JP5953084B2 - マイクロチップ、及び血液観測装置 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロチップ、及び血液観測装置に関する。

血液凝固能や血小板機能などの血液観測を行うためのマイクロチップおよびそれを用いた血液観測装置として、例えば特許文献１に記載の技術がある。特許文献１には、全血もしくは多血小板血漿またはそれらの薬剤処理液から選択される第１の液体を流入させる第１の流路と、第１の流路に接続されて、第１の液体と反応しうる薬剤を含む第２の液体を流入させる第２の流路と、第１の流路と第２の流路の接続部から延設された合流流路とを内部に備えるマイクロチップであって、合流流路に、第１の液体と第２の液体を混合する攪拌子を有する撹拌部が設置されたマイクロチップおよびそれを用いた血液観測装置が開示されている。

また、特許文献２には、流路を有するマイクロ化学チップと流路に液体試料を送液する送液チューブとを接続するマイクロコネクタが開示されている。また、特許文献２では、上記流路に接続された孔が形成されたチューブ挿入部を備え、送液チューブを、上記流路に接続された孔が形成されたチューブ挿入部に形成された孔に挿入することが開示されている。

国際公開第２００９−０６９６５６号パンフレット 特開２００７−１５２１５１号公報

マイクロチップを用いて血液観測を行う場合、マイクロチップを血液観測装置のステージにセットする必要がある。ここで、マイクロチップは、ステージの適正な位置にセットする必要があり、マイクロチップの位置がずれると正確な観測を行うことができない。そこで、例えば特許文献１では、ステージにチップ固定用ピンを設けるとともに、マイクロチップに固定用の孔を設け、チップ固定用ピンと固定用の孔とをはめ込むよう工夫している。また、特許文献１では、上記以外の工夫として、ステージに２つの接続ノズルを設置し、この２つの接続ノズルをマイクロチップの２つの流入口に接続することを開示している。

しかしながら、チップ固定用ピンと固定用の孔とをはめ込む場合には、チップ固定用ピンと固定用の孔を、血液観測装置のステージとマイクロチップに設ける必要がある。換言すると、チップ固定用ピンや固定用の孔を省くことができれば、血液観測装置やマイクロチップをより簡易な構成とすることができる。また、２つの接続ノズルをマイクロチップの２つの流入口に接続することで、チップ固定用ピンや固定用の孔を省くことができる。但し、特許文献１では、２つの接続ノズルをマイクロチップの２つの流入口に接続する場合における、接続ノズルやマイクロチップの具体的な構成については言及されていない。

本発明は、上記した問題に鑑み、マイクロチップの位置決めを行うことができる新たな技術を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を採用する。すなわち、本発明は、少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップであって、観測対象となる血液を含む第一流体が流入する第一流入口と、上流側において前記第一流入口と接続され、前記第一流体が流れ、血栓が生成される第一流路と、前記第一流路の下流側と接続され、血栓生成後の第一流体を外部へ排出する排出口と、前記血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体が流入する第二流入口と、前記第二流体が流れる第二流路であって、一端が前記第二流入口と接続され、他端が前記血栓生成後の第一流体が流れる第一流路と接続される第二流路と、を備え、前記第二流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記第二流体を吐出するノズルを収容する。

血液観測を行うためのマイクロチップとは、全血または多血小板血漿などを用いて血流と同等環境下における血液凝固および血小板による血栓生成を微量の血液を用いて効率よく正確に評価するためのものである。本発明に係るマイクロチップでは、血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体を吐出するノズルが、マイクロチップをステージに載置する際、第二流入口に収容される。ここで、第二流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含む構成であり、ノズルは、一方の基板（ステージ側の基板）を貫通するだけでなく、他方の基板内にも伸びている。そのため、第二流入口にノズルが収容されると、ステージ上で、２枚の基板の移動が同時に規制され、マイクロチップの位置決めを確実に行うことができる。また、位置決めを確実に行えることで、観測の精度が向上する。

また、一方の基板に設けた貫通孔だけの場合では、マイクロチップの厚みに多少のばらつきがあった場合、ノズルが他方の基板に接触し流体の吐出が阻害されるおそれがあるが、他方の基板に窪み部を設けることで、マイクロチップの厚みのばらつきに対応することができる。

マイクロチップは、２枚の基板が貼り合わされたものの他、既存の３枚の基板が貼り合わされたものでもよい。第一流路の流路幅は、変化を持たせることができ、これにより血栓生成を促進することができる。第一流路の内面には、血栓生成を促進するため、コラーゲンなどの血栓生成誘発剤をコーティングするようにしてもよい。

また、ノズルは、先端に向けてその外径を徐々に細く形成することができ、第二流入口の窪み部は、底部に向けてその径を徐々に細く形成することができる。これにより、ノズルを第二流入口に容易に収容することができ、また、より確実にノズルが第二流入口に固定される。そのため、接続ミスの発生を抑制でき、また、接続ミスに伴う液漏れの発生も抑制することができる。

なお、本発明に係るマイクロチップは、上述した第一流入口と第二流入口の機能を兼備える流入口を備え、この流入口が、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、マイクロチップを載置するステージから突出し、流入口から流入する流体を吐出するノズルを収容するようにしてもよい。この場合、流入口から流入する流体は、予め抗凝固処理された血液を含む流体とすることができる。すなわち、本発明は、少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップであって、観測対象となる、抗凝固処理された血液を含む流体が流入する流入口と、上流側において前記流入口と接続され、前記流体が流れ、血栓が生成される流路と、前記流路の下流側と接続され、血栓生成後の流体を外部へ排出する排出口と、を備え、前記流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記流体を吐出するノズルを収容する。なお、前記流入口は、前記ノズルを収容し、前記ステージ上での前記マ
イクロチップの移動を規制するようにしてもよい。また、前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成され、前記流入口の窪み部は、底部に向けてその径が徐々に細く形成されるようにしてもよい。

ここで、本発明は、上述したマイクロチップを用いて血液観測を行う血液観測装置として特定することもできる。例えば、本発明は、血液観測装置であり、少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うための上述したマイクロチップを載置するステージと、前記ステージから突出し、血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体を吐出するノズルであって、前記第二流入口に収容されるノズルと、を備える。

本発明に係る血液観測装置では、ノズルがステージより突出しており、第二流入口に収容される。そして、上述したように、このノズルは、一方の基板（ステージ側の基板）を貫通するだけでなく、他方の基板内にも伸びている。そのため、第二流入口にノズルが収容されると、２枚の基板の移動を同時に規制することができ、マイクロチップの位置決めを確実に行うことができる。また、位置決めを確実に行えることで、観測の精度が向上する。

ここで、ノズルが第二流入口に収容された状態では、第二流入口を中心としたマイクロチップの回転移動は許容される。そこで、前記ステージから突出し、前記マイクロチップの側部と接することで、前記第二流入口とともに、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、位置決め補助部を更に備える構成としてもよい。これにより、マイクロチップの回転移動を規制することができ、より確実に位置決めを行うことができる。

なお、上述したように、ノズルは、先端に向けてその外径を徐々に細く形成することができる。これにより、ノズルを第二流入口に容易に収容することができ、また、より確実にノズルが第二流入口に固定される。そのため、接続ミスの発生を抑制でき、また、接続ミスに伴う液漏れの発生も抑制することができる。

また、血液観測装置は、上述した予め抗凝固処理された血液を含む流体が流入する流入口を備えるマイクロチップを用いて血液観測を行うものでもよい。すなわち、本発明は、少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップを用いて血液観測を行う血液観測装置であって、前記マイクロチップは、観測対象となる、抗凝固処理された血液を含む流体が流入する流入口と、上流側において前記流入口と接続され、前記流体が流れ、血栓が生成される流路と、前記流路の下流側と接続され、血栓生成後の流体を外部へ排出する排出口と、を備え、前記流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記流体を吐出するノズルを収容し、前記血液観測装置は、前記マイクロチップを載置するステージと、前記ステージから突出し、前記流体を吐出するノズルであって、前記流入口に収容されるノズルと、を備える。

本発明に係る血液観測装置は、前記ステージから突出し、前記マイクロチップの側部と接することで、前記流入口とともに、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、位置決め補助部を更に備える構成でもよい。また、前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成されているものでもよい。

本発明によれば、マイクロチップの位置決めを行うことができる新たな技術を提供することができる。

第一実施形態に係るマイクロチップの第一基板の平面図を示す。 第一実施形態に係るマイクロチップの第二基板の平面図を示す。 第一基板と第二基板を貼り合わせた、実施形態に係るマイクロチップの平面図を示す。 図１ＣにおけるＡ−Ａ断面図を示す。 図１ＣにおけるＢ−Ｂ断面図を示す。 第一実施形態に係る血液観測装置の構成を示す。 ノズルと第二流入口との接続を説明する図を示す。 変形例に係るノズルと第二流入口との接続を説明する図を示す。 第二実施形態に係るマイクロチップの第一基板の平面図を示す。 第二実施形態に係るマイクロチップの第二基板の平面図を示す。 第一基板と第二基板を貼り合わせた、実施形態に係るマイクロチップの平面図を示す。 図５ＣにおけるＡ−Ａ断面図を示す。 第二実施形態に係る血液観測装置の構成を示す。 第二実施形態において、ノズルと流入口との接続を説明する図を示す。

以下、図面を参照して、本発明に係る、マイクロチップ及び血液観測装置について説明する。なお、以下の実施形態の構成は例示であり、本発明はこの実施形態の構成に限定されるものではない。

[第一実施形態]
＜マイクロチップ＞
まず、マイクロチップについて説明する。図１Ａから図１Ｅは、第一実施形態に係るマイクロチップの構成を示す。なお、図における破線は、流路や流入口などがマイクロチップ１の内部に存在することを意味する。

第一基板１０は、図１Ａに示すように、平面視長方形であり、第一流入口１２が設けられている。第一流入口１２には、図示しないチューブが接続され、観測対象となる血液を含む第一流体が流入する。第一流入口１２は、第一流路２０と連通しており、流入した第一流体は第一流路２０へ流れる。チューブには、ポンプ、真空採血管、シリンジなどが接続されるが、これらについては、後述する血液観測装置２で説明する。第一実施形態における第一流体とは、血液に対して血液と反応しうる薬剤が既に混合された混合液である。第一流入口１２は、貫通孔であり、第一実施形態では円形である。但し、第一流入口１２の形状は限定されるものではなく、多角形など任意の形状とすることができる。

また、第一基板１０には、更に、第二流入口１３の一部が設けられている。第二流入口１３は、第二基板１１に設けられた貫通孔１３ｂと、第一基板１０に設けられた貫通しない窪み部１３ａとによって構成され（図１Ｅ参照）、第一基板１０には、このうち窪み部１３ａが設けられている。第二流入口１３（第二基板１１側）には、図示しないチューブのノズル４が接続され、血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体が流入する。第二流体には、第一流体としての混合液の凝固を抑制する血液凝固防止剤が例示される。また、第二流入口１３は、マイクロチップ１をステージに載置する際の位置決め機能を有する。第二流入口１３とチューブのノズル４の接続の詳細については後述する。第二流入口１３は、第二流路１７と連通しており、流入した第二流体は第二流路１７へ流れる。チューブには、ポンプ、防止剤タンクなどが接続されるが、これらについては、後述する血液観測装置２で説明する。第一実施形態に係る窪み部１３ａは、断面が円形であるが、多角形など任意の形状としてもよい。また、窪み部１３ａの底部は、第一実施形態では平坦であるが、湾曲していてもよい。また、窪み部１３ａの深さは、ノズル４を収容でき、窪み
部１３ａの底部の厚みを確保できる深さとして設計することができる。窪み部１３ａの形状や大きさは、ノズル４の形状や大きさを考慮して設計することが好ましい。

また、第一基板１０には、更に、排出口１９が設けられている。排出口１９は、廃液貯留部１８と連接する貫通孔であり、廃液貯留部１８で貯留される廃液を外部へ排出する。廃液は、吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不織布や織布等布などに染み込ませて吸い上げてもよく、また、ポンプなどにより吸引して、外部へ排出するようにしてもよい。

第二基板１１も第一基板１０と同じく、平面視長方形であり、第一流路２０、第二流路１７、第二流入口１３、廃液貯留部１８が設けられている。

第一流路２０は、第一流入口１２から流入する血栓生成前の混合液、血栓生成中の混合液、血栓生成後の混合液が流れる。第一流路２０は、第二基板１１の表面に形成された溝により構成されている。溝の形状や大きさは、特に限定されず、溝の形状は、例えば半円状、矩形状とすることができる。第一流路２０の上流部分１４は、一端が第一流入口１２と接続されるとともに、第一流入口１２の内径と同程度の幅を有しており、血栓生成前の混合液が流れる。第一流路２０の上流部分１４の他端には、下流側に向けて徐々にその幅が狭くなるテーパ部分１６が設けられている。更に、このテーパ部分１６の下流側には、上流部分１４の半分程度の幅を有する下流部分１５が接続されている。テーパ部分１６及び下流部分１５の内面は、コラーゲンなどの血栓生成誘発剤でコーティングされており、混合液がこれらの領域を通過することで、血栓が生成される。また、テーパ部分１６を設けることで、高ずり応力惹起血小板凝集も観測することができ、アテローム血栓症の血栓生成を再現することもできる。

血栓生成誘発剤としては、コラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）、予め作られた血栓、絹糸やコットン等の繊維基材などが例示される。これらは一種単独で、または、複数を組み合わせて使用することができる。これらのうち、入手が容易で、取り扱いやすく、実際の血管に近いモデルとなることからコラーゲンが特に好ましく、コラーゲンと組織トロンボプラスチンを含むものでも良い。血栓生成誘発剤が血流によって流出しないようコラーゲンやｖＷＦなどの血栓生成誘発剤は、テーパ部分１６や下流部分１５に高い接着強度でコーティングすることができる。コラーゲンのコーティングは、例えば、特開平０５−２６０９５０号公報やＢｌｏｏｄ．１９９５ Ａｐｒ １；８５（７）：１８２６−３５．に記載されているように、コラーゲンを酸性溶液に溶解し、これに親水性が付与されたガラスやポリスチレンの基板を浸漬し、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便に高い接着強度でコーティングが可能である。疎水性の樹脂等にコートする場合には、樹脂表面をプラズマ処理等で親水化した後、所望の領域にコラーゲン溶液を塗布し、自然乾燥ないしは減圧下にて乾燥することでコーティングすることが出来る。また、繊維基材や予め作られた血栓などの血栓生成誘発剤は、テーパ部分１６や下流部分１５に固定された状態が望ましい。そして、薄い吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不織布や織布等にコラーゲンを含浸し、乾燥させておく事で、より血栓生成誘発能の高い血栓生成誘発剤が得られる。また、組織トロンボプラスチンを含むコラーゲン溶液にそれらの基材を浸漬させ乾燥させると、さらに血栓生成誘発能が高まる。血栓生成誘発剤としてコラーゲンをコーティングする場合、第二基板１１のうち少なくともコーティングする領域の基材は平滑なガラスまたはプラスチックとするとコラーゲンの密着性に優れ好ましい。基材としてプラスチックを用いた場合はプラズマ処理等で親水化し、所望の領域にコラーゲン溶液をピペットやシリンジ等のディスペンサーで塗布し、自然乾燥または減圧下で乾燥することでコラーゲンまたは組織トロンボプラスチンを含むコラーゲンを容易にコーティングすることが可能である。

第二基板１１には、第二流入口１３の貫通孔１３ｂが設けられており、貫通孔１３ｂを
介して上述したように血液凝固防止剤が流入する。第二流入口１３を構成する貫通孔１３ｂには、第二流路１７の一端が接続され、血液凝固防止剤が流れる。

第二流路１７は、上記のように一端が第二流入口１３に接続され、他端が廃液貯留部１８に接続されている。廃液貯留部１８には、第一流路２０の他端（下流部分１５の最下流側）も接続されている。そのため、廃液貯留部１８には、血栓生成後の混合液、すなわち廃液と、血液凝固防止剤とが流入する。廃液と、血液凝固防止剤とは、廃液貯留部１８で混合された後、上述した貫通孔かなる排出口１９より外部へ排出される。第一実施形態では、廃液貯留部１８は平面視長方形であるが、円形、正方形など他の形状でもよい。

窪み部１３ａが設けられた面と各溝が設けられた面とが接するように、第一基板１０と第二基板１１とが貼り合わされることで、マイクロチップ１が構成される。すなわち、第二基板１１の第一流路２０、第二流路１７、廃液貯留部１８は、その表面に溝が形成され、一方、表面が平坦な第二基板１１と貼り合わされることで、第二基板１１が蓋として機能する。その結果、図１Ｄ、図１Ｅに示すように、第一流路２０、第二流路１７、廃液貯留部１８が管状の流路となる。

ここで、マイクロチップ１の材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等が好ましい。また、血液観測（特に画像解析）に使用する観点からは透明な材質が好ましい。さらに、流路を形成する観点からはプラスチックが好ましく、透明なプラスチックが特に好ましい。材質をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン製とした場合には、基板同士の密着性に優れるため、第一基板１０と第二基板１１とを接着剤などで接着しなくても圧着することで積層することが出来るが、マイクロチップ１の内部に高い圧力がかかる場合は、接着剤を用いることが好ましい。ポリスチレン製の基板を用いた場合には流路内をポリビニルラクトンアミド（ＰＶＬＡ）で簡便に高い接着強度でコーティングすることができるので、抗凝固処理されていない血液を用いる場合に、意図しない部位での血液凝固を抑制することが可能である。また、ポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）によっても簡便かつ効果的に意図しない部位での血液凝固を抑制する事が可能である。なお、マイクロチップ１を構成する第一基板１０や第二基板１１に設けられる溝や穴は、刃物やレーザー光線で堀ることもできるが、マイクロチップ１の材質がプラスチックである場合は、射出成型で形成することもできる。射出成型で形成すると、一定した品質のマイクロチップ１を効率よく作成できる。

＜血液観測装置＞
次に血液観測装置２について説明する。図２に示すように、血液観測装置２は、ステージ２１、第一ポンプ３、シリンジ３１、第二ポンプ５、防止剤タンク５１、カメラ７、コンピュータ８を備える。

ステージ２１は、上述したマイクロチップ１を載置する。そのため、ステージ２１は、マイクロチップ１よりも一回り大きく形成され、第一実施形態ではマイクロチップ１よりも一回り大きい長方形である。ステージ２１は、マイクロチップ１を載置できればよく、その形状や大きさは特に限定されない。

ステージ２１には、血液凝固防止剤を送るチューブの先端に設けられたノズル４が接続されている。ここで、図３は、ノズルと第二流入口との接続を説明する図を示す。図３に示すように、ノズル４は、マイクロチップ１を載置した際、マイクロチップ１の第二流入口１３に対応する位置に設けられ、ステージ２１の裏面から表面に貫通して上方に突出している。ノズル４は、外径が第二流入口１３の内径よりも僅かに小さく形成され、第二流入口１３に収容自在である。ステージ２１から突出したノズル４の長さは、ノズル４を第二流入口１３に収容した際、ノズル４の先端が第二流入口１３の底部、すなわち窪み部１
３ａの底部に接触しないよう、第二流入口１３の深さよりも短く、かつ、ノズル４の先端が窪み部１３ａに達するよう設計されている。そのため、第二流入口１３にノズル４が収容されると、ステージ２１上では、２枚の基板（第一基板１０、第二基板１１）の移動が同時に規制され、マイクロチップ１の位置決めを確実に行うことができる。また、位置決めを確実に行えることで、観測の精度が向上する。更に、ノズル４は、先端に向けてその外径が徐々に細くなるように形成されている。これにより、ノズル４を第二流入口１３に容易に収容することができる。そのため、接続ミスの発生を抑制でき、また、接続ミスに伴う液漏れの発生も抑制することができる。なお、図４に示すように、窪み部１３ａは、ノズル４と同じく、底部に向けてその径が徐々に細くなるように形成してもよい。これにより、第二流入口１３にノズル４を収容した際の固定力が向上する。

ここで、マイクロチップ１は、ノズル４が第二流入口１３に収容されることで、その移動が規制されるが、ノズル４と第二流入口１３との接続のみでは、ノズル４を中心とした回転運動が許容される。そこで、第一実施形態では、ステージ２１上に、この回転運動を抑制するための位置決め補助部としての突起ネジ２２が設けられている。突起ネジ２２は、マイクロチップ１を正しい位置に載置した際、マイクロチップ１の側部と接する位置に設けることができる。第一実施形態では、ノズル４の近傍に突起ネジ２２が設けられている。これにより、マイクロチップ１の移動（ノズル４を中心とした回転運動）を規制することができ、より確実に位置決めを行うことができる。なお、突起ネジ２２は、ステージ２１に対して取り外し自在とすることが好ましい。また、大きさや形状が異なるマイクロチップ１に対応できるよう、ステージ２１には、突起ネジ２２を接続するための接続用孔を予め複数設けておくことが好ましい。これにより、利便性がより向上する。

ステージ２１の中央には、第一流路２０を流れる混合液をカメラ７で撮像するための窓部２３が設けられている。第一実施形態の窓部２３は、第一流路２０に沿う細長い長方形であり、血栓の発生が促進される、テーパ部分１６及び下流部分１５をカメラ７で撮像できるようになっている。

カメラ７は、ステージ２１の裏面側に配置され、上述した窓部２３を通じて血栓の発生状況等を撮像自在である。カメラ７は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ
によって構成することができる。カメラ７は、汎用のコンピュータ８に接続されており、撮像された画像データは、コンピュータ８の記憶装置に記憶することができる。コンピュータ８は、ＣＰＵ、メモリ、ディスプレイ、キーボードやマウスなどの操作部を備える。撮像した画像データを分析する画像分析プログラムをコンピュータ８にインストールし、このコンピュータ８により画像分析を行えるようにしてもよい。なお、画像解析の方法は、例えば特許文献１に記載されている方法等、既存の方法により適宜行うことができる。

なお、図２では記載を省略しているが、血栓の生成を観察するため、マイクロチップ１内に圧力センサを設け、マイクロチップ１内の圧力を観察したり、または制御してもよい。また、必要に応じてマイクロチップ１を加温するヒータや、マイクロチップ１に対して光を発する照明等を設けてもよい。

第一ポンプ３は、チューブを介してシリンジ３１と接続されている。また、シリンジ３１は、チューブを介して第一流入口１２と接続されている。第一ポンプ３は、シリンジ３１に貯留される血液（血液に対して血液と反応しうる薬剤が既に混合された混合液）を送り出す。例えば、第一ポンプ３にはミネラルオイルが充填されており、第一ポンプ３からミネラルオイルがシリンジ３１に注入され、注入されたミネラルオイルに押されて血液（混合液）がチューブを通り、第一流入口１２を介してマイクロチップ１内に流入する。血液の流入圧力は圧力センサを配置し、配置した圧力センサによって計測することができる。シリンジ３１に代えて血液リザーバを用いてもよい。第一ポンプ３には、市販の一般的
なポンプを用いることができる他、エアーの一定圧で押し出したり、シリンジをプランジャーが上になるよう倒立させ、プランジャーに重りをのせたりしてシリンジポンプとしてもよい。

第二ポンプ５は、チューブを介して血液凝固防止剤を貯留する防止剤タンク５１と接続され、防止剤タンク５１はチューブを介して第二流入口１３とノズル４により接続されている。第二ポンプ５は、防止剤タンク５１に貯留される血液凝固防止剤を送り出す。例えば、第二ポンプ５には、０．５M EDTA（pH10）の溶液が充填されおり、第二ポンプ５から上記溶液が防止剤タンク５１に注入され、注入された溶液に押されて血液凝固防止剤がチューブを通り、ノズル４から吐出され、第一流入口１２を介してマイクロチップ１内に流入する。血液凝固防止剤の流入圧力は圧力センサを配置し、配置した圧力センサによって計測することができる。

＜観察方法＞
次に、マイクロチップ１及び血液観測装置を用いた観察方法について説明する。まず、血液観測装置のステージ２１にマイクロチップが設置される。マイクロチップ１の設置は、まず、第二流入口１３にノズル４が収容され、次に、マイクロチップ１の側部が突起ネジ２２と接するよう、マイクロチップ１の向きが調整される。ノズル４が第二流入口１３に収容され、マイクロチップ１の側部が突起ネジ２２と接すると、マイクロチップ１の設置、すなわち位置決めが完了する。

マイクロチップ１が設置されると、第一流入口１２に血液が流される。すなわち、第一ポンプ３を動作させることで、シリンジ３１に貯留されている血液（混合液）がチューブを介してマイクロチップ１内に流入する。血液の流入圧力は、例えば圧力センサにより計測することができる。

第一実施形態で観察対象となる血液は、血液に対して、血液と反応しうる薬剤が既に混合された混合液とすることができる。測定用サンプルとしての血液を採血する方法としては、シリンジまたは真空採血管に予め抗凝固処理剤を入れて採血を行うか、または、採血直後の血液に抗凝固処理剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。さらに、ヘパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパリナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、ヘパリナーゼでヘパリンを分解させ、測定目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。また、同様にクエン酸を含む真空採血管で採血し、塩化カルシウムおよびコーン由来トリプシンインヒビターやトロンビンアプタマー等の観測目的に適した凝固因子阻害剤を加えることで、観測目的に合わせて抗凝固処理した血液を採血することが可能である。抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤のうち、一般的な３．２％クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液９容に対してこの抗凝固処理剤１容とするのが好ましい。その他の抗凝固処理剤としてはヘパリン、ヒルジン、ヒルログ（ヒルジンＣ末端領域ペプチド）、アプロチニン、抗トロンビン抗体、トロンビンアプタマー、コーン由来トリプシンインヒビター（１９７７． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５２．８１０５）等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。

血液と反応しうる薬剤には、抗凝固解除剤が例示される。抗凝固解除剤としては、クエン酸のようなキレート剤による抗凝固処理を解除する場合は、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム等のハロゲン化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、重炭酸カルシウム等の無機酸カルシウム塩、蟻酸、酢酸、プロピオ
ン酸、酪酸、アルギン酸、乳酸、グルコン酸、グリセリン酸、グリセロリン酸等の有機酸のカルシウム塩、などの遊離カルシウム供与体であるカルシウム化合物を挙げることができる。

また、抗凝固解除剤として凝固因子阻害剤（抗凝固処理剤）による抗凝固処理を解除する場合は、凝固因子阻害剤に応じた抗凝固解除剤を適宜選択して使用することができる。例えば、ヘパリンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、プロタミン、へパリナーゼまたは抗へパリン抗体等が利用可能であり、ヒルジン、ヒルログおよびアプロチニンを用いて抗凝固処理した場合の抗凝固解除剤としては、それぞれ抗ヒルジン抗体、抗ヒルログ抗体および抗アプロチニン抗体等の抗凝固解除剤が使用可能である。さらに、抗トロンビン抗体を凝固因子阻害剤による抗凝固処理を解除する場合は、抗凝固解除剤として、ＰＰＡＣＫトロンビン等の完全に不活性化されたトロンビン、トロンビンの分解断片およびトロンビン中における抗体認識エピトープを含有する合成ポリペプチド等の抗凝固解除剤の使用が可能である。なお、抗凝固処理、または抗凝固解除に使用される抗体は補体系への影響を最小限にする為に、パパイン等でＦｃドメインを取り除いたものを使用するか鶏卵抗体等のヒト補体系活性化能を有さない抗体を使用することが望ましい。

そして、１本鎖オリゴＤＮＡであるトロンビンアプタマー（Ｂｌｏｏｄ． １９９３ Ｊｕｎ １５；８１（１２）：３２７１−６．やＪ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ １０；２７２（５）：６８８−９８．）を抗凝固処理剤として用いた場合にはトロンビンアプタマーに対するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等のトロンビンアプタマーに結合し機能を阻害する物質が抗凝固解除剤として使用可能である。トロンビンアプタマーはエクソサイトＩおよびＩＩを認識する２種を併用すると、単独の場合より飛躍的に高い抗凝固処理効果が得られる。この際用いられるアンチセンスＤＮＡは実質的にトロンビンアプタマーの抗トロンビン機能を無効化するものであれば、トロンビンアプタマーの一部に対するものであってもよい。

なお、薬剤には、血小板を活性化する薬剤を用いてもよい。血小板を活性化する薬剤としては、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビンおよびリストセチンなどが例示される。

第一流入口１２から流入した混合液は、第一流路２０を流れる。具体的には、上流部分１４、テーパ部分１６、下流部分１５の順に流れる。テーパ部分１６及び下流部分には、血栓誘発剤が設けられており、テーパ部分１６及び下流部分１５を混合液が流れることで、血栓が生成される。混合液が第一流路２０を流れる様子は、ステージ２１の裏面側に設置されたカメラ７により、窓部２３を通じて撮像することができる。撮像する画像データは、静止画でもよく、また、動画でもよい。

第一流路２０の最下流に達した混合液は、廃液貯留部１８に滞留する。廃液貯留部１８には、第二流路１７が接続されていることから、第二流路１７を通じて血液凝固防止剤が混合される。廃液貯留部１８において血液凝固防止剤が混合された廃液は、排出口１９を通じて排出される。例えば、廃液は、吸湿性の繊維基材、例えば、コットン、不織布や織布等布などに染み込ませて吸い上げてもよく、また、ポンプなどにより吸引して、外部へ排出することができる。なお、第一実施形態では、廃液をマイクロチップ１の第一基板１０から排出させたが、第二基板１１に貫通孔を設け、第二基板側から排出させるようにしてもよい。この場合、ステージ２３の対応する位置にも貫通孔を設ける必要がある。

血液の流速を目視で観測したり、例えば第一ポンプ３に圧力センサを接続し、接続した圧力センサによって測定することによって血液が有する血液凝固能を評価することができる。また、血栓が生成される様子を目視やカメラ７で観測することによって血液凝固の状態を調べることができる。

なお、薬剤として血小板を活性化する薬剤を用いた場合、混合された血液は、血小板が活性化されながら第一流路２０を流れる。テーパ部分１６や下流部分１５を流れることで、血小板の粘着・凝集が惹起され、血小板血栓が生成される。このときの血液の流速や圧力を測定することによって血小板機能を評価することができる。また、血栓生成室を目視やカメラ７で観測することによって血小板による血栓生成の状態を調べることができる。これにより、血小板の粘着、凝集などの血小板機能を人体内に近い環境で具体的に観測することができる。

＜効果＞
以上説明した第一実施形態に係るマイクロチップ１及び血液観測装置２によれば、血液凝固防止剤を吐出するノズル４が、マイクロチップ１を血液観測装置２のステージ２１に載置する際、第二流入口１３に収容される。そのため、第二流入口１３にノズル４が収容されると、ステージ２１上では、２枚の基板（第一基板１０、第二基板１１）が同時に規制され、マイクロチップ１の位置決めを確実に行うことができる。また、位置決めを確実に行えることで、観測の精度が向上する。更に、ノズル４は、先端に向けてその外径が徐々に細くなるように形成されている。これにより、ノズル４を第二流入口１３に容易に収容することができる。そのため、接続ミスの発生を抑制でき、また、接続ミスに伴う液漏れの発生も抑制することができる。

[第二実施形態]
＜マイクロチップ＞
図５Ａから図５Ｄは、第二実施形態に係るマイクロチップの構成を示す。なお、図における破線は、流路や流入口などがマイクロチップ１ａの内部に存在することを意味する。なお、第一実施形態と同様の構成については同一符号を付し、説明は割愛する。

第一基板１０ａは、図５Ａに示すように、平面視長方形であり、流入口１２aの一部が
設けられている。流入口１２ａは、第二基板１１ａに設けられた貫通孔１２ｂ１と、第一基板１０ａに設けられた貫通しない窪み部１２ａ１とによって構成され（図５Ｄ参照）、第一基板１０ａには、このうち窪み部１２ａ１が設けられている。流入口１２ａ（第二基板１１ａ側）には、図示しないチューブのノズル４ａが接続され、抗凝固処理された血液を含む流体が流入する。また、流入口１２ａは、マイクロチップ１ａをステージに載置する際の位置決め機能を有する。すなわち、先に説明した第一実施形態に係るマイクロチップ１における第二流入口１３と同様の機能を有する。また、第一基板１０ａには、排出口１９が設けられており、廃液貯留部１８で貯留される廃液を外部へ排出する。

第二基板１１ａも第一基板１０ａと同じく、平面視長方形であり、流入口１２ａを構成する貫通孔１２ｂ１、流路２０ａ、廃液貯留部１８が設けられている。流路２０ａは、流入口１２ａから流入する血栓生成前の混合液、血栓生成中の混合液、血栓生成後の混合液が流れる。

窪み部１２ａ１が設けられた面と各溝が設けられた面とが接するように、第一基板１０ａと第二基板１１ａとが貼り合わされることで、マイクロチップ１ａが構成される。すなわち、第二基板１１ａの流路２０ａ、廃液貯留部１８は、その表面に溝が形成され、一方、表面が平坦な第二基板１１ａと貼り合わされることで、第二基板１１ａが蓋として機能する。その結果、図５Ｄに示すように、流路２０ａ、廃液貯留部１８が管状の流路となる。

＜血液観測装置＞
次に第二実施形態に係る血液観測装置２ａについて説明する。図６に示すように、血液
観測装置２ａは、ステージ２１、ポンプ３ａ、シリンジ３１ａ、カメラ７、コンピュータ８を備える。ポンプ３ａは、チューブを介してシリンジ３１ａと接続されている。また、シリンジ３１ａは、チューブを介して流入口１２ａと接続されている。ポンプ３ａは、シリンジ３１ａに貯留される血液（抗凝固処理された血液）を送り出す。

ステージ２１には、抗凝固処理された血液を含む流体を送るチューブの先端に設けられたノズル４ａが接続されている。ここで、図７は、ノズルと流入口との接続を説明する図を示す。図７示すように、ノズル４ａは、マイクロチップ１ａ載置した際、マイクロチップ１ａの流入口１２ａに対応する位置に設けられ、ステージ２１の裏面から表面に貫通して上方に突出している。ノズル４ａは、外径が流入口１２ａの内径よりも僅かに小さく形成され、流入口１２ａに収容自在である。流入口１２ａにノズル４ａが収容されると、ステージ２１上では、２枚の基板（第一基板１０ａ、第二基板１１ｂ）の移動が同時に規制される。
＜効果＞
以上説明した第二実施形態に係るマイクロチップ１ａ及び血液観測装置２ａによれば、ノズル４ａが、マイクロチップ１ａを血液観測装置２ａのステージ２１に載置する際、流入口１２ａに収容される。そのため、流入口１２ａにノズル４ａが収容されると、ステージ２１上では、２枚の基板（第一基板１０ａ、第二基板１１ｂ）が同時に規制され、マイクロチップ１ａの位置決めを確実に行うことができる。また、位置決めを確実に行えることで、観測の精度が向上する。更に、ノズル４ａは、先端に向けてその外径が徐々に細くなるように形成されている。これにより、ノズル４ａを流入口１２ａに容易に収容することができる。そのため、接続ミスの発生を抑制でき、また、接続ミスに伴う液漏れの発生も抑制することができる。

以上、本発明の好適な実施形態を説明したが、本発明は、これらに限らず、可能な限りこれらの組合せを含むことができる。また、上述した実施形態は、一例にすぎない。例えば、特許文献１に開示されているマイクロチップや血液観測装置２とも適宜組合せることができる。

１、１ａ・・・マイクロチップ
２、２ａ・・・血液観測装置
３・・・第一ポンプ
３ａ・・・ポンプ
４、４ａ・・・ノズル
５・・・第二ポンプ
７・・・カメラ
８・・・コンピュータ
１０、１０ａ・・・第一基板
１１、１１ａ・・・第二基板
１２・・・第一流入口
１２ａ・・・流入口
１３・・・第二流入口
１２ａ１、１３ａ・・・窪み部
１２ｂ１、１３ｂ・・・貫通孔
１７・・・第二流路
１８・・・廃液貯留部
１９・・・排出口
２０・・・第一流路
２０ａ・・・流路
２１・・・ステージ
２２・・・突起ネジ
２３・・・窓部
３１、３１ａ・・・シリンジ
５１・・・防止剤タンク

Claims (12)

1. 少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップであって、
   観測対象となる血液を含む第一流体が流入する第一流入口と、
   上流側において前記第一流入口と接続され、前記第一流体が流れ、血栓が生成される第一流路と、
   前記第一流路の下流側と接続され、血栓生成後の第一流体を外部へ排出する排出口と、
   前記血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体が流入する第二流入口と、
   前記第二流体が流れる第二流路であって、一端が前記第二流入口と接続され、他端が前記血栓生成後の第一流体が流れる第一流路と接続される第二流路と、を備え、
   前記第二流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記第二流体を吐出するノズルを収容し、
   前記窪み部は、前記マイクロチップの厚み方向において、前記第二流路よりも深く延出している
   マイクロチップ。
2. 前記第二流入口は、前記ノズルを収容し、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、
   請求項１に記載のマイクロチップ。
3. 前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成され、
   前記第二流入口の窪み部は、底部に向けてその径が徐々に細く形成される、
   請求項１又は２に記載のマイクロチップ。
4. 少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップであって、
   観測対象となる、抗凝固処理された血液を含む流体が流入する流入口と、
   上流側において前記流入口と接続され、前記流体が流れ、血栓が生成される流路と、
   前記流路の下流側と接続され、血栓生成後の流体を外部へ排出する排出口と、を備え、
   前記流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出し
   た窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記流体を吐出するノズルを収容し、
   前記窪み部は、前記マイクロチップの厚み方向において、前記流路よりも深く延出している
   マイクロチップ。
5. 前記流入口は、前記ノズルを収容し、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、
   請求項４に記載のマイクロチップ。
6. 前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成され、
   前記流入口の窪み部は、底部に向けてその径が徐々に細く形成される、
   請求項４又は５に記載のマイクロチップ。
7. 少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップを用いて血液観測を行う血液観測装置であって、
   前記マイクロチップは、観測対象となる血液を含む第一流体が流入する第一流入口と、
   上流側において前記第一流入口と接続され、前記第一流体が流れ、血栓が生成される第一流路と、
   前記第一流路の下流側と接続され、血栓生成後の第一流体を外部へ排出する排出口と、
   前記血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体が流入する第二流入口と、
   前記第二流体が流れる第二流路であって、一端が前記第二流入口と接続され、他端が前記血栓生成後の第一流体が流れる第一流路と接続される第二流路と、を備え、
   前記第二流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記第二流体を吐出するノズルを収容し、
   前記窪み部は、前記マイクロチップの厚み方向において、前記第二流路よりも深く延出し、
   前記血液観測装置は、
   前記マイクロチップを載置するステージと、
   前記ステージから突出し、血栓生成後の第一流体の凝固を抑制する第二流体を吐出するノズルであって、前記第二流入口に収容されるノズルと、を備える血液観測装置。
8. 前記ステージから突出し、前記マイクロチップの側部と接することで、前記第二流入口とともに、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、位置決め補助部を更に備える
   請求項７に記載の血液観測装置。
9. 前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成されている、
   請求項７又は８に記載の血液観測装置。
10. 少なくとも２枚の基板が貼り合わされた、血液観測を行うためのマイクロチップを用いて血液観測を行う血液観測装置であって、
    前記マイクロチップは、観測対象となる、抗凝固処理された血液を含む流体が流入する流入口と、
    上流側において前記流入口と接続され、前記流体が流れ、血栓が生成される流路と、
    前記流路の下流側と接続され、血栓生成後の流体を外部へ排出する排出口と、を備え、
    前記流入口は、一方の基板を貫通する貫通孔と、この貫通孔から他方の基板内に延出した窪み部とを含み、前記マイクロチップを載置するステージから突出し、前記流体を吐出するノズルを収容し、
    前記窪み部は、前記マイクロチップの厚み方向において、前記流路よりも深く延出し、
    前記血液観測装置は、
    前記マイクロチップを載置するステージと、
    前記ステージから突出し、前記流体を吐出するノズルであって、前記流入口に収容されるノズルと、を備える血液観測装置。
11. 前記ステージから突出し、前記マイクロチップの側部と接することで、前記流入口とともに、前記ステージ上での前記マイクロチップの移動を規制する、位置決め補助部を更に備える
    請求項１０に記載の血液観測装置。
12. 前記ノズルは、先端に向けてその外径が徐々に細く形成されている、
    請求項１０又は１１に記載の血液観測装置。
    

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