KR101605694B1 - 경피적 면역화를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 경피 경로를 통하여 백신을 전달하기 위한 방법 및 시스템 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 경피적 면역화를 위한 응결 분획을 포함하는 기구의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 어떠한 피부 처치가 없이 효율적인 면역 반응을 가능하게 하는 피내 백신화를 위한 프로토콜에 관한 것이다. 본 발명은 또한 어떠한 형태의 항원에 대하여 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도하는, 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간에 사용될 수 있는 것이다.

Description

경피적 면역화를 위한 방법 및 조성물 {METHOD AND COMPOSITIONS FOR CUTANEOUS IMMUNISATION}
본 발명은 경피 경로를 통하여 백신을 전달하기 위한 방법 및 시스템 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 경피적 면역화를 위한 응결 분획 (condensation compartment)을 포함하는 기구의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 어떠한 피부 처치가 없이 효율적인 면역 반응을 가능하게 하는 피내 백신화(epicutaneous vaccination)를 위한 프로토콜(protocol)에 관한 것이다, 본 발명은 또한 어떠한 형태의 항원에 대하여 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도하는, 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간에 사용될 수 있는 것이다.
대다수의 발열원들은 점막 또는 피부를 통하여 신체에 진입한다. 따라서, 피부는 점막과 같이, 발열원을 탐지하고 자체로 방어하기 위한 모든 필요한 수단을 갖는다. 특히 이러한 방어선은 전문적이고 거주성의 항원-부여 세포 (antigen-presenting cells: APCs) 대표단을 포함한다. 정상 조건 하에서의 표피에만 존재하는 APC들은 골수로부터 유래되는 랑거한스 세포 (Langerhans cells; LC) 및 수지상 세포 (DC)이다. 항원을 포획한 후에, 활성화된 LC들은 강력한 전신성 면역 반응을 개시하는 배수성 임파샘으로 이주한다. 따라서, 상기 피부는 보다 효과적인 백신 개발을 위한 고전적인 주사법을 통한 투여경로에 대한 잠재적인 대안으로서 대표한다. 추가적으로, 피부 면역 체계는 또한 자가-면역성 질환, 알러지 및 가능하게는 암과 같은 서로 상이한 병리에 대한 내성을 유도하기 위한 이상적인 목표가 될 수도 있다.
그러나, 피부층의 가장 상층에 있는, 각질층은 액체, 거대 분자(폴리펩티드 및 단백질), 입자 또는 심지어 미생물의 진입에 대한 효과적인 물리화학적 방어벽이다. 다양한 기술들이 피내 경로, 즉, 항원의 피부로의 적용을 통한 효율적인 면역 반응을 획득하기 위한 방법들로서 시험 되어 왔다.
이러한 기술들은 모두 예를 들어, 경미하거나 중등의 찰과상 (연속적으로 점착성 스트립(strips)을 적용하거나 또는 사포를 이용), 또는 초음파 또는 초미세 바늘을 적용함으로서 각각의 물리적 쇠퇴와 관련한 것이다. 이러한 상이한 기술들은 면역성 세포를 포함하는 피부의 표피층으로 진입 및 면역반응의 유도를 촉진시키기 위하여 항원 적용전의 예비적 단계로서, 그 효능의 정도는 다소 상이하나 효능을 나타냈다. 이전에 손상시킨 피부에 항원 또는 콜레라 독소 (CT) 또는 대장균의 민감 독소(LT)와 같은 보체(adjuvants)와의 동시 투여는 면역성 항체 반응을 발생키기기 위해 효과적임을 나타냈다 (Glenn GM, Rao M, Matyas GR, Alving CR. Skin immunization made possible by cholera toxin. Nature. 1998. 391: 851 Glenn GM, SchartonKersten T, Vassell R, Matyas GR, Alving CR. Transcutaneous immunization with bacterial ADPribosylating exotoxins as antigens and adjuvants. Infect Immun. 1999. 67:11006.).
다른 한편, 밀폐 처치(occlusive treatment)를 후속하여 수행한지 여부에 따라, 항원 적용 전의 단순한 피부 수화(hydration)는 특이적 항체 반응을 유발하지 않았다. 이는 이미 이전에 피부가 처치되어 각질층의 물리적 섭동을 초래하거나 항원이 강력한 보체 (CT 또는 LT)와 동시투여가 되었다면 획득된다.
다른 연구자들은 연속적으로 백신 제형을 그대로 유지하고, 1 내지 24시간 동안 동물 피부상에서 액상으로 고착되고, 피부처치 후에만 동물 및 인간에서 면역반응을 유도하는 밀폐 계(occlusive system)의 사용을 발표한 바 있다. 그러나, 0 내지 24시간의 접촉 기간 동안을 이용한 유도된 반응은 정량적 및/또는 정성적으로 변화되지 않는다.
국제 특허 출원 WO 2004/03069호는 포스인트로(PosIntro) 또는 이스콤 (ISCOM) 시스템을 이용하여 건조 형태의 항원 및 면역자극성 화합물을 함유한 조성물 수단에 의한 면역반응 유도하는 내용을 개시하였다.
면역반응을 얻기 위한 피부 패취(patch)의 사용이 국제특허출원 WO 2007/122226호에 제시된 바 있다. 그러나, 상기에 개시된 방법은 보체 (adjuvants)를 이용한다.
따라서, 임의의 물리적 또는 물리화학적 전처리 조작 (사포, 에탄올, 아세톤, 점착성 스트립, 글리세롤) 또는 강력한 보체 (LT 또는 CT) 또는 기타 촉진용 첨가제의 사용이 없이는 항원-특이적 항체 반응이 탐지되지 않는다.
본 발명은 최초로, 보체 (LT 또는 CT)의 사용 또는 피부를 전처리하거나 또는 천공할 필요가 없이, 경피 경로를 통하여 항원-특이적 면역 반응을 유도하게 하는 방법을 개시한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 어떠한 보체가 존재하지 않음에도 효과적이고, 응결 분획을 생성하게 하는 조건 하에서 피부에 적용되는 건조형 백신 제형의 사용을 기반으로 하는 경피적 백신화를 위한 방법을 개시한다. 본 발명은 피부 수화(hydration)의 창제 및 유지가 상기 각질층이 항원의 통과를 허용하는 섭동을 초래함을 확인하였다. 추가적으로, 상기 전달계(delivery system)하에 축적되는 수분은 건조 상태의 백신 제형을 재수화되고 가용화되어 피부와 접촉하도록 진입하게 허용한다. 본 발명자들은 전임상 실험에서 지금까지 개시된 서로 상이한 경피 시스템과 상반되게, 본 발명이 어떠한 보체 (LT 또는 CT)의 공동투여 및 어떠한 피부 조작 (찰과상 또는 천공)이 없이 면역원-특이적 항체를 유도하도록 함을 확인한 바 있다. 특히, 놀랍게도, 본 발명은 선원에 개시된 바가 없는, 어떠한 활성 처치가 없이 거대분자(주로 폴리펩티드 및 단백질)의 경피적 전달을 가능하게 한다. 실시예에서 상술하는 바대로, 특히 강력한 면역 반응은 본 발명의 방법을 이용한 백신의 3가지 적용 후에 관찰된다.
본 발명은 하나 이상의 상기 문제점을 해결하고자 함에 그 목적이 있다.
본 발명은 하나의 목적은 백신 제형이 어떠한 보체가 없는 건조형태이며, 피부와 접촉시에 백신 제형을 포함하는 응결 분획(condensation compartment)을 형성하는 경피 기구를 수단으로 포유동물의 온전한 피부에 적용하여 투여됨을 특징으로 하는, 포유동물, 바람직하게는 인간의 경피적 백신화 (epicutaneous vaccination)를 위한 조성물을 제조하기 위한 백신 제형(vaccine formulation)의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 어떠한 피부의 전처리 또는 보체와의 어떠한 공동투여도 없이, 항원을 포함하는 백신 제형을 투여하기 위한 의도되는 조성물을 제조하기 위한 경피적 투여 기구 (cutaneous administration device)의 용도를 제공하며, 상기 경피적 투여 기구는 피부와 접촉시에 백신 제형을 함유하는 응결 분획을 형성함으로서 항원이 표피로 진입하게 하고 어떠한 보체 또는 피부의 전처리 조작이 없이 면역 반응을 가능하게 하는, 보체 화합물이 없는 건조 형태의 백신 제형을 포함한다.
본 발명은 또 하나의 목적은 어떠한 피부의 전처리 또는 보체와의 어떠한 공동투여도 없이, 항원을 포함하는 백신 제형을 투여하기 위한 경피적 투여 기구 (cutaneous administration device)의 사용을 제공하며, 상기 경피적 투여 기구는 피부와 접촉시에 백신 제형을 함유하는 응결 분획을 형성함으로서 항원이 표피로 진입하게 하고 어떠한 보체 또는 피부의 전처리 조작이 없이 면역 반응을 가능하게 하는, 보체 화합물이 없는 건조 형태의 백신 제형을 포함한다.
본 발명은 또 하나의 목적은 어떠한 피부의 전처리가 없이 포유 동물의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 포유 동물의 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 경피 투여 기구는 어떠한 보체 화합물이 없는 항원을 함유한 건조형태의 백신 제형을 포함하며, 상기 기구는 피부와 접촉시에 백신 제형을 함유하는 응결 분획을 형성하고 상기 적용 기간은 항원의 표피로의 진입 및 어떠한 보체 또는 피부의 전처리 조작이 없이 면역 반응을 유도하기에 충분한 기간인 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 국소적 피부 수화를 창제 및 유지하는 단계; 상기 수화된 피부를 항원의 진입 또는 면역반응의 유도를 허용하기에 충분한 시간 동안 건조 상태의 보체-제거(adjuvant-free) 백신 제형과 접촉시키는 단계를 포함하는, 경피 경로를 통한 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 배킹부(baking)를 포함하는 (상기 기구의 주변 일부가 피부와 밀폐 챔버(chamber)를 창제하도록 적용되고, 챔버 내에서 피부와 접촉시에 항원을 배킹면상에 유지시킴) 피부 기구에 의하여 피내 경로로 객체에 항원을 투여함을 포함하는, 객체에서 단백질 항체에 대하여 전신성 면역 반응을 유도하는 방법(상기 항원은 기구를 피부에 적용 후에 배킹부로부터 제거되고 피내 경로로 객체에 전달되며, 상기 투여는 객체에서 전신성 면역반응 유도를 초래함)을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 경피 기구의 배킹부의 주변 일부는 젖은 피부상에 점착 특성을 갖는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 경피 기구에 의한 항원의 투여 이후에 유도된 상기 전신성 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 응결은 피부에 상기 경피 기구를 적용한 후에 챔버 내부에서 형성되고, 상기 응결은 항원의 이동 및 경피적 전달을 유발 또는 증강시키는 것이다. 특히 상기 응결은 땀에 의하여 형성가능한 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 객체에서 단백질 항원에 대하여 전신성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 항원은 건조 형태 또는 입자 형태이다. 보다 구체적으로는, 상기 항원은 전자기장 및 또는 반데어 발스 힘 (Van der Waals force)에 의한 점착제 없이 지지체에 부착되거나, 또는 지지체 상의 점착제 피복에 의하여 부착 가능하다.
바람직하게는 상기 항원은 분무법/건조법으로 지지체에 적용될 수 있다, 상기 항원은 또한 액체에서 용해되거나 분산 가능하며, 이 경우는 흡착성 물질의 저수조 (reservoir)에서 지지체상에 보유된다.
본 발명은 또 하나의 목적은 백신 제형을 어떠한 보체 화합물 없이 경피 기구로 약 48시간 동안 포유 동물의 처치되지 않은 피부에 적용함을 특징으로 하는, 포유동물에서 면역반응의 유도를 위하여 의약 산물(medicinal product)을 제조하기 위한 건조 형태의 백신 제형의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 백신 제형을 어떠한 보체 화합물이 없이 경피 기구로 약 48시간 동안 포유 동물의 처치되지 않은 피부에 적용함을 특징으로 하는, 포유동물 면역반응 유도용 의약 산물(medicinal product)을 제조하기 위한 건조 형태의 백신 제형의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 백신 제형을 어떠한 보체 화합물이 없이 경피 기구로 약 48시간 동안 포유 동물의 처치되지 않은 피부에 적용함을 특징으로 하는, 포유동물에서 면역반응의 유도를 위한 건조 형태의 백신 제형의 용도를 제공하는 것이다
본 발명은 또 하나의 목적은 보체 화합물이 없는 경피 기구로 약 48시간 동안 포유 동물의 처치되지 않은 피부에 백신 제형을 적용함을 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다
본 발명은 또 하나의 목적은 배킹부(baking)를 포함하는 (상기 기구의 주변 일부가 피부와 밀폐 챔버 (chamber)를 창제하도록 적용되고, 챔버 내에서 피부와 접촉시에 항원을 배킹부 면상에 유지시킴) 피부 기구 (상기 항원은 기구를 피부에 적용 후에 배킹부로부터 제거되고 피내 경로로 객체에 전달됨)를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 하나의 목적은 객체 피부에 적용 후에 응결 분획을 형성하는 경피 투여 기구를 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물 (상기 분획은 어떠한 보체 화합물도 제거된 건조형태의 백신 제형을 포함함)을 제공하는 것이다.
본 발명은 면역 반응이 온전한 피부상에 (즉, 미리 천공되거나 물리적 및/또는 화학적으로 손상되지 않은) 보체의 사용 없이 경피 경로를 통하여 유도될 수 있다는 예기치 못한 발견에 기인한 것이다. 이러한 효과는 건조 형태의 백신 제형을 사용하고 이를 피부에 적용시키고 또는 정당한 기간 동안 적용시에 응결 분획을 형성하는 기구로 적용함으로서 수득된다.
어떠한 특정한 작용기전에 얽매이지 않고자 하는 바램으로서, 피부의 수화는 각질층의 각질세포를 부어 오르게 하고 세포간 공간의 지질 영역간에 물 분자가 통합되게 하는 것으로 보인다. 이러한 수화과정은 피부 항상성의 불안정을 유도하고 결국, 그중에서도 랑거한스 세포의 형태학 및 표현형 변화 또는 표피 단핵세포 수의 증가와 함께 생성된 시토킨(cytokins)의 양상 변화를 초래할 수도 있다.
피부의 방어적 역할에도 불구하고, 대기로 배향하는 물의 흐름은 생리학적 조건하에서 신체 및 대기 사이에 피부를 통하여 정립된다. 이러한 흐름은 일명 무의식적 수분 소실 (Insensible water loss; IWL)이라는 명칭으로 알려져 있다. 응결 분획을 사용하는 본 발명의 방법은 에워 싸는 도구로부터 피부를 분리시키는 일부에 부여된다. 이러한 현상 동안, 신체 및 대기 사이의 물 증기의 교환이 교란되고, 이는 분획에서 물이 축적되게 하고 물질 흡수에 대한 주요 방어벽인, 피부, 전체 표피 및 특히 각질층에 증가된 수화 현상을 초래할 것이다. 이러한 결과는 인간에서 상기 응결 분획으로 제거된 후 측정된 물의 매우 강력한 흐름이, 피부 표면상에 축적된 물을 증발시킴을 의미한다. 기구의 응결 분획은 시간이 지나면서 상기 분획 부피의 수분 증기 포화현상 (water vapour saturation; IWL로부터 유래), 응결되고 평형상태에 도달하게 된다. 적용 초기에, 상기 부피는 주위 공기를 포함하므로 수분 증기로 포화되지 않는다. 일단 대기의 포화가 달성되면, 상기 증기 중 수분은 액산 수분 형태로 응결가능하다. 이러한 응결은 피부로부터의 잔여 수분의 흐름에 의하여 확대될 수 있다. 이러한 조건하에서 수분밀폐 기구의 하면에 수분 축적을 초래하는 평형상태에 도달하게 된다 (도 1B 참조).
따라서 본 발명은 선원의 경피적 백신화 방법상의 문제점들을 어떠한 피부 처치법이 요구되지 않는 즉시 사용형 (ready-to-use) 기구 제조와 함께, 임의 형태의 항원으로도 사용될 수 있는 방법을 제시함으로서 해결가능하다. 각질층 내면 및 상면에서의 수분 축적과 함께 표피에서 유도된 강력한 수화 현상은 각질세포를 부어 오르게 하거나 세포간 지질 상의 구조를 파괴하기 위하여, 수분 존재하에서의 백신 분자 및 피부 사이의 분배 계수를 조절하는 것이 가능하게 한다. 이러한 변형은 피부 표면상에 존재하는 액체 중 활성 성분의 용해 및 피부의 천공 또는 손상의 필요성이 없이 피부를 통한 활성 성분의 진입(수동확산법을 통해)을 가능하게 한다.
본 발명은 응결 분획을 형성하는 임의의 경피 투여 기구로 시행가능하다. 이러한 경피 투여 기구로는 바람직하기로는 패취(patch) 형 또는 드레싱(dressing) 형태 기구, 바람직하게는 패취형이다. 본 발명의 기구는 전형적으로 수동 확산법을 갖는, 즉, 피부의 천공 또는 손상을 야기하기 위한 수단을 포함하지 않는 경피 형태인 것이다. 특히 유리하게는, 국제특허 출원 WO02/071950호에 개시된 바와 같은 VIASKINR 기법을 이용하여 제조된 정전기적 패취형(electrostatic patch)와 같은 밀폐형 패취 형태의 기구가 바람직하다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 “분획(compartment)”는 피부 상에 기구 적용 후 피부 및 기구 배킹부 사이에 생기는 공간을 의미하며, 상기 배킹부는 피부에 부착하지 않아 피부 상에 소량의 수분 축적을 위한 공간을 형성하는 것이다 (실시예 도 1A 및 1B 참조). 본 발명의 결과는, 적용기간 동안에 응결 분획의 방향으로 피부에 의한 액체의 자연적인 발산 덕분으로 상당한 정도의 수화를 유지시키는 응결 분획의 사용이 거대분자 항원의 통과 및 특정 반응의 유도를 허용함을 나타냈다. 이러한 결과는 특히 만족스러운 반응을 얻기 위해서는 특정 보체의 도움 및 피부 전치를 할 필요성이 강조되어 온 지난 선원의 데이터를 감안하면 놀라운 발견이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 기구는 피부와 접촉시에, 상기 기구 표면 cm²당 1 내지 300mm3 범위의 부피를 갖는 응결 분획을 형성하는 것이다. 상기 부피는 약 0.01mm to 3mm의 분획 높이에 상응한다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 분획 부피는 기구 표면 cm²당 2 내지 200mm3 범위의 부피를 갖고, 보다 바람직하게는 약 0.02mm 내지 1mm의 분획 높이에 해당하는 기구 표면 cm²당 2 내지 100mm3 범위의 부피를 갖는 것이다. 기구의 피부상의 확산 면적은 당업계에 종사하는 자에게 적용가능하며, 전형적으로는 약 0.2 내지 5cm², 보다 바람직하게는 0.5 내지 3cm²범위 내인 것이다.
상기 응결 분획 (기구의 배킹부)가 반드시 완전히 불침투성일 필요는 없다. 반대로, 평상시 농도 및 압력 조건하에서, 수분 증기가 분획에서 액상 수분 존재를 통하여 포화된 수분 증기를 유지시키는 것을 방해하지 않는다는 전제하에서 폴리에틸렌과 같은 소재로, 수분 증기에 대한 어느 정도의 투과성도 수용가능하다.
본 발명의 특정한 구현예로서, 본 발명의 응결 분획 벽은 바람직한 구현예로서, 상기 기구는 15g/m2/24h 이하, 바람직하게는 10g/m2/24h 이하, 예를 들어 약 9g/m2/24h의 수증기 투과율을 갖는 소재를 포함하는 것이다.
상기 재료로는 예를 들어, 중합체(polymers), 공중합체 (copolymers), 플라스틱(plastics), 세라믹 (ceramic), 임의의 생체 적합성 물질 (biocompatible material; 예를 들어 흑연), 등으로부터 선택 가능하다. 특히 생체적합성 중합체의 예로는 폴리에틸렌(polyethylene; PE), 폴리카보네이트 (polycarbonate), 폴리에스테르 (polyester; PET), 셀룰로오스 플라스틱 (cellulose plastics; CA, CP), 폴리비닐 클로리드 (polyvinyl chloride; PVC), 폴리메틸-메타크릴레이트 (polymethyl-methacrylate; PMMA), 폴리우레탄 (polyurethane; PUR), 실리콘 (silicones; PTFE) 또는 폴리비닐리덴 플로라이드 (polyvinylidene fluoride; PVDF)를 들 수 있다. 상기 생체 적합성 공중합체의 하나의 예로는 특히, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 (ethylene-vinyl acetate copolymer; EVA)인 것이다.
본 발명과 양립가능한 수증기투과율 (MVTRs)을 갖는 중합체의 예로는 특히, CoTran® 9706 (MVTR=26.4g/m2/24h), CoTran® 9720 (MVTR=9.4g/m2/24h) 및 CoTran® 9722 (MVTR=7.9g/m2/24h)을 재료로 한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 응결 분획은 예를 들어, 디스크(disk)의 외경과 필수적으로 동일한 외경 및 1 내지 50mm, 바람직하게는 약 2 내지 20mm 범위의 내경을 갖는 폴리에틸렌으로 제조한 생체 적합성 재료의 환에 고정되고 (예를 들어, 점착된), 필수적으로 원형 (배킹부)이고 약 2 내지 100mm, 바람직하게는 약 5 내지 70mm 범위의 직경을 갖는 예를 들어, 폴리에틸렌으로 제조된, 중합체 디스크로 형성되는 것이다. 상기 디스크 및 환의 두께는 예를 들어, 약 0.01 내지 2mm 범위 내이며, 이는 0.01 내지 2mm 범위의 분획 높이를 한정하고 상기 분획의 부피는, 배킹부의 유연성이 어떤 점에서, 피부와의 접촉 자체를 한정하더라도, 작지만 0은 아닌 것이다.
상기 디스크는 임의의 적합한 수단으로 환에 고정될 수 있다. 전형적으로, 상기 환은 상기 디스크로의 부착을 허용하는 점착 또는 점착성인 것이다.
도 1A에 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 기구의 하나의 특정한 표준형은
(a) 표면적 cm2 당 응결 분획 부피에 따라, 약 0.01 내지 2mm의 변화 가능한 직경 및 높이를 갖는, 생체 적합성 재료로 제조된 환 (ring; [1]) (도 1A에 나타난 본 발명의 구현예로서, 상기 환은 적어도 그 외면이 피부와 접촉하도록 설계됨);
(b) 환에 부착되고 (예를 들어 점착제 수단으로), 분획(건조 형태의 활성 성분을 함유)을 위한 천정으로 작용하는, 생체 적합성 재료로 제조된 디스크(disk; [2]) (상기 디스크의 표면은 전형적으로 그 직경이 5 mm 이상이며 상기 디스크의 MVTR (수증기투과율)은 바람직하게는 10g/m2/24h이하 인 것임);
(c) 피부로의 적용 전에 박리되도록 설계된 환의 점착 표면을 보호하는 박리지 (a release liner [3])(상기 박리지는 유리하게는 기구 적용 전에는 봉인되도록 분획을 포장하는 디스크인 것임)으로 구성되는 것이다.
상기 기구에 의하여 형성된 분획은 수화 특성을 갖는 응결 분획인 것이다. 수화 특성은 표피의 수화율 (hydration rate), 유리하게는 피부 적용 1 시간 이후에 바로 30% 내지 100%, 보다 구체적으로는 50% 내지 70%의 수화율 증가를 유도하는 기구의 응결 분획 최하면에 표피가 일체화되도록 작용할 수 있는 능력을 부여한다. 바람직하게는, 상기 응결 분획의 수화 특성은 표피 외부 표면상 및 기구의 응결 내에서, 적용 1시간 시점부터 약 40% 내지 100%, 보다 바람직하게는 50%이상 범위의 수분의 상대 양(relative quantity) 증가를 유도하도록 허용되어야 하는 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예로서, 상기 기구는 상기 응결 분획의 수분 밀폐성을 확보하는 수단으로 피부에 고착되는 것이다. 어떠한 점착 수단도 강력한 점착 특성을 갖는 검(gum), 중합체 또는 플라스틱(plastic) 형태를 포함하여, 상기 목적으로 사용가능하다.
본 발명은 온전한 상태의 피부 그 자체, 즉, 이전에 어떠한 특정한 처치를 수행하지 않는 경우에서도 백신화를 허용할 수 있는 장점을 갖는 것이다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 “피부의 처치(treatment of the skin)"는 적어도 피부의 표면 층의 적어도 일부 손상을 초래하는 어떠한 찰과상 또는 천공을 의미한다.
또한 본 발명의 추가적인 장점은 보체와의 동시투여가 없는 경우에도 주요 면역 반응을 획득할 수 있다는 점이다. 본 발명의 의미 내에서, 용어 "보체(adjuvant)"는 항원의 피부로의 진입을 촉진시키고 항원에 대한 면역반응을 증가시키는, 피부상에 물리화학적 및/또는 생물학적 작용을 갖는 임의의 화합물을 의미한다. 물리화학적 및/또는 생물학적 작용을 통하여, 본원에서 정의된 바와 같은 보체는 각질층을 섭동시켜 표피의 투과성을 약화시키고, 항원을 통과시키게 하고 결국 표피의 면역학적 활성 세포와 접촉시키게 하는 화합물이다. 보체 화합물들의 예로는 특히, 콜레라 독소 (cholera toxin; CT) 또는 LT 독소 (E- coli의 열-민감성 독소)들이다. 기타 예로는 폴(Paul et al ) 등의 문헌 (Paul A, Cevc G, Bachhawat BK. Transdermal immunization with large proteins by ultradeformable drug carriers. Eur J Immunol. 1995, 25 (12):35214)에 개시된 바와 같은, 세포막으로 항원의 수송을 가능하게 하는 트랜스퍼좀 (transfersomes)이다.
본 발명은 건조 형태의 어떠한 백신 제형으로 수행가능하다. 본 발명에서 용어 "백신 제형(vaccine formulation)"은 항원 요소를 함유하는 임의의 제형을 의미한다. 이는 전형적으로 하나 이상의 항원, 예를 들어, 펩티드 (peptide), 폴리펩티드 (polypeptide; 또는 단백질), 지질(lipid) 및/또는 당류(saccharide) 형태, 또는 이러한 화합물들의 단순 혼합물 또는 화학적 접합체를 포함하는 제형이다. 본 발명의 바람직한 백신 제형으로는 하나 이상의 항원 분자 (500Da 이상의 분자량을 갖는 물질, 바람직하게는 예방적 또는 치료학적 백신 활성 또는 목적을 갖는 1,500Da 이상의 폴리펩티드 및 단백질 또는 표피상에 국소적으로 (치료적)작용을 하도록 고안된 500Da 이상의 분자량을 갖는 분자)를 포함한다. 전형적으로, 상기 백신 제형은 펩티드 또는 폴리펩티드 형태의 하나 이상의 항원을 포함하는 것이다. 예를 들어, 독감(Flu) 바이러스 항원, 간염(Hepatitis) 바이러스 (/또는 C) 항원, 용혈성 인플루엔자 (Haemophilus Influenzae ) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus) 항원, 살모넬라 (Salmonella (이질)) 항원, 결핵 (Tiphy) 항원 등과 같은 박테리아 항원 (bacterial antigen), 바이러스 항원 (viral antigen), 종양 항원 (tumour antigen) 등 또는 자가-면역 질환 (auto-immune diseases), 암(cancer), 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease), 알레르기(allergies) 등의 특성을 갖는 항원일 수 있다. 상기 백신 제형은 약학적 용도로 적용된 부형제 (excipient) 또는 운반체 (vehicle) 또는 시토킨(cytokine), Toll 수용체의 리간드 (ligand) 화합물 등과 같은 면역조절 활성을 갖는 임의의 화합물도 포함할 수 있다.
상기 백신 제형은 “건조 형태 (dry form)”, 즉, 탈수된 형태로서, 특히 분말상(powder), 입자상 (particle), 응집물 (agglomerate), 케이크상 (cake), 건조형 (dried form) 등으로 사용되는 것이다. 상기 건조 형태는 동결 건조 또는 단순 증발법으로 획득가능하다.
본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 백신 제형은 분말 상인 것이다.
본 발명의 또 다른 특정한 구현예로서, 상기 백신 제형은 표면상에 점착성 물질이 없다면 화학적 또는 물리화학적 힘에 의하여, 기구 표면, 전형적으로는 분획의 배킹부(backing) 상에 고착되는 것이다. 바람직하게는, 상기 백신 제형은 정전기 힘 또는 반 데어 발스 힘에 의하여, 기구 표면, 전형적으로는 분획의 배킹부(backing) 상에 고착되는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 기구는 0.1㎍/cm2 내지 500㎍/cm2표면, 바람직하게는 20㎍ 내지 300㎍/cm2표면, 보다 바람직하게는 20㎍ 내지 100㎍/cm2표면 범위의 백신 제형 양을 포함하는 것이다. 이러한 양은 질병, 병리, 치료기간, 객체 등과 관련하여 당업자에 의하여 변화가능한 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명은 보체 및 피부 처치가 없더라도 유의적인 면역반응이 유도될 수 있게 한다. 본 발명은 어떠한 형태의 발열원 (pathogen; 바이러스, 기생충, 박테리아, 단백질 등), 종양 세포 (tumour cells) 또는 자가 항원 (self antigens)에 대한 예방적 또는 치료학적 백신화 또는 알러지 환자 치료를 위해 사용가능하다. 이러한 결과는 항원-특이적 반응(antigen-specific response), 특히 IgG 형 항체 반응을 유도함을 나타낸다.
면역반응의 정도는 기구의 적용 기간 변화 및/또는 반복적 적용의 수행으로 변화될 수 있다. 실시예들에서 상술하는 바와 같이, 단지 6시간 동안 백신의 3차례 적용 후에 유도된 면역 반응은 24시간 적용 (실시예 2)에서의 결과와 균등한 결과를 나타냈다. 예를 들어, 본 발명자들은 6시간 내지 24시간 범위 동안 지속되는 수화정도는 피부의 전-처치 및 보체와의 공동 투여없이도 면역반응을 유발하기에 적합함을 확인하였다.
추가적으로 본 발명자들은 적용기간을 48 내지 72시간 동안 연장하였다 (실시예 5). 상기 결과는 48시간의 적용기간은 항체-특이적 반응 면에서 24시간의 적용기간에 비교하여 거의 10배 상승하는 놀라운 결과를 나타냄을 확인하였다. 48시간 이상 지속된 적용은 예를 들어, 72시간의 적용 기간은 항원 반응 면에서 추가적인 상승을 기여하지 않았다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 개개 적용 시점이 약 7 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 20일, 전형적으로는 약 15 일간 떨어진 간격으로, 객체에 적용하기 위한 2개 이상의 기구, 바람직하게는 3개 이상 기구로 이루어진 연속적 적용을 포함한다.
바람직하게는, 개개 적용을 위하여, 상기 기구는 약 6 내지 72시간, 바람직하게는 약 6 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 약 48시간 동안 피부에 고착되는 것이다.
면역반응을 유도하기 위한 본 발명의 특히 바람직한 프로토콜 (protocol)은 약 48 시간 동안 기구를 연속적으로 3회 이상 적용함을 포함하며, 상기 개개 적용은 약 15일간의 떨어진 간격을 갖는 것이다.
전술한 내용에서, 표현 “약(about)”은 주어진 수치와 비교하여 ±10%의 변수를 의미한다.
본 발명은 또한 대부분의 항체 반응은 백신 제형이 건조 상태이고 약 48시간의 하나 이상의 기간, 바람직하게는 약 48시간의 반복된 기간 동안 적용시에 온전한 피부상에 경피적으로 백신화함으로서 획득됨을 나타낸다.
본 발명은 어떠한 포유동물에 대해서도 백신화를 위해 사용가능하다. 또한 소아 또는 성인에 사용가능하며, 필수적으로 비-침습적이고 (non-invasive), 보체의 사용을 요구하지 않는다.
본 발명의 기타 측면 및 장점들은 예시적이고 비-제한적으로 간주되어야 할 하기 실시예를 참고시에 명백할 것이다.
본 발명은 백신 제형이 어떠한 보체가 없는 건조형태이며, 피부와 접촉시에 백신 제형을 포함하는 응결 분획(condensation compartment)을 형성하는 경피 기구를 수단으로 포유동물의 온전한 피부에 적용하여 투여됨을 특징으로 하는, 포유동물 및 인간의 경피적 백신화 (epicutaneous vaccination)를 위한 조성물을 제조하기 위한 백신 제형(vaccine formulation)의 용도를 제공한다.
본 발명의 상기한 목적들 및 장점들은 하기한 발명의 상세한 설명뿐만 아니라, 명세서 전반에 걸친 설시되는 일부들을 의미하는 참고 기호 및 이에 제한되지 않은 첨부되는 하기 도에 대한 설명란을 고려한다면 보다 명확히 설명될 것이다.
도 1: (A)는 응결 분획(condensation compartment)을 갖는 경피 기구의 도이며:(여기에서 [1] 은 생체 적합성 재료의 환, [2] 은 디스크상에 양면 점착제로 고착된 "배킹부(backing)" 디스크이며, [3]은 적용전에 제거되고 점착제를 보호하는 박리지를 의미함), (B)는 응결 분획에서 수증기 흐름의 도이며;
도 2: 응결 분획(condensation compartment)을 포함하는 기구를 사용하여 보체와의 동시투여없이 온전한 피부 상에 경피 경로를 통하여 항원-특이적 항체 면역 반응을 유도함을 나타낸 도이며;
도 3: 응결 분획(condensation compartment)을 포함하는 기구를 피부상에 경피적 경로로 적용한지 6시간 또는 24시간 이후의 항-오발부민 (anti-ovalbumin) 항체 면역 반응을 유도함을 나타낸 도이며;
도 4: 응결 분획에 진입된 수증기 양 및 시간 기능으로서 응결된 수분의 양 사이의 비율을 나타낸 도이며 ( ■: 분획 내에 축적된 수분 양; ◆분획 내에 응결된 수분 양; □ 20시간 이후에 수증기 상태의 수분의 양; ◇20시간 이후에 응결된 수증기 상태의 수분의 양임)
도 5: 응결 분획을 포함하는 기구의 적용 기간과 관련한 피부의 서로 상이한 층(상부, 상부 및 중간, 총 표피층)에서의 수화 비율의 증가 결과를 나타낸 도이며;
도 6: 응결 분획을 포함하는 기구의 적용 기간과 관련한 피부 표면 상에 축적된 수분 양의 증가 결과를 나타낸 도이며;
도 7: 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 적용 기간을 연장함으로서 경피 경로에 의하여 유도되는 항-오발부민(anti-ovalbumin) 항체 면역 반응의 증강 결과를 나타낸 도이며;
도 8: 패취 형의 시스템을 비교하여, 어떠한 보체 또는 피부의 어떠한 천공 또는 찰과상 처치가 없는 경피 경로를 통한 강력한 면역원-특이적(immunogen-specific) 항체 면역 반응의 유도결과를 나타낸 도이며;
도 9: 저용량의 항원으로 어떠한 보체도 없이 경피 경로를 통한 항-TT 항체 (anti-TT) 항체 면역 반응의 유도결과를 나타낸 도이며;
도 10: 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 적용 기간을 연장함에 따른, 피부 항상성의 파괴현상과 관련한, 표피의 유도된 농축화(thickening) 현상을 나타낸 도이며;
도 11: 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 적용 기간을 연장함에 따른, 항원의 피부 진입 및 수지상 세포에 의한 이의 진행 유도현상을 나타낸 도이며;
도 12: 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 적용 기간을 연장함에 따른, 표피성 랑거한스 세포의 활성화와 관련한, 표피성 랑거한스 세포 네트워크(network)의 유도된 변화 현상을 나타낸 도이며;
도 13: 종양 항원을 포함하는 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 24시간 적용 후에, 발암 항원을 발현하는 시험관 내(in vitro) 세포를 목표화가 가능한 발암 항원에 특이적인 항체의 생성을 유도하는 현상을 나타낸 도이며;
도 14: RSV 항원을 포함하는 응결 분획을 갖는 기구의 피부로의 48시간 적용 후에, 어린 마우스에서 호흡기 세포융합 바이러스로 감염된 감염에 대한 부분적 보호효과를 유도하는 현상을 나타낸 도이다.
본 발명의 추가적 양상 및 이점은 하기한 실시예에서 설명될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 한정함이 아니고 설명하고자 하는 것으로 간주되어야 한다. 모든 인용된 공개 문헌 또는 출원들은 본원에서 전체로서 단지 참고로 인용된다.
실시예 1. 응결 분획을 포함하는 경피 기구의 제조
응결 분획을 갖는 경피 적용 기구를 분획에 원하는 높이를 부여하는 발포성 환으로 피복되고, 양 측면에 모두 점착제로 제조된(두께= 0.7mm) 폴리에틸렌 필름(3M)을 배킹부로 사용하여 제조하였다. 따라서 이 기구는 피부상에 확산 면적(diffusion surface; 1cm2) 및 피부를 통하여 확산된 공기를 위한 확장 분획(expansion compartment; 70mm3)을 갖는다 (도 1A 참조).
서로 상이한 수증기 투과율(MVTRs)을 갖는 다수의 중합체, 특히 CoTran® 9706 (MVTR=26.4g/m2/24h), CoTran® 9720 (MVTR=9.4g/m2/24h) 및 CoTran® 9722 (MVTR=7.9g/m2/24h)을 사용하였다.
실시예 2. 어떠한 보체 화합물이나 어떠한 청공성 또는 찰과성 피부 처치도 없이 경피 경로를 통 한 항원-특이적 항체 면역 반응( antigen-specific antibody immune response)의 유도
건조 형태의 오발부민 모델 항원 (ovalbumin model antigen; OVA), 테타누스 독소(tetanus toxin; TT), 종양 항원 (tumour antigen) 또는 상용 항-인플루엔자(anti-influenza) 백신을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=6 to 10) 등판에 적용하였다. 1차 적용 후 2 주 및 4주 후에 적용을 다시 수행하였다. 항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 도 2에 제시된 결과는 항원-특이적 항체 역가 (antigen-specific antibody titre)로 표시하였다. 개개 동물의 혈청에 대하여, 이는 그 450nm에서 측정된 흡광도가 처치하지 않은 마우스 혈청 상에서 측정된 차단 치(cut-off value)와 동일한 희석 결과의 정반대 결과이다. 이렇게 얻어진 결과는 보체가 사용되지 않았음에도 강력한 항원-특이적 면역 반응을 유도함을 나타내는 것이다.
실시예 3. 온전한 피부에 6시간 또는 12 시간 적용 후에 보체 화합물 없이 경피 경로를 통한 항- 오발부민 항체 면역반응 ( anti - ovalbumin antibody immune response )의 유도
건조 형태의 OVA (100μg)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n= 10) 등판에 적용하였다.
1차 적용 후 2 주 및 4주 후에 적용을 다시 수행하였다. 항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주 후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 도 3에 제시된 결과는 항원-특이적 항체 역가 (antigen-specific antibody titre)로 표시하였다. 개개 동물의 혈청에 대하여, 이는 그 450nm에서 측정된 흡광도가 처치하지 않은 마우스 혈청 상에서 측정된 차단 치(cut-off value)와 동일한 희석결과와 정반대 결과이다. 이렇게 얻어진 결과는 6시간 또는 24시간의 적용 시간으로 강력한 항원-특이적 면역 반응을 유도함을 나타내는 것이다.
실시예 4. 응결 분획에서 존재하는 수분의 양 및 물리적 상태 연구
피부는 증발시키기 위해 수증기의 생리학적 양을 허용한다. 이러한 증발을 무의식적 수분 소실(Insensible Water Loss-IWL)로 표시된다. 이는 응결 분획 중 수증기의 양의 증가를 유도한다. 결과적으로 증기 양의 증가는 분획 내부에서 부분 수증기 압력의 증가를 유발한다. 35℃에서의 53.75 mbar 압력으로 시작하여, 상기 분획은 포화 상태에 도달시켰다. 상기 압력 이상에서, 증기는 피부 표면에 고착되고 상기 응결 분획을 충진시킬 수 있는 액체 수분으로 응결된다. 또한, 응결 분획의 조성에서, 본 실시예에서 사용된 배킹부(backing)의 중합체는 충분히 비침투성은 아니고 그 수증기투과율 (Moisture Vapour Transmission Rate; MVTR)로 정의되는 바와 같이 특정 양의 증기가 새나가는 것을 허용한다.
따라서, 이 시스템에서, 수증기 형태로 상기 분획에 진입한 최초의 수분 양과 분획 또는 중합체 필름 또는 응결과정을 통한 전달과정으로 이탈하는 용량 간에는 평형상태가 유지된다. 이러한 상이한 양은 하기한 수학 식 1로 표기된다:
Figure 112010034216775-pct00001
상기 응결 분획 적용 20시간 전 및 후의 수분의 양을 무모 래트 등판으로부터 얻은 피부에서 IWL 측정법으로 정량하였다. 측정치를 기구를 처치하지 않은 부위와 비교하였다. 피부 단편을 프란츠 확산 세포 (Franz diffusion cells)에 올려 놓았다. 수용되는 분획에, 피부를 생리학적 상태에 필적하는 수화상태로 유지하기 위하여 완충액(PBS buffer pH=7.4)을 사용하였다. 프란츠 세포가 준비되면, 37℃를 유지하는 뜨거운 수욕조에 넣고, 온도를 생리학적 유동 온도와 평형을 맞추기 위하여 기타 수작업 전에 2시간 동안 유지시켰다.
도 4에 나타난 결과는 상기 분획에 수증기 형태로 첨가한 수분이 기구 적용 후에 급속하게 응결되기 시작했다. 시스템의 최초 및 최종 데이타를 표시한 이러한 시험 결과에 따라, 20시간 후에 계산된 수증기 및 액체의 양은 각각 1.08mg/cm2 액상 수분 및 0.3mg/cm2의 수증기 형태로 나타났다. 본 실험 동안의 시각적 검사에서, 수분은 피부 표면상에 액체 형태로 축적되는 것으로 나타났다.
실시예 5. 응결 분획을 갖는 적용 초과 시간 경과 후의 서로 상이한 표피층 (상부, 상부 및 중간, 총 표피층) 에서의 증가된 수화율
Hydrascan®은 Dermscan®을 개량한, 표피의 수화를 측정하는 기구이다. 그 측정 원리는 임시 열 전달법 (transient thermal transfer; TTT)에 기초한다: 고정 열 파동(constant heat pulse)이 열 감지기와 근접한 촉진자(stimulator)에 의하여 발생되고 표피를 통하여 전파된다. 피부 온도의 개개 변화는 피부 수분량에 비례한다 (Girard P., Beraud A. and Sirvent A. -인간 객체의 생체내 시험에서 경피 수화도를 측정하기 위한 3가지 상보적인 기법 연구: NMR spectroscopy, transient thermal transfer and corneometry -application to xerotic skin and cosmetics.- Skin Research and Technology, 2000, 6: 205-213).
측정법은 mW/℃ (2개 측정 지점 사이의 t°차이와 관련하여, 2개 측정 지점 사이의 열을 전도하는 능력을 측정하는 열 전도사이의 열전달 계수이다)으로 나타냈다.
이 장치는 3개 층, 즉 표피의 상층부, 중간 층 및 심층부 사이의 차별성을 형성시켜 표피의 수화도를 측정할 수 있다.
본 연구는 15명의 자원자 (18-50세의 정상 피부상태의 백인 여성)에게 70mm3 의 응결 분획을 갖는 기구를 28℃에서 팔뚝에 적용하였다. 수화 동력학(Hydration kinetics)을 히드라스캔 (Hydrascan) 측정법을 이용하여 0h, 1h, 2h, 3h 및 4h의 시간대 별에 측정을 수행하였다. 응결 분획 최하면의 수화도 측정은 개개 시간에 수행하였으며 상기 응결분획을 적용하지 않은 피부 면에서 측정된 측정치와 비교하였다. 얻어진 결과는 도 5에 표시하였고, 이는 적용 최초 1 시간부터 상기 응결 분획 내에서의 수화율 (hydration rate) 상의 증가를 나타냈으며 이 수화현상은 초과시간동안 유지되었다.
실시예 6. 응결 분획을 갖는 적용 초과 시간 경과 후의 피부 표면의 증가된 수화율
본 연구는 15명의 자원자 (18-50세의 정상 피부상태의 백인 여성)에게 70mm3 의 응결 분획을 갖는 기구를 26℃에서 팔뚝에 적용하였다. 무의식적 수분 소실 (Insensible Water Loss (IWL))의 측정은 Tewameter®210 (Courage and Khazaka Electronic Gmbh., Koln, 독일)을 이용하였다.
피부에서의 상기 응결 분획하에 축적된 수분량의 측정 결과를 기구를 제거하자 마자 90초간 매초마다 기록하는 IWL 측정치를 이용하여 계산하였다. 곡선아래 면적을 매 측정 시점에 계산하였다. 측정은 상기 응결 분획의 적용 후 0h 1h, 2h, 3h 및 4h 에 수행하였다.
얻어진 실험 결과는 도 6에 나타냈고 처치 중 피부 표면상에 축적된 수분 량이 증가 함을 확인하였다.
실시예 7. 피부에 적용시간을 연장함으로서 경피 경로를 통하여 유도된 항- 오발부민 항체 면역 반응의 증강효과
건조 형태의 OVA (100μg) 또는 TT (100μg)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (도 7A에서 n=6, 도 7B에서 n=10) 등판에 적용하였다. 상기 적용은 하기 상이한 처치법에 따라 새로이 적용하였다:
(1) 프로토콜 1: 최초 적용 후 2 주 및 4 주째 (도 7A 및 7B),
(2) 프로토콜 2: 최초 적용 후 2, 7, 9, 14, 21 및 28일째 (도 7B).
항-OVA 총 IgG-형 항체를 항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주 후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 도 7A 및 7B에 제시된 결과는 항원-특이적 항체 역가 (antigen-specific antibody titre)로 표시하였다. 개개 동물의 혈청에 대하여, 이는 그 450nm에서 측정된 흡광도가 처치하지 않은 마우스 혈청 상에서 측정된 차단 치(cut-off value)와 동일한 희석결과와 정반대 결과이다. 이렇게 얻어진 결과는 48시간의 적용 시간으로 특히 현저한 항원-특이적 면역 반응을 유도함을 나타내는 것이다.
실시예 8. 패취형 시스템과 비교시, 보체 화합물이나 피부의 어떠한 천공 또는 찰과상 처치도 없이 경피 경로로 면역원에 특이적인 강력한 항체 면역 반응을 유도하는 효과
건조 형태의 표준 면역원인 콜레라 독소 (CT)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=10) 등판에 24시간 동안 적용하였다. 상기 적용은 최초 적용 후 2주 및 4주 후에 새로이 적용하였다.
추가적으로, 액체 상태로 면역원이 흡수된 거즈로 구성되고, 통상적인 점착 플라스터(adhesive plaster)로 포장된 패취 형 시스템을 이미 개시된 기구와 같이, 동일 조건하에서 웅성 BALB/c 마우스 (n=10) 등판에 적용하였다. 항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주 후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 도 8에 제시된 결과는 항원-특이적 항체 역가 (antigen-specific antibody titre)로 표시하였다. 개개 동물의 혈청에 대하여, 이는 그 450nm에서 측정된 흡광도가 처치하지 않은 마우스 혈청 상에서 측정된 차단 치(cut-off value)와 동일한 희석결과와 정반대 결과이다.
이렇게 얻어진 결과는 패취형 시스템과 비교시에, 응결 분획으로 경피 투여법을 이용시에 강력한 면역원-특이적인 면역 반응을 유도함을 나타내는 것이다.
실시예 9. 보체 화합물 없이 저용량의 항원을 갖는 경피 경로로 항- TT 항체 면역 반응을 유도하는 효과
건조 형태의 TT (10 또는 100㎍)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=10) 등판에 24시간 또는 48시간 동안 적용하였다. 상기 적용은 최초 적용 후 2주 및 4주 후에 새로이 적용하였다.
항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주 후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 도 9에 제시된 결과는 항원-특이적 항체 역가 (antigen-specific antibody titre)로 표시하였다. 개개 동물의 혈청에 대하여, 이는 그 450nm에서 측정된 흡광도가 처치하지 않은 마우스 혈청 상에서 측정된 차단 치(cut-off value)와 동일한 희석결과와 정반대 결과이다.
실험 결과, TT 100㎍을 포함하는 응결분획을 24 시간 동안 경피 투여시 및 TT 10㎍을 포함하는 응결분획을 48 시간 동안 경피 투여시와 동등하게 항원-특이적 항체 역가를 유도함을 나타냈다.
실시예 10. 응결분획을 갖는 기구의 피부 적용 시간 연장에 비례한 표피 농밀화 유도 효과
건조 형태의 OVA (100㎍/cm2)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=8 내지 16) 등판에 0, 24시간 또는 48시간 동안 적용하였다. 응결분획 하면의 피부 면적을 채취하고 냉동시켰다. 상기 시료로부터 얻은 피부 단편을 염색제(Hemalun-eosin)로 염색하였다. 도 10에 제시된 결과는 200배 확대한 현미경 사진 관잘 결과를 보여 준다.
실험 결과, OVA를 포함하는 응결분획을 갖는 경피 투여 기구의 적용은 24시간 동안의 적용 및 48시간 적용 후에 표피가 농밀화(thickening)를 유도함을 나타냈다.
실시예 11. 응결분획을 갖는 기구의 피부 적용 시간 연장에 비례한, 항원의 피부 진입 및 이의 수지상 세포에 의한 진행 유도 효과
(a) 건조 형태의 Alexa 488 (A488)이 결합된 OVA (100㎍/cm2)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=10 내지 20) 등판에 6, 24시간 또는 48시간 동안 적용하였다. 응결분획 하면의 피부 면적을 채취하였다. 진피로부터 표피를 분리한 후(0.5% 트립신), 표피 세포를 기계적인 재현탁법으로 분리하고 진피세포는 효소적 가수분해법으로 분리하였다 (collagenase/DNase). 세포 현탁액 및 수지상 세포 중에서 OVA-A488 가 탐지되고, 상기 세포들은 유세포 분석법에 의하여(FACscallibur 및 Cell quest software) CDc 마커(marker)로 동정되었다. 도 11에 제시된 결과는 개개 세포 현탁액 (표피 및 진피)의 총 세포 및 수지상 세포 (CD11c+) 중 형광 세포 (OVA-A488 +)의 백분율로 표시하였다.
실험 결과, 일부 표피 및 진피 세포는 OVA-A488 + 양성으로 나타났고 이들의 비는 OVA-A488 함유 응결분획을 갖는 경피 투여기구의 적용기간의 연장과 함께 중가하였음을 나타냈다. 이러한 OVA-A488 + 세포 일부는 수지상 세포 (CD11c+)이고 유사하게, 수지상 OVA-A488 + 세포의 비중은 응결분획을 갖는 경피 투여기구의 적용기간의 연장과 함께 중가하였음을 나타냈다.
(b) 건조 형태의 Alexa 488 (A488)이 결합된 OVA (100㎍/cm2)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 돼지 (n=1) 등판에 24시간 동안 적용하였다. 응결분획 하면의 피부 면적을 채취하였다. 진피로부터 표피를 분리한 후(0.5% 트립신), 표피 세포를 기계적인 재현탁법으로 분리하고 진피세포는 효소적 가수분해법으로 분리하였다 (collagenase/DNase). 세포 현탁액 및 수지상 세포 중에서 OVA-A488가 탐지되고, 상기 세포들은 유세포 분석법에 의하여(FACscallibur 및 Cell quest software) SLA-II 마커(marker)로 동정되었다. 도 11에 제시된 결과는 개개 세포 현탁액 (표피 및 진피)의 총 세포 및 수지상 세포 (SLA-II+) 중 형광 세포 (OVA-A488 +)의 백분율로 표시하였다.
실험 결과, 일부 표피 및 진피 세포는 OVA-A488 함유 응결분획을 갖는 경피 투여기구의 24시간 적용 후에 OVA-A488 + 양성으로 나타났다. 이러한 OVA-A488 + 세포 일부는 수지상 세포 (SLA-II+)이다.
도 11에 주어진 결과는 응결 분획을 포함하는 경피 투여 기구가 피부로의 항원 진입을 촉진시키고 수지상 세포에 의한 이들의 진행을 촉진시킴을 확인시켰다.
실시예 12. 응결분획을 갖는 기구의 피부 적용 시간 연장에 비례한 표피 랑거한스 세포의 네트워크상의 변화 유도 효과
건조 형태의 OVA (100㎍)을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=5) 등판에 0, 24시간 또는 48시간 동안 적용하였다. 응결분획 하면의 피부 면적을 채취하고 냉동시켰다. 상기 랑거한스 세포(Langherans cells)는 CD207 마커를 이용하여 시료로부터 얻은 피부단편으로 동정되었다. 도 12에 제시된 결과는 200배 확대한 현미경 사진 관잘 결과를 보여 준다.
실험 결과, OVA를 포함하는 응결분획을 갖는 경피 투여 기구의 적용은 24시간 동안의 적용 및 48시간 적용 후에 표피의 랑거한스 세포의 네트워크(network) 상의 변형을 유도함을 나타냈다. 이러한 현상은 이러한 세포들의 활성화의 특징이다.
실시예 13. 종양 항원을 함유하는 응결분획을 갖는 기구의 피부로의 24시간 적용 후에 시험관내 세포를 발현하는 종양 항원을 목표화할 수 있는 종양 항원에 특이적인 항체 생산에 대한 유도 효과
건조 형태의 종양항원을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 적용 전에 면도하고 탈모시킨 웅성 BALB/c 마우스 (n=6) 등판에 24시간 동안 적용하였다. 상기 적용은 최초 적용 후 2주 및 4주 후에 새로이 적용하였다.
항-항원(anti-antigen) 총 IgG-형 항체를 최종 적용 2주 후에 채취된 동물 혈청을 대상으로 ELISA법으로 분석을 수행하였다. 동물 혈청을 종양 항원을 발현하는 세포와 같이 배양하였다. 세포 상에 종양 항-항원 항체의 고정화를 형광성 유세포 분석법에 의하여(FACscallibur 및 Cell quest software) 마우스 항-IgG 항체를 표지시킨 후에 탐지하였다. 도 13에 제시된 결과는 세포수와 관련하여 형광도를 나타내는 그래프 형태로 표시하였다.
실험 결과, 종양 항원을 함유하는 응결분획을 갖는 경피 투여 기구를 이용한 경피 경로를 통하여 면역화된 마우스 혈청에 포함된 종양 항-항원 항체는 종양항체를 발현하는 세포를 시험관내 방법으로 인지함을 나타냈다.
실시예 14. RSV 항원을 함유하는 응결분획을 갖는 기구의 피부로의 48시간 적용 후에 젊은 마우스의 호흡기 세포융합바이러스 ( RSV ) 감염에 대한 부분적 보호효과에 대한 유도 효과
건조 형태의 호흡기 세포융합바이러스 항원을 포함하고 10mm3/cm2 의 부피를 갖는 응결 분획을 사용하는 점만 제외하고 실시예 1에 따라 제조된 경피 투여 기구를, 젊은 BALB/c 마우스 (7 일) 등판에 48시간 동안 적용하였다. 항원을 대조군으로서 비강내 경로로 보체와 함께 공동 투여하였다. 바이러스 시험은 비강-경로를 통하여 백신화 24시간 이후에 수행되었다. 바이러스 RNA에 대한 어세이는 주사 5일후에 채취된 폐에서 수행되었다. 도 14에 제시된 실험 결과는 참고 유전자(reference gene)과 비교하여 폐에서 바이러스 RNA의 상대량으로 표시하고 양성대조군 (백신화되지 않는 환자)과 관련하여 표준화하였다.
실험 결과, RSV 항원을 함유하는 응결분획을 갖는 경피 투여 기구를 피부에 48시간 적용한 후에 젊은 마우스에 바이러스 부하가 비-처치된 젊은 마우스와 비교시에 절반으로 감소하였다.

Claims (28)

  1. 어떠한 보체가 없는 건조형태의 백신 제형을 포함하며, 피부와 접촉시에 백신 제형을 포함하는 응결 분획을 형성하는 경피 기구를 수단으로 어떠한 피부 처리없이 포유동물의 온전한 피부에 경피경로로 적용하여 투여되도록 제형화된, 포유동물의 경피적 백신화를 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 백신 제형은 항원을 포함하여, 피부와 접촉시에 백신 제형을 포함하는 응결 분획을 형성하는 경피 기구는 어떠한 피부의 전처리 또는 보체와의 어떠한 공동투여도 없이, 표피로 진입하게 하고 면역 반응을 가능하게 함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 응결분획의 벽이 10g/m2/24h이하의 MVTR (수증기투과율)을 갖는 소재를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 응결분획의 부피가 기구 표면 cm²당 1 내지 300mm3 범위의 부피를 갖음을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 응결분획이 표피 외부 표면상 및 기구의 응결 내에서, 적용 1시간 시점부터 50%이상의 수화율 증가를 유도하도록 허용함을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 기구는 점착 수단에 의하여 피부에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 분말 형태임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 표면상에 점착성 물질이 없다면 화학적 또는 물리화학적 힘에 의하여, 기구 표면 상에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 정전기 힘 또는 반 데어 발스 힘에 의하여, 기구 표면상에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 기구는 0.1㎍/cm2 내지 500㎍/cm2 표면 범위의 백신 제형 양을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 펩티드 또는 폴리펩티드 형태, 또는 상이한 화학적 형태를 갖는 구성요소와 접합된 폴리펩티드 중 하나 이상의 항원을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 경피 기구 형태로 제형화된 백신 제형은 개개 적용 시점이 7 내지 30일간 떨어진 간격으로, 2개 이상의 기구로 객체에 연속적으로 적용하도록 적용됨을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    개개 적용을 위하여, 상기 기구는 6 내지 72시간 동안 피부에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 상기 경피 기구 형태로 제형화된 백신 제형은 48 시간 동안 기구를 연속적으로 3회 이상 적용함을 포함하며, 상기 개개 적용은 15일간의 떨어진 간격을 갖도록 적용됨을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 항원에 대해서 특이적인 면역반응을 유도함을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 백신 제형은 IgG 형의 항체 반응을 유도함을 특징으로 하는 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
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  22. 제 4항에 있어서,
    상기 응결분획의 부피가 기구 표면 cm²당 2 내지 100mm3 범위의 부피를 갖음을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 10항에 있어서,
    상기 기구는 20㎍ 내지 300㎍/cm2표면 범위의 백신 제형 양을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 기구는 20㎍ 내지 100㎍/cm2 표면 범위의 백신 제형 양을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 12항에 있어서,
    상기 적용은 개개 적용 시점이 10 내지 20일간 떨어진 간격임을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 적용은 개개 적용 시점이 15 일간 떨어진 간격임을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 13항에 있어서,
    개개 적용을 위하여, 상기 기구는 6 내지 48 시간 동안 피부에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 27항에 있어서,
    개개 적용을 위하여, 상기 기구는 48시간 동안 피부에 고착됨을 특징으로 하는 조성물.
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