KR20100095309A - 참돌꽃의 면역활성을 갖는 유효성분의 추출방법 및 그 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참돌꽃의 면역활성을 갖는 유효성분의 추출방법 및 그 추출물에 관한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 참돌꽃을 500Mpa의 초고압에서 연속하여 5~15분 동안 초고압 추출한 후, 수직 환류 냉각기가 부착된 추출플라스크에서 시료 중량에 대해 10배수의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한 위 경우에, 상기 초고압으로 추출된 추출물을 분획여두에 넣고 클로로포름을 첨가하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 후 클로로포름층을 분리함으로써, 참돌꽃으로부터 면역활성을 갖는 유효성분을 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 위 각 방법에 의해 얻어지는, 참돌꽃의 면역활성을 갖는 추출물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 참돌꽃의 유용 성분 추출에 초고압 기술을 도입함으로써 기존의 추출 방법이 가지고 있던 고에너지 저효율, 열에 의한 유용성분의 변성 및 손실, 가용성분 위주의 추출 등의 문제점을 개선하였다. 이로써 단시간에 불순물이 적은 순도 높은 유용 성분의 추출이 가능해졌다.
참돌꽃, 홍경천, 초고압추출, 분획, 클로로포름, 세포독성, 면역활성
Description
본 발명은 참돌꽃의 면역활성을 갖는 유효성분의 추출방법 및 그 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 참돌꽃의 기능 성분을 효율적으로 추출하기 위하여 초고압 추출 방법을 도입하고 이어지는 분획 과정의 수행을 통해서 면역활성 기능이 우수하고 독성은 저감된 성분을 효과적으로 추출할 수 있도록 한 기술에 관한 것이다.
참돌꽃은 돌나무과의 돌꽃속에 속하는 다년생 초본으로 홍경천(Rhodiola sachalinensis)이라고도 부른다. 소수의 종(種)을 제외한 대부분이 해발 3,500m~5,000m의 고산지대에서 서식하는 참돌꽃은 산소가 희박하고 일교차가 크며 저온건조하고 자외선이 강한 악조건에서도 자생이 가능한 특수한 적응성을 지녔으며, 그 생리활성으로서 간보호 활성, 알코올 흡수 억제 효과, 항알러지 효과 등이 보고되고 있다.
참돌꽃은 salidroside, p-tyrosol, flavonoid, monoterpene glycoside, cyanoglycoside 등과 같은 지표 활성물질을 가지고 있는 것으로 확인되었지만 국내에 자생하지 않을 뿐만 아니라 높은 독성으로 인해 현재 연구가 미비하고 그 활용도도 적은 편이다.
이에 본 발명에서는 초고압 추출 기술과 분획 기술을 도입하여 독성은 저감시키고 면역 기능성은 우수한 성분의 추출방법을 개발하였다.
본 발명의 핵심기술 중 하나인 초고압 공정은 참돌꽃의 유용 생리활성 성분을 단시간 내에 높은 순도로 추출할 수 있게 하며, 세포 조직 파괴로 인한 기존의 알려진 성분 외의 신물질 용출 및 세포 독성물질의 저감이라는 효과를 가능하게 하였다.
본 발명에서는 참돌꽃을 진공 상태로 추출용 비닐 용기에 물과 함께 넣은 후 밀봉 상태로 초고압 추출 장치에 장착하여 500Mpa 기압으로 15분 동안 초고압 처리한 다음 추출 flask에 넣어 60℃에서 12시간 2회 반복 추출한 후 30분 동안 초음파 처리하였다. 그리고 추출물을 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조하여 분말(powder) 상태로 제조하였다.
상기와 같은 공정을 통하여 얻어진 Powder상의 추출물을 사용하여 Water, Chloroform, Ethyl acetate, Butanol의 용매를 사용하여 분획을 시행하였다. 위와 같이 용매를 사용한 분획은 서로 섞이지 않은 용매 사이의 분배를 이용한 방법으로 용매의 친화력에 따라 성분을 분리하기 때문에 효율적인 분획을 위해서는 극성도가 다른 용매를 혼합하여 활성 성분과 친화성이 가장 좋은 추출용매를 선정하는 것이 중요하다. 참돌꽃 초고압 추출물의 분획을 시행할 경우 추출물에 존재하는 다량의 화합물을 물리, 화학적으로 성질이 유사한 화합물 군끼리 분류할 수 있어 분획물 각각의 특이적인 유용 생리활성을 측정할 수 있으며, 식품가공에 적용할 경우 활성성분의 농축에 의한 효율적인 가공제품의 제조를 가능하게 한다.
본 발명에서는 상기와 같은 공정을 통하여 얻어진 참돌꽃 분획물을 이용하여 참돌꽃의 면역 활성을 측정함으로써 상기 공정의 특정 분획물의 면역 활성 부분의 효과적인 기능을 확인하였다.
본 발명에서는 일반적인 단순 추출방법을 이용하여 추출할 경우의 문제점으로 지적돼온 유효성분 용출의 비효율성과 참돌꽃의 독성으로 인한 생리활성 성분의 생체적용성의 감소로 인해 발생하는 한계점을 극복하기 위해서, 참돌꽃의 면역 활성 성분의 효율적인 추출 공정으로서 초고압 추출을 도입하고 분획을 통해서 활성을 극대화함으로써 참돌꽃의 면역활성 기능의 증진을 가능하게 할 뿐 아니라 산업화 시 활성성분 농축에 의해 효율적인 제품화를 통한 경쟁력 향상이 가능하도록 하고자 한다.
본 발명의 초고압 추출 공정은 기존의 추출 기술의 단점을 보충함과 동시에 보다 높은 수율 증진과 유효 성분 용출을 통하여 높은 생리활성을 나타낼 수 있는 장점이 있고, 나아가 저온에서 진행되기 때문에 온도에 의한 성분의 변화가 적어 기능성 식품 소재의 추출 공정에 활용 가치가 높다고 하겠다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 면역활성을 갖는 참돌꽃의 유효성분을 뽑아내기 위해 초고압 상태에서 추출하는 것을 특징으로 한다.
더 구체적으로는 참돌꽃을 500Mpa의 초고압에서 연속하여 5~15분 동안 초고압 추출한 후, 수직 환류 냉각기가 부착된 추출플라스크에서 시료 중량에 대해 10배수의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한 위 각 경우에, 상기 초고압으로 추출된 추출물을 분획여두에 넣고 클로로포름을 첨가하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 후 클로로포름층을 분리함으로써, 참돌꽃으로부터 면역활성을 갖는 유효성분을 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 위 각 방법에 의해 얻어지는, 참돌꽃의 면역활성을 갖는 추출물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 참돌꽃의 유용 성분 추출에 초고압 기술을 도입함으로써 기존의 추출 방법이 가지고 있던 고에너지 저효율, 열에 의한 유용성분의 변성 및 손실, 가용성분 위주의 추출 등의 문제점을 개선하였다. 이로써 단시간에 불순물이 적은 순도 높은 유용 성분의 추출이 가능해졌다.
이러한 본 발명의 효과는 초고압 하에서 일어나는 단백질 변형 및 세포막 파괴에 기인하는 것으로 판단되는바, 본 발명에서는 용매가 세포 내부 깊숙이 침투하여 용출을 용이하게 하고 성분의 수득률 향상을 가능하게 하여 추출의 효율을 극대화할 수 있다. 또한 초고압 추출은 참돌꽃 독성물질의 저감 효과도 수반하는데, 이는 수소결합, 전기적 결합, 반데르발스 결합과 같은 에너지 수준이 제한된 약한 결합을 끊어 성분 변성을 유도하기 때문인 것으로 사료된다.
본 발명의 발명자들이 실시한 분획은 용매분획으로써 추출물에 존재하는 여러 가지 다량의 화합물로부터 면역 증진능을 나타내는 특유의 성분을 분리 및 농축하기 위해 실시하였다. 즉, 발명자들은 다양한 생리활성을 가지고 있으나 독성으로 인해 불가피하게 활용도가 적었던 참돌꽃을 대상으로 초고압 기술을 적용하여 독성 저감효과와 함께 여러 가지 생리활성 기능을 가지는 다량 화합물이 포함되어진 추출물을 생산한 후에, 면역 증진능을 나타내는 성분의 분리와 성분 농축 효과를 극대화할 수 있도록 용매 분획을 실시한 것이다. 본 발명에서는 후보 용매별로 각각의 분획물에 대한 면역 활성을 탐색하고 기존 일반 추출물과의 비교 작업을 통해, 초고압 추출 기술 및 분획공정을 이용한 독성 저감 효과 및 천연 유래 성분의 면역 활성 증진 효과를 실증하였다.
참돌꽃은 여러 가지 유효성분을 지니고 있음에도 그 독성 때문에 활용에 장애가 있거나 이용도가 극히 적었으나, 본 발명에서는 초고압 추출을 통해 참돌꽃의 독성을 낮추고 유효성분의 용출을 극대화하였을 뿐 아니라 참돌꽃이 지니고 있는 성분 중 순도 높은 활성 성분의 효율적 분리를 가능하게 하는 분획 공정을 통하여 생리활성 기능에 대해서도 수확을 거둘 수 있었다.
인체 면역반응에 긍정적인 영향을 미치는 면역활성과 관련하여서는, 상기와 같은 공정을 통해 참돌꽃이 가지고 있는 생체 내 유용 활성을 이용한 기능성 식품 소재로서 부가가치를 창출할 수 있는 계기가 될 것이다.
본 발명에서는 참돌꽃(홍경천)을 대상으로 하여 새로운 추출 공정 도입과 분획을 통해 결과적으로 유효 활성성분의 추출 극대화 및 활성의 극대화를 도모하여 면역활성능이 높은 기능성 소재의 생산을 가능하게 하였다.
본 발명에서는 초고압 추출 장치를 사용하여 500Mpa에서 각각 연속하여 5~15분 동안 초고압 추출을 시행하였다. 그리고 초고압 추출이 끝난 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료중량 대비 10배수의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 24시간 동안 추출하였는데, 이는 종래의 단순 열수추출에 비해 낮은 온도로 함으로써 추출성분의 안정성을 높이기 위함이다.
다음으로 그 얻어진 추출물을 감압여과 장치로 여과하고, 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 부탄올(Butanol) 및 증류수(Water)의 각각 극성이 다른 용매를 이용하여 참돌꽃의 생리활성 성분이 특정한 용매에서 추출이 극대화되어 농축될 수 있도록 단계적으로 분획을 시행하였다.
그 후 각각의 용매층을 추출 온도보다 낮은 온도로 감압 농축하고, 동결 건조하여 얻어지는 파우더상의 각각의 분획물질을 면역 활성 기능 검정에 사용하였다.
이하, 본 발명에 따른 참돌꽃의 추출과 분획에 관한 실시예를 공정별로 상세히 설명한다.
1. 제1공정 : 초고압 추출 및 열수 추출 공정
참돌꽃(홍경천)을 세척하여 초고압 기기 전용 비닐 용기에 넣은 후 물을 채 우고 공기가 들어가지 않도록 밀봉하였다. 밀봉한 비닐 용기를 초고압 추출 장치(Ilshin autoclave, Korea)에 넣고 500 Mpa에서 5~15분 동안 초고압 추출을 실행하였다.
초고압 추출이 끝난 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에, 시료 중량에 대해 10배수의 증류수를 용매로 하여 60℃에서 24시간 동안 열수 추출을 시행하였다. 추출이 종료된 후 얻어진 추출물을 감압 여과 장치로 여과 및 농축을 시행한 후 동결 건조하여 분말(powder)상의 추출물을 수득하였다.
2. 제2공정 : 분획 공정
상기의 공정에서 얻어진 참돌꽃 추출물 100g을 증류수에 완전히 용해시켰다. 그 후 분획여두에 넣고 Chloroform을 300㎖ 첨가하여 Chloroform층과 Water층을 분획한 뒤 Chloroform층을 분리하였다. 이와 같은 공정을 3번 반복하여 얻어진 Chloroform층을 감압 농축하여 Chloroform 분획물을 얻었다.
동일한 방법으로 Ethyl acetate, Butanol을 순차적으로 각각 3회씩 가하여 Chloroform, Ethyl acetate, Butanol, Water 분획물을 각각 얻은 후 감압 농축하였다. 이들 분획물들을 진공 건조하여 용매를 완전히 제거한 후 면역활성 실험에 사용하였다(표 1 참조).
3. 제3공정 : 분획물의 면역 기능 활성 평가
초고압 공정을 통한 참돌꽃 분획물의 생리활성을 확인하기 분획물을 이용하여 세포독성 및 면역 활성을 측정하였다.
(실험 1)
분획을 통해 얻어진 용매별 참돌꽃 분획물을 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0㎎/㎖의 농도로 조절하여 인간 신장 정상세포인 HEK293에 대한 세포독성을 측정하여 그래프 1에 나타내었다. 모든 분획물 중 최고 농도인 1.0㎎/㎖에서 Chloroform 분획물이 Water 분획물보다 0.75% 낮은 13.63%로 가장 낮은 세포 독성을 나타내었고, Ethyl acetate 분획물이 17.81%로 가장 높은 세포독성을 나타내었다.
세포독성 실험을 통해 물을 용매로 하여 초고압 공정만으로 참돌꽃을 추출하였을 경우보다 참돌꽃 추출물의 분획 공정을 더하여 실시할 경우 Chloroform 분획층에서 세포독성이 더욱 낮아지는 효과를 확인할 수 있다.
(실험 2)
참돌꽃 분획물이 인간의 면역체계에 중요한 역할을 하는 면역세포인 B cell(Raji)과 T cell(Jurkat)의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 1.0×104cells/㎖의 농도로 조절한 면역세포에 각각의 참돌꽃 분획물을 0.5㎎/㎖의 농도로 투여한 후 hemacytometer를 사용하여 세포수를 측정하여 생육 증강도를 알아보았다. 또한 분획물 투여 후 B cell과 T cell이 분비하는 면역물질로 인해 cytokines에 의해 영향을 받는 NK-cell(NK-92MI) 또한 그 활성도가 증가하는지를 관찰하였다. NK-cell 활성 측정은 B cell과 T cell의 상층액을 NK-cell에 첨가하여 비첨가군과 비교하여 그 활성을 측정하였다. 면역세포 생육도와 NK-cell 활성도를 측정한 결과는 B cell과 T cell 각각 그래프 2와 3에 나타내었다.
각각의 참돌꽃 분획물을 투여한 실험군에서 B cell과 T cell 모두 전체적으로 6일까지 생육이 증가하였으며, 그중 Chloroform 분획물은 가장 높은 생육도를 보여주는 6일째 B cell과 T cell에서 각각 13.2×104cells/㎖, 12.6×104cells/㎖의 세포 생육을 나타내어 참돌꽃의 분획물 중 가장 높은 면역세포 생육 활성을 나타냈다. 또한 NK-cell 활성도에 있어서 비첨가군에 비교하였을 때 배양액을 첨가한 모든 실험군에서 6일 동안 생육도가 증가하는 것을 확인하였다. Water 분획물을 첨가한 B cell과 T cell의 분비물의 투여를 통해 각각 13.11×104cells/㎖, 12.8×104cells/㎖로 가장 높은 생육활성을 나타내었으며, 면역세포 생육도 측정 실험에서 가장 높은 활성을 보여주었던 Chloroform 분획물은 B cell과 T cell 각각 14.05×104cells/㎖, 13.6×104cells/㎖로 그 다음 높은 활성을 보여주었다.
(실험 3)
참돌꽃 분획물에 의한 인간면역 세포의 생육 증강도를 뒷받침할 수 있는 자료로서 참돌꽃 분획물 투여로 인한 인간면역세포 B cell과 T cell의 면역물질 분비능을 구체적으로 알아보고자 면역세포가 분비하는 cytokine(IL-6, TNF-α)를 cytokine kit를 이용하여 측정하여 표 2에 나타내었다.
앞선 면역세포 생육활성 증진효과 실험과 마찬가지로 IL-6와 TNF-α 양의 변화는 각 분획물에 대해 6일째까지 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. IL-6의 경우 클로로포름 분획물을 처리한 것이 6일째 B cell에서 91×10-4 pg/㎖, T cell에서 95×10-4 pg/㎖로 가장 높은 농도를 나타내었으며, TNF-α도 마찬가지로 클로로포름 분획물을 처리한 것이 각각 94×10-4 pg/㎖, 99×10-4 pg/㎖로 높은 농도를 나타내었다.
이상의 결과를 통해 참돌꽃 분획물의 투여에 의해 면역 cell의 농도증가나 cytokine 분비량의 증가를 통해 참돌꽃 분획물 중 클로로포름 분획물이 면역활성과 관련하여 활용가능성이 있음을 확인할 수 있다.
(실험 4)
여러 가지 화합물에 의해 단구/대식세포(monocyte/macrophage-llike cells) 또는 과립구(granulocyte)로 분화된다고 알려져 있는 HL-60 세포주(cell line)을 이용하여 참돌꽃 분획물의 첨가를 통한 세포의 분화정도를 알아보고자 실험을 시행하였다.
분획물을 0.5㎎/㎖의 농도로 조절하여 세포에 투여한 후 총 5일 동안 24시간 간격으로 세포를 수확한 다음 분화도를 측정하여 그래프 4에 나타내었다. 모든 분획물 첨가군에서 4일째 가장 높은 분화능을 보여주었으며, Chloroform 분획물에서 131.9%의 가장 높은 세포 분화도를 확인할 수 있었다.
이는 참돌꽃 추출물 중 Chloroform을 용매로 하여 분획을 시행하였을 경우 그 분획물이 다른 용매에 의한 분획물보다 분화유도 물질의 증가와 이로 인한 세포의 신호전달 체계가 신속하게 이루어져 분화도가 증가한 것으로 사료된다.
상기와 같이 본 발명은 초고압 추출을 시행하여 이에 따른 참돌꽃의 독성저감 및 생리활성 성분의 효과적인 획득을 가능하게 하였으며, 초고압 추출물을 분획하여 각각의 분획물에 대해 실험을 함으로써 면역 활성 증진 효과의 증대라는 효과를 달성하였다.
Claims (5)
- 초고압 상태에서 추출하는 것을 특징으로 하는,면역활성을 갖는 참돌꽃의 유효성분 추출방법.
- 제1항에 있어서,참돌꽃을 500Mpa의 초고압에서 연속하여 5~15분 동안 초고압 추출한 후, 수직 환류 냉각기가 부착된 추출플라스크에서 시료 중량에 대해 10배수의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 추출하는 것을 특징으로 하는,참돌꽃의 면역활성을 갖는 유효성분 추출방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 초고압으로 추출된 추출물을 분획여두에 넣고 클로로포름을 첨가하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 후 클로로포름층을 분리하여 수득하는 것을 특징으로 하는,참돌꽃의 면역활성을 갖는 유효성분 추출방법.
- 제1항 또는 제2항의 추출방법으로 추출되는 것을 특징으로 하는,참돌꽃의 면역활성을 갖는 추출물.
- 제3항의 추출방법으로 추출되는 것을 특징으로 하는,참돌꽃의 면역활성을 갖는 추출물.
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| CN104841156A (zh) * | 2015-05-09 | 2015-08-19 | 东北师范大学 | 一种利用超高压设备提取植物中有效成分的方法 |
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