KR20100045654A - 인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 ＯｓＰＡＰ１ 및 형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래 탈인산화효소 OsPAP1 (Oryza sativa purple acid phosphatase 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

본 발명에서 분리된 OsPAP1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 OsPAP1 단백질은 인산결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여하는, 새로운 유전자로, 인산의 결핍조건에서 인산의 이용 효율을 증가시킬 수 있다.

인산결핍, 벼, 탈인산화효소, 식물형질전환, OsPAP1

Description

인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 ＯｓＰＡＰ１ 및 형질전환 식물체{A phosphate starvation-induced rice purple acid phosphatase gene and transgenic plants}

본 발명은 인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 (OsPAP1) 및 형질전환 식물체에 관한 것이다.

모든 살아있는 유기체는 일생동안 생물적, 비생물적 스트레스에 지속적으로 노출되어 있다. 동물은 위험에 노출되어질 경우 피할 수 있지만, 식물은 고착성 생물체로 다양한 스트레스에 대해 동물보다 더 많은 영향을 받게된다. 그러므로 식물은 자신을 보호하기 위해 비생물적 스트레스 (예를 들면, 수분, 온도, 빛, 염도, 금속과 토질)와 생물적 스트레스 (예를 들면, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 포식동물)를 빠르게 감지하고 반응해야 한다.

식물은 환경 스트레스 및 방어/스트레스 감응을 위한 정교한 네트워크를 가지고 발달되어졌다 (Yang Y. et al.,(1997) 11:1621-1639). 그러므로 식물은 움직 일 수 없기 때문에, 환경 자극을 빠르게 인식하고 반응하는 메카니즘을 가지게 되었다. 식물에서 단백질의 인산화/탈인산화 과정은 이러한 적응에 있어 매우 중요한 역할을 하며 (Umezawa T. et al.,(2004) Mol. Gen. Genet. 224:331-340), 특히 인산이 결핍된 조건에서 식물은 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고 고친화성 인산운반체, 탈인산화효소, 유기산 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도하게 된다 (Raghothama KG., (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50:665-693).

또한, 인산은 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 영양소 중의 하나로서, 인지질, 핵산, 에너지 대사, 효소활성의 조절, 신호전달과정 등에서 필수적인 생물학적 기능을 한다. 지구의 암석권에는 인산이 많이 존재하나 토양에서 인산의 80% 정도가 고정되어 있어, 뿌리가 쉽게 이용할 수 없기 때문에 인산은 작물 생산성에 제한인자로 존재하므로, 작물에 충분한 영양소를 공급하기 위해서는, 인산질 비료를 많이 주게 되고 그것으로 인하여 농업비용이 증가하게 되는 문제점이 발생한다. 뿐만 아니라 미처 흡수되지 못한 인산질 비료는 빗물에 씻겨 내려가 지하수를 오염시키고 부영양화를 일으켜 환경오염을 야기하게 된다.

따라서 이런 문제를 해결하기 위해서는 인산결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물 개발이 필요한 바, 본 발명자들은 인산 결핍 조건에서 발현하여 인산 이용효율을 증진시켜주는 기능을 가진 것으로 알려져 있는 탈인산화효소 유전자를 벼에서 분리하고, 이를 이용하여 인산결핍 조건에도 적응할 수 있는 식물체를 개발하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 인산결핍조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여함을 특징으로 하는 벼 유래 탈인산화효소 OsPAP1 (Oryza sativa purple acid phosphatase 1) 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 또는 재조합벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산서열로 이루어지고 인산 결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여함을 특징으로 하는 벼 유래 탈인산화효소 OsPAP1 (Oryza sativa purple acid phosphatase 1) 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 OsPAP1 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명에서는 벼 전체 게놈 서열이 규명되어 있기는 하나(Kikuchi, S. et al., Science, 301:376, 2003), 기존에 그 기능이 밝혀지지 않은 새로운 유전자로서, 인산결핍 조건에서 발현되는 탈인산화효소 유전자 OsPAP1 이 전체 1195bp의 염기서열을 가지고 있으며 355 아미노산을 암호화하고 있음을 밝혔다.

따라서 본 발명의 제1견지에 의하면,

본 발명은 서열번호 2의 아미노산서열로 이루어지고 인산 결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여함을 특징으로 하는 벼 유래 탈인산화효소 OsPAP1 (Oryza sativa purple acid phosphatase 1) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 OsMSRPK1 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 인산 결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여하는 탈인산화효소 활성을 의미한다.

또한, 본 발명의 제2견지에 의하면, 본 발명은 상기 OsPAP1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsPAP1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 제3견지에 의하면, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터에 관한 것이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으 며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

또한, 본 발명의 제4견지에 의하면, 본 발명은 상기 OsPAP1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러 한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태 의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에서 분리된 OsPAP1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 OsPAP1 단백질은 인산결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여하므로, 인산의 결핍조건에서 인산의 이용 효율을 증가시킬 수 있다.

따라서 상기 OsPAP1으로 형질전환된 식물체는 인산의 결핍시 야생종보다 효 율적으로 영양결핍에서 오는 스트레스를 극복하고, 식물의 인산 흡수 능력을 향상시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 벼 유래의 탈인산화효소 유전자 ( OsPAP1 )의 클로닝

본 실시예에서는 우리나라 재배 품종인 동진벼동진벼 (Oryza sativa cv. Dongjin)를 사용하였다.

동진벼에서 게놈 DNA를 분리하여 벼의 전체유전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 탈인산화효소 유전자 (OsPAP1)에 특이적인, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다.

서열번호 3: 5'-GGATCCATGGCTGTTGCACTC-3'

서열번호 4: 5'-GGATCCTCATTCTTCAGTTAC-3'

상기 프라이머로 PCR 방법을 이용하여 유전자의 코딩 영역을 증폭한 후, 증폭된 산물을 pBluescript 클로닝 벡터에 클로닝하여 시퀀싱을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다. 상기 OsPAP1 유전자의 cDNA 클론은 서열번호 1의 염기서열 (1008 bp)을 가지고 있으며, 서열번호 2의 335개 아미노산 서열을 암호화하고 있 다.

또한, 분리된 벼 탈인산화효소 유전자와 다른 식물체의 탈인산화효소 유전자와의 상동성을 CLASTAL W 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 이들 유전자들 간에는 50% 정도의 아미노산 염기서열이 같았다 (도 1 참고).

<실시예 2> 인산 결핍 조건에서 OsPAP1 유전자의 발현

일반적으로 유사기능을 하는 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도인자 특이적으로 조절되므로 분리된 탈인산화효소 유전자의 발현 양상을 RNA blot 방법을 이용하여 조사하였다. 이때 탈인산화효소 유전자 특이적인 염기서열을 가진 3′ UTR DNA 단편을 프로브로 사용하였다.

먼저, 동진벼 종자에서 유도된 캘러스 세포를 인산이 충분한 배지 (1 mM)와 인산이 결핍된 배지 (10 μM)에서 각각 2일간 배양하고, 트리졸 시약 (Trizol REAGENT, Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였다.

상기에서 분리된 10㎍의 RNA를 1.2% (W/V) 변성 포름알데히드 아가로스 겔에서 전기 영동하여 나일론 막 (nylon membrane, Amersham)에 RNA를 부착시킨 후, RNA 가 부착된 나일론 막은 [32P] dATP로 표지된 프로브를 20% (W/V) SDS, 20X SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린, 그리고 10ml/L Hearing sperm DNA (10 mg/ml)가 포함된 용액과 함께 65℃에서 하룻밤동안 반응시켰다.

그 결과, 벼 캘러스 세포에서의 OsPAP1 유전자의 발현은 인산의 결핍시간과 인산의 농도에 따라 발현량에 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 2를 참고하면, 인산 결핍 조건을 시간별로 실험한 결과 3일째부터 발현량이 급격히 증가하였고 (A), 영양결핍 조건에서 인산 결핍 처리시 가장 높은 발현을 보여 인산결핍에 특이적으로 발현하였으며 (B), 인산농도의 변화에 따라 OsPAP1 유전자의 발현량이 달라지며 특히, 저농도의 인산에서 발현량이 증가되었다(C).

따라서 인산 결핍 조건에서 벼 캘러스 세포에서의 OsPAP1 유전자 발현이 증가됨을 알 수 있다.

<실시예 3> OsPAP1 유전자가 도입된 제조합 단백질의 발현 및 탈인산화효소 활성.

본 실시예에서는, 재조합 단백질의 발현을 위해 먼저 OsPAP1 유전자를 pBluescript 벡터로부터 BamHⅠ과 BglⅡ제한효소로 잘라 pBacPAK9 벡터의 AcNPV 폴리헤드린 프로모터 아래쪽에 옮긴 다음, 500ng의 pBacPak9-OsPAP1과 100ng AcNPV DNA을 sf9세포와 5시간 공배양시켜 형질전환하였다.

상기 형질전환 세포를 TC 100 배지에서 5일 동안 배양하고, 상기 형질전환 곤충세포에서 발현된 OsPAP1 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 전기 영동한 결과, 야생형에서는 OsPAP1 단백질 사이즈에 발현이 나타나지 않았지만 OsPAP1이 재조합된 조건에서는 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 3A).

또한, 곤충세포의 야생형과 재조합 세포로부터 단백질을 분리하여 탈인산화효소활성을 측정하였다. 구체적으로, 100 mM 소디움 아세테이트(pH 5.6)를 처리하 여 37°C 에서 10분간 반응시킨 후, 2N NaOH를 가하여 반응을 멈추고, 7.5mM p-니트로페닐포스페이트로부터 니트로페놀이 방출되는 정도를 410㎚에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 정량하였다. 그 결과, 탈인산화효소 활성은 야생형에 비해 재조합단백질에서 효소활성도가 높게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 3B).

<실시예 4> OsPAP1 유전자가 도입된 형질전환체의 생산.

벼는 대부분 물속에서 생활하기 때문에 다른 밭작물에 비해 상대적으로 약한 인산 결핍 스트레스를 받으므로, 본 실시예에서는 벼에서 분리한 탈인산화효소 유전자의 밭작물에서의 응용가능성을 증명하고 식물체내에서 그 기능을 조사하기 위해 쌍떡잎식물의 대표적인 모델 식물체인 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에 OsPAP1을 대량발현하는 형질전환체를 만들었다.

애기장대의 형질전환체 생산과정은 다음과 같다.

먼저 OsPAP1 유전자의 코딩 영역을 바이너리 벡터 (binary vector, pCAMBIA1300-35S)의 BamHI 사이트에 클로닝하여, OsPAP1 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 컨스트럭트를 만들었다.

다음으로 triparental mating 방법을 이용하여 아그로박테리움 투메파이앙스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 옮긴 후, 애기장대 야생형 (wild-type) 식물체에 상기 제작된 컨스트럭트가 포함된 아그로박테리움 투메파이앙스 EHA105를 사용하여 in planta 형질전환 방법으로 애기장대를 형질전환하였다.

상기 형질전환된 애기장대 T1 식물체에서 수확한 종자를 무균 살균처리한 후, 카베니실린 (carbenicillin, 100 mg/L)과 하이그로마이신 (hygromycin, 20 mg/L)이 첨가된 B5 배지에서 발아시켜서 형질전환된 식물체를 선택하고, OsPAP1 유전자의 발현량을 RNA 블랏 방법으로 확인한 다음, 다음 세대에서 순종 식물체를 얻었다.

도 3을 참고하면, 상기 형질전환된 애기장대 식물체의 OsPAP1 유전자의 발현량을 PCR, 노던 블럿으로 확인한 결과, 야생형에 비하여 형질전환된 애기장대 식물체에서 OsPAP1 유전자의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 4A, B).

또한, 애기장대의 야생형과 형질전환 식물체로부터 단백질을 분리하여 탈인산화효소 활성을 측정하였다. 실험방법은 상기 실시예 3에 나와 있는 곤충세포 탈인산화효소 활성측정법과 같다. 그 결과, 탈인산화효소 활성이 야생형에 비해 형질전환 식물체에서 효소활성도가 높게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 4C).

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 OsPAP1으로 형질전환된 식물체는 인산의 결핍시 야생종보다 효율적으로 영양결핍에서 오는 스트레스를 극복하고, 식물의 인산 흡수 능력을 향상시킬 수 있으므로, 궁극적으로는 농가의 비료 사용량의 절감에 따른 농업비용 감소는 물론 환경오염 방지와 나아가 작물의 생산량과 생산의 질을 높이는데 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 벼 탈인산화효소 유전자와 다른 식물체의 탈인산화효소 유전자 간의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 것이다. (StPAP1: 감자, AAF60316: 콩, AtPAP3: 애기장대, CAE85073: 루피너스 , AAF60315: 고구마)

도 2는 벼의 캘러스 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서 OsPAP1 유전자의 발현 양상 나타낸 것이다.

A: 인산 결핍 조건에서 시간에 따른 OsPAP1 유전자의 발현 양상,

B: 영양결핍 조건에서 인산 결핍 처리시의 OsPAP1 유전자의 발현 양상,

C: 인산농도의 변화에 따른 OsPAP1 유전자의 발현 양상,

도 3은 배큘로바이러스 시스템을 이용하여 제조한 재조합 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 형질전환된 애기장대 식물체의 PCR 결과 (A), Northern 결과 (B), 탈인산화효소의 활성도 (C)이다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> A phosphate starvation-induced rice purple acid phosphatase gene(OsPAP1) and transgenic plants <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213> OsPAP1 gene <400> 1 atggctgttg cactcgcgct cttggctgcc atgtcggcgc tctcgtcgtg cacaagtccg 60 gccaccgcag agctcacacg gcacgagcac ccggtggccg ccggcgcgcc gctgcgcctc 120 ctcgtcgtcg gcgactgggg ccggaagggc ggctacaacc agacaagagt tgcagaacag 180 atggggaagg ttgcggagga gacggagatc gacttcgtcg tgtcaaccgg cgacaacttc 240 ttggagaacg gcctcgccgg cgtcgacgac atggcgttcc atgactcctt catggatgtc 300 tacacggctc agagcttgca caagccatgg taccttgttc ttggaaacca tgactacagg 360 ggaaatgtgc tagcacagat tgacccagct ctgaggaaga tcgacagcag gttcatctgc 420 atgagatcct tcattgtcag tgcaggaatt gtcgatttct tctttgtcga cacgaccccg 480 tttcagctcc agtactggac tgatcctgga gaagatcact atgactggag gggagtcgcg 540 cctcgggatg cgtacatcgc caatctcctc gaggatgttg atgctgcaat gaagaaatca 600 actgcaacat ggaagatagc tgtaggacat cataccatga ggagtgtgag tgcccatgga 660 gacacccagg agctccttga gcttctcctt cctgtcctca aggaaaacgg tgtcgatttc 720 tacatcaatg ggcatgatca ctgcctggag cacatcagca gcagaaacag tccaattcag 780 tacttcacta gtggaggcgg atcaaaggca tggagaggca tttttcaaca aaacgaagac 840 aagctccagt tcttctatga tggacaaggg ttcctgtcac ttgagctcag tgagaaccga 900 gctcgattcg ccttctacga cgttttcggt gaagctttgt accactggag cttcagcaaa 960 gctaatctgc agaaggttca gtcctctgct agtgtaactg aagaatga 1008 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> amino acid sequence of OsPAP1 <400> 2 Met Ala Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ala Met Ser Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 Cys Thr Ser Pro Ala Thr Ala Glu Leu Thr Arg His Glu His Pro Val 20 25 30 Ala Ala Gly Ala Pro Leu Arg Leu Leu Val Val Gly Asp Trp Gly Arg 35 40 45 Lys Gly Gly Tyr Asn Gln Thr Arg Val Ala Glu Gln Met Gly Lys Val 50 55 60 Ala Glu Glu Thr Glu Ile Asp Phe Val Val Ser Thr Gly Asp Asn Phe 65 70 75 80 Leu Glu Asn Gly Leu Ala Gly Val Asp Asp Met Ala Phe His Asp Ser 85 90 95 Phe Met Asp Val Tyr Thr Ala Gln Ser Leu His Lys Pro Trp Tyr Leu 100 105 110 Val Leu Gly Asn His Asp Tyr Arg Gly Asn Val Leu Ala Gln Ile Asp 115 120 125 Pro Ala Leu Arg Lys Ile Asp Ser Arg Phe Ile Cys Met Arg Ser Phe 130 135 140 Ile Val Ser Ala Gly Ile Val Asp Phe Phe Phe Val Asp Thr Thr Pro 145 150 155 160 Phe Gln Leu Gln Tyr Trp Thr Asp Pro Gly Glu Asp His Tyr Asp Trp 165 170 175 Arg Gly Val Ala Pro Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Asn Leu Leu Glu Asp 180 185 190 Val Asp Ala Ala Met Lys Lys Ser Thr Ala Thr Trp Lys Ile Ala Val 195 200 205 Gly His His Thr Met Arg Ser Val Ser Ala His Gly Asp Thr Gln Glu 210 215 220 Leu Leu Glu Leu Leu Leu Pro Val Leu Lys Glu Asn Gly Val Asp Phe 225 230 235 240 Tyr Ile Asn Gly His Asp His Cys Leu Glu His Ile Ser Ser Arg Asn 245 250 255 Ser Pro Ile Gln Tyr Phe Thr Ser Gly Gly Gly Ser Lys Ala Trp Arg 260 265 270 Gly Ile Phe Gln Gln Asn Glu Asp Lys Leu Gln Phe Phe Tyr Asp Gly 275 280 285 Gln Gly Phe Leu Ser Leu Glu Leu Ser Glu Asn Arg Ala Arg Phe Ala 290 295 300 Phe Tyr Asp Val Phe Gly Glu Ala Leu Tyr His Trp Ser Phe Ser Lys 305 310 315 320 Ala Asn Leu Gln Lys Val Gln Ser Ser Ala Ser Val Thr Glu Glu 325 330 335 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for OsPAP1 <400> 3 ggatccatgg ctgttgcact c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for OsPAP1 <400> 4 ggatcctcat tcttcagtta c 21

Claims (6)

1. 서열번호 2의 아미노산서열로 이루어지고 인산 결핍 조건에서 발현되어 인산의 흡수에 관여함을 특징으로 하는 벼 유래 탈인산화효소 OsPAP1 (Oryza sativa purple acid phosphatase 1) 단백질.
2. 제 1 항의 OsPAP1 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제 2 항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제 2 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제 2 항의 유전자 또는 제 4 항의 재조합벡터로 형질전환된 식물체.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나 나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.

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