残基。相反，抗体识别的蛋白质表位可有不定的长度，包括短的伸展寡肽和较长的折叠多肽。表位之间单个的氨基酸差异可以是明显的。此抗原可具有诱导针对病原体分子、变应原物质或哺乳动物宿主(例如自身抗原、肿瘤抗原、免疫系统的分子)的免疫反应的能力。对于免疫调节，其分子可为变应原、自身抗原、其内部影像(internalimage)或免疫系统的其它成分(例如B或T细胞受体、它们的共同受体或配体，它们的可溶介质或受体)。因此，抗原通常完全相同，或者至少来源于此分子的化学结构，但是使用与这种化学结构不紧密相关的模拟物也可获得良好的结果。

“佐剂”是此制剂中的一个活性成分，它辅助诱导针对抗原的免疫反应。通过将佐剂本身包括在制剂中或与制剂中的其它成分联合应用，或者通过特定的免疫技术，佐剂的活性是能够增强针对异种抗原(即与佐剂化学结构完全不同的佐剂)的免疫反应。如上所述，通过将抗原和佐剂进行化学缀合，或者基因上融合抗原和佐剂的编码区，一个分子可含有抗原和佐剂两者的活性；因而此制剂可只含有一个组分或成分。某些天然蛋白，诸如CT和LT，均具有佐剂和抗原两者的特性；已知某些重组蛋白具有相似的特性(LeIF)；某些非蛋白佐剂也可诱导针对它们自己的抗体，诸如LPS或脂质A。这种佐剂和抗原特性的联合可用于诱导保护性免疫反应。例如，LT抗体是ETEC的保护性抗体，LeIF免疫反应在利什曼病的证明中是有效的，以及LPS抗体可在革兰氏阴性微生物引起的疾病中起保护作用。

术语“有效量”的含义是描述诱导抗原特异性免疫反应的佐剂或抗原的量。“亚单位”免疫原或疫苗是由活性成分(例如佐剂、抗原)组成的制剂，这些活性成分是通过重组技术、化学合成或由天然来源至少部分纯化，从病原体的其他细胞或病毒成分(例如膜或多糖成分如内毒素)中已经分离出来。

诱导免疫反应可为受试者提供治疗，例如免疫保护、脱敏、免疫抑制、自身免疫疾病的调节、肿瘤免疫监视的加强、预防疾病的预防性免疫接种和改善现有疾病的治疗性免疫接种。当一个“诱导”产品或方法的存在与缺乏时，引起免疫反应的大小和/或动力学上的改变存在统计学意义；免疫系统被诱导成分(例如体液与细胞免疫、Th1与Th2)发生改变；影响疾病症状的严重性和/或数量；影响受试者的健康和舒适(即发病率和死亡率)；或者这些情况的组合。

本发明所用的术语“引流淋巴结区”指所收集的淋巴通过一组规定的淋巴结(例如颈部、腋窝、腹股沟、肱骨内上髁、腘窝、腹部和胸部的淋巴结)进行过滤的解剖区。因此，如果免疫的位置和时间可使此制剂中不同成分可适当地放在一起，那么在需要抗原呈递细胞迁移至这些淋巴结的数日内，相同引流淋巴结区可成为免疫(例如肠内、粘膜、经皮、经真皮、其它胃肠外)的靶位(例如，当两个或是佐剂或是抗原的贴剂单独使用无效时，将两者同时紧挨着使用可是有效的)。例如，在老年、儿童或其它免疫应答人群中为提高常规疫苗的有效性，可在疫苗注射的同时，通过经皮技术，将传送佐剂的贴剂贴在注射疫苗的同一手臂上。相反，将贴剂贴在不同的四肢上，可防止含佐剂的贴剂提高仅含抗原贴剂的有效性。

未受到实施本发明的任何理论的限制，仅仅是为了解释我们所观察到的现象，我们假设这种经皮传送系统将抗原传递给免疫系统的细胞，在此诱导免疫反应。此抗原可通过皮肤正常存在的保护性外层(即角质层)，并直接诱导免疫反应，或者通过表皮中的抗原呈递细胞群(例如巨噬细胞、组织巨噬细胞、朗罕氏细胞、其它树突状细胞、B淋巴细胞或枯否细胞)，将处理的抗原呈递给淋巴细胞。因此，与进行皮下注射或经真皮技术一样，对于经皮免疫来说，有或无渗透增强技术，都不穿透真皮。可选择地是，此抗原可通过毛囊或皮肤附属器(例如汗腺、皮脂腺)穿透角质层。

例如，应用细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)的经皮免疫可靶向表皮朗罕氏细胞，已知它是最有效的抗原呈递细胞(抗原呈递细胞)。可通过形态学和表型(例如II类MHC分子、CD83或共同刺激分子的表达)评价抗原呈递细胞的成熟。我们已经发现，当在皮外将bARE应用于完整的皮肤时，它可活化朗罕氏细胞。诸如胰蛋白酶-裂解bARE的佐剂可增强朗罕氏细胞的活性。朗罕氏细胞引起特异性免疫反应是通过抗原的吞噬作用，以及向淋巴结迁移，并在此处朗罕氏细胞充当抗原呈递细胞，将抗原呈递给淋巴细胞进行的，而且由此诱导有效的抗体反应。尽管通常认为皮肤对病原体来说是一种屏障，但是通过所设计的引起对抗生物体的免疫反应的遍布表皮的众多朗罕氏细胞可证明这种屏障的缺陷。按照Udey(Clin.Exp.Immunol.，107：s6-s8，1997)：

朗罕氏细胞是来源于骨髓的细胞，它存在于所有哺乳动物的复层鳞状上皮中。它们包括未发炎表皮中所有辅助细胞活性，而且现有形态对于针对皮外所用抗原的免疫反应的引发和增殖是必需的。朗罕氏细胞是有效辅助细胞(“树突状细胞”)家族中的成员，它们广泛分布在上皮和实体器官中，以及淋巴组织中，但是很少提及它们。

现在认识到，朗罕氏细胞(和推测的其它树突状细胞)的生活周期具有至少两个不同的阶段。位于表皮的朗罕氏细胞构成一个规则的抗原捕捉“警戒”细胞网络。表皮朗罕氏细胞可摄取微粒，包括微生物，并且还是复合抗原的高效处理器。然而，它们仅表达低水平的I类和II类MHC抗原与共同刺激分子(ICAM-1、B7-1和B7-2)，而且是未刺激T细胞较差的刺激者。与抗原接触后，某些朗罕氏细胞被活化，退出表皮，迁移至区域淋巴结的T细胞依赖区，在此它们聚集，并成为成熟的树突状细胞。在退出表皮并迁移至淋巴结的过程中，结合抗原的表皮朗罕氏细胞(现在的“信使”)在形态学、表面表型和功能上出现戏剧性的变化。与表皮朗罕氏细胞形成对比，淋巴树突状细胞必需是无吞噬作用的，而且在处理蛋白抗原方面无效，但可表达高水平的I类和II类MHC抗原以及各种共同刺激分子，而且是已被识别的幼稚T细胞最有效的刺激物。

为了经皮传送免疫原和疫苗，可开发朗罕氏细胞有效的抗原呈递能力。可通过将制剂只传送给角质层(即皮肤的最外层，由角化细胞和脂质组成)的朗罕氏细胞，而获得应用皮肤免疫系统的免疫反应，并在随后活化朗罕氏细胞，以捕捉抗原，迁移至B细胞小囊和/或T细胞依赖区，并将抗原呈递给B和/或T淋巴细胞。如果除了bARE外的抗原(例如毒素、定居因子或毒力因子)被朗罕氏细胞吞噬，然后这些抗原也可被传送给淋巴结，呈递给T淋巴细胞，随后诱导针对这些抗原的免疫反应。因此，经皮免疫的一个特征是朗罕氏细胞的活化，推测是通过bARE或其衍生物、趋化因子、细胞因子、PAMP或其它朗罕氏细胞的活化物质(包括接触致敏物和佐剂)进行活化。增加皮肤朗罕氏细胞总数或它们的活化状态也将认为可增强免疫反应(例如丙酮预处理)。在老年受试者或朗罕氏细胞减少的皮肤中(即由UV损伤引起)，朗罕氏细胞的总数可重新补足(例如维A酸预处理)。

已知当诸如bARE的佐剂进行系统注射或给药时，它们具有很高的毒性。已经表明，当LT充当佐剂时，真皮内注射可诱导持续性小结节(Guy et al.，Vaccine，17：1130-1135，1999)。但是如果将它们置于完整皮肤表面时(即皮外应用)，它们不可能引起系统毒性。因此，经皮途径可发挥佐剂效应的优势，而且没有系统毒性。如果仅仅穿透至角质层下面(例如接近或位于表皮)，而没有通过真皮，那么可认为类似地没有毒性。因此，通过皮肤诱导免疫系统活化的能力可在不引起系统毒性的情况下诱导有效的免疫反应。

通常，亲和力成熟和主要转换为IgG抗体的同种型诱导的抗体反应的大小是在T细胞辅助下达到的，而且IgG1和IgG2a的产生提示Th1和Th2途径均被激活。可选择地是，1型胸腺非依赖抗原(TI-1)可诱导大的抗体反应，TI-1可直接活化B淋巴细胞，或者对B淋巴细胞具有相似的活化作用，诸如II类MHC、CD25、CD40、B7-1/CD80、B7-2/CD86和ICAM-1分子的增量调节。

通常所知的皮肤免疫反应的代表是特应性和接触性皮炎。接触性皮炎是一个朗罕氏细胞活化的致病表现，它是由朗罕氏细胞引起的，朗罕氏细胞吞噬抗原，迁移至淋巴结，呈递抗原，并使T淋巴细胞致敏，此T淋巴细胞迁移至皮肤，并在受影响的皮肤处引起强烈有害的细胞反应。通常知道这种反应与抗原特异性IgG抗体无关。特应性皮炎同样可应用朗罕氏细胞，但与Th2细胞有关，而且通常与高水平IgE抗体相关。

另一方面，应用bARE的经皮免疫提供有用而需要的免疫反应。通常未发现被诱导的高水平IgG引起的典型的特应性或接触性皮炎。霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定肠毒素在皮外应用于皮肤时，可在免疫后24、48和120小时无淋巴细胞浸润的情况下获得免疫。临床前和临床试验中所发现的较小皮肤反应容易得到治疗。此提示经皮免疫中应用朗罕氏细胞，这是因为它们“含有未发炎表皮中所有辅助细胞活性，而且现有形态对于针对皮外所用抗原的免疫反应的引发和增殖是必需的”(Udey，1997)。高水平抗原特异性IgG抗体和所产生的抗体类型(例如IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA)，以及通常无抗原特异性IgE抗体也都提示这里的经皮免疫反应的唯一性。如果抗原呈递细胞和T淋巴细胞充分的活化是在与特应性或接触性皮炎同时存在的经皮反应中发生，那么认为经皮免疫可与皮肤炎症一前一后地出现。

朗罕氏细胞的经皮导向也可与使其抗原呈递功能全部或部分失活的药物一前一后地应用，以此减轻免疫或防止致敏。调节朗罕氏细胞活化或其它皮肤免疫细胞的技术包括，例如，抗炎类固醇或非类固醇药物(NSAID)的应用；环孢菌素、FK506、雷怕霉素、环磷酰胺、糖皮质激素或其它免疫抑制剂的应用；白介素10的应用；白介素1单克隆抗体(mAB)或可溶受体拮抗剂(RA)的应用；白介素1转化酶(ICE)抑制剂的应用；或者通过超级抗原的耗竭，诸如通过葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导表皮朗罕氏细胞的耗竭。应用类似的化合物可减轻朗罕氏细胞的天然反应，并诱导不同的T辅助细胞的反应(Th1或Th2)，或者可用于调节皮肤炎症反应，以降低这种免疫潜在的副作用。类似地，在免疫之前、期间或之后，通过单独地应用免疫抑制剂或者通过免疫抑制剂与此制剂共同使用，可对淋巴细胞进行免疫抑制。例如，应用正常情况下引起变应性或刺激性接触过敏症的药物可能诱导有效的系统保护性免疫反应，而加入ICE抑制剂可减轻皮肤的不良反应。

抗原

经皮免疫系统传送药物给产生免疫反应的特定细胞(例如抗原呈递细胞、淋巴细胞)。作为一类的这些药物称为抗原。抗原可由化学结构组成，这些化学结构例如为糖类、糖脂、糖蛋白、脂类、脂蛋白、磷脂、多肽、它们的缀合物或者是已知可诱导免疫反应的任意其它原料。抗原可与载体缀合。抗原可以是一个完整的有机体，例如细菌或病毒颗粒；可从提取液或溶解产物中获得抗原，既可以从整个细胞中获得，也可以单独从细胞膜上获得；或者可化学合成抗原，或通过重组技术生成抗原。通过溶解或分散可将抗原掺入一个制剂中。

本发明的抗原可通过重组技术进行表达，优选为一个具有亲和性或附加表位的融合体；本发明的抗原可通过应用寡肽的化学合成而获得，或是游离的，或是与载体蛋白缀合。寡肽被认为是多肽的一种类型。优选6至20个残基长度的寡肽。多肽也可合成为支链结构。抗原性多肽包括：例如，合成或重组B细胞和T细胞表位、通用T细胞表位和混合的来自一个有机体或疾病的T细胞表位和来自另一个的B细胞表位。可通过抗原的物理和化学特性，优选通过分馏或色谱法，对经重组技术或肽合成获得的抗原，以及由天然来源或提取物获得的抗原进行纯化。重组物可联合抗原片段，或者可将它们融合至嵌合体中。可应用多价抗原制剂同时诱导针对一个以上抗原的免疫反应。缀合物可用于诱导针对多抗原的免疫反应，用于增强免疫反应，或者可用于两者。经皮免疫可用于增强其它免疫途径起始诱导的反应，诸如口服、经鼻或其它胃肠外途径。这种口服/经皮或经皮/口服免疫对增强疾病中粘膜的免疫性尤其重要，在这里粘膜的免疫性与防护相关。

可将抗原溶解在缓冲液或水或者诸如醇或DMSO的有机溶剂中，或者掺入凝胶、乳剂、脂质微胶粒或脂囊泡、霜剂中。适宜的缓冲液包括，但不限于，不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、生理盐水(水中含150mM NaCl)和Hepes或Tris缓冲液。可将不溶于中性缓冲液的抗原溶解于10mM乙酸中，然后用诸如PBS的中性缓冲液将其稀释至所需要的量。在抗原仅溶于酸性pH的情况下，酸性pH下的乙酸盐-PBS可在溶解于稀释乙酸后用作稀释剂。二甲亚砜和甘油可为本发明适宜应用的非水性缓冲液。

可将疏水抗原溶解于去污剂或表面活性剂，例如一个含有跨膜功能域的多肽。而且，对于含脂质体的制剂，去污剂溶液中的抗原(例如细胞膜提取物)可与脂质混合，然后通过稀释、透析或柱色谱法除去去污剂，可形成脂质体。某些抗原(例如膜蛋白)本身不需要溶解，但可将其直接插入一个脂质膜(例如病毒体)，单独的病毒颗粒悬浮液，或者微球体或可被活化抗原呈递细胞捕获(例如调理)的热灭活细菌的悬浮液中。抗原也可与WO 99/43350中所述的渗透增强剂混合。

在本领域中已知有许多抗原可用于对人或动物受试者进行预防接种，并诱导针对特殊病原体的特异免疫反应，还已知制备抗原、测定抗原适宜剂量、分析免疫反应的诱导、治疗病原体(例如细菌、病毒、真菌或原虫)引起的感染的方法。环境和食物变应原，以及哺乳动物宿主(例如人、动物)的自身抗原都不是来源于病原体的抗原的实例。用于生产经皮免疫的制剂和疫苗的抗原可是天然产物本身、它们的基因工程或化学合成形式、它们的片段、融合物或缀合物。通常免疫反应将只识别抗原的一个部分(例如一种或多种致免疫表位)。

Plotkin和Mortimer(Vaccine，2nd Ed.，Philadelphia：W.B.Saunders，1994)提供的抗原可用于对人或动物进行免疫接种而针对诱导特殊病原体的特异性免疫反应，还提供了制备抗原、测定抗原适宜剂量、分析免疫反应的诱导以及治疗病原体引起的感染的方法。

细菌包括，例如：炭疽、弯曲菌属、霍乱弧菌、包括难辨梭状芽胞杆菌的梭状芽胞杆菌、白喉、肠出血大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、贾第虫属、淋病球菌、幽门螺旋杆菌、B型流感嗜血杆菌、未分型流感嗜血杆菌、军团菌、脑膜炎双球菌、包括引起肺结核、百日咳的分枝杆菌、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、葡萄球菌、A族β溶血性链球菌、B族链球菌、破伤风菌、布氏疏螺旋体和耶尔森菌属。它们的产物可用作抗原。抗原包括，例如，毒素、类毒素、它们的亚单位或者它们的组合；毒力因子或定居因子；以及产物。

病毒包括，例如：腺病毒、血清型1至4型登革热病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、汉坦病毒、血清型A至E型肝炎病毒、1或2型单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、流感病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、日本马脑炎病毒、乳头状瘤病毒、B19细小病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞体病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、圣路易斯脑炎病毒、牛痘病毒、含诸如疟疾抗原的其它抗原基因编码的病毒表达载体、水痘病毒和黄热病病毒。病毒产物或其衍生物可用作抗原的来源。

真菌包括引起体癣、甲癣、孢子丝菌病、曲菌病的实体、念珠菌和其它致病真菌。真菌产物或其衍生物可用作抗原的来源。

原虫包括，例如：痢疾阿米巴、疟原虫、利什曼原虫和寄生虫；血吸虫；以及它们的产物。原虫产物或其衍生物可用作抗原的来源。

特别有利的是进入或通过粘膜表面的病原体，例如，放线菌属、气单胞菌属、芽胞杆菌属、类杆菌、博代氏杆菌属、布鲁氏杆菌属、弯曲菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、Clamy含药物粘合剂、梭状芽胞杆菌、棒状杆菌属、艾肯氏菌属、丹毒丝菌属、埃希氏杆菌属、梭形杆菌属、嗜血杆菌、克雷白氏杆菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、李司忒氏菌属、分直杆菌属、支原体属、奈瑟氏菌属、诺卡氏菌属、巴斯德氏菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、立克次氏体、沙门氏菌属、月型单胞菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属、弧菌属和Versinia细菌菌属中的致病物种；来自腺病毒、冠状病毒、疱疹病毒、正粘病毒、小RNA病毒、痘病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、轮状病毒等的致病病毒株；来自曲霉属、芽生菌、念珠菌属、球孢子菌、隐球菌属、组织胞浆菌属和藻菌菌属的致病真菌；以及艾美球虫属、内阿米巴属、贾第虫属和毛滴虫属等菌属中的致病原虫。

已将接种用作对肿瘤、变应性和自身免疫疾病的治疗。例如，用肿瘤抗原(例如HER2，前列腺特异抗原)接种可诱导抗体、CTL和淋巴细胞增生形式的免疫反应，这可使机体免疫系统识别并杀死肿瘤细胞。已经对用于接种的肿瘤抗原在白血病、淋巴瘤和黑瘤中的应用进行了描述。动物(例如鸟、猫、狗、啮齿动物)、蟑螂、跳蚤、螨和植物花粉(例如草、树)的变应原是已知的。应用T细胞受体或自身抗原(例如胰岛抗原)的接种诱导的免疫反应可阻止自身免疫疾病的发展。

佐剂

此制剂含有一种佐剂，尽管单分子可含有佐剂和抗原两者的属性(例如ADP-核糖基化外毒素)。因为大多数佐剂也可具有致免疫活性，并且可被看作是抗原，所以也可认为佐剂将具有上述属性和抗原的特性。例如，应用相同的技术可制备佐剂和抗原(见上)。

佐剂是可用于特异或非特异地增强抗原特异性免疫反应的物质，它可能是通过抗原呈递细胞(例如皮肤各层中的树突状细胞，尤其是朗罕氏细胞)的活化起作用的。也可参见Elson等的论述(《粘膜免疫学手册》，Academic Press，1994)。尽管活化一开始是发生在表皮或真皮中，但随着树突状细胞通过淋巴系统和循环的迁移，其作用可得到持续。在有或无抗原的情况下可配制并应用佐剂，但佐剂引起抗原呈递细胞的活化通常发生在抗原呈递之前。可选择的是，在短暂地间隔内可将它们分开应用，但需要定位在相同的解剖区域内(例如引流淋巴结区)。

佐剂包括，例如，趋化因子(例如防卫素、HCC-1、HCC-4、MCP-1、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1σ、MIP-3α、MIP-2、RANTES)；趋化因子受体的其它配体(例如CCR1、CCR-2、CCR-5、CCR-6、CXCR-1)；细胞因子(例如IL-1 β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12；IFN-γ；TNF-α；GM-CSF)；那些细胞因子的受体的其它蛋白配体，热激蛋白，以及它们的衍生物；eIF4a的利什曼原虫同系物及其衍生物；细菌的ADP-核糖基化外毒素及其衍生物(例如遗传突变体、含A和/或B亚单位片段、化学类毒素的变型)；含细菌ADP-核糖基化外毒素或其衍生物的化学缀合物或基因重组物；C3d串联排列；以及超级抗原。其它可用的佐剂也可参见Nohria等(Biotherapy，7：261-269，1994)和Richards等的(《疫苗设计》，Eds.Powell et al.，Plenum Press，1995)论述。

可选择佐剂以优先诱导抗体或细胞效应器，特异性抗体同种型(例如IgM、IgD、IgA1、IgA2、分泌IgA、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4)，或者特异性T细胞亚群(例如CTL、Th1、Th2和/或T_DTH)。例如，抗原呈递细胞可将II类局限抗原呈递给CD4⁺T细胞前体，并可进入Th1或Th2途径。主动分泌细胞因子的T辅助细胞是主要效应器细胞；如果它们是静息的，则它们是记忆细胞。记忆细胞的再活化产生记忆效应器细胞。Th1特征性地分泌IFN-γ(也可分泌TNF-β和IL-2)，并与细胞免疫的“辅助”相关联，而Th2特征性地分泌IL-4(也可分泌IL-5和IL-13)，并与体液免疫的“辅助”相关联。根据疾病病理，可选择佐剂以优选Th1反应(例如抗原特异性细胞溶解细胞)，而不优选Th2反应(例如抗原特异性抗体)。

大多数ADP-核糖基化外毒素(bARE)被组织为A∶B异二聚体，其B亚单位含有受体结合活性，其A亚单位含有ADP-核糖基转移酶活性。示例bARE包括霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、白喉毒素、假单胞菌属外毒素A(ETA)、百日咳毒素(PT)、肉毒梭状芽孢杆菌毒素C2、肉毒梭状芽孢杆菌毒素C3、泥渣梭状芽孢杆菌胞外酶、蜡状芽孢杆菌胞外酶、假单胞菌属外毒素S、金黄螺菌EDIN和球形芽孢杆菌毒素。可应用突变bARE，例如含有胰蛋白酶裂解位点的突变(例如Dickenson et al.，Infect Immun，63：1617-1623，1995)或影响ADP-核糖基化的突变(例如Douce et al.，Infect Immun，65：28221-282218，1997)。

通过CT、LT或其亚单位(例如CTB或LTB)的神经节苷脂GM1结合活性可完成经皮免疫。神经节苷脂GM1是在所有哺乳动物细胞中发现的普遍存在的细胞膜糖脂。当五聚体CT B亚单位结合于细胞表面时，亲水孔形成，它可使A亚单位插入并穿过脂质双层。可利用抗原呈递细胞上的其它结合靶位(例如ETA结合α2-巨球蛋白受体-低密度脂蛋白受体相关蛋白)。LT B亚单位结合于神经节苷脂GM1，以及其它神经节苷脂，而且其结合活性是皮肤上LT具有高致免疫性的原因。

应用bARE或含B亚单位片段或其缀合物进行经皮免疫，可能需要它们的神经节苷脂GM1结合活性。当用CT、CTA和CTB对小鼠进行经皮免疫时，需要CT和CTB诱导免疫反应。CTA含有ADP-核糖基化外毒素活性，但只有含有结合活性的CT和CTB可诱导免疫反应，此表明B亚单位对通过皮肤进行免疫是必须的，而且它足以通过皮肤进行免疫。我们得到的结论是结合于其细胞表面的CTB可活化朗罕氏细胞或其它抗原呈递细胞，引起经皮免疫反应。

尽管CT、LT、ETA和PT具有不同的细胞结合位点，但它们是经皮免疫的有效佐剂，包括IgG抗体，但不包括IgE抗体。无CT情况下，CTB也可诱导IgG抗体。因此，当bARE和其衍生物在皮外应用于皮肤时，两者均可有效地进行免疫。然而，作为佐剂和抗原的天然LT显然不如天然CT那样有效。但活化的bARE可充当经皮免疫系统中较弱致免疫抗原的佐剂。因此，应用一种或多种抗原的治疗性免疫可单独使用，或者与抗原呈递细胞的免疫刺激联合使用，以诱导预防性或治疗性免疫反应。

一般情况下，可对毒素化学灭活，形成类毒素，它的毒性较小，但保持致免疫性。我们想象应用基于毒素免疫原和佐剂的经皮免疫系统达到的抗毒素水平足以对这些疾病起保护作用。通过用这些毒素或它们本身的基因去毒类毒素，或者用类毒素和佐剂进行免疫可诱导抗毒素抗体。基因类毒素化毒素已改变了ADP-核糖基化外毒素活性或胰蛋白酶裂解位点，但，没有结合活性，可想象它们尤其可用作经皮免疫中所用的抗原呈递细胞的非毒性活化剂，而且可减小对毒素使用的顾虑。

BARE也可充当佐剂，以通过经皮免疫诱导抗原特异性CTL。此bARE佐剂可与其它抗原进行化学缀合，这些抗原包括，例如，糖类、多肽、糖脂和糖蛋白抗原。预期用毒素、它们的亚单位或类毒素与这些抗原进行化学缀合，可增强皮外应用这些抗原时的免疫反应。为了克服这些毒素的毒性难题(例如已知白喉毒素的毒性很强，一分子就可杀死细胞)，并克服使用诸如破伤风等有效毒素工作时的难题，几名工人已经使重组物接近产生基因生产的类毒素。这是根据通过基因缺失，使ADP核糖基转移酶的催化活性丧失。这些毒素仍保留结合能力，但没有天然毒素的毒性。预期这种基因类毒素化外毒素可诱导经皮免疫，并充当佐剂。因为类毒素被认为没有毒性，所以它们不会带来安全问题，这样它们在经皮免疫系统中是有优势的。然而，预期通过诸如胰蛋白酶裂解的技术进行活化，将会提高LT通过缺乏胰蛋白酶类酶的皮肤的佐剂的质量。另外，存在化学修饰毒素的几种技术，它们可解决这种难题。这些技术对某些应用很重要，尤其是儿科敷剂，在它们中摄取的毒素可能会引起副作用。

可由天然来源(例如pCT或pLT)通过生物化学技术纯化佐剂，或者通过重组技术生产佐剂(例如rCT或rLT)。或在蛋白水解(即活化)之前或在蛋白水解之后可对ADP-核糖基化外毒素进行提纯。也可使用ADP-核糖基化外毒素的B亚单位：在蛋白水解之后从天然酶进行提纯，或者由酶的整个编码区的一个片段生产。通过化学缀合或基因融合，可单独(例如CTB或LTB)或一起(例如CTA-LTB、LTA-CTB)使用ADP-核糖基化外毒素的亚单位。保持与其细胞膜受体结合能力的ADP-核糖基化外毒素片段，也可通过生物化学技术进行提纯，或通过重组技术进行生产，然后用它们替代B亚单位。

点突变(例如单、双或三氨基酸取代)、缺失(例如蛋白酶识别位点)和功能域分离的ADP-核糖基化外毒素也可用作佐剂。已经描述了较小毒性或丧失ADP-核糖基化活性，而保留佐剂活性的衍生物。大肠杆菌热不稳定肠毒素的特异性突变体包括LT-K63、LT-R72、LT(H44A)、LT(R192G)、LT(R192G/L211A)和LT(Δ192-194)。可用Y-1肾上腺细胞测定法(Clements and Finkelstein，Infect.Immun.，24：760-769，1979)测定毒性。可用NAD-胍丁胺ADP-核糖基转移酶测定法(Moss et al.，J.Biol.Chem.，268：6383-6387，1993)测定ADP-核糖基化作用。美国专利4,666,837、4,935,364、5,308,835、5,785,971、6,019,982、6,033,673和6,149,919中描述了特殊ADP-核糖基化外毒素，其衍生物，以及其生产方法和鉴定。

朗罕氏细胞的活化剂也可用作佐剂。这种活化剂的实例包括例如趋化因子、细胞因子、分化因子和生长因子(例如TGFβ超家族的成员)等的蛋白。

如果免疫抗原具有足够的朗罕氏细胞活化能力，那么可不需要单独的佐剂，如同既是抗原又是佐剂的LT那样。可选择的是，认为这种抗原可不需要佐剂，这是因为它们具有足够的致免疫性。应用低浓度朗罕氏细胞活化剂，在不引起皮肤损害的情况下诱导免疫反应，这样也是可能的。

增强佐剂活性的其它技术可是有效的，诸如将表面活性剂和/或磷脂加入此制剂中，通过ADP-核糖基化因子以提高ADP-核糖基化外毒素的佐剂活性。可应用一种或多种ADP-核糖基化因子(ARF)提高bARE的佐剂活性(例如ARF1、ARF2、ARF3、ARF4、ARF5、ARF6、ARD1)。类似地，一种或多种ARF可与ADP-核糖基化外毒素一起使用，以提高其佐剂活性。

在不破坏其经皮免疫中有效性的情况下，通过修饰可减少不需要的属性或有害的副作用(例如变应性或过敏反应；特应性、接触性皮炎或湿疹；系统毒性)。修饰可涉及，例如，除去可逆化学修饰(例如蛋白水解)，或者封装在一个包衣中，该包衣可将此制剂的一种或多种成分与免疫系统可逆地隔开。例如，可将此制剂的一种或多种成分封装在传送颗粒中(例如微球体、纳米颗粒)，尽管我们已表明对于经皮免疫，封装在脂囊泡中是不需要的，而且会有副作用。通过增量调节I类和/或II类MHC分子和/或共同刺激分子(例如CD40、象CD80和CD86的B7家族成员)的表达，颗粒的吞噬作用可增强抗原呈递细胞的活化。通过活化抗原呈递细胞而增量调节这种分子的可替代的方法也是已知的(见上文)。

制剂

生产药用制剂的方法是众所周知的。制剂的成分可与药物可接受的载体或赋形剂，以及任意组合的可选添加剂(例如至少一个粘合剂、缓冲剂、着色剂、干燥剂、稀释剂、湿润剂、防腐剂、稳定剂、其它赋形剂或它们的组合)结合在一起。一般参见《乌尔曼工业化学百科全书》，第6版(电子版，1998)；《雷明顿药物学》，第22版(Gennaro，1990，Mack Publishing)；《药物剂型》，第2版(许多编者，1989-1998，Marcel Dekker)和《药物剂型和药物传送系统》(Ansel等，1994，Williams & Wilkins)。

制药企业熟知GMP(药品生产管理规范)，GMP由政府机构(例如食品药品管理局(FDA))进行管理。通过将制剂中所要应用的成分溶解在足量的适宜溶剂中，可制备液体制剂。通常，通过将制剂的各种成分掺入含有分散介质的赋形剂中而制备分散体。为了从液体制剂生产固体形式，可在室温下或在烘箱中蒸发溶剂。将氮气或空气气流吹过表面，可促进干燥；可替代的是，可使用真空干燥或冷冻干燥。

生产各种剂型和贴剂产品的适宜方法是已知的。各剂量的大小和受试者的给药间隔可用于决定包装盒、包装间隔或包装室的适宜大小和形状。制剂可含有有效量的活性成分(例如至少一种佐剂和/或一种或多种抗原)，同时含有载体或适宜量的赋形剂，以提供适于人或动物应用的药物可接受的组合物。包括赋形剂的制剂可为霜剂、乳剂、凝胶、洗剂、软膏、糊剂、溶液、悬浮液或本领域所熟知的其它液体形式；尤其是提高皮肤水化作用的那些形式。对于贴剂，可将制剂的连续包衣涂在基底膜上，或者可层压含制剂的几层，以增加其含活性成分的容量。

可适当地调节一剂中活性成分的相对含量和给药方案，以将其有效地应用于受试者(例如动物或人)。这种调节可根据受试者的特别疾病或状况来进行，无论是要治疗还是预防。为了简化此制剂的给药，每个单位剂量所含活性成分的预定量将会完成单轮免疫。

存在众多引起蛋白不稳定或降解的原因，包括水解和变性。在变性情况中，蛋白的构象被打乱，而且此蛋白可从其通常的球形结构解折叠。不是重折叠为其天然构象，而是疏水作用可使分子团集在一起(即聚集作用)，或者使其重折叠为非天然构象。这些中的每个结果均可使抗原或佐剂活性减小或丧失。可加入稳定剂，以减少或防止这些难题。

可用保护剂(即冷冻保护剂和干燥稳定剂)对此制剂，或其产品中的中间体进行预处理，然后使其散热速率和终温度可使冰结晶的形成最小化。通过适当选择冷冻保护剂和应用预置的干燥参数，为了达到适宜的所需要的终应用，可将几乎任何制剂进行干燥。

应当认识到下面对可选添加剂的讨论是通过它们的功能来描述的，这些添加剂例如为粘合剂、缓冲剂、着色剂、干燥剂、稀释剂、湿润剂、防腐剂和稳定剂。因此，一个特殊化学品可充当上述添加剂的某些组合。这种化学品被认为是免疫学无活性的，因为它们不会直接诱导免疫反应，但通过提高抗原或佐剂的免疫学活性，它可增强免疫反应，例如，通过减少抗原或佐剂的修饰，或者干燥和水化循环过程中的变性。

稳定剂包括右旋糖酐和糊精；二醇，亚烷基二醇，聚链烷二醇和聚亚烷基二醇，糖和淀粉，以及它们的衍生物是适宜的。优选的添加剂是非还原糖和多元醇。特别是，可加入海藻糖，羟甲基或羟乙基纤维素，乙二醇或丙二醇，三甲基二醇，乙烯吡咯烷酮和它们的聚合物。碱金属盐，硫酸铵，氯化镁和表面活性剂(例如非离子去污剂)可稳定蛋白质佐剂或抗原；可选择的是，加入载体(例如琼脂、白蛋白、明胶、糖原、肝素)和冷冻干燥可进一步提高稳定性。通过将多肽与糖接触也可使多肽稳定，这里的糖例如为单糖、二糖、糖醇及其混合物(例如阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇)。多元醇可稳定多肽，并且是水混溶性的或水溶性的。各种其它赋形剂也可稳定多肽，包括氨基酸，脂肪酸和磷脂，金属，还原剂和金属螯合剂。此稳定剂可在粘合制剂的0.1％(w/v)至10％(w/v)之间或1％(w/v)至5％(w/v)之间。

通过适当选择稳定剂或其它赋形剂，可在聚(乳酸)(PLA)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球体中稳定单剂制剂。海藻糖用作添加剂会有优势，这是因为它是非还原糖，因此不会与有氨基的物质，诸如蛋白，发生氨基羰基反应。尽管象高浓度糖这样的稳定剂将对抗微生物的生长，诸如细菌和真菌，但防腐剂是典型的抗菌剂，它们可主动地消除(例如杀菌)或减少微生物的生长(例如抑菌)。抗氧化剂也可用于防止制剂中活性成分的氧化。

应认识到，以干燥非液体(即固体)形式应用于受试者的制剂或贴剂，可以贮存在不需要冷冻的条件下。抗原可与异种佐剂混合，置于敷料上形成一个贴剂，可将其完全干燥。然后，可将此干燥贴剂置于皮肤上，敷料与皮肤直接接触一段时间，并将其保持在覆盖了封闭衬垫层(例如塑料膜或蜡膜)的位置上。

贴剂材料可是无纺或纺织的(例如纱布敷料)。在加工过程中，也可对各层进行层压。它可是非封闭或封闭的，优选后者作衬垫层。可选释放衬垫所吸收制剂的量最好不明显，也许通过用硅氧烷或碳氟化合物处理薄膜可实现。优选此贴剂密封贮存(例如箔包装)。可将此贴剂保持在皮肤上，并且可应用各种粘合剂将此贴剂的成分保持在一起。一种或多种佐剂和/或抗原可应用于和/或掺入此贴剂的粘合部分中。通常，贴剂是平而柔顺的，并将制造成统一的形状。可选的添加剂：增塑剂可保持贴剂的柔顺性，增粘剂可辅助贴剂和皮肤之间的粘合，增稠剂至少在加工过程中可增加此制剂的粘性。

金属箔、纤维素、布料(例如醋酸盐、棉花、人造丝)、丙烯酸脂聚合物、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚酰胺(例如尼龙)、聚酯(例如聚亚乙基萘酯，对苯二酸亚乙酯)、聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯)、聚氨酯、聚偏二氯乙烯(SARAN)、天然或合成橡胶、硅氧烷高弹体和它们的组合也可为贴剂材料的实例(例如敷料、衬垫层、释放衬垫)。

粘合剂可为水基粘合剂(例如丙烯酸盐或硅氧烷)。可从几个商业来源得到丙烯酸粘合剂。丙烯酸聚合物可为C4-C18脂肪醇与异丁烯酸烷基酯的共聚物，或者是具有C4-C18烷基的异丁烯酸烷基酯、异丁烯酸和/或其它功能单体的共聚物。异丁烯酸烷基酯的实例可包括丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸辛酯、2-乙基己基丙烯酸酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸异癸酯、丙烯酸十二酯、丙烯酸十八酯、异丁烯酸甲酯、异丁烯酸乙酯、异丁烯酸丁酯、异丁烯酸异丁酯、2-乙基己基异丁烯酸酯、异丁烯酸异辛酯、异丁烯酸癸酯等。

功能单体的实例可包括含羟基的单体、含羧基的单体、含酰胺基的单体、含氨基的单体。含羟基的单体可包括异丁烯酸羟烷基酯，诸如：异丁烯酸2-羟乙酯、异丁烯酸羟丙酯等等。含羧基的单体可包括α-β不饱和羧酸，诸如丙烯酸、异丁烯酸等等；马来酸单烷基酯，诸如苹果酸丁酯等等；马来酸；富马酸；巴豆酸等等；以及无水马来酸。含酰胺基的单体的实例可包括烷基异丁烯酸酰胺，诸如丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、二乙基丙烯酰胺等等；烷基乙基羟甲基异丁烯酸酰胺诸如丁氧甲基丙烯酰胺、乙氧基甲基丙烯酰胺等等；双丙酮丙烯酰胺；乙烯吡咯烷酮；二甲基氨酰酯。除了上述用于共聚合的单体外，也可应用醋酸乙烯酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、乙烯、丙烯、丁二烯等等。

市售丙烯酸粘合剂的商品名为AROSET、DUROTAK、EUDRAGIT、GELVA和NEOCRYL。EUDRAGIT聚合物是一个多样性的聚合物家族，其共同特征是适合于胃肠道的聚丙烯或聚甲基丙烯主链，并且它们已广泛地应用于药物的制备，尤其是作为片剂的包衣，但它也已用作其它设计的包衣。EUDRAGIT聚合物的特征是(1)基于异丁烯酸和甲基异丁烯酸酯的阴离子共聚物，其中游离羧基与酯基的比例大约为1∶1，(2)基于异丁烯酸和甲基异丁烯酸酯的阴离子共聚物，其中游离羧基与酯基的比例大约为1∶2，(3)基于低含量四价铵基的丙烯酸和异丁烯酸酯的共聚物，其中铵基与剩余中性异丁烯酸酯的摩尔比为1∶20，以及(4)基于低含量四价铵基的丙烯酸和异丁烯酸酯的共聚物，其中铵基与剩余中性异丁烯酸酯的摩尔比为1∶40。此共聚物的商品名为EUDRAGIT L、EUDRAGIT S、EUDRAGIT RL和EUDRAGIT RS。EUDRAGIT E是一个基于二乙氨基乙基异丁烯酸酯和中性异丁烯酸酯的阳离子共聚物；EUDRAGIT NE是聚甲基丙烯酸酯的中性共聚物。对于异丁烯酸酯或丙烯酸酯聚合物，现有EUDRAGIT RS、EUDRAGIT RL和EUDRAGIT NE；也可应用EUDRAGIT RS-100、EUDRAGIT L-90、EUDRAGIT NE-30、EUDRAGIT L-100、EUDRAGIT S-100、EUDRAGIT E-100、EUDRAGIT RL-100、EUDRAGIT RS-100、EUDRAGIT RS-30D、EUDRAGIT E-100R和EUDRAGIT RTM。

另外，为了增大或减小粘合剂层的吸水能力，可将丙烯酸聚合物与亲水单体、含羧基的单体、含酰胺基的单体、含氨基的单体等等进行共聚合。橡胶树脂或硅氧烷树脂可用作粘合剂树脂；可将它们与增稠剂或其它添加剂一起掺入粘合剂层中。

可替代的是，也可通过掺入高吸水性聚合物、多元醇和吸水性无机原料调节粘合剂层的吸水能力。高吸水性树脂的实例可包括粘多糖，诸如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等等；分子中含有大量亲水基的聚合物，诸如壳多糖、壳多糖衍生物、淀粉和羧基甲基纤维素；以及高吸水性聚合物，诸如聚丙烯酸、聚环氧乙烷、聚乙烯醇和聚丙烯腈。可将吸水性无机原料掺入粘合剂层，而调节其吸水能力，其实例可包括粉状硅石、沸石、粉状陶瓷等等。

增塑剂可为柠檬酸三烷基酯，例如柠檬酸乙酰-三丁酯(ATBC)、柠檬酸乙酰-三乙酯(ATEC)和柠檬酸三乙酯(TEC)。此增塑剂可为粘合剂制剂的0.001％(w/v)至5％(w/v)。通过选择粘合剂层的柔顺性和防止脆性，可根据经验决定适宜的浓度。

增粘剂的实例为二醇(例如甘油、1，3-丁二醇、丙二醇、聚乙二醇)；可应用平均分子量为200、300、400、800、3000等的聚亚烷基二醇。丁二酸是另一种增粘剂。增粘剂可为粘合剂制剂的0.1％(w/w)至10％(w/w)。通过防止粘合剂层的脆性和柔顺性，可根据经验决定适宜的浓度。

可加入增稠剂，以增加粘合剂或致免疫制剂的粘性。增稠剂可为羟烷基纤维素或淀粉，或者水溶性聚合物：例如泊咯沙姆、聚环氧乙烷及其衍生物、聚乙烯亚胺、聚乙二醇和聚乙二醇酯。但用于增加溶液粘性的任意分子可能适于改善贴剂生产中制剂的处理。例如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素可为粘合剂或致免疫制剂的1％(w/w)至10％(w/w)。可将一层制剂薄膜铸塑或压出。然后在贴剂生产过程中可包被或层压各层。通过连续包被或将几个薄的粘合剂层层压在一起，可增加蛋白容量。可替代的是，在将象佐剂或抗原的免疫学活性成分的损耗最小化的情况下，可将粘性制剂涂在基底(例如衬垫或粘合剂层)上。市售增稠剂为NATROSOL羟乙基纤维素和KLUCEL羟丙基纤维素。

可将凝胶和乳剂系统掺入贴剂传送系统中，或者与贴剂分开生产，在应用于人或动物受试者之前将其加入贴剂中。凝胶或乳剂可达到促进生产的相同目的，它所提供的粘性制剂易于操作，而且损耗最小。术语“凝胶”指共价交联、非交联水凝胶基质。对于PIA贴剂，水凝胶可与至少一个具有免疫活性的蛋白一起配制。可将附加的赋形剂加入此凝胶系统中，以增强抗原/佐剂的传送，皮肤的水化作用，以及蛋白的稳定性。术语“乳剂”指诸如油包水霜剂、水包油霜剂、软膏和洗剂等制剂。乳剂系统可以为基于微胶粒的，或为基于脂囊泡的，或为基于微胶粒和脂囊泡两者的。乳剂系统可与至少一个佐剂和/或抗原一起配制为含蛋白粘合剂系统。可将附加的赋形剂加入此乳剂系统中，以增强抗原/佐剂的传送，皮肤的水化作用，以及蛋白的稳定性。

可在与受试者皮肤接触的贴剂中应用制剂。可用一个非封闭或封闭衬垫层将其覆盖，后者可防止蒸发并保持应用部位的水分。可将此制剂应用于单个部位或多个部位，应用于四肢的一或多个，或者应用于大面积的皮肤表面。可使用的其它基底是压敏粘合剂，诸如丙烯酸、聚异丁烯和硅氧烷。可将制剂直接掺入此基底中，也许可与粘合剂本身一起，而不是吸附在多孔垫(例如棉纱布)或胆汁条(例如纤维素纸)上。

可将此粘合剂和致免疫制剂至少部分地混合，或者甚至完全混合，然后将其粘附在衬垫层上。可将免疫学活性成分分散或溶解在此制剂中。可替代的是，通过使用Meyer棒将其涂敷或涂布在粘合剂上，铸塑一层，然后用滚子将其与粘合剂紧密地层压在一起，用轮转凹板影印将其印在粘合剂上等等，可将此致免疫制剂涂敷在粘合剂层的表面。粘合剂可与释放衬垫接触。粘合剂和致免疫制剂也可与显微刀片或显微针排或尖接触，这是通过包被，将此器械浸泡在此制剂中并干燥，或者用此制剂喷涂此器械进行的。

加入此制剂的聚合物可充当稳定剂或活性成分的其它赋形剂，还可减小使溶液饱和的活性成分的浓度，此溶液用于水化至少部分干燥形式(即干燥或半液态)的活性成分。因为此聚合物通过填充溶剂中空的空间而减小了有效的间隙体积，所以发生了这种减小。这样，在不减小饱和溶液量的情况下，可保存佐剂/抗原的量。一个重要的热力学观点是饱和溶液中的活性成分将被“驱赶”至较低浓度的区域(例如通过皮肤)。对于至少一种佐剂和/或一种或多种抗原的分散或溶解，聚合物也可稳定此制剂中那些成分的佐剂/抗原活性。这些聚合物包括乙二醇或丙二醇、乙烯吡咯烷酮和β-环糊精聚合物及共聚物。

经皮传送

此制剂经皮传送的靶位可为朗罕氏细胞，因此可获得有效的免疫。这些细胞在皮肤中很丰富，而且是有效的抗原呈递细胞，它们可引起T细胞记忆和有效的免疫反应。因为皮肤中存在大量的朗罕氏细胞，经皮传送的效率可与暴露于抗原和佐剂的表面积相关。事实上，经皮免疫比肌肉内免疫如此有效的原因可能是它的靶位是这些大量而有效的抗原呈递细胞。

在有或无化学或物理穿透的情况下，于完整皮肤的皮外应用单制剂的抗原和佐剂可获得免疫，可选择地覆盖一个封闭的敷料或应用其它贴剂技术。本发明的经皮免疫提供一个方法，通过它，抗原和佐剂可传送至免疫系统，尤其是皮肤下特定的抗原呈递细胞(例如象朗罕氏细胞那样的树突状细胞)。可将此贴剂戴30秒；1分钟至5分钟；或者小于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时或48小时。与经真皮传送药物的贴剂不同，本发明贴剂的释放特性不需要恒定或延续。优选将免疫活性蛋白快速而定量地释放。

而且，经皮免疫可优于应用皮下针的免疫，这是因为通过定位于较大皮肤表面积的几个部位，对准了更多的免疫细胞。可在单个皮肤位置，或者可在覆盖多个引流淋巴结区(例如颈部、腋窝、腹股沟、肱骨内上踝、腘窝、腹部和胸部)的皮肤上，经皮传送足以诱导免疫反应的治疗有效量的抗原。这些部位靠近全身大量不同的淋巴结，这样对免疫系统的刺激比小量抗原在单个部位通过真皮内、皮下或肌内注射更广泛。

通过或进入皮肤的抗原可遇到抗原呈递细胞，它可通过某种方式处理抗原而诱导免疫反应。多免疫位点可募集更大量的抗原呈递细胞，被募集的大量抗原呈递细胞可诱导更多的免疫反应。可认识到皮肤的应用可将抗原传送至皮肤的吞噬细胞，例如树突状细胞、朗罕氏细胞、巨噬细胞和其它皮肤抗原呈递细胞；也可将抗原传送至肝脏、脾脏和骨髓的吞噬细胞，已知它们可通过血流或淋巴系统充当抗原呈递细胞。

可用它们的脱唾液酸糖蛋白受体、甘露糖受体、Fcy受体CD64、IgE高亲和力受体或者其它高表达膜蛋白，特异性地定位朗罕氏细胞、其它树突状细胞、巨噬细胞或它们的组合。可将对那些受体任意特异的配体或抗体与佐剂、抗原或两者一起缀合或者重组为蛋白融合物。而且，佐剂、抗原或两者可与蛋白A或蛋白G缀合或重组为蛋白融合物，以定位于B淋巴细胞的表面免疫球蛋白。预想的结果将会是抗原广泛分配给抗原呈递细胞，其所达到的程度是目前免疫方法很少能达到的，如果目前方法曾经达到的话。

特异性免疫反应可包括体液(即抗原特异性抗体)和/或细胞(即抗原特异性淋巴细胞，诸如B淋巴细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CTL、Th1细胞、Th2细胞和/或T_DTH细胞)效应器功能。而且，免疫反应可包括NK细胞和介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的其它白细胞。

本发明制剂诱导的免疫反应可包括抗原特异性抗体和/或淋巴细胞的诱出。通过免疫测定技术可测定抗体。不同抗体同种型(例如IgM、IgD、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgE、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的测定可为系统或局部免疫反应的指征。还可通过中和试验测定免疫反应。抗体是由B淋巴细胞产生的保护性蛋白。它们具有高度特异性，通常其靶位是抗原的一个表型。免疫诱导的抗体可中和变应原、细胞入口受体、生长因子受体或毒素的生物活性。例如，诱导的抗体可治疗疾病，这是通过它与来源于病原体或肿瘤的抗原(例如霍乱毒素、HER2、流感血细胞凝集素)特异性地反应完成的。宿主中病原体感染或应用毒素的挑战性研究，免疫和对照人群之间发病率或死亡率的比较，或者另一临床标准(例如高抗体滴度或粘膜中IgA抗体分泌细胞的产生可用作替代标记)可证明对疾病的预防或对现有疾病的治疗。

CTL是用于防止病原体引发感染的免疫细胞。它们也是高度特异的。免疫可诱导抗原特异性CTL，此抗原可与自身主要组织相容性复合抗原相关。用经皮传送系统进行免疫而诱导的CTL可杀死感染病原体的细胞或肿瘤。抗体和CTL的加强反应，抗原刺激的淋巴细胞培养物的增殖，以及单独抗原真皮内皮肤刺激引起的迟发性超敏反应，均提示免疫也可产生记忆反应。

下面是对本发明的举例说明，并不是要将本发明限制或局限在下面实施例中。

实施例

含溶菌酶粘合剂制剂的稳定性

许多蛋白和大生物分子具有热不稳定性，以及化学不稳定性，此化学不稳定性由于pH因素或与众多化合物的不相容性造成的。许多粘合剂系统是溶剂中的溶剂化物，而这些溶剂对药物的稳定性是有害的。许多这种粘合剂聚合物所含功能基与许多反应分子不相容。另外，常规技术经常需要高温，以进行干燥、压出或粘合剂掺合。因此配制和加工这些化合物的含药物粘合剂系统非常困难。这里所述的制剂和加工方法可生产含蛋白粘合剂(PIA)系统，而且这些脆弱的分子不存在热或化学降解。此制剂也特别适于大分子量生物分子，这归因于粘合剂聚合物的水溶性特性，它使生物分子暴露于水时能进行释放。

将溶菌酶用作PIA制剂的模型蛋白。蛋白可为化学不稳定化合物，当经受热或各种溶剂或反应化学位点时，这些化合物可以聚集、降解或者变性。溶菌酶及其酶活性的测定使其成为一个需要稳定的良好的蛋白模型。

将溶菌酶用在2个水基粘合剂生产的贴剂上：将溶菌酶用在硅氧烷粘合剂上，也可将其用在贴剂上的丙烯酸粘合剂上。从20ml含粘合剂的水中提取蛋白1小时。在室温下贮存或在40℃下贮存过夜的硅氧烷-粘合剂贴剂中的溶菌酶回收率约为85％至90％，在室温下贮存的丙烯酸-粘合剂贴剂也是如此。测定基础溶菌酶，作为阳性对照，其回收率约为95％，活性约为107％(应用溶壁微球菌，通过溶菌酶反应动力学的UV光谱学和扫描监测，测定其生物活性)。从贴剂的粘合剂中提取的溶菌酶活性约为原始活性的100％至110％。

在室温下，用水作为基本溶剂，用液体增塑剂和乳化剂制备异丁烯酸粘合剂-KLUCEL增稠剂乳剂。证明此湿掺合物中溶菌酶的稳定性可持续7天以上。制备后不久包被此湿掺合物，然后用室温空气或氮气在非常接近此粘合剂表面的地方进行风干。根据溶菌酶生物活性所示，证明所得部分干燥含蛋白粘合剂的稳定性可持续30天以上。它也具有可接受的粘合剂和耐久特性。

含大肠杆菌热稳定肠毒素(LT)的粘合剂制剂

由Tulane大学的Dr.John Clements处获得LT(LTc)。所获得的这种原料为一种干燥粉末，它是由含200mM NaCl的TRIS缓冲液冻干的。这种LT从未用乳糖处理过。除非特别说明，它是贯穿此实施例中所用的LT。从SSVI-Berne获得LT(LTs)。这种原料为一种干燥粉末，它是由含5％乳糖的磷酸缓冲盐水(PBS)制剂冻干的。LT_R192G或LT(R192G)突变体蛋白是LT的单氨基酸残基突变体：192位的精氨酸突变为谷氨酰胺。PBSx，pH 7.4是pH为7.4的10 mM磷酸钾缓冲盐水；下标x指NaCl的浓度(例如PBS₂₀₀，pH7.4含有200mM NaCl)。

KLUCEL EF增稠剂是羟丙基纤维素，它是Hercules生产的粘性增强剂，它被制备为一种20％(w/w)的含于水的原料。NATROSOL250L NF为羟乙基纤维素，它是Hercules生产的粘性增强剂，它被制备为一种12％(w/w)含于水的原料。

此粘合剂制剂是含于水的EUDRAGIT EPO聚合物(Rohm)的悬浮液，它含37.4％的非挥发性成分(NVC)。改良的粘合剂制剂是加入6％(w/w)甘油和4％(w/w)1，3-丁二醇的标准粘合剂制剂。终悬浮液含有43.7％NVC。包括这些添加剂是为了增加EUDRAGIT粘合剂固化薄膜的可塑性和粘性。

已经明确粘合剂制剂中LT显示出良好的稳定性和可回收性。湿掺合物约含500μg/gm LT、5％二糖(例如蔗糖、海藻糖)和3％KLUCEL增稠剂。将EUDRAGIT粘合剂和在pH7.4下缓冲的蛋白溶液(含为非还原糖的二糖和KLUCEL增稠剂)混合，质量比约为1∶1，通过这样制备这种掺合物。经过6至7周的观察，发现5℃下的稳定性极佳，室温下的稳定性良好(有某些回收的蛋白丢失)。

将蛋白溶液(含二糖)与标准EUDRAGIT粘合剂结合而生产贴剂，其重量比约为1∶1。然后在1012塑料衬垫上，用8毫米刀将这些湿掺合物铸成薄膜。让这些薄膜在室温下风干，然后用释放衬垫覆盖。用直径7/16英寸的多用途冲压机冲出面积约1cm²的贴剂。将贴剂放在5ml玻璃冻干小瓶(瓶口20mm)中，并在氮气下密封。密封小瓶置于孵育器上，间断抽样检验。

用ddH₂O将这些贴剂再水化，制备样品，并按下面程序进行分析。在酸性环境下EUDRAGIT粘合剂是可溶性的。此程序中可使用ddH₂O、PBS₂₀，pH7.4或SE-HP朗罕氏细胞缓冲液(200 mM磷酸钠，pH7.2)作为再水化缓冲液。将无释放衬垫的2个贴剂置于1.7mlEPPENDORF离心试管中。加入约0.5ml再水化缓冲液，偶尔进行手动搅拌(约每半小时1次)，这些贴剂可在室温下的缓冲液中水化数小时。在14,000g和4℃下，将EPPENDORF试管离心5min。回收上清液，对其进行HP朗罕氏细胞分析。

用反相高效液相色谱法(RP-HP朗罕氏细胞)检测诸如LT和LT_R192G等蛋白的降解。以0.3ml/min的速率，应用充当缓冲液A的含0.1％(w/v)三氟醋酸(TFA)的ddH₂O和充当缓冲液B的含0.1％(w/v)TFA的95％(v/v)乙腈制成的梯度，从Vydac柱中(2.1mm ID×25cm的蛋白和肽C4)洗脱蛋白亚单位。在降解蛋白和聚集蛋白出现峰值时，LT的亚单位A和B均被解析。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)由14％分离凝胶和5％积层凝胶组成。通过在含β-硫基乙醇的缓冲液中将样品煮沸5分钟而还原蛋白样品。应用SDS-PAGE分离A和B亚单位可确认RP-HP朗罕氏细胞的结果。

用SSvI Berne的LTs制备1A系列贴剂。用ddH₂O推荐量的半量重新组成冻干样品，获得标称含2mg/ml LT和10％乳糖的PBS溶液。将海藻糖溶解在这个溶液中，使终浓度成为5％(w/v)。

用Tulane大学Clements实验室的LTc制备2A系列贴剂。用ddH₂O重新组成LTc，然后在PBS₁₅₀，pH7.4中透析。用30,000MW截断CENTRICON单位浓缩透析的LTc。将海藻糖溶解在浓缩LTc中，获得含1.2mg/ml LTc和5％(w/v)海藻糖的PBS₁₅₀，pH7.4溶液。

在40℃将1A系列贴剂孵育1个月。在40℃将2A系列贴剂孵育2个月。用二糖将LTc较好地稳定：对于这个蛋白，5％(w/v)海藻糖比10％(w/v)乳糖为更好的稳定剂。色谱图中的峰高较低，A和B亚单位产品峰面积间的比例显示存在乳糖造成的更多降解。

将标准EUDRAGIT粘合剂与其它成分(含LT，含或不含海藻糖，以及含或不含KLUCEL增稠剂的PBS缓冲液)掺合起来，含KLUCEL增稠剂的掺合物的质量比约为1∶1.2，不含KLUCEL增稠剂的掺合物的质量比约为1∶1。此湿掺合物中，KLUCEL增稠剂终浓度为3％(w/w)，二糖终浓度为5％(w/v)(存在时)，LT终浓度为410μg/gm至460μg/gm。

含海藻糖的制剂与不含海藻糖的制剂相比，清楚地表明海藻糖戏剧性地增加了LT的稳定性，甚至温度升高至60℃时。甚至在不含海藻糖时，应用标准EUDRAGIT粘合剂制备的贴剂LT的稳定性大于应用改良EUDRAGIT粘合剂制备的那些贴剂。改良EUDRAGIT粘合剂是为了增加部分干燥薄膜的粘性和可展性。含海藻糖的标准EUDRAGIT粘合剂薄膜趋于使贴剂衬垫基底破碎和剥落。但是，在升高温度孵育后，这种成片性戏剧性地降低(或者完全消失)。KLUCEL增稠剂的存在可铸成一致的薄膜。由不含KLUCEL增稠剂的掺合制剂铸成的薄膜没有任何一致性。

对2个掺合粘合剂和免疫活性蛋白组合物进行研究：KLUCEL增稠剂与蔗糖或海藻糖。将改良EUDRAGIT粘合剂与其它成分(含LT，二糖和KLUCEL增稠剂的PBS缓冲液)掺合，质量比约为1∶1.3。此湿掺合物中，KLUCEL增稠剂终浓度和二糖终浓度分别为2.6％和5％，LT终浓度约为450μg/gm。在5℃、室温、40℃或60℃孵育每种掺合组合物制成的贴剂。

对每种样品(即在4种不同温度下孵育的KLUCEL增稠剂-压敏粘合剂制剂，其中或含蔗糖，或含海藻糖)中提取的蛋白进行RP-HP朗罕氏细胞，分析其洗脱分布型的色谱图。描绘随孵育时间变化的峰面积比例和正规化的峰面积。含有5％(w/v)二糖与几乎不含或不含二糖相比，LT稳定性得到提高，甚至是在40℃时。在这些条件下，海藻糖作为稳定剂优于蔗糖。在5℃时，经过孵育时间，这两种二糖均可稳定蛋白。但在60℃时，LT未被稳定；在此温度下1周后未回收到任何LT。

用改良EUDRAGIT粘合剂研究5种掺合组合物：KLUCEL增稠剂和没有二糖，KLUCEL增稠剂和蔗糖，KLUCEL增稠剂和海藻糖，NATROSOL增稠剂和蔗糖，以及NATROSOL增稠剂和海藻糖。对于含KLUCEL增稠剂的贴剂，将改良EUDRAGIT与其它成分(含LT，含或不含二糖和KLUCEL增稠剂的PBS缓冲液)掺合起来，质量比约为1∶1。对于含NATROSOL增稠剂的贴剂，掺合的质量比约为1∶1.4。此湿掺合物中，KLUCEL贴剂的增稠剂终浓度和二糖终浓度(如果存在)分别为3％和0.4％，NATROSOL贴剂的增稠剂终浓度和二糖终浓度分别为3.5％和0.3％。湿掺合物中LT终浓度约为500μg/gm。在室温、40℃或60℃孵育5种掺合物制成的每种贴剂。

对每种样品(即在3种不同温度下孵育的KLUCEL增稠剂或NATROSOL增稠剂-压敏粘合剂制剂)中提取的蛋白进行RP-HP朗罕氏细胞，分析其洗脱分布型的色谱图。描绘随孵育时间变化的峰面积比例和正规化的峰面积。含有5％(w/v)二糖与几乎不含或不含二糖相比，LT稳定性得到显著提高。应用增稠剂提高制剂成分的粘性，所以可将它铸成均匀的薄膜。在这些条件下，KLUCEL增稠剂比NATROSOL增稠剂更优选，这是因为KLUCEL增稠剂存在时LT的稳定性比NATROSOL增稠剂存在时更强。在低浓度的二糖下(即0.3％至0.4％)，孵育1周后LT稳定性没有增加。因此，优选较高浓度的二糖。

优选粘合剂-蛋白制剂还含有约3％(w/v)增稠剂(例如KLUCEL羟丙基纤维素)和约5％(w/v)非还原糖(例如海藻糖)。在升高的温度下(40℃至60℃)固化一段时间，这样可解决至少部分干燥薄膜的破碎和成片性难题。含有不足以使蛋白去稳定的低浓度二醇(例如最终湿掺合物中1％或更低的甘油和/或1，3-丁二醇可用为起始点，直至约5％、10％或15％)，但足以使部分干燥压敏粘合剂层具有可展性和内聚性。通过铸型和干燥标准EUDRAGIT粘合剂和含3％(w/v)至5％(w/v)二糖的缓冲剂的湿掺合物，而制备薄膜，此薄膜趋于剥落贴剂所用的衬垫原料，并且没有较多的粘合剂特征。为了提高可展性和粘合性，通过加入甘油(最高约为6％)和1，3-丁二醇(最高约为4％)而改良标准EUDRAGIT粘合剂。加入这些增塑剂可获得所需的可展性和粘合性，但它们也可对LT稳定性产生不利影响。

由标准EUDRAGIT粘合剂和在含二糖缓冲液中的蛋白的掺合物浇铸贴剂，其每个贴剂之间的包衣重量非常不一致。发现在最终湿掺合物中含有约3％(w/w)KLUCEL或NATROSOL增稠剂将大大地增加浇铸一致性包衣的能力。

已经确定贴剂组合物中LT具有良好的稳定性和可回收性。湿掺合制剂约含500μg/gm LT，5％(w/v)二糖(例如蔗糖、海藻糖)和3％(w/v)KLUCEL增稠剂。通过将EUDRAGIT粘合剂和缓冲的蛋白溶液(pH 7.4；含二糖和KLUCEL增稠剂)混合，其重量比约为1∶1，而制备掺合物。在5℃时具有优良的稳定性。在室温下具有良好的稳定性，所以我们观察6至7周以上。

加入的稳定剂是二糖(例如蔗糖、海藻糖)，浓度为5％(w/v)，这样的高浓度可防止聚集、降解和变性。此结构稳定性与生物活性的保留相关联。海藻糖与蔗糖相比，可使稳定性略有升高，但乳糖对贴剂中LT的稳定性不利。诸如甘油和1，3-丁二酸的赋形剂也可对至少部分干燥贴剂中的LT稳定性带来某些不利影响。

市售LT和LTR_192G制剂中存在的乳糖也对溶解性具有不利影响。乳糖中制备的LT(诸如SSVI获得的LT)溶解性在不含乳糖的溶液中很差。另外，通过质谱法结果，即乳糖制备的LT与无乳糖LT粘合剂制剂相比，它在片段中产生14amu的差异，这表明乳糖可化学性地修饰蛋白。

加入KLUCEL增稠剂，这样可应用刀片铸成均匀一致的薄膜。增加二糖和KLUCEL增稠剂的浓度逐渐地使薄膜易碎或易剥落，而且逐渐使其丧失粘合剂属性。通过包含例如甘油和1，3-丁二醇(最终湿掺合物中的浓度分别约为3％和2％)的赋形剂改良EUDRAGIT粘合剂，这样使薄膜的可展性和大部分的粘合性得到恢复。然而加入这些也对蛋白稳定性不利。在升高的温度(40℃)下孵育1周，显示出可展性和薄膜粘结性恢复。这提示在不必须加入对蛋白稳定性不利的赋形剂的情况下，在升高的温度下(40℃至50℃)，于数小时或更少的短期内固化薄膜，可作为恢复薄膜可展性和完整性的可用方法。新近制备的EUDRAGIT粘合剂可用于防止聚合物之间的过度交联。

用于经皮免疫的含LT粘合剂制剂

下面的水基粘合剂用于压敏粘合剂层。将丙烯酸酯粘合剂与充当增塑剂的乙酰基柠檬酸三丁酯(ATBC)和充当增粘剂的丁二酸掺合。

表1粘合剂制剂

成分	非挥发性成分	湿重		干重
						％NVC	重量(gm)	％	重量(gm)	％
	异丁烯酸酯聚合物	100	22.8	22.0	22.8						58.8
丁二酸						100	1	0.96	1	2.58
	ATBC	100	15	14.5	15						38.7
水						0	65	62.6	0	0
	合计		103.8	100	38.8						100

干重％是成分的总重量与％NVC的乘积，再除以所有成分的总重量，乘以它们各自的％NVC。此粘合剂制剂用于生产一个含蛋白的乳剂。

表2含佐剂粘合剂制剂

成分	非挥发性成分	湿重		干重
						％NVC	重量(gm)	％	重量(gm)	％
	1×PBS/乳糖	6.05	23.4	38.8	1.42						13.3
粘合剂制剂						37.5	23.4	38.8	8.78	82.8
	NATROSOL增稠剂	2.5	13.5	22.4	0.338						3.18
LT蛋白佐剂						N/A	0.0234	0.04	0.023	0.22
	Tween 20	100	0.05	0.08	0.05						0.47

应用此含佐剂粘合剂制剂生产5种掺合物：

·掺合物1如表2中所示。

·掺合物2包含甘油(5.4％干重)。

·掺合物3包含1，3-丁二醇(5.4％干重)。

·掺合物4是用KLUCEL增稠剂替代NATROSOL增稠剂。

·掺合物5和6是应用转轮影印和层压为压敏丙烯酸酯或硅氧烷粘合剂层的掺合物1。

表3含佐剂/联合应用抗原的粘合剂制剂

成分	非挥发性成分	湿重		干重
						％NVC	重量(gm)	％	重量(gm)	％
	1×PBS/乳糖	6.05	15.6	38.7	0.94						13.3
EUDRAGIT EPO						37.5	15.6	38.7	5.85	82.3
	NATROSOL增稠剂	2.5	9.0	22.3	0.23						3.16
CS6蛋白抗原						100	0.0468	0.11	0.047	0.66
	LT蛋白佐剂	100	0.0156	0.04	0.016						0.22
Tween 20						100	0.03	0.07	0.03	0.42

应用此含佐剂粘合剂制剂生产2种掺合物：

·掺合物7如表3所示。

·掺合物8是26.6mg/ml CS6与应用转轮影印和仅LT层压为扁平的掺合物3的1∶1混合物。

生产下面的制剂：

A LT配制在EUDRAGIT EPO粘合剂/3.2％NATROSOL增稠剂/0.5％Tween中

B LT配制在EUDRAGIT EPO粘合剂/3.0％NATROSOL增稠剂/5％甘油/0.4％Tween中

C LT配制在EUDRAGIT EPO粘合剂/3.2％NATROSOL增稠剂/5％1，3丁二醇/0.4％Tween中

D LT配制在EUDRAGIT EPO粘合剂/3.2％KLUCEL增稠剂/0.5％Tween中

E LT和CS6配制在EUDRAGIT EPO粘合剂/3.2％NATROSOL增稠剂/0.4％Tween中

通过反相HP朗罕氏细胞测定制剂A至E的化学稳定性，通过大小排阻HP朗罕氏细胞测定其物理稳定性。反相色谱法按照结合亲和力将蛋白分开，并可检测蛋白降解所得的片段。大小排阻色谱法按照孔的通过与否分开蛋白，并可检测聚集、分离亚单位、沉淀物和解折叠的多肽链。将样品在15℃、25℃合40℃保存1周。制剂B仅检测到从LT-A亚单位分离的LT-B亚单位(一个五聚物)。

按照上述方法对小鼠进行经皮免疫(角质层harton Kersten et al.，Infect.Immun.，68：5306-5313，2000)。简要地，用40号大剪刀刮这些动物的背，不留下皮肤上任何可见的刺激物或改变，让它们休息48小时。在免疫过程中用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物在后大腿经肌肉内(IM)或腹膜内(IP)麻醉这些小鼠，以防止小鼠自己清洁皮肤。用10％甘油、70％异丙醇和20％水的水溶液水化暴露的皮肤表面；用砂纸使角质层至少部分破裂。将含10μg/cm²蛋白的1cm²贴剂在皮外粘贴24小时，并用粘合剂带置于此贴剂上，使其固定在动物身上。除去贴剂后，广泛地冲洗动物，尾冲下，置于流动自来水下约30秒，轻轻排干，然后再冲洗。

通过LT或CS6抗体的ELISA测定抗原特异性免疫反应的诱导。用0.1μg/孔抗原包被IMMULON-2聚苯乙烯平板(Dynex实验室)，在室温下将其孵育过夜，用含0.5％酪蛋白缓冲液的PBS封闭，冲洗，采用样品连续稀释法，并在室温下将平板孵育2小时。应用HRP-连接山羊抗鼠IgG(H+L)(Biorad)检测IgG(H+L)抗体1小时。用2，2′-连氮基-二(3-乙基苄噻唑啉磺酸)底物(ABTS；Kirkegaard and Perry)暴显色被结合的抗体，30分钟后用1％SDS溶液使停止反应。在405nm读取平板。或用OD(405nm)，或用ELISA单位报告抗体滴度，它们被确定为光密度(OD)为1.0的血清的反相稀释度。

表4免疫小鼠的ELISA结果

制剂	剂量	ELISA单位的几何均数
			A	10μg/cm2	3325
B	10μg/cm2	6962
			C	10μg/cm2	4896
D	10μg/cm2	12,707
			E	10μg/cm2(LT)30μg/cm2(CS6)	9959614
纱布贴剂(LT)	10μg	4861
			纱布贴剂(LT)	10μg	3109
纱布(-)对照	PBS	12

将含LT溶液加至1cm² Nu-纱布衬垫层而生产纱布贴剂。用一块粘合剂带将底物保持在小鼠的适当位置上。

用于经皮免疫的含蛋白的粘合剂制剂

通过将一种或多种ETEC亚单位抗原掺入粘合剂制剂中，可使这些含蛋白的粘合剂制剂用来治疗产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。这些制剂也适于掺入死亡的ETEC完整细胞(～10⁴至10⁸死亡细菌/剂)，含或不含LT-佐剂。然后在一片封闭(或半封闭)衬垫上将此掺合物铸为薄膜。让制剂固化(室温或40℃至60℃)，直至此薄膜至少部分干燥(含水量可在0.5％与5％之间；本发明的贴剂优选小于1％或2％左右)。从模铸上可将铸成的薄膜裁剪为所需要的大小和形状。然后可将此贴剂密封在一个不透光、防水塑料或金属箔袋中。可将按此方法生产的贴剂贮存在冷冻或环境温度下(例如20℃至30℃)。掺入不同量和比例的一种或多种抗原和佐剂，可改变这种多价疫苗掺合物，因此这种含蛋白粘合剂是灵活的。另外，为了调节剂量，可改变贴剂的大小。根据个人的年龄，可改变用于儿童和成人的贴剂大小(剂量)。

含蛋白粘合剂制剂是灵活的，而且独特地将疫苗包被在各层中。将每种疫苗成分分离地在贴剂衬垫上分层，通过这种方法生产这些贴剂。目的是形成一个多层膜，在其中粘合剂制剂粘附在衬垫层上，将第一层致免疫制剂涂敷在粘合剂制剂上，将第二致免疫制剂涂敷在第一致免疫和粘合剂制剂上，释放衬垫是离衬垫层最远的一层。这种方法的优势是它使制剂具有灵活性(即通过相同的方法，应用不同比例的含抗原第一致免疫制剂和含佐剂的第二致免疫制剂而生产贴剂，或者生产的贴剂仅含一或二种活性成分)。这种多层贴剂还具有控制每种抗原和佐剂释放速度的优势。在某些情况中，需要将LT佐剂迅速地释放，以在其它抗原释放之前，预引发皮肤树突状细胞(例如朗罕氏细胞)。然后LT引发的朗罕氏细胞可更有效地捕获和处理毒素和定居因子抗原。控制传送使佐剂和抗原的应用更有效，并可使剂量进一步减小。

所述制剂可适于稳定与粘合剂接触的至少具有佐剂和/或抗原活性的蛋白。下面是这种制剂的实施例，并不是要对这种制剂进行限制。用于ETEC亚单位疫苗(CS3、CS6、CFA/I、ST和LT)和死亡ETEC完整细胞传送的凝胶制剂

凝胶是充分水化或湿贴剂的实例。这些制剂是要掺入包含在凝胶基质中的一种或多种ETEC亚单位抗原。这种制剂也适于死亡ETEC完整细胞的经皮传送(～10⁴至10⁸死亡细菌/剂)，含或不含LT。通过将含有所需量和比例的抗原的溶液掺入卡波姆，Pluronic或两种凝胶成分的混合物(见下)中，而配制疫苗。然后将这种含凝胶致免疫制剂包被在一个条上，此条将这种凝胶固定好，使其不至脱落。重要的是，此原料与制剂中蛋白的结合力低。此条可包括上述贴剂原料。此条可为单层或1层以上的层压层。通常，此条大体上是不透水的，并有助于将皮肤保持在水化条件下。此原料可为符合所要求的柔韧性和与蛋白结合力低的任意类型的聚合物。优选的聚合物包括，但不限于，聚乙烯、乙烯基乙酸乙酯、乙基乙烯基醇、聚酯或特氟隆。支持凝胶的原料条的厚度小于1mm，优选小于0.05mm，最优选0.001至0.03mm。

负载凝胶的条可有不同的大小和形状。为了便于使用，优选角是圆形的。条的长度可以改变，并随使用者(即儿童或成人)不同而改变。它可约为2cm至12cm，优选约为4cm至9cm。条的宽度可改变，但它可约为0.5cm至4cm。这种条可具有浅囊或小凹，作为凝胶的储器。为了固定良好，当将含凝胶制剂包被在这种条上时，此凝胶应充满这种储器。这些浅囊可约为0.4mm宽和0.1mm深。负载凝胶的贴剂约为1mm厚，优选约为0.5mm或更小。通过将负载凝胶的条粘附于压敏粘合剂层，使凝胶表面背对粘合剂，而将其固定好。衬垫原料可为封闭或半封闭(例如TEGADERM敷料)。

可曲的劲度是重要的，因为必须使凝胶和皮肤间的接触保持为最大。需要此条与应用贴剂的解剖部位的外形一致(例如三角肌、掌侧前臂、颈部、耳后或其它部位上的皮肤)。可用Handle-O-Meter(ThwingAlbert Instruments)测定可曲劲度。可曲劲度应当小于5gm/cm，更优选小于3gm/cm。比较低的劲度可以用较小的力量就可使此原料条盖在显示轮廓的表面上。设计衬垫层使贴剂固定好，以助于皮肤和凝胶之间保持最大的接触，而且可防止凝胶在贴着贴剂期间脱水。

为防止贮存和装卸过程中湿贴剂脱水，可将其放置在相当坚硬的惰性塑料条上。凝胶表面将与塑料条直接接触，而且凝胶/塑料接触面的剥离力低，这样便于凝胶条与塑料条的分离。塑料条由聚乙烯或相似的原料制成。可将含凝胶贴剂包装在防光和不透水的塑料或箔袋中。可将此袋贮存在室温下或贮存在冰箱中。

下面是水化凝胶制剂的实施例，并不是要对其进行限制：含凝胶的磷酸盐缓冲盐水；1％卡波姆1342；1.5％卡波姆940；1.5％卡波姆934；1.5％卡波姆940，2％蔗糖，10％异丙醇，10％甘油；50％Pluronic F87和30％Pluronic F108。

卡波姆聚合物是高分子量丙烯酸基的聚合物，它可与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联，和/或用C10-C30烷基丙烯酸酯进行修饰。可将这些掺入或不掺入贴剂中，或者可通过本领域技术人员所熟知其它方法将这些传送至皮肤中。

制剂可由不同平均分子量的卡波姆s组成。例如此聚合物可为卡波姆1342(例如在1×PBS中含1％卡波姆1342，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)；卡波姆934(例如在1×PBS中含1.5％卡波姆934，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)或卡波姆940(例如在1×PBS中含1.5％卡波姆940，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)。可在磷酸盐缓冲盐水溶液中制备每种制剂，它所含LT的浓度可约为0.6mg/ml或更小，但是所配制的抗原和佐剂也可约为0.001mg/ml至0.6mg/ml，或者约为0.6mg/ml至6mg/ml。另外，可包含诸如羟苯甲酯和对羟基苯甲酸丙酯等的抗菌剂。

可应用卡波姆940和Pluronic F87的组合(例如在1×PBS中含1.5％卡波姆940，0.5％Pluronic F87，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)。Pluronics是另一类水凝胶，它含有重复链节的环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷。此制剂中LT和抗菌剂的量可完全相等。

应用渗透增强剂和卡波姆s可增强其它制剂的传送。例如，凝胶可包含卡波姆940和Pharmasolve(例如在1×PBS中含1.5％卡波姆940，10％Pharmasolve，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)，而终凝胶可含有卡波姆940，甘油和异丙醇(例如在1×PBS中含1.5％卡波姆940，10％甘油，10％异丙醇，0.6mg/ml LT，0.3％羟苯甲酯，0.1％对羟基苯甲酸丙酯，2.5％乳糖)。LT和抗菌剂的浓度可与上述制剂保持相同，或者可在其它特定的范围内。

上面引用的所有参考文献(例如论文、书、专利和专利申请)表明本领域技术的水平，并将它们收入参考文献中。

符合本权利要求和它们的合法同等物范围的所有修改和替代均包含在它们的范围内。使用过渡语“包含”的权利要求是允许其他成分包括在此权利要求范围内；本发明也可通过使用过渡短语“基本上由…组成”(即如果它们实质上未影响本发明的实施，则允许包括此权利要求范围内的其它成分)和过渡语“组成”(即仅允许包括权利要求中列举的成分，而不包括通常与本发明相关的杂质或不重要的活性)代替短语“包括”的权利要求来描述。权利要求的限制之间没有任何特殊关系，除非权利要求中清楚地陈述了这种关系(例如产品权利要求中成分的排列或方法权利要求中步骤的顺序不对此权利要求构成限制，除非这些得到清楚地陈述)。因此，这里公开的单个成分的所有可能的组合和排列将被认为是本发明的部分。

本领域普通技术人员可通过上面所述清楚地认识到，在不违背本发明的精神或基本特征的情况下，可在其它特殊形式中实施本发明。所述的实施方式应当只被看作是举例说明，而不是限制，因为本发明的法定保护范围将由附加的权利要求而不是由说明书进行说明。

Claims (25)

1、一种用于经皮免疫的贴剂，它至少包含四种不同的成分：

(1)衬垫层；

(2)粘附于衬垫层的压敏粘合剂层，和

粘附和/或掺入压敏粘合剂层的致免疫制剂，它包括：

(3)至少一种与压敏粘合剂层的粘合剂接触的蛋白，其中至少一种蛋白具有免疫学活性，和

(4)一个稳定剂，它在粘合剂存在的情况下保持这个至少一种蛋白的免疫学活性；

其中将此贴剂在皮外应用于受试者的皮肤，使压敏粘合剂层粘附于皮肤和衬垫层位于最外面，以便有效量的至少一种蛋白通过经皮免疫诱导受试者的抗原特异性免疫反应。

2、按照权利要求1所述的贴剂，其中的衬垫层是封闭的。

3、按照权利要求1所述的贴剂，其中的粘合剂是一种水基粘合剂。

4、按照权利要求1所述的贴剂，其中的粘合剂是一种丙烯酸酯粘合剂。

5、按照权利要求1所述的贴剂，其中至少一种蛋白具有佐剂活性。

6、按照权利要求1所述的贴剂，其中至少一种蛋白是一种ADP-核糖基化外毒素，它的一个片段，或它的一种突变体。

7、按照权利要求1所述的贴剂，其中至少一种蛋白是一种大肠杆菌热不稳定外毒素，它的一个片断，或它的一种突变体。

8、按照权利要求1所述的贴剂，其中至少一种蛋白是诱导抗原特异性免疫反应的抗原。

9、按照权利要求1所述的贴剂，其中至少一种蛋白在1μg至100μg之间。

10、按照权利要求1所述的贴剂，其中稳定剂是一种非还原糖。

11、按照权利要求1所述的贴剂，其中稳定剂是蔗糖或海藻糖。

12、按照权利要求1所述的贴剂，它还含有第五种成分(e)释放衬垫，其中压敏粘合剂层位于衬垫层和释放衬垫之间，以便去掉释放衬垫可以暴露出压敏粘合剂层，并使此贴剂在皮外可应用于患者的皮肤，使衬垫层位于最外面。

13、按照权利要求1所述的贴剂，其中包装单片贴剂，以便在至少2年中，至少一种蛋白通过经皮免疫可有效地诱导受试者的抗原特异性免疫反应。

14、按照权利要求1所述的贴剂，其中压敏粘合剂层还包含至少一种增塑剂和至少一种增粘剂。

15、按照权利要求14所述的贴剂，其中增塑剂是三烷基柠檬酸酯。

16、按照权利要求14所述的贴剂，其中增粘剂是一种或多种二醇和/或丁二酸。

17、按照权利要求1所述的贴剂，其中致免疫制剂还含有增稠剂。

18、按照权利要求17所述的贴剂，其中增稠剂是羟烷基纤维素或淀粉。

19、按照权利要求1-18中任一所述的贴剂用于诱导抗原特异性免疫反应的用途。

20、按照权利要求1-18中任一所述的贴剂用于治疗和/或预防一种或多种与疾病相关症状的用途。

21、按照权利要求19或20所述的用途，还包括在使用贴剂前水化皮肤。

22、按照权利要求19或20所述的用途，还包括在使用贴剂前，通过化学和/或物理能量增强皮肤的穿透，以使角质层破裂，而不穿破皮肤的真皮。

23、权利要求1-18中任一所述的用于经皮免疫的贴剂的生产方法，其特征在于：致免疫制剂包括(a)包括至少一种免疫学活性蛋白的免疫原，和(b)可在使用了压敏粘合剂、和/或掺入了粘附于衬垫层的压敏粘合剂层的悬浮液或溶液中，保持至少一种蛋白的免疫学活性的稳定剂。

24、一种制剂，它包括(a)压敏粘合剂，(b)至少包括一种免疫学活性蛋白的免疫原，以及(c)可在含有压敏粘合剂的悬浮液或溶液中保持至少一种蛋白的免疫学活性的稳定剂。

25、按照权利要求24所述制剂在生产用于经皮免疫的贴剂中的应用，此贴剂是通过将此制剂粘附于衬垫层而生产的。

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