KR20100098656A

KR20100098656A - 마이크로칩 및 혈액 관측 장치

Info

Publication number: KR20100098656A
Application number: KR1020107013982A
Authority: KR
Inventors: 가즈야 호소카와; 도모코 와다
Original assignee: 후지모리 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2010-09-08
Also published as: CN101874208A; US20100267066A1; EP2228657A4; EP2228657B1; JP5317988B2; CA2706646A1; CN101874208B; AU2008330621A1; WO2009069656A1; RU2010126151A; US8425840B2; BRPI0820397A2; JPWO2009069656A1; EP2228657A1

Abstract

전혈 혹은 다혈소판 혈장, 또는 이들의 약제 처리액으로부터 선택되는 제1 액체를 유입시키는 제1 유로와, 제1 유로에 접속되고, 상기 제1 액체와 반응할 수 있는 약제를 포함하는 제2 액체를 유입시키는 제2 유로와, 제1 유로와 제2 유로의 접속부로부터 연장 형성된 합류 유로를 내부에 구비하는 마이크로칩으로서, 상기 합류 유로에, 상기 제1 액체와 상기 제2 액체를 혼합하는 교반자를 가지는 교반부가 설치된 것을 특징으로 하는, 마이크로칩 및 그것을 사용한 혈액 관측 장치.

Description

마이크로칩 및 혈액 관측 장치{MICROCHIP AND BLOOD MONITORING DEVICE}

본 발명은, 미량의 혈액과 약제를 효율적으로 혼합하여 혈액의 반응성, 성상(性狀) 등을 조사하기 위한 칩에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 혈액 응고능(凝固能)과 혈소판 기능 등의 혈액 관측을 행하기 위한 마이크로칩 및 이것을 사용한 혈액 관측 장치에 관한 것이다.

심근경색 등의 아테로마(atheroma)성 혈전증은, 동맥 경화 부위에서 아테로마 플라크(plaque)가 혈류에 폭로된 조직 인자를 포함하는 콜라겐 상에, 혈소판이 점착되고, 또한 혈소판 응집, 혈액 응고계의 활성화가 복합적으로 일어나, 폐색성의 위험한 혈전이 생기게 한다. 심근경색 등의 심질환에 의한 사망은 일본에서도 전체 사인의 2위를 차지하는 위험한 질환이다.

그러나, 심근경색 등에 있어서는 동맥 경화 영역에서만 혈전 생성이 진행되어, 전신에 혈전 경향이 극단적으로 진행되지는 않는다. 이와 같은 혈전증에 있어서의 혈전 경향의 평가, 항혈전 요법에 있어서의 항혈전 효과의 모니터링에는 시험관 내의 시험은 적합하지 않고, 혈류의 존재하에서, 응고 및 혈소판(점착, 응집)에 대한 종합적인 평가가 중요하다.

종래, 혈액 응고능의 평가는, 혈장을 이용한 부분 활성화 트롬보플라스틴 시간(APTT), 트롬보플라스틴 시간(PT)에 의해 관측되고 있다. APTT는 주로 내인계(內因係) 응고, PT는 외인계(外因係) 응고를 반영한다. 혈소판의 관측으로서는 다혈소판 혈장을 사용하고, 아데노신2인산(ADP), 콜라겐 등의 혈소판 활성화 물질을 첨가하여 투과도의 변화 등에 의해 혈소판의 응집능을 평가할 수도 있다. 또한, 전혈(全血) 응고 시간, 칼슘 재첨가(再添加) 전혈 응고 시간 등에 의해 전혈의 응고 시간의 측정도 행해진다.

또한, 전혈을 사용한 관측계로서는 트롬보엘라스토그램(thromboelastogram)이 사용되어, 응고 성분의 활성화 및 혈소판의 응집 등이 모니터링된다.

그러나, 생체 내에서는 혈류하에서 혈전이 성장하는데 반해, 전술한 관측 방법 등은 폐쇄된 시험관 내에서의 측정이므로, 혈전이 생체 내에서 성장하는 상태를 관찰할 수 없다.

전술한 문제점을 해결하는 제안으로서 특허 문헌 1, 비특허 문헌 1 및 2에는, 평가할 항혈전약이 투입된 혈액을 콜라겐 셀상을 통해 통과시켜, 혈소판을 형광 표지(fluorescent label)함으로써 혈소판의 점착, 응집을 공초점(共焦點) 현미경 장치에 의해 모니터링하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 전술한 문헌에 기재된 발명은, 항응고약의 존재하에서 관측을 행하므로, 응고계에 의해 일어나는 혈소판의 점착, 응집에 의한 혈전이 생성되지 않는 문제, 내지는, 혈전의 생성능의 저하를, 혈소판의 형태 변화를 관측함으로써 평가하여, 응고계와 연동한 혈소판의 활성화가 반영되지 않는 문제가 있다. 따라서, 항혈소판약의 약효를 평가하기 위해서는 바람직한 기술이지만, 혈전 자체나 혈전 생성 과정 전체를 모니터링할 수는 없다.

또한, 특허 문헌 2에는, 혈관을 모방한 유로에 항응고 처리된 혈액을, 항응고 처리를 해제하거나 또는 혈액 응고를 촉진하면서 흐르게 하여 혈전의 생성을 관측하는 혈전 관측 장치로서, 그 내부의 적어도 일부에 혈전 생성을 유발하는 혈전 유발재를 포함하는 혈전 생성실과; 상기 혈전 생성실에 접속되어 상기 혈전 생성실에 혈액을 유입시키는 유입관과; 상기 유입관에 접속되어 상기 유입관에 항응고 처리를 해제하는 약제 또는 혈액 응고를 촉진하는 약제를 투입하는 약제관을 구비하는 것을 특징으로 하는 혈전 관측 장치가 개시되어 있다. 이 장치에 의하면, 미량의 혈액 샘플을 테스트하여 혈액 관측을 행할 수 있지만, 혈액과 항응고 해제제나 응고 촉진제가 쉽게 섞이지 않는 경우가 있어, 개선의 여지가 있다.

또한, 특허 문헌 1, 비특허 문헌 1 및 2의 방법에 따라 혈소판을 퀴나크린(quinacrine)으로 염색한 경우에는, 백혈구도 동시에 염색되어 혈소판의 기능만을 선택적으로 평가할 수는 없다. 또한, 형광 색소의 퇴색이나 장치가 고가인 점 등 관측에 적합하지 않은 점이 많았다.

또한, 종래의 섬유소용해(fibrinolysis)의 평가는, 피브린의 용해만을 측정하는 것이며, 실제 동맥에 있어서 생성되는 백색 혈전의 용해 효과를 측정할 수 있는 방법은 존재하지 않았다.

기판에 원하는 유로의 홈을 형성하여, 커버판과 접합시킴으로써 형성되는 마이크로 유체칩이 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis), PCR, 그 외, 각종 관측 등 다양한 용도에 사용되고 있다. 마이크로칩 내의 액체는 레이놀즈수(Reynolds number)가 매우 커지는 것에 의해 층류(laminar flow)가 형성되어, 마이크로칩 내의 액체를 자연스럽게 혼합시키기가 곤란하다. 이 문제를 해결하기 위하여, 다양한 방법이 시도되고 있다.

예를 들면, 특허 문헌 3에는 기둥형 돌기물로 이루어지는 교반자, 특허 문헌 4에는 피에조 효과로 진동하는 교반자, 특허 문헌 5에는 광의 압력으로 회전하는 교반자가 각각 제안되어 있다. 그러나, 제안된 이들 교반자를 사용하여 전혈, 다혈소판 혈장, 이들의 약제 처리액 등을 포함하는 액체를 마이크로칩 내에서 교반하면 활성화가 일어나 혈액 응고 등이 발생하는 경우가 있으며, 예를 들면 혈액 응고나 혈소판 기능 등을 관측하는 경우에는, 정확하게 관측하기가 매우 곤란하다. 또한, 유로를 길게 형성함으로써 마이크로칩 내의 액체를 자연스럽게 혼합하는 것도 고려할 수 있지만, 마이크로칩이 커지는 문제점이 있다. 그리고, 이를 방지하기 위해 유로를 구불구불하게 복수회 굴곡시키면 액체가 체류하는 영역 등에서 활성화가 일어나 혈액 응고 등이 생기고, 관측을 정확하게 행할 수 없다.

특허 문헌 1: 일본 특허출원 공개번호 2004-251630호 공보 특허 문헌 2: 국제 공개 제2007/046450호 팜플렛 특허 문헌 3: 일본 특허출원 공개번호 2007-24522호 공보 특허 문헌 4: 일본 특허출원 공개번호 2006-205080호 공보 특허 문헌 5: 일본 특허출원 공개번호 2001-252897호 공보

비특허 문헌 1: Blood. 1990;75:390-398 비특허 문헌 2: Blood. 1999 Aug 1;94(3):968-75

본 발명은, 전술한 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 전혈 또는 다혈소판 혈장(본 명세서에 있어서는, 이들을 합쳐서 「혈액」이라고도 함)을 사용하여 혈류와 동등한 환경 하에서 혈액 응고 및 혈소판에 의한 혈전 생성에 대해 미량의 혈액 사용하여 효율적이며 정확하게 평가할 수 있는 장치 및 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 전혈 또는 다혈소판 혈장 또는 이들의 약제 처리액으로부터 선택되는 제1 액체를 유입시키는 제1 유로와; 제1 유로에 접속되어, 상기 제1 액체와 반응할 수 있는 약제를 포함하는 제2 액체를 유입시키는 제2 유로와; 제1 유로와 제2 유로의 접속부로부터 연장 설치된 합류 유로를 내부에 구비하는 마이크로칩으로서, 상기 합류 유로에, 상기 제1 액체와 상기 제2 액체를 혼합시키는 교반자를 가지는 교반부가 설치된 것을 특징으로 하는, 마이크로칩을 제공한다.

상기 교반자의 표면은 응고 억제 처리되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 응고 억제 처리는 응고계의 접촉층을 활성화시키지 않는 처리이면 특별히 한정되지 않지만, 헤파린, 폴리비닐락톤아미드 또는 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트로 적어도 상기 교반자의 표면을 형성하는 처리인 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로칩에 있어서는, 상기 교반부의 폭은, 상기 합류 유로보다 넓은 것이 바람직하고, 또한, 하류 쪽으로 가면서 점차 좁아지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 교반부의 깊이는, 상기 합류 유로보다 깊은 것이 바람직하고, 또한, 하류 쪽으로 가면서 점차 얕아지는 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로칩에 있어서는, 상기 합류 유로의 깊이가 50㎛∼200㎛인 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로칩은, 상기 제1 유로, 제2 유로 및 합류 유로를 구성하는 홈이 표면에 형성된 제1 기판과, 상기 교반부가 되는 구멍이 표면에 형성된 제2 기판을, 상기 홈 및 구멍의 개구부를 내측으로 하여 적층시켜 이루어지는 마이크로칩인 것이 바람직하다. 여기서, 상기 제1 기판과 제2 기판의 접합 강도가 0.5∼50kgf이면서 내부에 혈액을 흘렸을 때의 내압성이 100kPa인 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로칩은, 상기 교반부의 하류에, 그 내부의 적어도 일부에 혈전의 생성을 유발하는 혈전 생성 유발재가 포함된 혈전 생성실을 가지는 것이 바람직하다. 여기서, 혈전 생성 유발재는 콜라겐 또는 콜라겐과 조직 인자의 혼합물인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기한 것 중 어느 하나의 마이크로칩을 사용하는 혈전 형성의 측정 방법으로서, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시키고, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 항응고 처리된 혈액은 구연산에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 항응고 처리를 해제시키는 시약은 칼슘을 포함하는 용액인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기한 것 중 어느 하나의 마이크로칩을 사용하는 혈전 형성 및 혈전 용해능의 측정 방법으로서, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시키고, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정하고, 또한 상기 제2 유로로부터 혈전 용해 물질을 유입시켜 생성한 혈전을 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 혈전 용해 물질이 플라스민, 유로키나아제, 및 조직 플라스미노겐 액티베이터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종류 이상인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기한 것 중 어느 하나의 마이크로칩을 사용하는 혈소판 기능의 측정 방법으로서, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 혈소판을 활성화시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시키고, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실을 통과시켜서 혈소판 기능을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 항응고 처리된 혈액은 구연산 또는 헤파린에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 혈소판을 활성화시키는 시약이 ADP, 콜라겐, 리스토세틴(ristocetin), 또는 아라키돈산인 것이 바람직하다.

전술한 각 방법에 있어서는, 제1 유로로부터 유입시키는 항응고 처리된 혈액과 제2 유로로부터 유입시키는 시약의 용량비가 10:2 ∼ 100:1인 것이 바람직하다. 또한, 상기 교반부에 있어서, 제1 유로로부터 유입된 혈액과 제2 유로로부터 유입된 시약의 혼합액이 5초∼3분간 교반되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 교반자의 선회 속도가 30∼300 회전/분인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기한 것 중 어느 하나의 마이크로칩을 사용하여 이루어지는 혈액 관측 장치를 제공한다. 본 발명의 혈액 관측 장치에 있어서는, 상기 제1 유로와 상기 제2 유로가 하방(下方), 및 상기 합류 유로가 상방(上方)이 되도록 본 발명의 마이크로칩이 설치되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 혈액 관측 장치는 상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 합류 유로 중 적어도 1개의 유로에 걸리는 압력을 측정하기 위한 압력 센서를 구비하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 혈액 관측 장치는 상기 합류 유로 내를 관찰하기 위한 카메라를 구비하는 것이 바람직하다.

카메라는 유로 내를 일정 시간마다 정지화상 또는 동영상으로서 자동으로 촬영하는 기능을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한, 유로 전체를 파노라마 사진 또는 정지화상의 연속으로서 정지화상으로 일정 시간 간격으로 촬영할 수 있으면, 측정 후의 유로의 폐색 상황을 시각적으로도 확인할 수 있어서 더욱 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 마이크로칩을 사용하여 관측하는 혈액의 관측 방법으로서, 항응고 처리된 전혈 또는 다혈소판 혈장을, 항응고 처리를 해제하는 약제, 혈소판을 활성화시키는 약제 또는 혈전 용해제와 유로 내에서 교반하여 혼합하고, 유로 내를 유동시키면서 관측하는 것을 특징으로 하는, 혈액 관측 방법을 제공한다. 여기서, 혈전 용해제가 유로키나아제, 플라스민 및 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA)로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다. 혈액 관측 방법으로서는, 혈액 응고 또는 혈소판 기능의 측정 방법인 것이 바람직하다. 또한, 혈소판을 활성화시키는 약제가 아데노신2인산(ADP), 콜라겐, 트롬빈 및 리스토세틴으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. 그리고, 본 발명의 혈액 관측 방법은, 혈액 응고나 혈소판 기능의 관측에 사용하는 것이 바람직하다.

청구항 1에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 합류 유로에 제1 액체와 제2 액체를 혼합하기 위한 교반자를 가지는 것에 의해, 제1 액체와 제2 액체를 마이크로칩 혼합부에서, 혈액 응고의 활성화에 의한 혈액 응고덩어리 등의 발생을 억제하도록 교반하여 균일하게 혼합할 수 있으므로, 전혈, 다혈소판 혈장, 이들의 약제 처리액 등을 포함하는 액체를 마이크로칩 내에서, 예를 들면 혈액 응고나 혈소판 기능 등을 관측하는 경우에 적합하다.

청구항 2 및 3에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 제1 액체와 제2 액체가 합류한 액체의 응고를 억제하는 응고 억제 처리가, 헤파린, 폴리비닐락톤아미드 또는 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트로 적어도 교반자의 표면을 형성하는 처리인 경우에는, 교반자를 용융 수지에의 침지에 의한 피복이나 사출 성형 등의 수지 가공으로 제작할 수 있으므로, 마이크로칩을 효율적으로 제작할 수 있다.

청구항 4에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 교반부의 폭은, 상기 합류 유로 보다 넓으므로, 제1 액체와 제2 액체가 합류한 액체의 교반부에 있어서의 체류 시간을 길게 할 수 있어서, 충분히 교반할 수 있다.

청구항 5에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 교반부의 폭은 하류 쪽으로 가면서 점차로 좁아지므로, 교반 후의 혼합액이 하류의 합류 유로에 원활하게 흘러서, 교반부의 출구에서 액체의 활성화에 의한 혈액 응고 등이 발생하지 않는다. 또한, 교반부의 공기가 용이하게 유출되어, 교반부에 공기가 잔류하지 않는다.

청구항 6에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 교반부의 깊이는 상기 합류 유로보다 깊기 때문에, 제1 액체와 제2 액체가 합류한 액체의 교반부에 있어서의 체류 시간을 길게 할 수 있어서, 충분히 교반할 수 있다.

청구항 7에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 교반부의 깊이는 하류 쪽으로 가면서 점차 얕아지므로, 교반 후의 혈액 혼합액이 하류의 합류 유로에 원활하게 흘러서, 교반부의 출구에서 액체의 활성화에 의한 혈액 응고 등이 발생하지 않는다. 또한, 교반부의 공기가 용이하게 유출되어, 교반부에 공기가 잔류하지 않는다.

청구항 8에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 합류 유로의 깊이가 50㎛∼200㎛이므로, 소량의 시료 및 시약으로 해석을 행할 수 있어서, 바람직하다.

청구항 9에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 마이크로칩을, 상기 제1 유로, 제2 유로 및 합류 유로를 구성하는 홈이 표면에 형성된 제1 기판과, 상기 교반부가 되는 구멍이 표면에 형성된 제2 기판을, 상기 홈 및 구멍의 개구부를 내측으로 하여 적층시켜 얻을 수 있으므로, 간편하게 마이크로칩을 제작할 수 있다.

청구항 10에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 제1 기판과 제2 기판의 접합 강도가 0.5∼50kgf이므로, 혈전 형성을 측정한 후에, 양 기판을 박리하여 해석할 수 있어서, 바람직하다.

또한, 청구항 11에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 상기 교반부의 하류에, 그 내부의 적어도 일부에 혈전의 생성을 유발하는 혈전 생성 유발재가 포함된 혈전 생성실을 가지므로, 교반 후의 혼합액이 혈전 생성실을 통과할 때 혈전 생성이 유발되므로, 혈액 응고능이나 혈소판에 의한 혈전을 생성할 수 있다.

청구항 12에 따른 본 발명의 마이크로칩에 의하면, 혈전 생성 유발재가 콜라겐 또는 콜라겐과 조직 인자의 혼합물이므로, 효율적으로 혈전이 생성된다.

청구항 13에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정함으로써, 혈액과 시약이 효율적으로 혼합되어 혈전 생성실에 도달하므로, 효율적으로 혈전 형성을 측정할 수 있다.

청구항 14에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은 구연산에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 항응고 처리를 해제시키는 시약은 칼슘을 포함하는 용액이므로, 저렴한 비용으로 항응고 처리를 행할 수 있어서, 바람직하다.

청구항 15에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정하고, 또한 상기 제2 유로로부터 혈전 용해 물질을 유입시켜 생성된 혈전을 용해시킴으로써, 혈전 형성 및 혈전 용해능의 양쪽을 측정할 수 있다.

청구항 16에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 혈전 용해 물질이 플라스민, 유로키나아제, 및 조직 플라스미노겐 액티베이터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종류 이상이므로, 효율적으로 혈전을 용해시킬 수 있다.

본 발명의 마이크로칩을 사용한 청구항 17에 따른 측정 방법에 의하면, 상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 혈소판을 활성화시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실을 통과시킴으로써, 혈소판 기능을 측정할 수 있다.

청구항 18에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은 구연산 또는 헤파린에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 혈소판을 활성화시키는 시약은 ADP, 콜라겐, 리스토세틴, 또는 아라키돈산이므로, 효율적으로 혈소판을 활성화시킬 수 있다.

청구항 19에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 제1 유로로부터 유입시키는 항응고 처리된 혈액과 제2 유로로부터 유입시키는 시약의 용량비가 10:2∼100:1이므로, 소량의 시약으로 효율적으로, 혈전 생성, 혈전 용해, 또는 혈소판 활성화되도록 할 수 있다.

청구항 20에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 교반부에 있어서, 제1 유로로부터 유입된 혈액과 제2 유로로부터 유입된 시약의 혼합액이 5초∼3분간 교반되므로 혈액과 시약을 균일하게 혼합할 수 있다.

청구항 21에 따른 본 발명의 측정 방법에 의하면, 상기 교반자의 선회 속도가 30∼300 회전/분이므로, 비교적 엄격하지 않은 조건에서 교반을 행할 수 있다.

본 발명의 혈액 관측 장치는 본 발명의 마이크로칩을 포함하는 것이므로, 미량의 혈액 샘플로 효율적으로 혈액 관측을 행할 수 있으므로, 피검사자의 부담이 작아진다.

또한, 본 발명의 혈액 관측 장치에 있어서, 상기 제1 유로와 상기 제2 유로가 하방, 및 상기 합류 유로가 상방이 되도록 마이크로칩이 설치된 것이면, 유로나 교반부에 기포가 생길 경우에, 기포는 자연스럽게 위쪽으로 축출되므로, 기포의 방해없이 안정적으로 균일하게 교반·혼합할 수 있고, 혈액 관측을 더욱 정확하게 행할 수 있다.

또한, 제1 유로, 제2 유로 및 합류 유로가 상부에 설치되고, 교반자를 포함한 교반의 홈이 하부에 설치되면 기포가 교반부에 모이지 않고 균일하게 교반·혼합할 수 있고, 혈전 관측을 더욱 정확하게 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 혈액 관측 장치가 상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 합류 유로 중 적어도 1개의 유로에 대한 압력을 측정하기 위한 압력 센서를 구비한 것이면, 혈전 생성이나 혈전 용해의 정도를 수치화할 수 있어서 정량적인 평가가 가능하다.

또한, 본 발명의 혈액 관측 장치가 상기 합류 유로 내를 관찰하기 위한 카메라를 가짐으로써 혈전 생성이나 혈전 용해의 상태를 영상으로서 관찰할 수도 있다.

설치되는 카메라는 동영상, 정지화상을 촬영 가능한 것이 바람직하다. 일정 시간 간격으로 자동적으로 내부의 동영상 및 정지화상을 촬영하여 보존하면, 측정 후에 혈전 형성 상태를 경시적으로 또한 시각적으로 평가할 수 있어서 바람직하다. 유로 내를 파노라마 사진 또는 정지화상의 연속으로서 전체를 촬영할 수 있으면 보존 및 객관적 비교가 용이하므로 더욱 바람직하다. 정지화상, 동영상을 촬영할 경우, 투과형 광원, 즉 카메라와 반대측에 광원을 설치하여 촬영하면 더욱 선명한 화상을 촬영할 수 있다.

마이크로칩 내에 생성된 혈전은, 측정 후 꺼내어서, 전자 현미경이나 형광 염색에 의한 현미경의 관찰, 전기 영동 등 목적에 따라 상세하게 형상, 조성 등을 조사함으로써, 더욱 상세한 검사를 행할 수 있다. 혈전 유발재를 코팅한 영역의 칩을 용이하게 손으로 박리할 수 있으면, 측정 후에 내부로부터 혈전을 꺼낼 수 있으므로 바람직하다.

본 발명의 혈액 관측 방법은, 본 발명의 마이크로칩을 사용하여, 항응고 처리된 전혈 또는 다혈소판 혈장을, 항응고 처리를 해제하는 약제, 혈소판을 활성화시키는 약제 또는 혈전 용해제와 유로 내에서 교반하여 혼합하고, 유로 내를 유동시키면서 관측하는 것을 특징으로 하므로 항혈전약 등의 효능을 인체 내부와 유사한 환경에서 관측하거나, 혈소판의 점착, 응집 등의 혈소판 기능을 측정하고, 혈전의 크기의 변동을 확인하는 혈전 용해 관측을 행하는 것 등이 가능하다.

상기 혈전 용해제가 유로키나아제, 플라스민 및 tPA로부터 선택되는 1종 이상이면, 생리적 상태에 가까운 환경 상태에서 형성된 혈전의 혈전 용해를 효율적으로 관측할 수 있다. 또한, 상기 혈소판을 활성화시키는 약제가 ADP, 콜라겐, 트롬빈 및 리스토세틴으로부터 선택되는 1종 이상이면, 혈소판을 효율적으로 활성화시킬 수 있다.

그리고, 전술한 방법이 혈액 응고능 또는 혈소판 기능을 조사하는 것이면, 항혈전약의 효능이나 혈액 중의 혈소판의 기능을 조사할 수 있으므로 바람직하다.

도 1은 본 발명의 제1 양태에 따른 마이크로칩(1)의 주요부를 나타내는 개념도이다. (A)는 마이크로칩(1)의 제1 기판, (B)는 마이크로칩(1)의 제2 기판, (C)는 완성된 마이크로칩(1)의 평면도, (D)는 완성된 마이크로칩(1)의 정면도(교반자 생략)를 각각 나타낸다.
도 2는 본 발명의 제2 양태에 따른 마이크로칩(2)의 주요부를 나타내는 개념도이다. (A)는 마이크로칩(2)의 제1 기판, (B)는 마이크로칩(2)의 제2 기판, (C)는 마이크로칩(2)의 제3 기판, (D)는 완성된 마이크로칩(2)의 평면도, (E)는 완성된 마이크로칩(2)의 정면도(교반자 생략)를 각각 나타낸다.
도 3은 본 발명의 제3 양태에 따른 마이크로칩(3)의 주요부를 나타내는 개념도이다. (A)는 마이크로칩(3)의 제1 기판, (B)는 마이크로칩(3)의 제2 기판, (C)는 완성된 마이크로칩(3)의 평면도, (D)는 완성된 마이크로칩(3)의 정면도(교반자 생략)를 각각 나타낸다.
도 4는 본 발명의 제1 양태에 따른 혈액 관측 장치 A를 나타내는 개념도이다.
도 5는 본 발명의 제2 양태에 따른 혈액 관측 장치 B를 나타내는 개념도이다.
도 6은 본 발명의 제2 양태에 따른 혈액 관측 장치 B를 수직으로 세워서 설치한 상태를 나타낸 개념도이다.
도 7은 본 발명의 혈액 관측 장치 A를 사용했을 때의 유량-압력 그래프이다. (A)는 제1 펌프로부터 3.2% 구연산 나트륨을 10분의 1량 첨가한 25μg/ml의 콘유래 트립신 저해제(inhibitor)를 첨가한 전혈을, 제2 펌프로부터 0.2M CaCl₂를, 제3 펌프로부터 0.5M EDTA(pH10)을 유입시켰을 때의 결과를 나타낸다. (B)는 제1 펌프로부터 3.2%구연산 나트륨을 10분의 1량 첨가한 전혈을, 제2 펌프로부터 0.1μM ADP 용액을 유입시켰을 때의 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 혈액 관측 장치 B를 사용하여 관찰된 혈전의 상태를 나타낸 도면이다(사진).
도 9는 도 8의 결과를 수치화한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 제4 양태에 따른 마이크로칩(4)의 주요부를 나타내는 개념도이다. (A)는 마이크로칩(4)의 제1 기판, (B)는 마이크로칩(4)의 제2 기판, (C)는 완성된 마이크로칩(4)의 측면도를 각각 나타낸다.
도 11은 본 발명의 혈전 관측 장치 C의 스테이지를 나타내는 개념도이다.
도 12는 본 발명의 혈전 관측 장치 C의 개념도이다.
도 13은 본 발명의 혈액 관측 장치 C를 사용했을 때의 유량-압력 그래프이다. (a)는 control(실시예 7), (b)는 8000 단위/ml tPA 제제(실시예 10), (c)는 0.5 단위/ml 저분자 헤파린(실시예 9)을 각각 나타낸다.
도 14는 본 발명의 혈전 관측 장치 C의 CCD 카메라에 의해, 각 위치에서 경시적으로 정지화상을 촬영하여, 재합성한 도면(중간조 화상)이다.
도 15는 혈전의 주사형 전자 현미경 사진이다. (A)는 본 발명의 혈전 관측 장치 C의 마이크로칩을 박리하여 백색 혈전을 관찰한 도면이다. (B)는 대상의 정치 환경에서 형성되는 혈병(血餠)이다.

먼저, 도면을 참조하여 본 발명의 마이크로칩을 설명한다.

도 1은, 본 발명의 마이크로칩의 제1 형태예를 나타내는 개념도이다. 이하, 도 1에 따라 제1 형태예를 설명한다.

도 1의 (A)는, 마이크로칩의 유로가 되는 홈이 표면에 형성된 제1 기판(100)의 평면도이다. 도 1의 (B)는, 마이크로칩의 교반자의 수납부가 되는 구멍이 배면에 형성된 제2 기판(110)의 평면도이다. 도 1의 (C) 및 (D)는, 이들 홈이나 구멍의 개구부를 내측으로 하여 제1 기판(100)과 제2 제2 기판(110)이 적층된 제1 형태예의 마이크로칩(1)의 평면도 및 정면도이다. 파선은, 홈이나 구멍 등이 마이크로칩(1)의 내부에 존재하는 것을 나타낸다.

도 1의 (A)에 있어서, 제1 기판(100)에는, 제1 유로(101)와 합류 유로(103)로서, 연속된 1개의 홈이 형성된다. 이 홈은 중간에 폭이 좁아지는 협착부(105)가 있고, 협착부(105)의 상류에서 홈의 폭이 넓은 부분에 접속되는 제2 유로(102)가 되는 홈이 형성되어 있다. 이들 홈의 단면 형상은, 요(凹)자형, U자형, V자형 등 임의의 형상을 가진다. 또한, 합류 유로(103)의 하류의 종단에는 폐액 저류부(104)가 되는 구멍이 설치되어 있다. 구멍의 개구 형상은, 원형, 사각형 등 임의의 형상이며, 구멍의 바닥면은 평면일 수도 있고 곡면일 수도 있다. 그리고, 본 명세서의 도면의 설명에 있어서는, 「상류」라고 하는 경우에는 도면의 좌측, 「하류」라고 하는 경우에는 도면의 우측을 의미한다.

도 1의 (B)에 있어서, 제2 기판(110) 상에는, 제1 기판(100)과 적층되었을 때, 각각, 제1 유로(101)의 상류의 시단(始端)에 상당하는 위치에 제1 유입구(111)가 되는 관통 구멍이, 제1 기판(100) 상의 제2 유로(102)의 상류의 시단에 상당하는 위치에 제2 유입구(112)가 되는 관통 구멍이, 제1 기판(100) 상의 폐액 저류부(104)에 상당하는 위치에 배출구(114)가 되는 관통 구멍이, 그리고, 제1 기판(100) 상의 제1 유로(101)와 제2 유로(102)의 접속부에 상당하는 위치에 교반부(113)가 되는 원통형 구멍이 각각 형성되어 있다. 구멍의 바닥면은, 평면일 수도 있고 곡면일 수도 있다. 또한, 제1 기판(100) 상의 협착부(105)로부터 하류의 합류 유로(103)에 씌워지는 제2 기판(110)의 배면에 콜라겐 등의 혈전 생성 유발재가 도포된다. 구체적으로는, 도 1의 (C)에 나타낸 바와 같이, 유발재 설치부(115)에, 안전하게 넓은 폭으로 도포된다. 그리고, 유발재 설치부(115) 내부를 지나는 합류 유로(103)가 혈전 생성실이 된다.

혈전 생성 유발재로서는, 콜라겐이나 vWF(von Willebrand 인자), 사전에 만들어진 혈전, 견사(絹絲)나 면(cotton) 등의 섬유 기재(基材) 등을 예로 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로, 또는 복수개를 조합시켜 사용할 수 있다. 이들 중, 입수가 용이하며, 취급하기 쉽고, 실제 혈관에 가까운 모델이 된다는 점에서 콜라겐이 특히 바람직하고, 콜라겐과 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 것도 바람직하다. 혈전 생성 유발재가 혈류에 의해 유출되지 않도록 콜라겐이나 vWF 등의 혈전 생성 유발재는, 유발재 설치부(115)에 높은 접착 강도로 코팅되어 있다. 콜라겐의 코팅은, 예를 들면 일본 특허출원 공개번호 평05-260950호 공보나 Blood. 1995 Apr 1;85(7):1826-35.에 기재되어 있는 바와 같이, 콜라겐을 산성 용액에 용해하고, 여기에 친수성이 부여된 유리나 폴리스티렌의 기판을 침지하고, 세정, 건조하는 방법 등에 의해 간편하게 높은 접착 강도로 코팅할 수 있다.

소수성의 수지 등에 코팅하는 경우에는, 수지 표면을 플라즈마 처리 등으로 친수화한 후, 원하는 영역에 콜라겐 용액을 도포하고, 자연 건조 내지 감압하에서 건조함으로써 코팅할 수 있다.

또한, 섬유 기재나 사전에 만들어진 혈전 등의 혈전 생성 유발재는, 혈전 생성실이 되는 유발재 설치부(115) 내의 합류 유로(103) 내부에 고정된 상태가 바람직하다. 그리고, 얇은 흡습성 섬유 기재, 예를 들면 면, 부직포나 직포 등에 콜라겐을 함침하고 건조시켜 둠으로써, 더욱 혈전 생성 유발능이 높은 혈전 생성 유발재를 얻을 수 있다. 또한, 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 콜라겐 용액에 이들 기재를 침지시키고 건조시키면, 혈전 생성 유발능이 더욱 높아진다.

혈전 생성 유발재로서 콜라겐을 사용하여 코팅하는 경우, 제2 기판(110) 중 적어도 유발재 설치부(115)가 되는 부위의 기재는 평활한 유리 또는 플라스틱으로 하면 콜라겐의 밀착성이 우수하여 바람직하다. 기재로서 플라스틱을 사용한 경우에는 플라즈마 처리 등으로 친수화하여, 원하는 영역에 콜라겐 용액을 피펫이나 주사기(syringe) 등의 디스펜서로 도포하고, 자연 건조 또는 감압하에서 건조함으로써 콜라겐, 또는 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 콜라겐으로 용이하게 코팅할 수 있다.

그리고, 협착부(105)도 혈전 생성 유발재이며, 협착부(105) 만을 혈전 생성 유발재로서 사용하는 경우도 있다. 본 형태예와 같이 협착 부위(105)를 형성해 두면, 높은 접선응력(tangential stress) 야기 혈소판 응집도 관측할 수 있고, 아테로마 혈전증의 혈전 생성을 재현할 수도 있으므로 바람직하다.

도 1의 (C) 및 (D)에 나타낸 바와 같이, 제1 형태예의 마이크로칩(1)은, 제1 기판(100) 상에 제2 기판(110)을, 제2 기판(110)에 설치된 유발재 설치부(115)를 내측으로 하고, 각 유로 및 교반부(117)가 밀봉되도록, 밀착시켜 적층함으로써 얻어진다.

마이크로칩의 재질은, 금속, 유리나 플라스틱, 실리콘 등이 바람직하다. 또한, 혈액 관측(특히 화상 해석)에 사용하는 관점에서 보면 투명한 재질이 바람직하다. 또한, 회로를 형성하는 관점에서 보면 플라스틱이 바람직하고, 투명한 플라스틱이 특히 바람직하다. 재질을 PDMS(폴리디메틸실록산) 등의 실리콘제로 한 경우에는, 기판 사이의 밀착성이 우수하기 때문에, 제1 기판(100)과 제2 기판(110)을 접착제 등으로 접착하지 않아도 압착함으로써 적층할 수 있지만, 마이크로칩(1)의 내부에 높은 압력이 걸리는 경우에는, 접착제를 사용하는 것이 바람직하다. 폴리스티렌제의 기판을 사용한 경우에는 유로 내를 폴리비닐락톤아미드(PVLA)로 간편하게 높은 접착 강도로 코팅할 수 있으므로, 항응고 처리되어 있지 않은 혈액을 사용하는 경우에, 의도하지 않은 부위에서의 혈액 응고를 억제할 수 있다. 또한, 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트(PMEA)에 의해서도 간편하고 효과적으로 의도하지 않은 부위에서의 혈액 응고를 억제할 수 있다. 그리고, 마이크로칩(1)의 기판에 형성되는 홈이나 구멍은, 날붙이나 레이저 광선으로 도려낼 수도 있지만, 마이크로칩(1)의 재질이 플라스틱인 경우에는, 사출 성형으로 형성할 수도 있다. 사출 성형으로 형성하면, 일정 품질의 마이크로칩(1)을 효율적으로 만들 수 있으므로 바람직하다.

본 형태예의 마이크로칩(1)을 사용한 혈액 관측의 일례를 도 1의 (C) 및 (D)에 따라 설명한다. 제1 유입구(111) 및 제2 유입구(112)에는 튜브(도시되지 않음)가 접속되고, 튜브를 통하여 송액 펌프(도시되지 않음), 진공 채혈관이나 주사기가 접속된다. 그리고, 접속된 펌프나 진공 채혈관 또는 주사기에 의해 각각 혈액과 약제가 마이크로칩(1) 내의 제1 및 제2 유로(101, 102)에 도입된다. 그리고, 항응고 처리되어 있지 않은 혈액을 사용하는 경우에는, 마이크로칩에 접속되는 주사기나 진공 채혈관 등의 용기도, 헤파린 코팅된 용기나 폴리비닐락톤아미드(PVLA), 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트(PMEA) 등의 혈액 응고 억제성을 가지는 소재로 코팅된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

제1 유입구(111)로부터 도입되고, 제1 유로(101)를 통과한 제1 액체인 혈액과, 제2 유입구(112)로부터 도입된 혈액과 반응할 수 있는 약제를 포함하는 제2 액체는, 제2 유로(102)를 통과하고, 제1 유로(101)와 제2 유로(102)의 접속 부분에서 합류하고, 교반부(113)에 도달한다. 교반부(113)에서는 교반자(117)에 의해 혈액과 약제가 균일하게 혼합되고, 교반 혼합된 혼합액은, 서로 반응하면서, 합류 유로(103)를 흘러내린다. 교반 혼합된 혼합액은, 합류 유로(103)의 협착부(105)나 유발재 설치부(115)를 통과함으로써 혈전의 생성이 유발된다. 그리고, 협착부(105)는, 합류 유로(103)를 통과하는 혼합액의 유속이나 성질과 상태를 관측함으로써, 혈액과의 반응성 등, 목적으로 하는 관측을 행할 수 있다. 관측에 제공된 혈액은, 합류 유로(103)의 종단에 설치된 폐액 저류부(104)에 저류되고, 필요에 따라 배출구(114)로부터 배출된다. 폐액 저류부(104)를 설치하지 않고, 직접 배출구(114)로부터 배출해도 된다.

교반자(117)는, 마이크로칩의 외부로부터 모터(도시되지 않음)의 회전력이 자기로 전달되어 회전할 수 있는 것이 바람직하다. 교반자(117)는, 제1 액체와 제2 액체가 합류된 액체의 응고를 억제하는 응고 억제 처리가 행해져 있다. 응고 억제 처리로서는, 헤파린, 폴리비닐락톤아미드(PVLA)나 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트(PMEA) 등을 사용하여 자성체의 표면에 용융 수지에의 침지에 의한 피복이나 인몰드 사출 성형 등의 수지 가공법으로 교반자의 표면을 형성하는 처리를 이용할 수 있다.

도 2는 본 발명의 마이크로칩의 제2 형태예를 나타내는 개념도이다. 이하, 도 2에 따라 제2 형태예를 설명한다. 본 형태예가 제1 형태예와 다른 점은, 기판이 3장 이용되어 마이크로칩(2)이 구성되어 있는 점이다. 제1 형태예와 공통되는 부분은 설명을 생략한다.

도 2의 (A)는, 마이크로칩의 유로가 되는 홈이 배면에 형성되고, 이들에 접속하여 유입구나 배출구가 되는 관통 구멍이 형성된 제1 기판(200)의 평면도이다. 도 2의 (B)는 마이크로칩의 교반자의 수납부가 되는 관통 구멍이 형성된 제2 기판(210)의 평면도이다. 도 2의 (C)는, 교반자의 수납부의 바닥이 되는 제3 기판(220)의 평면도이다. 도 2의 (D) 및 (E)는, 이들 3개의 기판이 적층된 제2 형태예의 마이크로칩(2)의 평면도 및 정면도이다.

도 2의 (B)에 있어서, 제2 기판(210) 상에는, 적층되었을 때, 교반부(213)가 되는 관통 구멍이 형성되어 있다. 이 관통 구멍은 폭이 하류를 향해 가면서 점차 좁아지고, 깊이가 하류를 향해 가면서 점차 얕아지는 형상을 가지고 있다. 본 형태예에 있어서는, 제2 기판(210)의 표면에 혈전 생성 유발재가 설치된다.

도 2의 (D) 및 (E)에 나타낸 바와 같이, 제2 형태예의 마이크로칩(2)은, 제1 기판(200) 아래에 제2 기판(210)을 각각의 유로가 밀봉되도록 밀착시켜 적층하고, 또한 제2 기판(210) 아래에 제3 기판(220)을, 제2 기판(210) 상에 설치된 교반부(213)의 바닥이 되도록 밀착시켜 적층함으로써 얻어진다.

도 3은 본 발명의 마이크로칩의 제3 형태예를 나타내는 개념도이다. 이하, 도 3에 따라 제3 형태예를 설명한다. 본 형태예가 제1 형태예와 다른 점은, 제3 유로가 설치되어 마이크로칩(3)이 구성되어 있는 점이다. 제1 형태예와 공통되는 부분은 설명을 생략한다.

도 3의 (A)는, 마이크로칩의 유로가 되는 홈이 표면에 형성된 제1 기판(300)의 평면도이다. 도 3의 (B)는, 마이크로칩의 교반자의 수납부가 되는 구멍이 배면에 형성된 제2 기판(310)의 평면도이다. 도 3의 (C) 및 (D)는, 이들 홈이나 구멍의 개구부를 내측으로 하여 기판(300)과 기판(310)이 적층된 제3 형태예의 마이크로칩(3)의 평면도 및 정면도이다.

도 3의 (A)에 있어서, 제1 기판(300)은, 협착부(305)의 하류이면서, 폐액 저류부(304)의 상류에서, 일단이 합류 유로(303)에 접속되도록 제3 유로(306)가 되는 홈이 표면에 형성되어 있다.

도 3의 (B)에 있어서, 제2 기판(310)은, 제1 기판(300)과 적층되었을 때, 제1 기판(300) 상의 제3 유로(306)의 타단에 상당하는 위치에 제3 유입구(318)가 되는 관통 구멍이 형성되어 있다. 교반부(313)는, 제2 형태예에 따른 마이크로칩(2)과 동일하다.

도 3의 (C) 및 (D)에 나타내는 제3 형태예에 따른 본 발명의 마이크로칩(3)은, 제1 형태예와 마찬가지로 밀착시켜 적층함으로써 얻어진다.

그리고, 제3 형태예에 따른 마이크로칩(3)은, 제3 유입구(318)에 튜브(도시되지 않음)가 접속되고, 튜브를 통하여 송액 펌프(도시되지 않음)나 주사기가 접속되어 혼합액의 응고를 억제하기 위한 항응고 처리제가 제3 유로(306)에 도입된다. 이 항응고 처리제가 도입됨으로써, 관측에 제공된 혼합액의 응고로 인한 마이크로칩 내의 유로의 막힘이 발생하지 않기 때문에, 안정하게 관측할 수 있다. 항응고 처리제로서는, 후술하겠지만, 예를 들면 EDTA 용액 등이 예시된다.

다음으로, 본 발명의 마이크로칩을 사용한 본 발명의 혈액 관측 장치에 대하여 설명한다.

도 4는, 제3 형태예에 따른 마이크로칩(3)을 투명한 기판으로 구성하여 내장한 본 발명의 혈액 관측 장치의 제1 형태예인 혈액 관측 장치 A의 모식도이다. 이하, 도 4에 따라 제1 형태예를 설명한다.

마이크로칩(3)의 제1 유입구(311)에는 튜브를 통하여 항응고 처리된 혈액을 공급하는 제1 송액 펌프(320)가 접속되어 있다. 제1 송액 펌프(320)에는 압력 센서(도시되지 않음)가 접속되어 있다.

제2 유입구(312)에는 튜브를 통하여 항응고 해제제를 공급하는 제2 송액 펌프(321)가 접속되어 있다. 항응고 해제제는, 항응고 처리된 혈액의 항응고 처리를 해제하는 약제이다.

제3 유입구(318)에는 튜브를 통하여 혈액 응고 방지제를 공급하는 제3 송액 펌프(322)가 접속되어 있다.

송액 펌프(320)로부터 압출된 항응고 처리된 혈액은, 마이크로칩(3) 내에서 송액 펌프(321)로부터 주입된 항응고 해제제와 합류 유로에서 합류하고, 교반부(313)에서 교반자(317)에 의해 교반 혼합된 후, 합류 유로를 흘러내려서, 혈전 생성 유발재가 코팅된 유발재 설치부(315)에 도달한다.

유발재 설치부(315)의 합류 유로인 혈전 생성실에 있어서의 혈전의 생성을 육안 관찰하거나 또는 카메라(도시되지 않음)로 관찰함으로써 혈액 관측을 행할 수 있다. 또는, 유로 내의 압력을 송액 펌프(320)에 접속된 압력 센서에 의해 측정함으로써 더욱 정량적인 혈액 관측이 가능하게 된다.

혈전 생성실을 통과한 혈액 혼합액은, 제3 유입구(318)에 튜브를 통하여 접속된 제3 펌프(322)로부터 도입되는 혈액 응고 방지제와 혼합되어 배출구(314)로부터 원활하게 배출된다.

도 5 및 도 6은, 제3 형태예에 따른 마이크로칩(3)을 투명한 기판으로 구성하여 내장한 본 발명의 혈액 관측 장치의 제2 형태예인 혈액 관측 장치 B의 모식도이다. 이하, 도 5에 따라 제2 형태예를 설명한다. 본 형태예가 제1 형태예와 다른 점은, 장치가 시스템화되어 있는 점이다. 제1 형태예와 공통되는 부분은, 설명을 생략한다.

혈액 관측 장치 B에 사용하는 마이크로칩(3)은, 제2 유입구(312)에 튜브를 통하여 혈소판 활성화제를 공급하는 제2 송액 펌프(321)가 접속되어 있는 점 외에는, 제1 형태예와 동일하게 구성되어 있다. 혈소판 활성화제는, 혈소판을 활성화시키는 약제이다. 혈액 관측 장치 B는, 혈액 관측 장치 A에, 혈전 생성실을 관찰하기 위한 CCD 카메라(324), 화상 해석 장치(325), 히터(329), 조명(331), 그리고 컴퓨터(도시되지 않음)를 부설한 것이며, 혈전 생성의 상태를 화상화하거나 마이크로칩 내의 압력을 모니터링하도록 제어할 수 있는 시스템이다.

마이크로칩(3)에는 고정용 구멍(323)이 2군데 형성되고, 마이크로칩(3)을 설치하기 위한 스테이지(330) 상에 설치된 칩 고정용 핀(326)에 끼워짐으로써, 고정된 상태로 측정을 행할 수 있다. 스테이지(330) 상의 마이크로칩 바로 아래가 되는 위치에는 히터(327)가 설치되고, 37℃로 가온함으로써 생체 내부에 근접한 조건으로 측정할 수 있다.

이 혈액 관측 장치 B를 사용한 본 발명의 혈액 관측 방법에 대하여 개략적으로 설명한다.

제1 펌프(320)로부터 유입된 항응고 처리된 혈액과, 제2 펌프(321)로부터 유입된 혈소판을 활성화시키는 약제는 교반부(313)에서, 자력 스터러(stirrer)(329)에 의해 회전되는 교반자에 의해 혼합되어, 흘러내리면서 유발재 설치부(315)의 혈전 생성실에서 혈전이 생성된다. 스테이지(330)의 혈전 생성실에 상당하는 부분에는 조명용 간극(328)이 설치되어 있고, 광원(331)에 의해 혈전 생성실이 조명되고, 이를 카메라(324)로 촬영하고, 화상 해석 장치(325)로 해석한다.

이 혈액 관측 장치 B에 있어서는, 화상 해석에 의해 혈전 생성의 상황을 더욱 상세하게 파악할 수 있다. 특히 퀴나크린(quinacrine) 등에 의해 혈소판, 백혈구를 형광 표지하고, 콜라겐에의 점착 및 응집을 관측할 경우에는, 형광 발색에 의한 단위 면적당 휘도를 화상 해석으로 관측함으로써 관측 결과를 수치화하여, 데이터로서 취득할 수 있다. 혈액이 흘러내리는 상태에서 생성되는 혈전은, 혈소판, 백혈구를 많이 포함하는 백색 혈전이며, 항응고 상태에서 혈소판을 활성화시켜서 얻어지는 혈전도 혈소판에 의한 백색 혈전이므로, 혈액의 적색이 백색으로 변화되어 가는 상태나 홍백의 비율, 면적을, 본 장치를 사용하여 관측함으로써 용이하게 혈전의 생성 과정을 해석할 수 있다. 그리고, 화상 해석 및 펌프(320)에 걸리는 압력 변화의 측정에 의해 종합적인 혈전 생성의 상황을 관측할 수 있다.

도 6은, 혈액 관측 장치 B를, 마이크로칩(3)의 제1 유로와 제2 유로가 아래쪽이며, 합류 유로가 위쪽이 되도록, 즉 유입구(311)와 유입구(312)가 아래쪽에, 배출구(314)가 위쪽으로 되도록 수직으로 세워 설치한 것이다. 마이크로칩(3)은, 도 5와 같이 수평으로 눕혀서 설치하면 교반부(313)가 위쪽으로 볼록하게 된다. 그러면 교반부(313)에 혈액이 유입되어도, 공기가 약간 잔존하는 경우가 있다. 이와 같이 수직으로 세워 설치되어 있으면, 교반부에서 혼합될 때, 기포가 생겨도, 기포는 자연스럽게 위쪽으로 이동하고, 기포의 방해없이 안정적이며 균일하게 교반 혼합할 수 있다.

이하, 본 발명의 제4 형태예에 따른 마이크로칩(4)과, 이를 사용한 혈전 관측 장치 C에 대하여 설명한다.

도 10은, 본 발명의 제4 형태예에 따른 마이크로칩(4)을 나타내는 개념도이다. 도 10의 (A)는 제1 기판(400), 도 10의 (B)는 제2 기판(410), 그리고, 도 10의 (C)는 완성도를 나타낸다.

마이크로칩(4)은 기판(400)과 기판(410)이 서로 부착되어 이루어진다. 기판(400)에는, 제1 유입구(411)에 상당하는 관통 구멍이 형성되고, 또한 제1 유로(401), 제2 유로(402), 합류 유로(403), 및 제3 유로(406)에 상당하는 홈이 형성되어 있다.

기판(410)에는, 제2 유입구(412), 제3 유입구(418), 및 배출구(414)에 상당하는 관통 구멍이 형성되고, 또한 교반부(413)에 상당하는 구멍이 형성되고, 혈전 생성실(415)에 상당하는 부분에 혈전 유발재가 코팅되어 있다.

도 10의 (C)은 기판(400)과 기판(410)을 서로 부착하여 마이크로칩(4)으로 만들었을 때의 도면이다. 기판(410)을 아래로 하여 위치시킬 때, 제1 유입구(411)는 위를 향하는 개구가 되고, 제2 유입구(412), 제3 유입구(418) 및 배출구(414)는 아래를 향하는 개구가 된다. 기판(400)과 기판(410)은, 기판(400)의 제1 유로(401), 제2 유로(402) 및 혼합 유로(403)에 상당하는 홈과, 기판(410)의 교반부(413)에 상당하는 홈 및 혈전 유발재 코팅부가 서로 마주 보는 형태이면서, 또한 교반자를 교반부에 수용한 상태로 서로 부착된다. 기판(410)의 제2 유입구(412) 및 제3 유입구(418)는 각각 기판(400)의 제2 유로(402)의 좌단부, 및 제3 유로(406)의 우단부에 접속된다. 기판(410)의 배출구(414)는 기판(400)의 합류 유로(403)의 우단부에 접속된다.

도 11은 마이크로칩(4)을 탑재하는 스테이지(40)를 나타낸다.

스테이지(40)에는, 마이크로칩(4)의 제2 유입구(412), 제3 유입구(418)에 각각 접속되는, 제1 접속 노즐(435), 제2 접속 노즐(436)이 설치되어 있다. 이들 노즐은 스테인레스나 경질 플라스틱으로 만들어져 있고, 마이크로칩(4)의 각 유입구에 아래로부터 접속된다. 이와 같이 접속됨으로써, 이들 노즐이, 마이크로칩(4)을 스테이지(40)의 소정의 위치에 정확하게 가이드하고, 카메라 등의 관측 기기나 교반자를 구동하는 자력 스터러와의 위치를 최적이 되도록 하는 기능도 가진다. 그리고, 제1 및 제2 접속 노즐은 각각 튜브를 통하여 제2 펌프(421) 및 제3 펌프(422)와 접속되어 있다.

제1 접속 노즐(435)로부터 항응고 처리를 해제하는 약제(예를 들면, 염화 칼슘)나 혈소판을 활성화시키는 시약(예를 들면, ADP) 또는 섬유소용해약(예를 들면, tPA) 등이 제2 유입구(412)를 통해 제2 유로(402)로 흐른다. 혈액 응고가 진행하여 혈전 유발재 도포 영역(415)으로부터 하류의 합류 유로(403) 및 배출 튜브(437)가 막히는 것을 방지하기 위하여, 제2 접속 노즐(436)로부터 혈액 응고 방지제가 제3 유입구(418)를 통해 제3 유로(406)로 흐른다.

제2 유입구(412)로부터 유입되는 항응고 처리를 해제하는 약제의 양은 제3 유입구(418)로부터 유입되는 혈액 응고 방지제에 비해 소량이면서, 정밀한 유량의 제어가 요구된다. 따라서, 제1 접속 노즐(435)의 직경은 제2 접속 노즐(436)의 직경보다 작게 설계되는 것이 바람직하다. 제1 접속 노즐(435)의 직경을 작게 설계하면, 소량의 액체를 유입시키는 경우에도 노즐 선단의 데드볼륨(dead volume)이 작으므로 정밀하며 안정적인 송액이 가능하게 된다.

제1 접속 노즐 및 제2 접속 노즐의 외경은 제2 유입구(412), 제3 유입구(418)의 구멍과, 액밀 방식으로 접속 가능한 형태로 설계된다. 예를 들면, 제1 접속 노즐의 외경이 0.5∼1.5mm, 제2 접속 노즐의 외경이 1∼3mm, 제2 유입구의 구멍의 직경이 0.5∼1.5mm, 제3 유입구의 구멍의 직경이 1∼3mm 정도이면 바람직하다.

제1, 제2 접속 노즐(435, 436)은 교반부(413)에 수납되는 교반자를 구동하는 자력 스터러(429)에 대한 위치 가이드로서의 기능도 가지고, 제1 접속 노즐(435) 및 제2 접속 노즐(436)에 접속되어 위치가 고정된 마이크로칩(4)의 교반부(413)의 바로 아래에 자력 스터러(429)가 설치된다. 합류 유로(403)의 아래는 투명한 히터(427)로 되어 있어 마이크로칩(4)의 온도를 제어하고, 또한 합류 유로(403)의 아래의 조명(431)에 의해 합류 유로(403)의 혈전 유발재 설치부(415) 상의 혈전을 비춘다. 스테이지(40)에는 마이크로칩(4)의 배출구(414)의 위치에 맞추어 폐액 배출을 위하여 구멍이 나 있고 폐액 탱크(434)에 폐액 튜브(437)를 통하여 접속된다. 폐액 탱크(434)는 음압으로 되어 있어 폐액이 배출구(414)로부터 흡인된다.

도 12는, 본 발명의 혈전 관측 장치 C의 모식도이다. 혈전 관측 장치 C는, 스테이지(40)에 마이크로칩(4)을 설치하고, 상부에, 제1 펌프(420) 및 압력 센서(432)가 접속된 혈액 리저버(433), 및 화상 해석 장치(425)에 접속된 CCD 카메라(424)를 설치하여 구성된다.

제1 유입구(411)에는 항응고 처리된 혈액이 흐르게 된다. 항응고 처리된 혈액은 혈액 리저버(433)에 저류되고, 혈액 리저버(433)는 제1 펌프(420)에 접속된다. 제1 펌프(420)로부터는 미네랄 오일이 혈액 리저버(433)에 주입되고, 주입된 미네랄 오일에 밀려서 혈액이 마이크로칩(4) 내에 유입된다. 혈액의 유입 압력은 압력 센서(432)에 의해 계측된다.

합류 유로(403)의 혈전 유발재를 도포한 영역(415)의 상부에는 CCD 카메라(424)가 설치된다. CCD 카메라(424)는 합류 유로를 따라 이동 가능하게 되고, 프로그램에 따라 정기적으로 합류 유로(403)의 정지화상을 촬영한다. CCD 카메라(424)는 일정 거리씩 이동하면서 정지화상을 취득하여, 합류 유로(403) 전체를 정지화상의 연속으로서 취득할 수 있다.

그런데, 제1 형태예의 마이크로칩(1)을 사용하는 경우에도, 수평으로 눕혀서 설치하면 교반부가 위쪽으로 볼록해지므로, 혈액 관측 장치 B와 같이 세워 설치하는 것이 바람직하다. 한편, 제2 형태의 마이크로칩(2)을 사용하는 경우에는, 수평으로 눕혀서 설치해도 교반부가 아래쪽으로 볼록해지므로, 수평으로 눕혀도 되고, 세워도 되며, 어떤 설치 방법도 채용할 수 있다.

그리고, 마이크로칩(1)이나 마이크로칩(3)을 마이크로칩(2)과 같이 구성하지 않는 이유는, 마이크로칩을 사출 성형하는 경우, 종래는, 홈만을 성형하고, 필요에 따라 유입구나 배출구를 나중에 설치하므로, 홈과 구멍을 한번에 성형하는 금형이 존재하지 않기 때문이다. 또한, 제2 형태의 마이크로칩(2)의 제1 기판(200)은, 홈과 구멍이 병존하지만, 이는, 구멍을 뒤에서 뚫은 것이다. 따라서, 홈과 구멍을 한번에 성형하는 금형을 만들면, 마이크로칩(1)이나 마이크로칩(3)의 교반부를, 아래쪽으로 볼록하게 할 수 있다.

또한, 혈액 관측 장치 B를 사용한 본 발명의 혈액 관측 방법에 대하여 상세하게 설명한다.

먼저, 도 5에 기초하고, 마이크로칩(3)의 세부는 도 3을 참조하여, 본 발명의 마이크로칩(3)을 사용한 본 발명의 혈액 관측 방법의 제1 형태예를 설명한다.

제1 유입구(311)에는 제1 송액 펌프(320)와 튜브 사이에 항응고 처리된 혈액이 수용된 주사기(도시되지 않음)가 거꾸로 선 상태로 접속되어 있다. 그리고, 제1 송액 펌프(320)에는, 혈액과 섞이지 않고, 혈액보다 비중이 작은 액체를 충전하고, 이 액체를 혈액이 수용된 주사기 내에 밀어넣어서 혈액의 위에 중층시켜서, 혈액보다 비중이 작은 액체를 통하여 혈액을 마이크로칩(3) 내에 밀어내도록 구성되어 있다.

제1 송액 펌프(320)의 혈액 압송용 혈액보다 비중이 작은 액체로서는 유동 파라핀, 미네랄 오일이나 실리콘 오일 등의 각종 유지, 생리 식염수 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 방식으로, 간접적으로 혈액을 밀어냄으로써 송액 펌프나 압력 센서가 혈액에 의해 오염되는 것을 방지할 수 있게 된다.

그리고, 펌프로서는, 시판중인 일반적인 펌프를 사용해도 되지만, 에어를 일정압으로 밀어내거나 주사기를 플런저가 위로 되도록 거꾸로 위치시키고, 플런저에 추를 올려서 주사기 펌프로 만들어도 된다.

혈액의 응고를 억제하는 항응고 처리에 사용하는 항응고 처리제로서는, 구연산 나트륨 또는 구연산 칼륨, 옥살산 나트륨 또는 옥살산 칼륨, ACD(Acid Citrate Dextrose), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 염 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 항응고 처리제는, 분말, 동결 건조품, 수용액 등의 용액으로서 사용할 수 있다. 이들 항응고 처리제 중, 일반적인 3.2% 구연산 나트륨이 용이하게 입수할 수 있으므로 바람직하다. 이 경우, 혈액에 대하여 이 항응고 처리제의 용량비를 9:1로 하는 것이 바람직하다.

그 외의 항응고 처리제로서는 헤파린, 히루딘(hirudin), 히룰로그(hirulog)(히루딘 C말단 영역 펩티드), 아프로티닌, 항트롬빈 항체, 트롬빈 앱타머(aptamer), 콘유래 트립신 저해제(1977. J. Biol.Chem 252. 8105) 등의 이용이 가능하다. 그리고, 항응고 처리제는, 복수개 이용되어도 된다.

측정용 샘플을 채혈하는 방법으로서는, 주사기 또는 진공 채혈관에 미리 상기 항응고 처리제를 넣어 채혈을 행하거나, 또는 채혈 직후의 혈액에 항응고 처리제를 신속하게 첨가하는 등의 방법으로 항응고 처리된 혈액을 얻을 수 있다.

또한, 헤파린을 포함하는 진공 채혈관 등으로 채혈한 후, 헤파리나제와 관측 목적에 적합한 항응고 처리제를 첨가하여, 헤파리나제로 헤파린을 분해시켜, 측정 목적에 적합한 항응고 처리제로 치환할 수도 있다. 또한, 마찬가지로 구연산을 포함하는 진공 채혈관으로 채혈하고, 염화 칼슘 및 콘유래 트립신 저해제나 트롬빈 앱타머 등의 관측 목적에 적합한 응고 인자 저해제를 첨가함으로써, 관측 목적에 맞도록 항응고 처리된 혈액을 채혈할 수 있다.

제2 유입구(312)에는, 항응고 해제제가 충전된, 약제관(도시하지 않음)이 접속된 제2 펌프(321)가 접속되어 있다.

항응고 해제제로서는, 구연산과 같은 킬레이트제에 의한 항응고 처리를 해제하는 경우에는, 염화 칼슘, 브롬화 칼슘, 요오드화 칼슘 등의 할로겐화 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 질산 칼슘, 중탄산 칼슘 등의 무기산 칼슘염, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 알긴산, 락트산, 글루콘산, 글리세린산, 글리세로인산(glycerophosphoric acid) 등의 유기산의 칼슘염, 등의 유리 칼슘 공여체인 칼슘 화합물을 예로 들 수 있다.

또한, 항응고 해제제로서 응고 인자 저해제(항응고 처리제)에 의한 항응고 처리를 해제하는 경우에는, 응고 인자 저해제에 따른 항응고 해제제를 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 헤파린을 사용하여 항응고 처리한 경우의 항응고 해제제로서는, 프로타민, 헤파리나제 또는 항헤파린 항체 등이 이용 가능하며, 히루딘, 히룰로그 및 아프로티닌을 사용하여 항응고 처리한 경우의 항응고 해제제로서는, 각각 항히루딘 항체, 항히룰로그 항체 및 항아프로티닌 항체 등의 항응고 해제제가 사용 가능하다.

또한, 항트롬빈 항체로 응고 인자 저해제에 의한 항응고 처리를 해제하는 경우에는, 항응고 해제제로서 PPACK 트롬빈 등 완전히 불활성화된 트롬빈, 트롬빈의 분해편 및 트롬빈 내의 항체 인식 에피토프(epitope)를 함유하는 합성 폴리펩티드 등의 항응고 해제제를 사용할 수 있다.

그리고, 항응고 처리, 또는 항응고 해제에 사용되는 항체는 보체계(complement system) 에 대한 영향을 최소한으로 하기 위하여, 파파인(papain) 등으로 Fc 도메인을 제거한 것을 사용하거나 계란항체(lgY) 등의 인간 보체계 활성화능을 갖지 않는 항체를 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 단일사슬 올리고 DNA인 트롬빈 앱타머(Blood. 1993 Jun 15;81(12): 3271-6.이나 J Mol Biol. 1997 Oct 10;272(5):688-98.)를 항응고 처리제로서 사용한 경우에는 트롬빈 앱타머에 대한 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 등의 트롬빈 앱타머에 결합하여 기능을 저해하는 물질이 항응고 해제제로서 사용 가능하다. 트롬빈 앱타머는 엑소시토시스(exocytosis) I 및 II를 인식하는 2종을 병용하면 단독의 경우보다 비약적으로 높은 항응고 처리 효과가 얻어진다. 이 때 사용되는 안티센스 DNA는 실질적으로 트롬빈 앱타머의 항트롬빈 기능을 무효화하는 것이라면, 트롬빈 앱타머의 일부에 대한 것이라도 된다.

제1 유입구(311)로부터 도입되고, 제1 유로(301)를 통과한 항응고 처리된 혈액과, 제2 유입구(312)로부터 도입되고, 제2 유로(302)를 통과한 항응고 해제제는, 합류하여 교반부(313)에 도달하고, 교반자(317)에 의해 균일하게 혼합된다. 혼합된 혈액은 항응고 처리가 해제되면서 합류 유로(303)의 협착부(305)나 유발재 설치부(315)를 통과함으로써 혈전의 생성이 유발된다. 혈전 생성실을 통과한 혈액은 배출구(314)에 접속된 배출관(도시하지 않음)으로부터 배출된다.

이 때의 혈액의 유속을 육안 관찰에 의해 관측하거나, 압력을 제1 펌프(320)에 접속된 압력 센서에 의해 측정함으로써 혈액이 가지는 혈액 응고능을 평가할 수 있다. 또한, 혈전 생성실을 육안 관찰이나 카메라(324)로 관측함으로써 혈액 응고 상태를 조사할 수 있다.

그리고, 제1 유입구(311)에 접속된 주사기 내에 항응고 처리, 예를 들면 구연산 나트륨으로 처리한 전혈 및 다혈소판 혈장(제1 액체)을 충전한다. 제2 유입구(312)에 접속된 약제관 내에는, 항응고 해제제, 예를 들면 염화 칼슘 용액(제2 액체)을 충전한다. 제2 액체의 농도는 제1 액체의 응고 캐스케이드(cascade)가 개시되는 약 5∼20 mmol로 조정한다. 제1 액체와 제2 액체의 혼합액은 교반자(317)에 의해 교반되고, 유발재 설치부(315) 내의 혈전 생성실에 유입된다. 이와 같은 투시 가능한 유발재 설치부(315)를 통과하는 혈액을 관측하는 장치에 의해 간편하게 혈전 생성이 관측된다.

또한, 혈전 생성의 관측은, 일정 시간 혈액을 흐르게 한 후, 혈전 생성실 내로부터 혈액을 제거함으로써, 육안 관찰에 의해 평가할 수 있다. 제1 액체나 제2 액체를 송액하는 펌프가 에어 구동인 경우에는, 일정 압으로 제1 액체나 제2 액체를 송액함으로써, 배출관으로부터 배출되는 혈류량의 저하에 의해, 콜라겐 상에서의 혈전 생성을 모니터할 수 있다. 다혈소판 혈장을 사용한 경우에는, 혈전은 시인성이 높으므로 관찰이 용이하며, 육안에 의한 혈전 생성의 관찰도 가능하다. 또한, 혈소판을 메파크린(mepacrine) 등으로 형광 라벨하여 형광 현미경으로 모니터할 수도 있다.

다음으로, 제1 형태예와 마찬가지로, 도 5 및 도 3을 참조하여, 본 발명의 혈액 관측 방법의 제2 형태예를 설명한다.

본 형태예가 제1 형태예와 다른 점은, 혈액으로서 항응고 처리된 전혈 또는 다혈소판 혈장을 사용하고, 혈액과 반응시키는 약제로서 혈소판을 활성화시키는 약제를 사용하는 점이다. 제1 형태예와 공통되는 부분은 설명을 생략한다.

이하, 도 6에 따라 설명한다.

마이크로칩(3)의 제1 유입구(311)에 접속된 주사기 내의 혈액은 항응고 처리되어 있다. 항응고 처리는 전술한 바와 같지만, 이들 중에서는 구연산 처리가 바람직하다.

제2 유입구(312)에 접속된 약제관에는 혈소판을 활성화시키는 약제가 충전되어 있다. 혈소판을 활성화시키는 약제로서는, ADP, 콜라겐, 트롬빈 및 리스토세틴 등을 예로 들 수 있다.

제1 유입구(311)로부터 도입되고, 제1 유로(301)를 통과한 항응고 처리된 혈액과, 제2 유입구(312)로부터 도입되고, 제2 유로(302)를 통과한 혈소판을 활성화시키는 약제는, 합류하여 교반부(313)에 도달하고, 교반자(317)에 의해 균일하게 혼합된다. 혼합된 혈액은, 혈소판이 활성화되면서 합류 유로(303)의 협착부(305)나 유발재 설치부(315)를 통과함으로써, 혈소판의 점착·응집이 야기되어 혈소판 혈전을 생성한다.

이 때의 혈액의 유속이나 압력을 측정함으로써 혈소판 기능을 평가할 수 있다. 또한, 혈전 생성실을 육안 관찰이나 카메라(324)로 관측함으로써 혈소판에 의한 혈전 생성 상태를 조사할 수 있다. 이로써, 혈소판의 점착, 응집 등의 혈소판 기능을 인체 내부와 유사한 환경에서 구체적으로 관측할 수 있다.

다음으로, 제1 형태예와 마찬가지로, 도 5 및 도 3을 참조하여, 본 발명의 혈액 관측 방법의 제3 형태예를 설명한다.

본 형태예가 제1 형태예와 다른 점은, 혈액으로서 전혈 또는 다혈소판 혈장을 사용하고, 이것을 그대로 제1 유로(301)에 흐르게 하여 혈전 생성실에서 혈전을 생성시켜, 어느 정도 혈전의 생성이 관찰되면, 혈액과 반응할 수 있는 약제로서 혈전 용해제의 용액을 제2 유로(302)에 흐르게 하는 점이다. 제1 형태예와 공통되는 부분은 설명을 생략한다.

이하, 도 5에 따라 설명한다.

마이크로칩(3)의 제1 유입구(311)에 접속된 주사기 내의 혈액은 특별한 항응고 처리는 되어 있지 않다.

제2 유입구(312)에 접속된 약제관에는 혈전 용해제가 충전되어 있다. 혈전 용해제로서는, 유로키나아제, 플라스민 및 tPA 등을 예로 들 수 있다.

제1 유입구(311)로부터 도입되고, 제1 유로(301)를 통과한 혈액은 교반부(317)를 통과하고, 혈전 생성실에서 혈전을 생성한다. 그리고, 이 때, 교반자(317)가 응고 억제 처리되어 있어도 교반부(313)에서 혈액 응고가 생기는 경우가 있다. 이를 방지하기 위해서는, 교반자(317)를 회전시키지 않고 정지시키는 것이 바람직하고, 교반부(313)도 PVLA 등으로 응고 억제 처리되어 있는 것이 더욱 바람직하다.

어느 정도 혈전이 관측되면, 제2 유로(302)로부터 혈전 용해제가 도입되고, 제2 유로(302)를 통과한 혈전 용해제는, 교반부(313)에 도달하고, 교반자(317)에 의해 균일하게 혼합된다. 혼합된 혈액은, 혈전 생성실에 도달하고, 생성된 혈전을 용해한다.

이 때의 혈액의 유속이나 압력을 측정함으로써 혈전 용해능을 평가할 수 있다. 또한, 혈전 생성실을 육안 관찰이나 카메라(324)로 관측함으로써 혈전 용해의 상태를 조사할 수 있다.

다음으로, 도 10∼도 12를 이용하여 본 발명의 혈전 관측 방법을 설명한다.

마이크로칩(4)은 스테이지(40)에 설치된다. 제1 접속 노즐(435) 및 제2 접속 노즐(436)이 각각 제2 유입구(412) 및 제3 유입구(418)에 끼워지고, 교반부(413)가 스테이지(40)의 자력 스터러(429) 상에 설치되고, 합류 유로(403)의 혈전 유발재 설치부(415)의 위에 CCD 카메라(424)가, 아래에 조명(431)이 각각 설치된다. 스테이지(40)에는 히터(427)가 설치되어 있고 마이크로칩(4)을 일정한 온도를 유지한다. 마이크로칩(4)은 37℃ 부근으로 유지되는 것이 바람직하다.

사용하는 시약이나 혈액, 혈전 유발재는, 측정 목적에 따라 적절하게 결정된다.

예를 들면, 혈액 응고, 혈소판 기능, 섬유소용해 등을 종합적으로 반영한 혈전 형성능을 측정하는 경우에는 이하와 같은 측정 방법이 바람직하다.

혈액 리저버(433)에는, 항응고 처리된 전혈이 들어 있다. 항응고 처리는 특별히 한정되지 않지만, 구연산 또는 구연산과 콘유래 트립신 저해제에 의한 것이 바람직하다. 혈액 리저버(433)는 제1 펌프(420) 및 제1 유입구(411)에 접속된다. 제1 펌프(420)로부터 미네랄 오일이 혈액 리저버(433)에 주입되고, 혈액이 제1 유입구(411)로부터 마이크로칩(4) 내로 주입된다. 제1 접속 노즐(435)을 통해서 제2 유입구(412)로부터는 염화 칼슘이 주입된다. 혈액 및 염화 칼슘은 제1 유로 및 제2 유로를 통해서 교반부(413)에서 합류하고, 교반자에 의해 혼합된다.

혼합되는 염화 칼슘과 혈액의 용량비는, 혈액:염화 칼슘이 10:2∼100:1의 용량비로 혼합되는 것이 바람직하다. 10:2를 초과하면 혈액이 염화 칼슘으로 희석되어 관측에 바람직한 혈전 형성이 일어나지 않고, 100:1을 밑도는 경우에는 염화 칼슘 용액의 양이 미량으로 되고, 낮은 유속이 되어 제2 펌프(421)에 의한 정밀한 송액이 곤란하게 되는 경우가 있다. 염화 칼슘 용액의 농도는 혼합되었을 때 구연산의 항응고 처리를 무효화(해제)하는 농도로 조정된다. 혼합부(413)에서는 5초∼3분 정도 체류시켜 교반되도록 제1 펌프 혹은 제2 펌프를 제어하는 것이 바람직하다. 교반이 5초 이하이면 충분히 교반되지 않을 가능성이 있으며, 3분을 초과하면 교반부(413)에서 혈액 응고가 진행될 가능성이 있다.

혼합된 혈액은 합류 유로(403)를 통해서 혈전 생성실(415)을 통과한다. 혈전 생성실(415)에 부착시키는 혈전 유발재는, 콜라겐과 조직 트롬보플라스틴 혼합물로 코팅된 것 바람직하다.

콜라겐과 조직 인자를 포함함으로써 콜라겐 상에서 혈소판의 점착 및 응집 및 조직 인자에 의한 응고계의 활성화 등 종합적으로 혈전 형성에 관여하는 현상이 유발된다. 합류 유로(403)와 혈전 유발재 설치부(415)에 의해 구성되는 혈전 생성실(415)을 통과한 혈액은, 제2 노즐(436)로부터 제3 유로를 통해서 주입되는 혈액 응고 방지제와 혼합되고 배출구(414)로부터 배출되고 배출 튜브(437)를 통하여 폐액 탱크(434)에 모여진다.

혈액 응고 방지제는, 배출구(414)로부터 폐액 탱크(434)로 폐액이 이동중의 혈액 응고에 의한 막힘이나 압력 상승을 방지할 목적으로 사용되는 것이며, EDTA, 구연산 등의 킬레이트제(chelate agent), 산, 알칼리 용액, 알코올류 또는 구아니딘, 요소, SDS 등의 변성제를 사용할 수 있다.

합류 유로에서 혈전 형성이 진행되면 혈액 리저버(433)에 미네랄 오일 송액 부분의 압력이 상승한다. 압력 센서(432)에 의해 압력 상승을 관찰함으로써 유로 내의 폐색 상황을 판정할 수 있다.

백색 LED에 의한 조명(431)에 의해 하부로부터 비추어지고, 상부 카메라(424)로부터 마이크로칩(4) 내의 혈전 형성의 상태가 표시된다. 카메라(424)는 지정된 일정 시간마다 일정한 거리를 이동하여 동일한 위치를 연속적으로 촬영함으로써 합류 유로(403) 내 전체의 혈전 형성을 경시적으로 파악할 수 있게 된다.

[실시예]

이하에서, 구체적인 실시예를 예로 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

[마이크로칩 및 혈액 관측 장치의 제작]

도 1의 (A)에 나타내는 제1 기판(100) 및 도 1의 (B)에 나타내는 제2 기판(110)의 2개의 투명한 기판(가부시키가이샤리첼(Richell Corporation) 제품인 사출 성형품)을 준비하였다. 제1 기판(100)의 유로가 개구된 면과 제2 기판(110)의 교반부(113)가 되는 구멍이 개구된 면을 대향시켜 접착제를 사용하여 적층하고, 도 1의 (C) 및 도 1의 (D)에 나타내는 마이크로칩(1)으로 만들었다. 그리고, 각각의 유로의 깊이는 0.12mm, 제1 유로(101)의 폭은 1.2mm, 합류 유로(103)의 협착 부분의 폭은 0.3mm로 하였다. 교반자(117)로는, 철제 원기둥을 PVLA로 피복한 직경 1mm, 길이 2mm의 원기둥 형상으로 된 것을 교반부(113)에 수납했다. 교반부(113)가 되는 구멍은 내경 3mm, 깊이 1.2mm의 단면 원형의 관통구멍으로 만들었다. 제2 기판(110)의 유발재 설치부(115)에 콜라겐을 도포했다. 교반자(117)는, 스터러의 자력에 의해 100∼200rpm으로 회전하도록 했다.

제작된 마이크로칩(1)의 제1 주입구 및 제2 주입구에 펌프를 접속하여 혈액 관측 장치를 제작하였다.

[혼합 상태 및 잔존 공기의 확인]

마이크로칩(1)의 제1 유입구(111)로부터 제1 액체로서 정제수를 20μL/min, 제2 유입구(112)로부터 제2 액체로서 적색 잉크를 10 μL/min의 속도로 각각 주입하고 교반부(113)로 교반하고, 배출구(114)로부터 배출한 바에 의하면, 전술한 2종의 액체는 균일하게 혼합되어 있었다.

제1 기판(100)을 아래로, 제2 기판(110)을 위로 한 상태에서 마이크로칩(1)을 수평으로 눕혀서 설치하여 혈액 관측 장치로 한 경우에는, 제1 액체와 제2 액체는 원활하게 혼합되었지만, 교반부(113)에 약간의 공기가 잔존하는 경우가 있었다.

한편, 마이크로칩(1)의 제1 유입구(111)를 아래로, 배출구(114)를 위로 한 상태에서 마이크로칩을 수직으로 세워 설치한 경우에는 공기가 잔존하지 않았다.

실시예 2

[마이크로칩의 제작]

도 2의 (A)에 나타내는 제1 기판(200) 및 도 2의 (B)에 나타내는 제2 기판(210)의 2개의 투명한 기판(플루이드웨어사(Fluidware Technologies Inc.) 제품인 사출 성형품) 및 투명한 아크릴판으로 이루어지는 도 2의 (C)에 나타내는 제3 기판(220)의 기판을 준비하였다. 제1 기판(200)의 유로가 개구된 면과 제2 기판(210)의 교반부(213)가 되는 구멍이 개구된 면을 대향시켜 접착제를 사용하여 적층하였다. 제2 기판(200)의 교반부(213)의 구멍의 개구를, 접착제를 사용하여 제3 기판(220)으로 봉쇄하여 도 2의 (D) 및 도 2의 (E)에 나타내는 마이크로칩(2)으로 만들었다. 그리고, 제2 기판(210)의 두께는, 교반부(213)가 되는 구멍의 깊이에 맞추어, 1.2mm로 하였다. 제2 기판(210)의 교반부(213)가 되는 구멍은, 내경 3mm의 원형의 관통 구멍에 더하여, 3차원적으로 경사가 형성된 삼각뿔형의 유출로를 가지는 도 2의 (B) 및 도 2의 (E)에 나타내는 형상으로 하였다. 각각의 유로의 깊이는 0.25mm, 제1 유로(201)의 폭은 0.5mm, 합류 유로(203)의 협착 부분의 폭은 0.2mm, 제2 유로(202)의 폭은 0.15mm로 하고, 콜라겐의 도포 및 교반자의 수납은, 실시예 1과 동일하게 행하였다.

[혈액 관측 장치의 제작 및 혼합 상태의 확인]

제1 기판(200)을 위로, 제3 기판(220)을 아래로 한 상태에서 수평으로 눕혀서 마이크로칩(2)을 설치하고, 제1 주입구 및 제2 주입구에 펌프를 접속하여 혈액 관측 장치를 제작하였다.

마이크로칩(2)의 제1 유입구(211)로부터 제1 액체로서 정제수를 20μL/min, 제2 유입구(212)로부터 제2 액체로서 적색 잉크를 10μL/min의 속도로 각각 주입하고 교반부를 통과시키고 배출구(214)로부터 배출한 바에 의하면, 전술한 2종의 액체는 균일하게 혼합되어 있었다. 또한, 교반부(213)에 공기가 잔존하지 않았다.

실시예 3

실시예 2의 제2 기판(210)의 교반부(213)로서, 내경 3mm의 단순한 원형의 관통구멍으로 한 점 외에는, 실시예 2와 동일하게 마이크로칩(2) 및 혈액 관측 장치를 제작하고, 실시예 2와 동일하게 혼합 상태의 확인 실험을 행하였다. 그 결과, 전술한 2종의 액체는 균일하게 혼합되었지만, 교반부에 공기가 잔존하는 경우가 있었다.

실시예 4[마이크로칩 및 혈액 관측 장치의 제작]

실시예 1과 동일하게 하여 도 3에 나타내는 마이크로칩(3)을 제작하였다. 다만, 제3 유로(306)는 폭을 0.2mm로 하고, 제2 기판(310)의 유발재 설치부(315)에 콜라겐 타입 I(닛타젤라틴사(Nitta Gelatin Inc.))과 PT 시약(시스멕스사(Sysmex Corporation))의 혼합액을 약 10μL 도포했다. 콜라겐 타입 I은 3mg/ml인 것을 사용하였다. PT 시약은, 시스멕스사의 PT 시약 1 바이알(vial)을 2ml의 정제수에 용해시키고 정제수로 하룻밤 투석한 것을 1 대 1의 비율로 혼합한 것을 사용하였다. 또한, 교반부(313)의 형상은 실시예 2와 동일하게 하였다.

제2 기판(310)을 위로, 제1 기판(300)을 아래로 한 상태에서 수평으로 눕혀서 마이크로칩(2)을 설치하고, 제1 주입구 내지 제3 주입구에 제1 펌프 내지 제3 펌프(320 내지 322)를 각각 접속하여 도 5에 나타내는 혈액 관측 장치 B를 제작하였다.

[혈액 관측 1]

각각의 펌프는, 표 1에 나타내는 프로그램의 단계를 위로부터 순차적으로 실행함으로써 각 펌프를 소정의 유속이 되도록 제어하면서, 마이크로칩(3)의 제1 유입구(311)로부터 3.2% 구연산 나트륨을 10분의 1량 첨가한 25μg/ml의 콘 유래 트립신 저해제를 첨가한 전혈, 제2 유입구(312)로부터 0.2M의 CaCl₂, 제3 유입구(318)로부터, 0.5M의 EDTA pH 10을 유입시켰다. 관측 후의 혈액은, 배출구(314)로부터 배출하였다.

그리고, 마이크로칩(3)은, 최초의 32초간(단계 1과 2) 수직으로 세워 CaCl₂와 전혈을 흘려서, 교반부(313)로부터 공기가 완전히 제거된 것을 확인하고, 제2 기판(310)을 위로, 제1 기판(300)을 아래로 한 상태에서 수평으로 스테이지(330) 상에 설치하였다.

혈액은, 제1 유입구(311)에 직접 끼워넣을 수 있는 끝 부분이 가느다란 주입통을 선단에 가지는 용기(리저버 탱크)에 600μL 만큼 넣고, 또한 리저버 탱크에 미네랄 오일을 넣었다. 이 리저버 탱크의 선단을 제1 유입구(311)에 직접 끼워넣고, 리저버 탱크를 거꾸로 세워서, 후단에 튜브를 통하여 제1 펌프(320)에 접속하였다. 제1 펌프(320)를 프로그램을 따라 작동시킴으로써, 미네랄 오일에 의해 혈액을 마이크로칩(3) 내에 밀어넣었다. 제1 펌프(320)의 압력 센서에 의해 압력 변화를 측정하였다. 결과를 도 7의 (A)에 나타낸다.

[표 1]

실시예 5

[혈액 관측 2]

실시예 4와 동일하게, 도 3에 나타내는 마이크로칩(3)을 사용한 도 5의 혈액 관측 장치 B를 사용하여 이하의 관측을 행하였다. 실시예 4와 동일한 부분은 생략하고, 상이한 부분만을 설명한다.

제1 유입구(311)[제1 펌프(320)]로부터 3.2%의 구연산 나트륨을 10분의 1량 첨가한 전혈을, 제2 유입구(312)[제2 펌프(321)]로부터 0.1μM의 ADP 용액을 각각 유입시켰다.

마이크로칩(3)의 제3 유입구(318)은 막아서 사용하지 않았다.

각각의 펌프는, 표 2에 나타내는 프로그램으로 제어하면서, 제1 유입구(311)로부터 전혈을, 0.1μM, 제2 유입구(312)로부터 ADP 용액을 마이크로칩(3) 내에 밀어넣었다. 그리고, 최초의 단계 1과 2는, 교반부(313)로부터 공기를 제거하기 위해 펌프를 작동시키기 위하여 행한 것이다. 제1 펌프(320)의 압력 센서에 의해 압력 변화를 측정하였다. 결과를 도 7의 (B)에 나타낸다.

[표 2]

실시예 6

혈전 생성의 화상 해석

실시예 5의 혈전 생성의 과정은 실제로는 도 8의 (A)∼(D)의 사진에 나타낸 바와 같이 관찰된다. 혈액 유입 직후의 유로 내는, 혈액에 의해 적색이지만, 유로 내에 백색 혈전이 생성됨에 따라 백색 영역이 증가한다.

그리고, 화상 처리 방법은 혈액 관측 장치 B의 화소 성분을 해석하는 하기의 방법으로 행하였다. 컬러 화상(RGB)의 B 성분(Blue)에 대하여, 임계값 80보다 작은 화소를 카운트하여, 화상 처리의 결과로 하였다.

이는, R(Red)이 강조된 부분을 추출하고 있는 것에 상당한다. 임계값은 0∼255 사이이며, 적색 부분이 적절하게 추출되도록 시행 착오를 통하여 80으로 결정하였다.

또한, 채널 범위에 상당하는 화소수(약 86000 도트)에 대한 비율(채널 비율)을 산출하고, RGB의 B 성분이 임계값 80보다 작은 화소를 카운트하여, 계열 1로서 화상 처리의 결과를 그래프화했다. 결과를 도 9에 나타낸다.

실시예 7

도 12에 나타내는 혈전 관측 장치 C를 사용한 응고 및 혈소판으로 이루어지는 혈전 형성의 측정예를 나타낸다.

도 10의 (A)의 기판(400)의 모든 유로는, 깊이가 120㎛, 유로 폭이 제1 유로(401), 합류 유로(403)는 250㎛, 제2 유로(402)는 50㎛, 제3 유로(406)는 50㎛인 홈이다. 각각의 유입구 및 배출구의 형상 및 크기는, 제1 유입구(411)가 직경 2mm, 제2 유입구(412)가 직경 0.7mm, 제3 유입구(418)가 직경 2mm인 원형으로 하였다. 각 접속 노즐의 굵기는, 제1 접속 노즐(435)의 외경을 0.7mm, 제2 접속 노즐(436)의 외경을 2mm로 하였다. 배출구(414)는 직경 2mm인 원형으로 하였다. 도 10의 (B)와 같이 교반부(413)는 반경 1.5mm인 원형이며 하류로 갈수록 합죽선 모양으로 좁아지는 형상이며, 깊이를 1.2mm로 하였다. 교반자(417)는 길이 2mm 직경 1mm의 원기둥형의 자성을 가지는 교반자이며 표면을 니켈로 코팅하였다.

혈전 유발재로서 콜라겐 타입 I(닛타젤라틴사)와 PT 시약(시스멕스사)의 혼합액 24μL를 기판(410)의 혈전 유발재 설치부(415)에 상당하는 위치에 한변이 1cm인 정사각형으로 도포하고, -0.08 메가파스칼로 3시간 감압하에서 건조했다. 기판(400)과 기판(410)을 서로 접합시켰을 때 합류 유로(403)가 혈전 유발재를 도포한 정사각형 부분의 중심을 통과하지 않도록, 즉 정사각형의 단으로부터 2.5mm의 위치에 합류 유로(403)가 통과하도록 혈전 유발재를 코팅했다. 혈전 유발재를 도포한 정사각형 부분의 중심을 통과하지 않도록 한 것은, 혈전 유발재가 주위로부터 건조되고, 이 곳이 마지막으로 건조되므로, 표면이 평활하지 않은 경우가 있기 때문이다. 콜라겐 타입 I은, 3mg/ml짜리를 사용하였다. PT 시약은, 시스멕스사의 PT 시약 1 바이알을 2ml의 정제수에 용해시키고 정제수로 하룻밤 투석한 것을 1 대 1의 비율로 혼합한 것을 사용하였다.

혈액 리저버(433)에 제1 펌프(420)를 접속하고, 제1 접속 노즐(435)을 제2 펌프(421), 제2 접속 노즐(436)을 제3 펌프(422)에 각각 튜브를 통하여 접속하였다.

제1 펌프(420)에는 미네랄 오일을, 제2 펌프(421)에는 0.2M 염화 칼슘 용액을, 제3 펌프(422)에는 0.5M의 EDTA(pH10) 용액을 각각 충전하였다.

3.2%의 구연산 나트륨 용액을 채혈 직후의 혈액에, 용량비가 혈액에 대하여 구연산 나트륨 용액이 9:1이 되도록 혼합하고, 또한 최종농도 25μg/ml가 되도록 콘 유래 트립신 저해제를 첨가하고 항응고 처리한 혈액을 혈액 리저버(433)에 충전하였다.

제1 펌프(420), 제2 펌프(421), 제3 펌프(422)의 프로그램을 하기 표 3에 나타낸다. 프로그램에 따라 혈액을 마이크로칩(4)에 주입하고, 염화 칼슘과 혼합하면서 합류 유로에 혈액이 흐르도록 했다.

혈액이 합류 유로에 흐르도록 했을 때의 압력 센서(432)로 측정한 압력 변화의 데이터를 도 13에 (a)로서 나타낸다.

[표 3-1]

[표 3-2]

도 14는 본 측정예에서 백색 혈전을 형성시키고, 도 12의 구동식 CCD 카메라(424)로 정지 화상을 경시적으로 촬영하여, 재합성한 예이다. 동일한 곳을 일정 시간마다 촬영함으로써 서서히 백색 혈전이 형성되고, 마이크로칩(4)의 유로가 폐색되어 가는 상태가 관찰된다.

실시예 8

실시예 7의 마이크로칩(4)을 혈전 관측 장치로부터 꺼내고, 기판(400)과 기판(410)을 박리하여, 혈전 유발재 설치부 상에 형성된 혈액 응고 및 활성화 혈소판으로 구성되는 백색 혈전을 꺼내고, 1% 글루타르알데히드 및 4산화 오스뮴으로 고정화한 후, 임계점 건조법으로 건조하고, 주사형 전자 현미경으로 관찰하였다. 또한, 칼슘 재첨가에 의해 정치 하에 전혈 응고시킨 것을 동일하게 처리하여 주사형 전자 현미경으로 관찰하여 비교했다.

도 15의 (A)는 마이크로칩 내에 형성되는 백색 혈전, 도 15의 (B)는 정치 환경에서 형성되는 혈병의 전자 현미경 사진이다.

도 15의 (A)는 혈소판이 주성분이며 적혈구가 거의 관찰되지 않은 데 비해, 도 15의 (B)는 적혈구가 피브린 섬유에 얽혀져 형성되어 있다. 도 15의 (A)와 (B)의 차이보다 본 혈전 관측 장치에서의 혈전이, 혈류가 없는 환경에서 형성되는 종래의 전혈 응고시킨 혈병과는 마이크로적인 분석에 있어서도 상이한 것을 알 수 있다. 또한, 마이크로칩(4)을 박리하여, 더욱 상세하게 관찰·분석함으로써 더욱 상세한 정보를 얻을 수 있다.

실시예 9

혈액에 0.5 단위/ml로 되도록 저분자 헤파린(후라그민(Fragmin))을 더 첨가한 점 이외는, 실시예 7과 동일하게 측정을 행하였다.

압력 센서(432)에 의해 측정된, 혈전 형성에 의한 압력 상승을 도 13의 (c)에 나타낸다.

실시예 10

0.2M의 칼슘 용액 대신, 8000 단위/ml의A 제제(클리액터(Cleactor), 에자이가부시키가아샤)액을 제2 펌프(421)에 충전한 점 이외는 실시예 7과 동일하게 측정을 행하였다.

압력 센서(432)에 의해 측정된, 혈전 형성에 의한 압력 상승을 도 13의 (b)에 나타낸다.

실시예 11

도 12에 나타내는 혈전 관측 시스템 C를 사용한 혈소판 기능의 측정예를 나타낸다.

기판(400)의 모든 유로의 깊이는 120㎛, 유로 폭은 제1 유로(401), 합류 유로(403)는 250㎛, 제2 유로(402)는 50㎛, 제3 유로(406)는 50㎛로 하였다. 제1 유입구(411)의 직경을 2mm, 제2 유입구(412)의 직경을 0.7mm, 제3 유입구(418)의 직경을 2mm로 하였다. 제1 접속 노즐(435)의 외경을 0.7mm, 제2 접속 노즐(436)의 외경을 2mm, 배출구(414)의 직경을 2mm로 하였다. 교반부(413)는 반경 1.5mm의 원으로 하류로 갈수록 합죽선 모양으로 좁아지는 형태이며, 깊이를 1.2mm로 하였다. 교반자(417)는 길이 2mm, 직경 1mm의 원기둥형의 교반자이며 표면을 니켈로 코팅하였다.

혈전 유발재로서 콜라겐 타입 I(닛타젤라틴사)와 PT 시약(시스멕스사)의 혼합액 24μL를 1cm×1cm의 정사각형으로 도포하고, -0.08 메가파스칼로 3시간 감압하에 건조했다. 기판(400)과 기판(410)을 접합시켰을 때 합류 유로(403)가 혈전 유발재를 도포한 정사각형의 중심을 통과하지 않도록, 즉 정사각형의 단으로부터 2.5mm의 위치에 합류 유로(403)가 통과하도록 혈전 유발재를 코팅했다. 콜라겐 타입 I은 3mg/ml짜리를 사용하였다. PT 시약은, 시스멕스사의 PT 시약 1 바이알을 2ml의 정제수에 용해시키고 정제수로 하룻밤 투석한 것을 1 대 1의 비율로 혼합한 것을 사용하였다.

혈액 리저버(433)에 제1 펌프(420)를 접속하고, 제1 접속 노즐(435)을 제2 펌프(421), 제2 접속 노즐(436)을 제3 펌프(422)에 각각 접속하였다.

제1 펌프(420)에는 미네랄 오일을, 제2 펌프(421)에는 정제수 및 1㎛ 또는 2㎛의 ADP 용액을, 제3 펌프(422)에는 0.5M의 EDTA(pH10)의 용액을 각각 충전하였다.

3.2%의 구연산 나트륨 용액을 채혈 직후의 혈액에, 용량비가 혈액에 대하여 구연산 나트륨 용액이 9:1이 되도록 혼합한 혈액을 혈액 리저버(433)에 충전하였다.

제1 펌프(420), 제2 펌프(421), 제3 펌프(422)의 프로그램은 실시예 7과 동일한 프로그램(표 3)으로 실시하였다.

제2 펌프(421)가 정제수인 경우에는 측정 개시 후 30분 후에도 혈소판 덩어리(塊)는 확인되지 않았다. 제2 펌프(421)가 1㎛의 ADP인 경우에는 약 15분 후, 2㎛인 경우에는 약 10분 후부터 분명한 혈소판 응집괴가 혈전 생성실(415)에 형성되었다. 그러나, 혈소판 응집덩어리의 강도가 약하고 압력 상승은 생기지 않았다.

이상, 본 발명을 최적 실시 형태예에 기초하여 설명하였으나, 본 발명은 이들 실시예나 형태예로 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위에서 다양하게 변경될 수 있다.

예를 들면, 교반자로는, 특허 문헌 3에 기재된 기둥형 돌기물로 이루어지는 교반자, 특허 문헌 4에 기재된 피에조 효과로 진동하는 교반자, 혹은, 특허 문헌 5에 기재된 광의 압력으로 회전하는 교반자 등에 응고 억제 처리를 실시한 것을 사용할 수도 있다.

[산업상 이용 가능성]

본 발명의 마이크로칩, 혈액 관측 장치 및 혈액 관측 방법은, 환자 등에 투여한 항혈전약의 효능을 평가하거나, 미량의 혈액을 사용하여 혈류와 동등 환경 하에서의 혈액 응고 및 혈소판에 의한 혈전 생성을 종합적으로 관측하기에 바람직하게 이용할 수 있다.

1, 2, 3, 4: 마이크로칩 40: 스테이지
100, 200, 300, 400: 제1 기판 110, 210, 310, 410: 제2 기판
220: 제3 기판 101, 201, 301, 401: 제1 유로
102, 202, 302, 402: 제2 유로 103, 203, 303, 403: 합류 유로
104, 304: 폐액 저류부 105, 205, 305: 협착부
111, 211, 311, 411: 제1 유입구
112, 212, 312, 412: 제2 유입구 113, 213, 313, 413: 교반부
114, 214, 314, 414: 배출구
115, 215, 315, 415: 유발재 설치부(혈전 생성실)
117, 217, 317, 417: 교반자 306, 406: 제3 유로
318, 418: 제3 유입구 320, 420: 제1 펌프(펌프 1)
321, 421: 제2 펌프(펌프 2) 322, 422: 제3 펌프(펌프 3)
323: 고정용 구멍 324, 424: 카메라
325, 425: 화상 해석 장치 326: 마이크로칩 고정용 핀
327, 427: 히터 328: 관측용 간극
329, 429: 스터러 330: 마이크로칩 설치용 스테이지
331, 431: 조명 432: 압력 센서
433: 혈액 리저버 434: 폐액 탱크
435: 제1 접속 노즐 436: 제2 접속 노즐
437: 폐액 튜브 A: 혈액 관측 장치
B: 혈액 관측 장치 C: 혈액 관측 장치

Claims

전혈(全血) 혹은 다혈소판 혈장, 또는 이들의 약제 처리액으로부터 선택되는 제1 액체를 유입시키는 제1 유로와, 상기 제1 유로에 접속되어, 상기 제1 액체와 반응할 수 있는 약제를 포함하는 제2 액체를 유입시키는 제2 유로와, 상기 제1 유로와 상기 제2 유로의 접속부로부터 연장 형성된 합류 유로를 내부에 구비하는 마이크로칩으로서,
상기 합류 유로에, 상기 제1 액체와 상기 제2 액체를 혼합하는 교반자를 가지는 교반부가 설치된, 마이크로칩.
제1항에 있어서,
상기 교반자의 표면이 응고 억제 처리된, 마이크로칩.
제2항에 있어서,
상기 응고 억제 처리가 헤파린, 폴리비닐락톤아미드 또는 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트로 적어도 상기 교반자의 표면을 형성하는 처리인, 마이크로칩.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반부의 폭이 상기 합류 유로보다 넓은, 마이크로칩.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반부의 폭이 하류 쪽으로 갈수록 점차로 좁아지는, 마이크로칩.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반부의 깊이가 상기 합류 유로보다 깊은, 마이크로칩.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교반부의 깊이가 하류 쪽으로 갈수록 점차로 얕아지는, 마이크로칩.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 합류 유로의 깊이가 50㎛∼200㎛인, 마이크로칩.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 합류 유로를 구성하는 홈이 표면에 형성된 제1 기판과, 상기 교반부가 되는 구멍이 표면에 형성된 제2 기판을, 상기 홈 및 구멍의 개구부를 내측으로 하여 적층시켜 이루어지는, 마이크로칩.
제9항에 있어서,
상기 제1 기판과 상기 제2 기판의 접합 강도가 0.5kgf∼50kgf인, 마이크로칩.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마이크로칩은, 상기 교반부의 하류에, 그 내부의 적어도 일부에 혈전의 생성을 유발하는 혈전 생성 유발재가 포함된 혈전 생성실을 가지는, 마이크로칩.
제11항에 있어서,
상기 혈전 생성 유발재는 콜라겐, 또는 콜라겐과 조직 인자의 혼합물인, 마이크로칩.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로칩을 사용하는 혈전 형성의 측정 방법으로서,
상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정하는, 혈전 형성의 측정 방법.
제13항에 있어서,
상기 항응고 처리된 혈액이 구연산에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 항응고 처리를 해제시키는 시약이 칼슘을 포함하는 용액인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로칩을 사용하는 혈전 형성 및 혈전 용해능의 측정 방법으로서,
상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 항응고 처리를 해제시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실에서 혈전 형성을 측정하고, 또한 상기 제2 유로로부터 혈전 용해 물질을 유입시켜 생성한 혈전을 용해시키는, 혈전 형성 및 혈전 용해능의 측정 방법.
제15항에 있어서,
상기 혈전 용해 물질이 플라스민, 유로키나아제, 및 조직 플라스미노겐 액티베이터로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종류 이상인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로칩을 사용하는 혈소판 기능의 측정 방법으로서,
상기 제1 유로로부터 항응고 처리된 혈액을, 상기 제2 유로로부터 혈소판을 활성화시키는 시약을, 각각 교반부에 유입시켜, 상기 교반부에서 혼합한 후, 혈전 생성실을 통과시켜 혈소판 기능을 측정하는, 혈소판 기능의 측정 방법.
제17항에 있어서,
상기 항응고 처리된 혈액이 구연산 또는 헤파린에 의해 항응고 처리된 혈액이며, 상기 항응고 처리를 해제시키는 시약이 ADP, 콜라겐, 리스토세틴, 또는 아라키돈산인, 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 유로로부터 유입시키는 항응고 처리된 혈액과 상기 제2 유로로부터 유입시키는 시약의 용량비가 10:2 ∼ 100:1인, 방법.
제19항에 있어서,
상기 교반부에 있어서, 상기 제1 유로로부터 유입된 혈액과 상기 제2 유로로부터 유입된 시약의 혼합액이 5초∼3분간 교반되는, 방법.
제20항에 있어서,
상기 교반자의 선회 속도가 30회전/분∼300회전/분인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로칩을 사용한, 혈액 관측 장치.
제22항에 있어서,
상기 제1 유로와 상기 제2 유로가 아래쪽, 및 상기 합류 유로가 위쪽이 되도록 마이크로칩이 설치된, 혈액 관측 장치.
제22항 또는 제23항에 있어서,
상기 제1 유로, 상기 제2 유로 및 상기 합류 유로 중 적어도 1개의 유로에 대한 압력을 측정하기 위한 압력 센서를 포함하는, 혈액 관측 장치.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 합류 유로 내를 관찰하기 위한 카메라를 포함하는, 혈액 관측 장치.