KR20100039428A - 말라리아 기생충에서 ｇｐｉ의 생합성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

말라리아 기생충에서 ｇｐｉ의 생합성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 말라리아 기생충 P.falciparum에서 GPI 생합성에 관여하는 효소 중 하나인 GWT1(PfGWT1)의 분리에 성공하였다. 게다가 본 발명자들은 PfGWT1 단백질을 암호화하는 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중(縮重, degenerate) 돌연변이 DNA가 GWT1 결실 효모의 표현형을 상보할 수 있음을 밝혔다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 말라리아 기생충의 GWT1 단백질 및 항말라리아 약물을 위한 스크리닝 방법에 있어서 상기 단백질의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지며, GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 축중 돌연변이 DNA를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 축중 돌연변이 DNA를 이용한 항말라리아 약물을 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

말라리아 기생충에서 ＧＰＩ의 생합성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법{METHODS OF SCREENING FOR COMPOUNDS THAT INHIBIT THE BIOSYNTHESIS OF GPI IN MALARIA PARASITES}
본 발명은 말라리아 기생충에서 GPI의 생합성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
말라리아는 기생충에 의한 가장 흔한 감염성 인간 질환이다. 이 질환은 말라리아 기생충이 모기(Anopheles gambiae)를 매개로 감염에 의하여 야기된다. 매년 말라리아 감염자 수는 5억 명으로 추정되며, 그 중 사망자 수는 200만 명 이상에 달한다(Gardner et al ., Nature, 2003, 419: 498-511). 현재 세계 인구의 40%는 말라리아 유행 지역에 살고 있으며, 그러한 지역에서는 유아의 3명 중 1명이 말라리아에 의해 사망한다고 전해지고 있다.
말라리아 기생충을 포함하는 기생충에서는 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol: GPI)이 그 생육이나 감염에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 말라리아 기생충의 세포 표면에는 GPI-앵커 단백질이 많이 존재한다. GPI-앵커 단백질에는 기생충이 적혈구에 침입할 때에 기능하는 MSP-1과 같은 단백질이 포함된다. GPI-앵커 단백질은 기생충 항원으로 작용하며, 숙주에서 면역 반응을 야기한다. 따라서, 이전부터 백신 개발을 목표로 한 연구를 하고 있다.
GPI는 단백질을 세포막에 연결시키는 앵커로서 기능할 뿐만 아니라, 말라리아 기생충 세포막의 당지질 성분으로서 풍부하게 존재하고 있다. 최근의 연구로 GPI 독성을 가지며, 치사적 증상을 일으키는 것으로 나타났다. GPI는 TNF-α등의 염증성 사이토카인 및 접착 분자의 발현을 유도한다. 그 결과, 감염 적혈구의 모세혈관에의 부착이 일어나 혈관, 특히 뇌혈관이 폐색한다(sequestration). 이것에 의해, 뇌병증(encephalopathy)에 이른다고 생각되는 염증 반응이 유도된다. 최근에 Schofield 등은 항-GPI 항체가 쥐의 말라리아 기생충인 쥐 말라리아 기생충(Plasmodium berghei)을 사용한 생체내에서 감염 모델 시스템에서 치사성을 감소시키며, 게다가 시험관 내에서 상기 항체가 열대열말라리아 기생충(Plasmodium falciparum)에 의한 후기 염증 반응을 억제하는 것을 보고했다(Schofield, L. et al., Nature 418: 785-789, 2002). 이러한 발견은 GPI가 말라리아 감염의 치사성에 주요한 인자임을 시사하고 있다.
또한, 이노시톨의 아실화가 GPI와 만노스의 결합에 필수적임이 보고되었으며(Gerold, P. et al., Biochem . J. 344: 731-738, 1999), 게다가 과잉의 글루코사민에 의해 야기되는 이노시톨 아실화의 억제는 말라리아 기생충인 열대열말라리아 기생충의 성숙을 억제한다(Naik, R. S. et al., J. Biol . Chem . 278: 2036-2042, 2003)는 것이 보고되어 있다. 따라서 GPI의 생합성, 특히 이노시톨의 아실화를 선택적으로 억제할 수 있는 화합물은 매우 유용한 항말라리아 약물이 될 수 있다.
본 발명의 목적은 GPI의 생합성을 억제하는 항말라리아 약물을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 GPI의 생합성에 관여하는 단백질(GPI 생합성효소)인 GWT1 단백질을 코드하는 말라리아 기생충 DNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 항말라리아 약물의 스크리닝 방법에 있어서 상기 DNA의 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 말라리아 기생충의 GPI 생합성 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이 DNA를 제공한다. 이러한 축중 돌연변이 DNA는 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가진다. 본 발명은 또한 항말라리아 약물의 스크리닝 방법에 있어서의 상기 축중 돌연변이 DNA의 사용 방법을 제공한다.
GWT1 유전자는 당초 진균의 GPI-앵커 단백질의 합성효소를 코드하는 것으로 알려져 있으며(국제 공개 공보 제 02/04626호), 효모에서 사람에 이르는 생명체에 보존되어 있다. 본 발명자들은 효모 GWT1에 대한 Plasmodium falciparum(P. falciparum) 호몰로그인 PfGWT1; Plasmodium yoelii yoelii(P. yoelii yoelii) 호몰로그인 PyGWT1가 각각 열대열말라리아 기생충(P. falciparum) 및 쥐 말라리아 기생충(P. yoelii yoelii)의 완전한 게놈 서열에 속한다는 것을 확인하였다(Gardner et al ., Nature 2003, 419: 498-511; Carlton et al ., Nature 2003, 419:512-519). 본 발명자들은 또한 GWT1 유전자 산물이 GPI 생합성 경로에서 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제로서 작용함을 확인하였다. PfGWT1 유전자 산물이 유사한 활성을 가진다고 생각되며, 따라서 이러한 활성을 억제하는 화합물은 유망한 항말라리아 약물가 될 수 있다.
국제 공개 공보 제 02/04626호에서 본 발명자들은 진균의 GWT1 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물군을 찾아냈다. PfGWT1 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물은 항말라리아 약물로 기대되었다.
본 발명에서 발명자들은 PfGWT1의 거의 전체 길이로 생각되는 부분을 분리하는 데 성공하였다. P. falciparum과 같은 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물을 이용하여, 항말라리아 약물은 결합 실험, 글루코사미닐(아실) 포스파티딜이노시톨(PI-GlcN) 아실트랜스퍼라제 분석을 통해 또는 GPI-앵커 단백질의 검출 시스템을 이용하여 스크리닝이 가능하다. 이러한 스크리닝 시스템으로 얻어진 화합물은 유망한 항말라리아 약물이 될 수 있다. 게다가 본 발명자들은 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중 돌연변이 DNA(말라리아 기생충의 GPI 생합성 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이체)가 GWT1 유전자 결실 진균의 표현형을 상보함을 발견하였다. 따라서, (말라리아 기생충의 GPI 생합성 단백질을 코드하는 DNA 보다) AT 함량이 낮은 축중 돌연변이 DNA가 도입된 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형을 지표로 사용함으로써 말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기의 [1] 내지 [25]를 제공한다.
[1］GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 활성을 가지는 말라리아 기생충의 단백질을 코드 하는 하기의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 DNA：
(a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA,
(c) 엄격한 조건하에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA와 혼성화하는 DNA, 및
(d) 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입된 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA;
[2］[1]의 DNA에 의해 코드되는 단백질;
[3］[1]의 DNA가 삽입된 벡터;
[4］[1]의 DNA 또는 [3]의 벡터를 발현 가능하게 보유하는 형질 전환체;
[5］[2]의 단백질 활성을 억제하는 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 항말라리아 약물;
[6］[5]에 있어서, [2]의 단백질 활성을 억제하는 화합물은 하기의 (1) 내지 (5)의 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 항말라리아 약물:
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
및
Figure pat00005

[7］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 작용을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1) [2]의 단백질과 피검시료 및 상기 단백질에 결합 활성을 가지는 표지된 화합물을 접촉시키는 단계,
(2) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물을 검출하는 단계, 및
(3) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물의 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계;
[8］[7]에 있어서, 상기 단백질에 결합 활성을 가지는 표지된 화합물이 [6]의 화합물 (1) 내지 (5)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 표지함으로써 생산되는 방법;
[9］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1) [2]의 단백질과 피검시료를 접촉시키는 단계,
(2) GlcN-(아실) PI를 검출하는 단계, 및
(3) GlcN-(아실) PI수준을 감소하는 피검화합물을 선택하는 단계;
[10］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1) [2]로 기재되는 단백질을 과발현하는 세포와 피검시료를 접촉시키는 단계,
(2) 상기 세포벽에 수송된 GPI-앵커 단백질의 양을 결정하는 단계, 및
(3) 단계 (2)에서 결정된 세포벽에 수송되는 GPI-앵커 단백질의 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계;
[11］[2]의 단백질 활성을 억제하는 화합물 투여를 포함하는 말라리아를 치료하는 방법;
[12］[11]에 있어서, [2]의 단백질의 활성을 억제하는 화합물이 [5]의 화합물인 방법;
[13］말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이체인, GPI 합성효소 유전자 결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지며, 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 단백질을 코드하는 DNA;
[14］말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이체인, GPI 합성효소 유전자 결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지며, 70% 감소한 AT 함량을 가지는 단백질을 코드하는 DNA;
[15］[13] 내지 [14]에 있어서, DNA는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 DNA：
(a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4 및 서열 번호 6-47의 홀수 번호의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호 1 및 서열 번호 3 및 서열 번호 6-47의 짝수 번호의 염기 서열 중 어느 하나를 포함하는 DNA,
(c) 엄격한 조건하에서 서열 번호 1 및 서열 번호 3 및 서열 번호 6-47의 짝수 번호의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 DNA와 혼성화하는 DNA, 및
(d) 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입된 서열 번호 2 및 서열 번호 4 및 서열 번호 6-47의 홀수 번호의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 단백질을 코드하는 DNA;
[16］서열 번호 5로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA;
[17］[13] 내지 [16] 중 어느 하나의 DNA가 삽입된 벡터;
[18］[13] 내지 [16] 중 어느 하나의 DNA, 또는 [17]의 벡터를 발현 가능하게 보유하는 형질 전환체;
[19］[18]에 있어서, 형질 전환체는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균인 형질 전환체;
[20］[18]에 있어서, GPI 합성효소 유전자 결실 진균은 효모인 형질 전환체;
[21］[18] 내지 [20] 중 어느 하나의 형질 전환체를 배양하고, 상기 형질 전환체 또는 그 배양상청액으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, [13] 내지 [16] 중 어느 하나의 DNA에 의해 코드되는 단백질의 제조 방법;
[22］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 작용을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1) [13] 내지 [16] 중 어느 하나의 DNA를 발현하는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균과 피검시료를 접촉시키는 단계,
(2) 상기 진균의 성장을 측정하는 단계, 및
(3) 상기 진균의 성장을 억제하는 피검화합물을 선택하는 단계;
[23］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1)[13] 내지 [16]의 어느 하나의 DNA를 발현하는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균과 피검시료를 접촉시키는 단계,
(2) 상기 진균의 세포벽에 수송된 GPI-앵커 단백질 양을 결정하는 단계, 및
(3) 단계 (2)에서 결정된 세포벽에 수송되는 GPI-앵커 단백질 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계;
[24］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 작용을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1)[13] 내지 [16] 중 어느 하나의 DNA를 GPI 합성효소 유전자 결실 진균에 도입해, 상기 DNA에 의해 코드되는 단백질을 발현시키는 단계,
(2) 단계 (1)에서 발현된 단백질을 조제(preparation)하는 단계,
(3) 상기 조제한 단백질과 피검시료 및 상기 단백질에 결합 활성을 가지는 표지된 화합물을 접촉시키는 단계,
(4) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물을 검출하는 단계, 및
(5) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물의 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계;
[25］하기의 단계를 포함하는 항말라리아 작용을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
(1)(i) 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이체인 GWT1-결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA, 또는 (ii) 상기 축중 돌연변이 DNA가 도입되고, 상기 축중 돌연변이 DNA에 의해 코드되는 단백질을 발현하는 벡터를 GWT1-결실 진균에 도입하는 단계,
(2) 단계 (1)의 발현된 단백질을 조제하는 단계,
(3) 조제한 단백질과 피검시료를 접촉시키는 단계,
(4) GlcN-(아실) PI를 검출하는 단계, 및
(5) GlcN-(아실) PI 수준을 감소시키는 피검화합물을 선택하는 단계.
본 발명에 의해 열대열말라리아 기생충의 GWT1 단백질(PfGWT1)을 코드하는 DNA가 처음으로 분리되었다. PfGWT1 단백질을 코드하는 DNA의 염기 서열을 서열 번호 1로, PfGWT1 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 2로 나타내었다. 또한, 3일열말라리아 기생충(Plasmodium vivax)의 GWT1 단백질(PvGWT1)을 코드하는 DNA의 염기 서열을 서열 번호 3으로, PvGWT1 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 4로 나타내었다.
GWT1 단백질은 말라리아 기생충의 성장이나 감염에 중요한 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol: GPI)의 생합성에 관여한다. 따라서, 말라리아 기생충의 GWT1 단백질의 활성을 억제하는 화합물은 항말라리아 약물로서 사용할 수 있다. 이러한 항말라리아 약물은 상기 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 사용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA를 제공한다. 이러한 DNA에는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA가 속한다.
본 발명은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 또한 제공한다. 여기서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(PfGWT1 단백질 또는 PvGWT1 단백질)과 동등의 생물학적 특성을 가지고 있는 것을 의미한다. PfGWT1 단백질 또는 PvGWT1 단백질의 생물학적 특성으로서는 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 활성이 포함된다. GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 활성은 Costello 및 Orlean(J. Biol . Chem. (1992) 267:8599-8603) 또는 Franzot 및 Doering(Biochem . J. (1999) 340:25-32)에 보고되어 있는 방법에 의해 측정 가능하다.
서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA에는 엄격한 조건하에서 혼성화하는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA 및 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입된 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA가 포함된다.
본 발명의 DNA는 당업자에 잘 알려진 방법에 의해 분리할 수 있다. 예를 들면, 혼성화(Southern, E.M., J. Mol. Biol., 1975, 98:503-517) 및 PCR(Saiki, R.K. et al., Science, 1985, 230:1350-1354；Saiki, R.K. et al., Science, 1988, 239:487-491)을 이용하는 방법을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 당업자가 말라리아 기생충으로부터 서열 번호 1 혹은 서열 번호 3으로 기재되는 DNA 혹은 그 일부를 프로브(probe)로 사용하여 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 특이적으로 혼성화하는 DNA를 프라이머로 사용하여 서열 번호 1 혹은 서열 번호 3으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 높은 상동성을 가지는 DNA를 분리하는 것은 일상적인 실험이다. 게다가, 혼성화 또는 PCR 기술에 의하여 분리될 수 있고, 서열 번호 1 혹은 서열 번호 3으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA와 혼성화하는 DNA는 또한 본 발명의 DNA에 포함된다. 이러한 DNA에는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 말라리아 기생충 호몰로그를 코드하는 DNA가 포함된다. 말라리아 기생충 호몰로그에는 열대열말라리아 기생충, 3일열말라리아 기생충, 4일열말라리아 기생충(Plasmodium malariae) 및 란형말라리아 기생충(Plasmodium ovale) 등에 존재하는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 호몰로그가 포함된다.
상기 DNA는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화 반응을 사용하여 분리된다. 본 발명에서 「엄격한 혼성화 조건」이란, 예를 들면 65℃ 4x SSC에서 혼성화, 다음 65℃로 1시간, 0.1x SSC에서 세척을 의미한다. 다른 엄격한 조건은 50% 포름아미드 중 42℃ 4x SSC에서 혼성화이다. 또 다른 엄격한 조건은 PerfectHybTM(TOYOBO) 용액 중 65℃ 2.5시간 혼성화, 그 다음에 (1) 0.05% SDS를 포함하는 2 xSSC로 25℃ 5분, (2) 0.05% SDS를 포함하는 2 xSSC로 25℃ 15분 및 (3) 0.1% SDS를 포함하는 0.1 xSSC로 50℃ 20분의 세척이다. 이렇게 분리된 DNA는 아미노산 수준에서 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지는 폴리펩티드를 코드한다고 생각된다. 본 명세서에서「높은 상동성」이란, 아미노산 서열 전체로 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가리킨다.
아미노산 서열 또는 염기 서열의 상동성 수준은 Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Karlin, S. & Altschul, S. F., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1990, 87: 2264-2268, Karlin, S. & Altschul, S. F., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1993, 90: 5873-5877)를 이용해서 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 근거한 BLASTN나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되고 있다(Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215:403). BLASTN를 이용해 염기 서열을 해석하는 경우 파라미터는 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLASTX를 이용해 아미노산 서열을 해석하는 경우 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다. 이러한 해석 방법의 구체적인 수행 방법은 공지이다(National Institute of Biotechnology Information 웹 사이트, http://www.ncbi.nlm.nih.gov
/ 참조).
본 발명의 DNA에는 게놈 DNA, cDNA 및 화학 합성 DNA가 포함된다. 게놈 DNA 및 cDNA의 조제는 기술분야 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다. 게놈 DNA는 예를 들면, (i) 말라리아 기생충으로부터 게놈 DNA를 추출하여 (ii) 게놈 라이브러리(벡터로서 예를 들면, 플라스미드, 살균 바이러스, 코스미드, BAC 또는 PAC를 이용)를 제작한 다음 (iii) 이 라이브러리를 전개하고, (iv) 본 발명의 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열 번호 １ 또는 서열 번호 ３)를 기본으로 조제한 프로브를 이용해 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화를 실시하는 것으로 조제할 수 있다. 또는, 게놈 DNA를 본 발명의 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열 번호 １ 또는 서열 번호 ３)에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해서 조제하는 것도 가능하다. 한편, cDNA는 예를 들면, (i) 말라리아 기생충으로부터 추출한 mRNA를 기본으로 cDNA를 합성하고, (ii) 합성 cDNA를 λZAP등의 벡터에 삽입해 cDNA 라이브러리를 제작하여, (iii) cDNA 라이브러리를 전개하고, (iv) 상기와 같이 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화를 실시하는 것으로 조제할 수 있다. 또는 PCR에 의해 조제할 수 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 ２ 혹은 서열 번호 ４에 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 구조적으로 유사하고 있는 단백질을 코드하는 DNA를 제공한다. 이러한 DNA로서는 상기 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 상기 단백질에 있어서의 아미노산의 변이수나 변이 부위는 변이한 단백질의 기능(예를 들면, 이하의 문헌에 기재되는 기능; Mark, D. F. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 1984, 81: 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research , 1982, 10: 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224: 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA , 1982, 79: 6409-6413)가 보유되나 한정되지 않는다. 변이하는 아미노산 수의 비율로서는 전형적으로 전체 아미노산 잔기의 10% 이내이며, 바람직하게는 전체 아미노산의 5% 이내이며, 더욱 바람직하게는 전체 아미노산의 1% 이내이다. 또한, 변이하는 아미노산 수는 통상 30 아미노산 이내이며, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 보다 바람직하게는 5 아미노산 이내, 더 바람직하게는 3 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 2 아미노산 이내이다.
변이가 도입되는 아미노산 잔기는 변이 후의 아미노산과 측쇄의 성질이 보유되는 것이 바람직하다(아미노산의 보존적 치환으로서 알려진 단계). 아미노산 측쇄의 성질로서는 예를 들면, 소수성(A, I, L, M, F, P, W, Y, V) 및 친수성(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T)의 것을 들 수 있다. 또한, 아미노산의 측쇄로서는 지방족의 측쇄(G, A, V, L, I, P), 수산기를 포함하는 측쇄(S, T, Y), 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M), 카르본산 및 아미드를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q), 알칼리성 측쇄(R, K, H) 및 방향족 측쇄(H, F, Y, W)를 들 수 있다.
하나 이상의 아미노산 잔기가 부가된 단백질의 예는 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 당업자에게 주지의 방법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA와 다른 펩티드 또는 리딩 프레임(reading frame)이 매치하는 단백질을 코드하는 DNA와 결합될 수 있으나, 특정의 방법에 제한되지 않는다. 본 발명의 단백질은 공지의 여러 가지 펩티드와 융합 단백질을 형성할 수 있다. 이러한 펩티드에는 FLAG(Hopp, T. P. et al., Biotechnology, 1988, 6: 1204-1210), 6x His, 10x His, 인플루엔자 어글루티닌(Influenza agglutinin, HA), 사람 c-myc 단편, VSP-GP 단편, p18HIV 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항체 단편, lck tag, α-튜불린 단편, B-tag 및 프로테인 C 단편이 포함된다. 본 발명의 단백질과 융합시킬 수 있는 단백질의 예로서는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), HA, 이뮤노글로불린 일정 영역, β-갈락토시다제 및 말토스 결합 단백질(MBP)을 들 수 있다.
상기한 혼성화 기술 및 PCR 기술을 이용과 더불어 당업자는 예를 들면, 상기 DNA에서 돌연변이를 도입하기 위하여 부위 특이적 변이 유발법(site-directed mutagenesis, Kramer, W. & Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154: 350)을 포함하는 방법에 의해 상기 DNA를 조제할 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 또한 단백질을 코드하는 염기 서열의 변이에 의해 자연적으로 변이가 일어날 수 있다. 더불어, 염기 서열 돌연변이가 단백질에서 아미노산의 변이를 수반하지 않는(축중 돌연변이) 축중 돌연변이 DNA 또한 본 발명에 포함된다. 게다가, 본 발명은 상기 DNA에 의해 코드되는 단백질도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 DNA를 포함하는 벡터, 본 발명의 DNA 또는 벡터를 보유하는 형질 전환체 및 상기 형질 전환체를 이용한 본 발명의 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 벡터는 벡터를 삽입한 DNA를 안정적으로 유지하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 숙주로서 대장균을 이용한다면 클로닝용 벡터로서는 pBluescript®벡터(Stratagene)가 바람직하다. 본 발명의 단백질을 생산하는 목적에 있어서 벡터를 이용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는 시험관내, 대장균내, 배양 세포내 및 생체내 단백질을 발현하는 한 특별히 제한되지 않는다. 발현 벡터의 바람직한 예로서 시험관내 발현이면 pBEST 벡터(Promega), 대장균 발현이면 pET 벡터(Novagen), 배양 세포 자연 발현이면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864) 및 생체내이면 pME18S 벡터(Mol. Cell Biol., 8:466-472(1988))를 들 수 있다. 벡터에서 본 발명의 DNA 삽입은 통상적인 방법에 의해 예를 들면, 제한효소 사이트를 이용한 리가제 반응에 의해 할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. 편, 1987, John Wiley & Sons. , Section 11.4-11. 11).　
본 발명의 벡터가 도입되는 숙주 세포로서는 특별히 제한은 없고, 본 발명이 목적에 따라 여러 가지의 숙주 세포를 이용할 수 있다. 단백질을 발현시키기 위해서 이용할 수 있는 세포로서는 예를 들면, 세균 세포(예：스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 바실러스 섭틸리스), 진균 세포(예：효모, 아스페르질러스), 곤충 세포(예：드로소필라 S2, 스포돕테라 SF9), 동물세포(예：CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 멜라노마 세포) 및 식물세포를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포에의 벡터 도입은 예를 들면, 인산 칼슘 침전법, 전기 펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology, ed., Ausubel et al., 1987, John Wiley & Sons, Inc., Section 9.1-9. 9), 리포펙타민법(GIBCO-BRL) 및 미세주사법등 공지의 방법으로 하는 것이 가능하다.
적당한 분비 시그널을 목적 단백질에 혼입함으로써, 숙주 세포에서 발현한 단백질을 소포체중강, 세포 주변강 또는 세포외의 환경에 분비시킬 수 있다. 이러한 시그널은 목적의 단백질에 대해서 내인성 또는 외인성일 수 있다.
본 발명의 단백질이 배지에 분비되는 경우 배지에서 단백질을 회수한다. 본 발명의 단백질이 세포내에 세균이 고분자물질을 생합성하는 되는 경우는 그 세포를 우선 용해해, 그 후에 단백질을 회수한다.
본 발명의 단백질은 재조합 세포 배양물로부터 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스크로마토그라피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실 아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이것들로 한정되지 않는 공지의 방법을 사용하여 회수 및 정제될 수가 있다.
본 발명에 있어서의 DNA를 포함하는 화합물은 분리된 화합물이다. 여기서, 「분리」란 본래의 환경(예를 들어 자연스럽게 발생한다면 그 자연적 환경)으로부터 구분되는 것을 가리킨다. 대상 화합물이 실질적으로 풍부한 시료에 및/또는 대상 화합물이 부분적 혹은 실질적으로 정제된 시료에 존재하는 화합물은「분리」된 화합물이다. 「실질적으로 정제된」이라는 용어는 원래 환경 및 공존하는 천연의 다른 성분의 적어도 60%, 바람직하게는 75% 및 가장 바람직하게는 90% 제거로부터 구분된 화합물의 상태를 가리킨다.
본 발명은 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물의 활성을 억제하는 항말라리아 약물을 제공한다. 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물은 바람직하게는 국제 공개 공보 제 02/04626호에 기재되어 있는 화합물이고, 화합물(1) 내지 (5)를 포함한다.
Figure pat00006
화합물(1)：1-(4-부틸 벤질)이소퀴놀린
Figure pat00007
화합물(2)：4-[4-(1-이소퀴놀릴 메틸) 페닐]-3-부틴-1-올
Figure pat00008
화합물(3)：5-부틸-2-(1-이소퀴놀릴 메틸) 페놀
Figure pat00009
화합물(4)：2-(4-브로모-2-플루오로벤질)-3-메톡시피리딘
Figure pat00010
화합물(5)：N-[2-(4-부틸 벤질)-3-피리딜]-N-메틸아민
말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물의 활성을 억제하는 화합물 혹은 그의 염 또는 그의 수화물은 포유동물(바람직하게는 사람)에 투여될 수 있다. 그것들은 관용되어 있는 방법에 의해 정제, 파우더, 세립제, 과립제, 피복 정제, 캅셀제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 눈 연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 습포제(cataplasm), 로션제등으로 제형화될 수 있으며, 그런 다음 투여된다.
통상 이용되는 약학적, 보조적 약제의 제형화를 위하여 약학적 제형(예를 들면, 부형제, 결합제, 윤활제, 착색제, 풍미제 및 필요에 따라 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면활성제, pH 조절제, 방부제 및 항산화제)이 사용될 수 있다. 약학적 제형은 일반적으로 의약품 조제의 원료로서 이용되는 성분을 배합하는 통상적 방법을 사용하여 조제될 수 있다.
예를 들면, 경구 제형은 본 발명의 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염과 부형제 및 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 윤활제, 착색제, 풍미제등을 배합함으로써 생산될 수 있으며, 그런 다음 파우더, 세립제, 과립제, 정제, 피복 정제, 캅셀제등을 배합함으로써 통상적 방법에 의해 생산될 수 있다.
이러한 성분으로서 예를 들면, 콩기름, 소의 지방 및 합성 글리세라이드등의 동물 지방 및 식물유；액체 파라핀, 스쿠알렌 및 고형 파라핀등의 탄화수소； 옥틸 도데실 미리스테이트 및 이소프로필 미리스테이트 등의 에스테르유； 세토스테아릴 알콜 및 베헤닐 알콜등의 고급 알코올； 실리콘 수지； 실리콘유； 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 캐스터유 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머등의 계면활성제； 히드록시에틸 셀룰로스, 폴리 아크릴산, 카르복실비닐폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 메틸셀룰로스 등의 수용성 고분자； 에탄올 및 이소프로판올등의 저급 알코올； 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜 및 소르비톨 등의 다가 알코올； 포도당 및 자당 등의 당；무수 규산, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 알루미늄 실리케이트등의 무기 파우더； 및 정제수등을 들 수 있다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 옥수수 전분, 흰 설탕, 포도당, 만니톨, 솔비톨, 결정 셀룰로스 및 이산화 규소를 들 수 있다. 결합제로서는 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 검 아라빅, 트라거캔스, 젤라틴, 쉘락(shellac), 히드록시프로필메틸 세룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 블록 폴리머, 메글루민등을 들 수 있다. 붕괴제로서는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산 칼슘, 덱스트린, 펙틴 및 카복시메틸 셀룰로스 칼슘을 들 수 있다. 윤활제로서는 스테아린산 마그네슘, 탈크(talc), 폴리에틸렌 글리콜, 실리카, 경화 식물유등을 들 수 있다. 착색제로서는 예를 들면 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이다. 풍미제로서는 코코아분말, 1-멘솔, 방향성 디스펄선트(dispersant), 박하유, 보르네올(borneol), 계피 분말등이다. 이러한 당 코팅 및 필요에 따라 다른 적합한 코팅제의 사용은 물론 정제 및 과립제에 무방하다.
나아가, 시럽제 및 주사용 제약등의 액상 제형은 통상적 방법에 의해 조제할 수 있다. 이러한 방법에 본 발명과 관련되는 화합물 또는 약리학적으로 허용되는 그의 염에 pH 조정제, 용해제, 등장화제(isotonizing agent)등은 필요에 따라서 용해 보조제, 안정화제등을 더한다.
외용제를 제조할 때 방법은 한정되지 않고, 통상적 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 제형에 사용되는 기본 원료는 의약품, 의약 부외품, 화장품등에 통상 사용되는 각종 원료로부터 선택하는 것이 가능하다. 사용되는 기본 원료로서 구체적으로는 예를 들면 동물 지방 및 식물유, 광물유, 에스테르유, 왁스류, 고급 알코올류, 지방산류, 실리콘유, 계면활성제, 인지질류, 알코올류, 다가 알코올류, 수용성 고분자류, 점토 광물류 및 정제수 등의 원료를 들 수 있다. 더욱 필요에 따라 pH 조정제, 항산화제, 킬레이트제, 방부 및 항진균제, 착색료, 향료등을 첨가할 수 있다. 그러나, 본 발명의 외용제의 기본 원료는 이에 한정되지 않는다. 게다가, 필요에 따라 분화 유도 효과를 가지는 성분, 혈류 촉진제, 살균제, 소염제, 세포 활력제, 비타민류, 아미노산, 보습제 및 각질 용해제등의 성분을 배합할 수 있다. 상기 기본 원료는 통상 외용제의 제조에 사용되는 농도가 되는 양으로 첨가된다.
본 발명에 기재되는 「염」에는 예를 들면, 무기 또는 유기산 염, 무기 또는 유기염기 염, 또는 산성 혹은 알칼리성 아미노산 염 등을 들 수 있다. 특히, 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 산 및 염기는 해당 화합물 1 분자에 대해 0.1 내지 5 분자의 적당한 비로 염을 형성한다.
무기산 염의 바람직한 예로서는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산 염을 들 수 있다. 유기산 염의 바람직한 예로서는 초산, 호박산, 푸말산, 말레산, 주석산, 구연산, 유산, 스테아르산, 안식향산, 메탄 설폰산 및 p-톨루엔 설폰산의 염을 들 수 있다.
무기 염기 염의 바람직한 예로서는 나트륨염 및 칼륨염 등의 알칼리 금속염；칼슘염 및 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염；알루미늄염 및 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기 염기 염의 바람직한 예로서는 디에틸아민, 디에탄올아민, 메글루민 및 N, N＇-디벤질에틸렌디아민 염을 포함한다.
산성 아미노산 염의 바람직한 예로서는 아스파라긴산 및 글루타민산 염을 들 수 있으며, 알칼리성 아미노산 염의 바람직한 예로서는 아르기닌, 리신 및 오르니틴 염을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 혹은 그의 염 또는 그의 수화물은 그 형태는 특별히 한정되지 않으나 통상적인 방법에 의해 경구투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 예를 들면 정제, 파우더, 과립제, 캅셀제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 눈 연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 습포제 및 로션제 등의 투여 형태로서 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 증상의 정도, 환자의 연령, 성별, 체중, 투여 형태, 염의 종류, 질병의 구체적인 종류등에 따라 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서의 화합물은 환자에게 치료의 효과적인 양으로 투여된다. 여기서 「치료의 효과적인 양」이란, 처치되어야 할 환자의 증상을 회복 또는 경감하기 위해서 유효하며, 의도되는 약리학적 결과를 가져오는 약제의 양이다. 투여량은 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별, 약제에 대한 감수성등에 의해 현저하게 다르다. 그러나, 정상 성인으로서 1일당 약 0.03 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.1 내지 500 mg, 한층 더 바람직하게는 0.1 내지 100 mg를 1일 1 내지 몇차례, 또는 몇일에 1 내지 몇차례로 나누어 투여한다. 주사제의 경우 정상적으로 약 1 μg/kg 내지 3000 μg/kg이고, 바람직하게는 약 3 μg/kg 내지 1000 μg/kg이다.
더불어 본 발명은 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물을 이용한 항말라리아 약물의 스크리닝법에 관한 것이다. 본 스크리닝법으로서는 이에 한정되지 않지만, [1] 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물과 결합하는 표지된 화합물과 경합하는 화합물을 스크리닝하는 결합 분석법, [2] 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물의 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하기위한 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 분석 시스템 및 [3] 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물이 세포, 바람직하게는 진균 세포에서 발현되며, 그런다음 세포 표면상의 GPI-앵커 단백질이 검출되는 GPI-앵커 단백질 검출 시스템을 들 수 있다. 본 발명은 이러한 방법에 한정되지 않고, 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물을 사용하는 항말라리아 약물을 스크리닝하는 임의의 방법을 포함한다. 상기 [1] 내지 [3]으로 기재되는 방법을 이하에 상세하게 기재한다.
[1] 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물과 결합하는 표지된 화합물에 경합하는 화합물을 스크리닝하는 결합 분석법
이하에 본 발명에 기재된 2개의 방법 즉, (1) 말라리아 기생충의 GWT1 유전자 산물(이하 말라리아 기생충의 GWT1 단백질로 기재한다)을 조제하는 방법, (2) 표지된 화합물의 결합 실험(이하 결합 분석으로 기재한다) 방법에 대해서 개시한다.
(1) 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 조제하는 방법
말라리아 기생충의 GWT1 단백질은 서열 번호 2의 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA를 도입한 세포막 분획, 바람직하게는 진균 세포, 더욱 바람직하게는 S. 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 조제된다. GWT1 유전자 결실 세포에 이러한 DNA를 도입하는 것이 바람직하다. 결합 분석에서 조제된 막 분획은 어떠한 처리없이 사용되거나, 사용 전에 더욱 정제될 수 있다. 이하 S.세레비지에를 사용한 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
(a) 말라리아 기생충의 GWT1 유전자의 도입
본 발명에 사용되는 말라리아 기생충 GWT1 유전자는 천연 유전자일 수 있으며, 또는 바람직하게 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 기재되는 아미노산 서열에 기초하여 합성될 수 있다. 말라리아 기생충 GWT1 유전자는 아데닌 혹은 티민이 매우 풍부하다. 따라서, 상기 유전자가 통상의 유전자 재조합 기술로 조작하기 어려울 것이라는 것 및 효모나 세포 등에서의 유전자 발현이 충분하지 않을 것이 예상되었다. 따라서, 각 아미노산에 대응하는 코돈이 효모 혹은 세포등에서 효율적으로 발현한다고 생각되는 것과 대체되는 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하며, DNA 합성을 수행하고, 그런 다음 인공 말라리아 기생충 GWT1 유전자를 제조하는 상기 디자인된 서열에 기초한 이하의 실험에 이용하는 것이 바람직하다.
말라리아 기생충의 GWT1에 대한 발현 플라스미드는 S.세레비지에 발현 벡터 예를 들면, YEp352의 멀티 클로닝 사이트에 예를 들어 pKT10 유래의 GAPDH 프로모터 및 GAPDH 터미네이터(Tanaka et al ., Mol . Cell Biol., 10: 4303-4313, 1990)와 같은 적당한 프로모터·터미네이터를 삽입함으로써 조제된 발현 벡터에 말라리아 기생충의 GWT1 발현 플라스미드를 도입하여 제조한다. S.세레비지에(예를 들면 G2-10 균주)를 적당한 배지(예를 들면 YPD 배지(Yeast extract-Polypeptone-Dextrose 배지))에서, 적당한 온도(예를 들면 30℃)로 진탕 배양해, 대수 성장 후기의 시점에서 집균한다. 세척 후, 예를 들면 초산 리튬법에 의해 GWT1 발현 플라스미드를 S. 세레비지에의 세포에 도입한다. 이 방법은 YEAST MAKERTM Yeast Transformation System (Biosciences Clonetech) User Manual에 기재되어 있다. SD(ura-) 배지에서 30℃, 2일간 배양하는 것으로서 말라리아 기생충의 GWT1 과발현 균주 및 음성의 대조 벡터 도입균주를 얻을 수 있다.
S.세레비지에 이외의 진균을 위한 발현 벡터 및 유전자 트랜스퍼 방법이 다음과 같이 보고되었다: 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (S. pombe)의 pcL과 같은 발현 벡터 및 그의 트랜스퍼 방법이 Igarashi 등(Nature 353: 80-83, 1991)에 의해 기재되어 있다; C. 알비칸스(C. albicans)의 pRM10과 같은 발현 벡터 및 그의 트랜스퍼 방법이 Pla J. 등(Yeast, 12: 1677-1702, 1996)에 의해 기재되어 있다; A. 푸미가투스(A. fumigatus)의 pAN7-1과 같은 발현 벡터 및 그의 트랜스퍼 방법이 Punt P. J. 등(GENE, 56: 117-124, 1987)에 의해 기재되어 있다; C. 네오포르만스(C. neoformans)의 pPM8과 같은 발현 벡터 및 그의 트랜스퍼 방법이 Monden P. 등(FEMS Microbiol . Lett., 187: 41-45, 2000)에 기재되어 있다.
(b) 막 분획의 조제법
말라리아 기생충의 GWT1 유전자를 도입한 S. 세레비지에 세포를 적당한 배지(예를 들면 SD(ura-) 액체 배지)에서 적당한 온도(예를 들면 30℃)로 진탕하면서 배양한다. 이 진균 세포를 대수 성장 중기의 시점에서 집균하여 세척한 후, 적당량(예를 들면 진균 세포양의 3배 양)의 호모게나이제이션(Homogenization) 완충액(예를 들면 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, Complete(Roche))에 현탁한다. 적당량(예를 들면 진균 세포양의 4배 양)의 글라스 비드를 현탁액에 첨가한다. 이 혼합물을 소용돌이 빙상에 둔다. 이 조작을 몇차례 돌려주어 진균 세포를 파쇄한다.
얻은 용해물에 1 ml의 호모게나이제이션 완충액을 더한다. 이것을 예를 들면 2,500 rpm로 5분간 원심분리하여 글라스 비드 및 깨지지 않은 진균 세포를 침전시킨다. 상청을 다른 튜브로 옮긴다. 세포 소기관을 포함하는 막 분획(전체 막 분획)을 침전시키기 위하여 예를 들어 13,500 rpm로 10분간 튜브를 원심분리한다. 침전물을 1 ml의 결합 완충액(예를 들면 0.1 M 포스페이트 완충액, pH 7.0, 0.05% Tween 20, CompleteTM(Roche))에 부유시킨 다음, 예를 들면 2,500 rpm로 1분간 원심분리하여 부유되지 않는 물질을 제거하였다. 그런 다음, 상청액을 예를 들면 15,000 rpm으로 5분간 원심분리한다. 침전물을 막 분획을 제조하기 위하여 150μl 내지 650 μl의 결합 완충액에 재부유시켰다.
S. 세레비지에 이외 진균의 막 분획은 S. 폼베에 대해서는 Yoko-o 등(Eur . J. Biochem. 257: 630-637, 1998)에, C. 알비칸스에 대해서는 Sentandreu M. 등(J. Bacteriol., 180: 282-289, 1998)으로, A. 후미가투스에 대해서는 Mouyna I. 등(J. Biol. Chem., 275: 14882-14889, 2000)으로, C. 네오포르만스에 대해서는 Thompson J.R. 등(J. Bacteriol., 181: 444-453, 1999)의 방법에 의해 제조될 수 있다.
다른 방법으로서 말라리아 기생충의 GWT1 단백질은 진균 세포 이외의 세포, 예를 들면 대장균, 곤충 세포 및 포유류 세포 등으로 발현 시키는 것에 따라 조제할 수 있다.
포유류 세포를 사용하는 경우 말라리아 기생충의 GWT1 유전자를 예를 들면 CMV 프로모터를 가지는 과발현용 벡터에 이은 후 이것을 포유류 세포에 도입한다. Petaja-Repo 등(J. Biol. Chem., 276:4416-23, 2001)의 방법에 의해 막 분획을 조제할 수 있다.
말라리아 기생충의 GWT1 유전자를 발현하는 곤충 세포(예를 들면 Sf9 세포)를 예를 들면 BAC-TO-BAC®Baculovirus Expression system(Invitrogen) 등의 배큘로바이러스 발현 키트을 이용해 제조할 수 있다. 그런 다음 Okamoto 등(J. Biol. Chem., 276:742-751, 2001)의 방법에 의해 막 분획을 조제할 수 있다.
대장균으로부터는 예를 들면 pGEX 벡터(Amersham Biosciences Corp.) 등의 대장균 발현 벡터에 말라리아 기생충의 GWT1 유전자를 연결함으로써, 또한 BL21 등의 대장균에 컨스트럭트를 도입함으로써, 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 조제할 수 있다.
(2) 결합 분석의 방법
(a) 표지된 화합물의 합성
표지된 화합물은 GWT1 단백질과 결합하는 것이 확인된 화합물로부터 조제된다. GWT1 단백질과 결합할 수 있는 어떠한 화합물도 사용할 수 있다. 바람직하게는 국제 공개 공보 제 02/04626호에 기재되는 화합물, 더욱 바람직하게는 상기 화합물 (1) 내지 (5)의 화합물이다.
어떠한 표지의 방법도 사용할 수가 있다. 화합물은 바람직하게는 방사성 동위 원소에 의해 표지되며 더욱 바람직하게는 3H에 의해 표지된다. 방사성 표지된 화합물을 출발 원료로서 방사성 화합물을 사용하여 일반 제조법에 의해 제조할 수 있다. 혹은 3H 표지는 3H의 교환 반응을 이용하여 수행될 수 있다.
(b) 특이적 결합의 확인
조제한 막 분획에 표지된 화합물을 더해 빙상에서 적당한 시간, 예를 들면 1 - 2시간 정치해, 표지된 화합물과 막 분획과의 결합 반응을 한다. 그 후 혼합물을 예를 들면 15,000 rpm, 3분간 원심분리하여, 막 분획을 침전시킨다. 침전을 결합 완충액에 재부유시켜 현탁액을 원심분리한다. 이 조작을 적당(2회) 반복하여 결합하고 있지 않은 표지된 화합물을 제거한다. 침전물을 결합 완충액에 다시 현탁한다. 얻은 현탁액을 신틸레이션 바이알로 옮겨 신틸레이션을 더한다. 액체 신틸레이션 카운터에서 방사 활성을 측정한다.
표지된 화합물과 GWT1 단백질의 특이적인 결합은 표지된 화합물의 결합이 과도한 비표지된 화합물을 첨가(10배 이상)함으로써 억제되는지, 또한 상기 화합물이 GWT1 단백질을 발현하지 않는 진균 세포로부터 제조된 막분획과 무시할만한 정도로 결합하는지 평가함으로써 확인될 수 있다.
(c) 피검시료에 의한 표지된 화합물의 결합 억제
피검 시료 및 상기 표지화합물을 제조한 막 분획에 첨가하고, 그 혼합물은 얼음에서 적당한 시간 예를 들면 1 - 2시간 정치, 막 분획과의 결합 반응을 한다. 본 발명의 스크리닝 방법으로 이용하는 피검시료로서는 단일의 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질 또는 펩티드뿐만 아니라 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 세포 추출물, 세포 배양 상청액, 발효 미생물 세균 산물, 해양생물 추출물, 식물 추출물등을 들 수 있다.
혼합물을 예를 들면 15,000 rpm, 3분간 원심분리해 막 분획을 침전시킨다. 침전을 결합 완충액에 재부유시켜 원심분리한다. 이 조작을 적당(2회) 반복해, 결합하고 있지 않은 표지된 화합물을 제거한다. 침전을 결합 완충액에 현탁한다. 현탁액을 방사능 측정용 바이알로 옮겨 신틸레이터를 더한다. 액체 신틸레이션 카운터에서 방사 활성을 측정한다.
피검시료가 존재하는 경우 표지된 화합물과 막 분획의 결합이 억제되면, 피검시료는 말라리아 기생충의 GWT1 단백질에 결합하는 활성이 있다고 판단된다.
[2] 말라리아 기생충의 GWT1 단백질의 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제분석
GPI에의 아실기의 전이는 Costello L. C. 및 Orlean P.(J. Biol . Chem. (1992) 267: 8599-8603); 또는 Franzot S. P. 및 Doering T. L.,(Biochem . J. (1999) 340: 25-32)에 보고되어 있는 방법에 의해 검출 가능하다. 이하에 구체적인 방법의 예를 든다. 이하의 실험 조건은 사용하는 각각의 말라리아 기생충의 GWT1 단백질에 맞추어 최적화하는 것이 바람직하다.
말라리아 기생충의 GWT1 단백질은 [1]에 기재되는 방법에 따라 조제된다. 적당한 금속 이온(Mg2 +, Mn2 +), ATP, 코엔자임 A 및 바람직하게는 UDP-GlcNAc가 다른 반응에 사용되는 것을 억제하는 억제제, 예를 들면 키틴의 합성 억제제로서 닉코마이신Z(nikkomycin Z) 도는 아스파라긴 결합형 당쇄형성의 합성 억제제로서 튜니카마이신(tunicamycin)을 포함하는 완충액에 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 포함하는 막 분획을 더한다. 더욱 피검시료를 더해 적당한 온도로 적당한 시간(예를 들면 24℃로 15분 간) 보온한다.
적당하게 표지한 바람직하게는 방사성 표지한 GlcN-(아실) PI의 전구체(예를 들면 UDP-GlcNAc, 아실-코엔자임 A, 바람직하게는 UDP-[14C]GlcNAc)를 혼합물에 가세한다. 얻어진 혼합물을 적당한 시간(예를 들면 24℃로 1시간) 보온한다. 클로로포름：메탄올(1:2)의 혼합물을 첨가해 얻을 수 있던 혼합물을 교반해 반응을 정지시키고 지질을 추출한다. 추출한 반응 산물을 적당한 용매, 바람직하게는 부탄올에 용해한다. 그런 다음, HPLC 또는 박층 크로마토그래피(TLC) 등의 방법, 바람직하게는 TLC에 의해, 반응으로 생성된 GlcN-(아실) PI를 분리한다. TLC를 사용하는 경우, 전개 용매는 예를 들면 CHCl3/CH3OH/H2O(65:25:4), CHCl3/CH3OH/1M NH4OH(10:10:3) 및 CHCl3/피리딘/HCOOH(35:30:7) 등으로부터 적당히 선택할 수 있다. 바람직한 전개 용매는 CHCl3/CH3OH/H2O(65:25:4)이다. 분리한 GlcN-(아실) PI를 표지에 사용하기에 적당한 방법으로 정량한다. 방사성 동위 원소로 표지한 것이면, 분리한 GlcN-(아실) PI는 이 방사 활성에 의해 정량된다.
피검시료가 존재하는 경우에 생성하는 GlcN-(아실) PI의 양이 감소하면 피검시료에 말라리아 기생충의 GWT1 단백질에 의한 아실기 전이를 억제하는 활성이 있다고 판단된다.
[3] 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 세포에 발현 시켜 세포막 표면의 GPI-앵커 단백질을 검출하는 단계을 포함하는 GPI-앵커 단백질 검출 시스템
말라리아 기생충의 GWT1 단백질의 활성을 억제하는 피검시료의 능력은 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 세포, 바람직하게는 진균 세포에 발현시켜 세포막 표면의 GPI-앵커 단백질을 검출하는 단계을 포함하는 GPI-앵커 단백질 검출 시스템에 의해서도 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서의 진균은 접합균, 포자낭균, 담자균 및 불완전균문에 속하는 균종이고, 바람직하게는 병원성 진균, 케카비속(Mucor), 사카로마이세스속(Saccharomyces), 칸디다속(Candida), 크립토코커스속 (Cryptococcus), 트리코스포론속(Trichosporon), 말라세지아속(Malassezia), 아스퍼질러스속(Aspergillus), 두부백선균속(Trichophyton), 소포자균속(Microsporum), 스포로트릭스속(Sporothrix), 블라스토마이세스속(Blastomyces), 콕시디오이데스속(Coccidioides), 파라콕시디오이데스속(Paracoccidioides), 페니실리니움속(Penicillinium) 및 푸사리움속(Fusarium)이고, 보다 바람직하게는 C. 알비칸스, C. 글라브라타(C. glabrata), C. 네오포르만스 및 A.푸미가투스이고, 더욱 바람직하게는 효모이다. 효모로서는 S.세레비지에 및 S.폼베를 들 수 있다. 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 발현 벡터를 상기 진균 세포에 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 진균 세포에 발현시킬 경우 (1) 리포터 효소를 이용하는 방법, (2) 진균 세포벽의 표층 당단백질과 반응하는 항체를 이용하는 방법, (3) 동물세포에 대한 단백질의 부착능을 이용하는 방법 또는 (4) 진균 세포를 광학 현미경 혹은 전자현미경으로 관찰하는 방법에 의해 진균 세포벽으로 수송되는 GPI-앵커 단백질의 양을 검정할 수 있다.
(1) 내지 (4) 방법은 국제 공개 공보 제02/04626호에 개시되어 있으며, 발명의 실시예에 구체적으로 기재되어 있다. (1) 내지 (4) 방법 및 바람직하게는 (1) 내지 (4) 방법을 혼합해 피검시료가 세포벽으로 GPI-앵커 단백질을 수송 또는 진균 세포 표면상 GPI-앵커 단백질의 발현을 억제하는지를 판정할 수 있다.
이하, (1) 내지 (4) 방법을 설명한다.
(1) 리포터 효소를 이용하는 방법
GPI-앵커 단백질의 세포벽에의 수송 과정은 GPI-앵커 단백질을 방사성 동위 원소로 표지해 진균 세포벽 분획을 얻은 후, GPI-앵커 단백질에 대한 항체에 의한 면역 침강법인 트레이서 실험에 의해 정량하는 것이 가능하다. 또는, 아래와 같이 보다 용이하게 정량할 수 있다: GPI-앵커 단백질에 흔히 관찰되고, 수송 시그널로 기능한다고 인식되는 C-말단 서열은 측정이 용이한 효소(리포터 효소)와의 융합 단백질로서 발현될 수 있으며, 진균 세포벽 분획을 얻을 수 있다,; 각 분획의 효소 활성을 측정하는 리포터 시스템이 사용될 수 있다(Van Berkel MAA et al, FEBS Letters, 349: 135-138, 1994). 이하 리포터 효소를 이용하는 방법에 대해서 설명하지만, 이에 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
먼저, 리포터 유전자를 구축해 진균에 도입한다. 리포터 유전자는 리딩 프레임 매치같은 방법으로 시그널 서열, 리포터 효소 및 GPI-앵커 단백질 C 말단 서열을 각각 코드하는 DNA를 진균에서 기능하는 프로모터 서열과 연결시킴으로써 구축한다. 프로모터 서열로서는 예를 들면 GAL10, ENO1의 프로모터의 서열등을 들 수 있다. 시그널 서열로서는 예를 들면 α-팩터, 인버타제(invertase) 및 리소자임을 들 수 있다. 리포터 효소로서는 예를 들면 β-락타마제(lactamase), 리소자임, 알칼린 포스파타제 및 β-갈락토시다아제를 들 수 있다. 효소 활성은 가지지 않지만 용이하게 검출이 가능한 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence Protein) (GFP)을 이용할 수 있다. GPI-앵커 단백질 C말단 서열로서는 α-어글루티닌 C 말단 서열, CWP2C 말단 서열등을 들 수 있다. 또, 구축한 리포터 유전자를 포함하는 벡터 중에 적당한 선택 마커, 예를 들면 LEU2, URA3등을 삽입하는 것이 바람직하다.
구축한 리포터 유전자를 적당한 방법, 예를 들면 초산 리튬법(Gietz D. et al, Nucl. Acids Res. 20: 1425, 1992)에 의해 진균에 도입한다. 필요하다면 선택 마커에 적절한 방법을 이용해(예를 들면, LEU2이면 Leu-의 배지, URA3이면 Ura-의 배지를 이용해) 배양해 DNA가 도입된 진균을 선택한다.
GPI-앵커 단백질의 세포벽으로 수송에 있어서의 피검시료의 효과는 이하의 방법에 의해 검정된다.
리포터 유전자를 도입한 진균을 피검시료의 존재하에 적당한 조건, 예를 들면 30℃으로 48시간 배양한다. 배양 후 배양상청을 원심분리해, 배양상청 분획의 리포터 효소의 활성을 측정한다. 남겨진 세포 분획은 세척 후, 글루카나제로 세포벽 글루칸을 분해하는 것과 같이 적당한 방법으로 세포벽 성분을 분리한 다음, 세포벽 분획 및 세포질 분획의 리포터 효소 활성을 측정한다. 분석은 원심분리 후 세포 분획 중에 리포터 효소양을 검정하기 위하여 원심분리를 이용함으로써, 따라서 세포의 세척, 세포 분획에 남은 배양상청 분획 유래의 리포터 효소양을 검정하기 위한 비례 계산 이용 및 세포 분획의 리포터 효소양으로 부터 이를 제거하지 않고 간단히 수행될 수 있다.
피검시료에 배양상청 분획 중의 리포터 효소 활성을 상승시키는 활성, 혹은 세포벽 분획 중의 리포터 효소 활성을 저하시키는 활성이 나타나면 상기 피검시료는 GPI-앵커 단백질의 세포벽에의 수송 과정에 영향을 주었다고 판단된다.
(2) 진균 세포벽의 표층 당단백질과 반응하는 항체를 이용하는 방법
진균 표층에서 GPI-앵커 단백질의 발현에 영향을 주는 피검시료의 능력은 진균 세포벽에서 GPI-앵커 단백질의 것와 반응하는 항체에 의해 정량함으로써 결정될 수 있다.
항체는 예를 들면, α-어글루티닌, Cwp2p 또는 Als1p등의 GPI-앵커 단백질의 아미노산 서열 사용(Chen M. H. et al ., J. Biol . Chem., 270: 26168-26177, 1995; Van Der Vaat J. M. et al ., J. Bacteriol., 177: 3104-3110, 1995; Hoyer L. L. et al., Mol . Microbiol., 15: 39-54, 1995), 그런 다음 상기 부위의 펩티드 합성, 캐리어 단백질같은 항원 기질과의 결합, 그 후 폴리클로날 항체를 얻기위한 집토끼 또는 이와 같은 것 또는 모노클로날 항체를 얻기위한 생쥐 또는 이와 같은 것들을 면역화하여 항원 결정기를 예상함으로써 획득할 수 있다. Als1p 펩티드에 대한 집토끼 폴리클로날 항체가 바람직하다.
또 다른 방법으로서 GPI-앵커 단백질에 대한 모노클로날 항체는 진균, 바람직하게는 α-어글루티닌, Cwp2p 및 Als1p등을 과발현시키는 진균(경우에 따라서는 더 부분 정제한 GPI-앵커 단백질)을 생쥐에 면역화하고, 상기 생쥐가 생산하는 항체를 기반으로 한 클론을 선택하기 위하여 ELISA, 웨스턴 블랏western blot) 분석을 이용하여 획득할 수 있다.
이하의 방법은 GPI-앵커 단백질의 세포벽에의 수송 과정에 있어서의 피검시료의 영향 및 세포벽중의 GPI-앵커 유래 단백질 유래의 단백질양에 있어서의 피검시료의 영향을 검정할 수 있다.
진균을 피검시료의 존재하에 적당한 조건, 예를 들면 30℃, 48시간 배양한다. 배양한 진균을 원심분리에 의해 집균한 다음 세포를 바람직하게는 글라스 비드를 이용해 파쇄한다. 세척한 파쇄세포를 바람직하게는 SDS로 추출 원심분리 후 추출하여 세척하였다. 세척 후의 파쇄세포는 글루칸을 분해하는 효소, 바람직하게는 글루카나제를 처리하며, 그의 원심분리된 상청액을 GPI-앵커 단백질 시료라고 한다.
항-Als1p 펩티드 항체를 96 웰 플레이트에 4℃로 밤새 인큐베이션 해 코팅 한다. 세척 용액, 바람직하게는 0.05% Tween 20 함유 PBS(PBST)로 세척 후, 96 웰 플레이트의 비특이적 흡착 부위를 블록하는 시약, 바람직하게는 BSA, 젤라틴등의 단백질, 더욱 바람직하게는 블록 에이스(Dainippon Pharmaceutical )로 블로킹한다. 플레이트를 재차 세척 용액 바람직하게는 PBST로 세척 후, 적당하게 희석한 GPI-앵커 단백질 시료를 더한다. 적당한 시간, 예를 들면 실온으로 2시간 반응 시킨다. 세척 용액, 바람직하게는 PBST로 세척 후, 효소 표지한 C.알비칸스에 대한 항체, 바람직하게는 HRP 표지 항칸디다 항체를 적당한 시간, 예를 들면 실온으로 2시간 반응시킨다. 표지 방법은 효소 표지 또는 방사성 동위 원소에 의한 표지일 수 있다. 세척 용액, 바람직하게는 PBST로 세척 후, GPI-앵커 단백질 시료에서 Als1p 양은 표지의 종류에 적절한 방법 즉, 효소 표지 방법, 기질 용액을 첨가, 반응 정지 후 490 nm의 흡광도를 측정함으로써 산출한다.
(3) 동물세포에 대한 부착능에 의한 방법
GPI-앵커 단백질의 진균 표층에서의 발현에 있어서의 피검시료의 영향을 진균 세포벽 중의 GPI-앵커 단백질의 활성, 바람직하게는 진균의 동물세포에의 부착능등을 측정하는 것으로써 검정 가능하다. GPI-앵커 단백질의 활성으로서는 동물세포에의 부착에 관여하는 Als1p, Hwp1등의 달리, 접합(mating)에 관여하는 α-어글루티닌, 효모의 응집에 관여하는 Flo1p등이 포함된다. 이하, 진균의 동물세포에의 부착능에 의한 방법에 대해서 상세하게 기재하지만, 본 발명은 이것에 의해 한정되는 것은 아니다.
진균으로는 세포에 대한 부착능을 가지는 진균을 사용해, 진균은 C. 알비칸스인 것이 바람직하다. 포유류 세포로서는 진균이 접착하는 세포, 바람직하게는 장관 표피 세포인 것이 바람직하다. 포유류 세포를 배양해 적당한 방법, 예를 들면 에탄올 고정에 의해 고정한다. 피검시료와 진균을 적당한 시간 예를 들면 30℃으로 48시간 인큐베이션, 일정시간, 예를 들면 30℃으로 1시간 배양한다. 배양상청을 제거하고 세포를 완충액으로 세척해 한천(agar) 배지, 예를 들면 Sabouraud dextrose agar 배지(Becton Dickinson Co. LTD.)에 중층한다. 30℃ 밤새 배양 후, 콜로니 수를 카운트해 부착율을 계산한다.
화합물 처리를 하지 않은 진균과 비교하였을 때, 만약 피검 시료가 세포 부착으로 형성된 콜로니수를 감소시키는 활성이 인정되면, 상기 피검시료는 세포벽으로 GPI-앵커 단백질을 수송하는 과정에 영향을 끼친다고 판단된다.
(4) 진균을 전자현미경 또는 광학 현미경으로 관찰하는 방법
GPI-앵커 단백질의 진균 표층에서의 발현에 있어서의 피검시료의 영향은 진균 세포벽의 구조를 전자현미경에 의해 관찰하는 것으로서 검정이 가능하다.
피검시료의 존재하에서 C. 알비칸스등의 진균을 일정시간, 예를 들면 30℃으로 48시간 배양해, 투과형태 전자현미경을 이용해 초미형태학적 구조를 관찰한다. 여기서, 투과형태 전자현미경에 의한 관찰은 예를 들면 전자현미경 차트 메뉴얼(의학 출판 센터)에 기재되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 진균 세포의 최외층의 면상 섬유 구조는 전자 밀도가 높고, 투과형태 전자현미경으로 볼 수 있다. 이 구조는 기존의 다른 항진균제에서는 영향을 받지 않고, GPI-앵커 단백질을 구성 성분으로 포함하는 표층 당단백질층이라고 생각된다. 단지 고전자 밀도의 얇은 층으로 남은 이 구조가 사라지면, 무처치의 세포와 비교해 상기 피검시료가 GPI-앵커 단백질의 세포벽에의 수송 과정에 영향을 주었다고 판단된다.
또 투과형태 전자현미경과 광학 현미경하에서의 관찰로 진균 세포가 크고 팽화해 출아(분열)가 억제되어 있는 것이 관찰되는 경우, 상기 피검시료가 세포벽에 대해서 영향을 주고 있다고 판단된다.
또한, 본 발명은 말라리아를 치료하는 방법으로 말라리아 기생충의 GWT1 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 투여하는 단계을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 화합물에는 국제 공개 공보 제 02/04626호에 기재되어 있는 화합물(예를 들면, 본 명세서에 기재되어 있는 화합물 (1) 내지 (5))이 포함된다.
천연의 PfGWT1 단백질의 염기 서열은 AT 함량이 매우 높은(80.41%) 특징을 가지며, 그에 따라 코돈 이용이 좌우된다. 더불어서, 본 유전자에는 6개 이상 연속한 A의 잔기를 23곳에서 포함하는 서열 스트렛치가 포함되어 있고, 이러한 서열 스트렛치는 가짜 Poly(A) 사이트로서 기능해 절단된(truncated) 단백질을 생산할 수 있다. 상기의 특성때문에, 본 유전자는 효모내에서 적게 발현하였고, 또 대장균내에서 복제 또는 PCR에 의한 증폭은 매우 어려웠다. 또, 염기 서열 결정이 매우 어려웠다. 그러나, 본 발명자들은 PfGWT1 단백질을 코드하는 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중 돌연변이 DNA(서열 번호 5)를 이용하여 PfGWT1 단백질을 효율적으로 발현시키는데 성공하였다. 게다가 본 발명자들은 이 축중 돌연변이 DNA를 GWT1 결실 효모에 도입하는 것으로, 상기 효모의 표현형이 상보적임을 밝혔다. 이러한 발견은 효모등 진균의 GPI 합성과 말라리아 기생충의 GPI 합성효소가 대체 가능함을 시사하고 있다.
말라리아 기생충의 GPI 합성효소를 코드하는 유전자에 있어서의 AT 함량은 예를 들면 열대열말라리아 기생충(P. falciparum) GPI8에서는 79.35%이고, 열대열말라리아 기생충 GPI13에서는 77.89%이다. 이러한 AT 함량은 PfGWT1와 같이 높다. 이는 열대열말라리아 기생충 게놈의 번역 영역의 평균 AT 함량은 76.3%이기 때문에, 대부분의 열대열말라리아 기생충 유전자는 다른 종에서 거의 발현되지 않는다고 예상된다. 본 발명자들은 효모에서 PfGWT1 단백질을 코드하는 DNA의 AT 함량보다 낮은 함량을 가지는 DNA의 축중 돌연변이체를 발현하는 데에 성공하였다. 따라서, 이러한 축중 돌연변이 DNA를 이용하는 것으로 말라리아 기생충 이외의 숙주로 말라리아 기생충의 GPI 합성효소를 발현할 수 있다. 또, GPI 결실 효모 및 GWT1 결실 효모는 치사성 등의 특징을 포함하는 것이 알려져 있다. 따라서, 상기 축중 돌연변이 DNA를 이용하는 것으로 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형을 상보할 수 있다.
상기 축중 돌연변이 DNA가 도입된 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형은 말라리아 기생충의 GPI 합성효소의 활성에 의존하고 있다. 따라서, 상기 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형을 지표로서 말라리아 기생충의 GPI 합성효소의 활성을 억제하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이것에 의해, 말라리아 기생충을 실제로 이용하는 일 없이 GPI 생합성 경로를 타겟으로 한 항말라리아 약물을 선택하는 것이 가능해진다.
본 발명은 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형의 상보 활성을 가지는 단백질을 코드하는 축중 돌연변이 DNA, GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중 돌연변이 DNA를 제공한다. 이러한 DNA는 본 발명의 스크리닝 방법으로 이용할 수 있다.
본 명세서에 「AT 함량」이란 GPI 합성효소 유전자 코드 영역의 전체 염기 서열중에서 아데닌 및 티민의 함량을 가리킨다. 본 발명의 축중 돌연변이 DNA에 있어서의 AT 함량은 바람직하게는 50% 내지 70%이하이고, 보다 바람직하게는 53% 내지 65%이하, 더욱 바람직하게는 55% 내지 62%이하이다.
GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 표현형에는 온도 감수성(바람직하게는 고온 감수성) 및 치사성이 포함된다.
본 발명에 있어서의 단백질로서는 GWT1, GPI1, GPI8, GPI3/PIG-A, GPI10/PIG-B, YJR013W/PIG-M, GPI13/PIG-O, GAA1/GAA-1, DPM1, GPI2, GPI15, YDR437W, GPI12, MCD4, GPI11, GPI7, GPI17, GPI16, CDC91, DPM2, DPM3, SL15를 들 수 있다. 이러한 단백질의 GPI1 및 GPI8는 말라리아 기생충에서 존재하는 것이 밝혀지고 있어 GPI3/PIG-A, GPI10/PIG-B, YJR013W/PIG-M, GPI13/PIG-O, GAA1/GAA-1, 및 DPM1는 말라리아 기생충에서 그 존재가 알려져 있다(Delorenzi et al ., Infect . Immun. 70: 4510-4522, 2002). 열대열말라리아 기생충의 GWT1, GPI1, GPI8, GPI3/PIG-A, GPI10/PIG-B, YJR013W/PIG-M, GPI13/PIG-O, GAA1/GAA-1 및 DPM1의 염기 서열을 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 6-21의 짝수 번호에 나타낸다. 각각 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 2 및 서열 번호 6-21의 홀수 번호에 나타낸다. 또, 삼일열 말라리아 기생충의 GWT1의 염기 서열을 서열 번호 3에, 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타낸다. 그 외의 말라리아 기생충의 GWT1, GPI1, GPI8, GPI3/PIG-A, GPI10/PIG-B, YJR013W/PIG-M, GPI13/PIG-O, GAA1/GAA-1또는 DPM1는, 서열 번호 1 및 서열 번호 3 및 서열 번호 6-21의 짝수번호에 기재되는 염기 서열의 어느 쪽이든 하나를 포함하는 DNA를 이용하는 것으로, 당업자에게 공지의 방법(예를 들면, 혼성화 기술이나 PCR 기술을 이용하는 방법)에 의해 클로닝할 수 있다.
또, GWT1, GPI1, GPI8, GPI3/PIG-A, GPI10/PIG-B, YJR013W/PIG-M, GPI13/PIG-O, GAA1/GAA-1 및 DPM1 이외의 말라리아 기생충 GPI 합성효소 유전자는 효모 또는 사람 유래의 GPI 합성효소 유전자를 이용하는 것으로 클로닝할 수 있다. 효모(S. 세레비지에)의 GPI2, GPI15, YDR437W, GPI12, MCD4, GPI11, GPI7, GPI17, GPI16 및 CDC91의 염기 서열을 각각 서열 번호 22-41의 짝수 번호에 나타내고, 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 22-41의 홀수 번호에 나타낸다. 또, 사람의 DPM2, DPM3 및 SL15의 염기 서열을 각각 서열 번호 42-47의 짝수 번호에 나타내며, 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 42-47의 홀수 번호에 나타낸다.
말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 본래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중 돌연변이 DNA를 제조는 설계와 합성의 2단계로부터 된다. 우선, 설계 단계에서 목적으로 하는 단백질의 아미노산 서열을 기초로 역번역을 행해 각 아미노산 잔기가 취할 수 있는 코돈을 리스트업 한다. 역번역은 시판의 유전자 해석 소프트웨어(예를 들면, DNASIS-Pro, 히타치 소프트웨어 엔지니어링 균주회사)를 이용할 수 있다. 리스트업 한 코돈중에서, 목적으로 합치한 것(예를 들면, AT 함량의 낮은 코돈 및 유전자 발현에 사용되는 숙주에 있어 사용 빈도의 높은 코돈)를 각각의 아미노산에 대해서 선택한다. 목적으로 하는 단백질의 아미노산 서열을 재구성하는 것으로서 축중 돌연변이 DNA를 설계하는 것이 가능하다.
설계한 DNA는 당업자에게 공지의 방법으로 합성할 수 있다. 본 발명의 축중 돌연변이 DNA는 예를 들면, 설계한 염기 서열을 기본으로 시판의 DNA 합성기를 사용해 합성할 수 있다.
본 발명은 또 상기 축중 돌연변이 DNA가 삽입된 벡터, 상기 DNA 또는 벡터를 발현 가능하게 보유하는 형질 전환체(바람직하게는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균)를 제공한다. 벡터나 숙주는 상기의 것을 사용할 수 있다.
본 명세서에 「GPI 합성효소 유전자를 결실한다」란, 기능을 가진 본 유전자 산물의 발현이 없다, 혹은 발현 수준이 감소하는 것을 의미한다. 본 발명의 GPI 합성효소 유전자 결실 진균은 상기 GPI 유전자를 파괴하는 것으로 제조할 수 있다. 예를 들면 상동 재조합의 기술을 사용해 상기 유전자에 무관계한 DNA, 예를 들면 선택 마커등을 삽입하는 것으로서 파괴할 수 있다. 보다 구체적으로는 S. 폼베의 his5 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자(Longtine et al, Yeast, 14: 953-961, 1998)를 상기 유전자의 부위에 상동의 염기 서열(50 염기에서 70 염기)를 포함하는 프라이머로 증폭한 선택 마커 카셋트를 효모에 도입하는 것으로 제조할 수 있다.
본 발명의 GPI 합성효소 유전자 결실 진균에는 예를 들면 GWT1 온도 감수성 변이균주 gwt1-20, GPI7 파괴균주, GPI8 변이균주 gpi8-1 및 GPI10 온도 감수성 변이균주 per13-1이 포함된다.
본 발명의 축중 돌연변이 DNA로 형질 전환된 GPI 합성효소 유전자 결실 진균은 상기 축중 돌연변이 DNA가 삽입된 벡터를 상기 진균에 도입하는 것으로 제조할 수 있다. 벡터로서는 S. 세레비지에에서는 pRS316, YEp351 등, S. 폼베에서는 pcL, pALSK 등을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 GPI 합성효소 유전자 결실 진균을 이용한 항말라리아 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이러한 방법으로서 제 1의 단계는 말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 축중 돌연변이 DNA로 형질 전환된 GPI 합성효소 유전자-결실 진균과 피검시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기「접촉」은 상기 진균의 배양액에 피검시료를 첨가하는 것으로써 가능해진다. 피검시료가 단백질의 경우 상기 단백질을 코드하는 DNA를 포함하는 벡터를 상기 진균에 도입하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에서 다음의 단계는 상기 진균의 성장을 측정하는 것을 포함한다. 보다 구체적으로는, 통상의 배양 조건하 즉, 효모 추출물-폴리펩톤-덱스트로스(Yeast extract-polypeptone-dextrose) 배지(YPD 배지) 등의 액체 배양기속 또는 한천 배지상에 진균을 접종, 25℃에서 37℃으로 4시간 내지 72시간 정도 배양한다. 본 발명의 축중 돌연변이 DNA로 형질 전환된 GPI 합성효소 유전자 결실 진균의 성장을 측정할 수가 있다. 또, 성장의 정도는 배양액의 탁도, 한천 배지상에 형성된 콜로니 수 또는 장소의 크기 혹은 색을 지표에 측정할 수 있다. 본 발명의 방법에서 다음의 단계는 상기 진균의 성장을 억제하는 화합물을 선택하는 것을 포함한다.
다른 방법으로서 제1의 단계는 상기 축중 돌연변이 DNA가 도입된 GPI 합성효소 유전자 결실 진균에 피검시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 다음의 단계에서 GPI-앵커 단백질의 효모 세포벽에의 수송양을 검출하는 것이 포함된다. 검출 방법으로서는 (1) 리포터 효소를 이용하는 방법, (2) 진균 세포벽의 표층 당단백질과 반응하는 항체를 이용하는 방법, (3) 동물세포에 대한 부착능에 의한 방법 및 (4) 진균을 광학 현미경 또는 전자 현미경으로 관찰하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 방법에서 다음의 단계는 검출되는 GPI-앵커 단백질의 세포벽에의 수송양을 감소시키는 시료를 선택하는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 축중 돌연변이 DNA를 이용해 조제한 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 이용해 항말라리아 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법으로 예를 들면, 단백질과 결합하는 표지된 화합물과 경쟁하여 GPI 생합성에 관여하는 단백질과 결합하는 화합물을 선택하기 위하여 수행되는 스크리닝인 결합 분석 시스템이 수행된다. 구체적으로는, 본 발명의 축중 돌연변이 DNA를 GPI 합성효소 유전자 결실 진균에 도입해, 상기 DNA에 의해 코드되는 단백질을 상기 진균에서 발현시켜 단백질을 조제한다. 그 다음에, 조제한 단백질과 피검시료 및 상기 단백질에 결합 가능한 표지된 화합물을 접촉시킨다. 다음의 단계에서 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물을 검출해, 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물의 양을 감소시키는 피검시료를 선택한다.
또한 본 발명은 GlcN-PI 아실트랜스퍼라제 분석 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 GWT1 유전자 결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA를 사용하여 제조되며, 상기 DNA는 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는 말라리아 기생충의 GWT1 단백질을 코드하는 DNA의 축중 돌연변이체이다.
구체적으로는, 상기 축중 돌연변이 DNA를 GWT1 유전자 결실 진균에 도입해, 상기 축중 돌연변이 DNA에 의해 코드되는 단백질을 진균에 발현시켜, 발현시킨 단백질을 조제한다. 그 다음에 이 단백질과 피검시료를 접촉시켜 GlcN-(아실) PI를 검출해, GlcN-(아실) PI의 양을 감소시키는 피검시료를 선택한다.
본 명세서에서 인용하는 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 삽입되어 있다.
지금까지 진균 세포에서 말라리아 기생충의 유전자를 발현시켜 그 유전자의 기능을 억제하는 물질을 스크리닝하는 시도는 되어 있지 않다. 본 발명의 방법은 실제로 말라리아 기생충 자체를 이용할 필요를 없앴기 때문에, 포스트게놈 시대의 비교 제노믹스(comparative genomics)를 이용한 약물 탐색을 위하여 완전히 새로운 스크리닝법의 가능성을 입증한다.
도 1은 4분자(tetrad) 분석의 결과를 나타내는 사진이다. opfGWT1 과발현 플라스미드가 도입된 gwt1 파괴균주가 생육 가능해졌다. 단일 2배체 세포(diploid) 유래의 4 출아(spore)를 세로로 스팟팅하였다. GWT1 유전자가 1 카피(copy)가 파괴되어 있는 경우 출아의 생육율은 2분의 1이다. 따라서, 이러한 경우, [콜로니 형성 스팟]:[비생육 콜로니 스팟]=2:2가 된다. 화살표로 나타낸 열에서는 gwt1 파괴균주의 치사 표현형이 도입한 opfGWT1에 의해 상보적이었으며, 따라서, 모든 4 스팟을 성장시켜 각각의 콜로니를 형성하였다.
도 2는 opfGWT1 유전자를 발현하는 효모의 성장에 대한 화합물의 억제 활성을 나타내는 그림이다. GWT1 유전자 파괴 효모에 효모 GWT1 유전자 또는 opfGWT1를 발현시켰다. 효모의 GWT1 의존적 성장을 억제하는 활성을 가지는 화합물은 opfGWT1이 발현된 효모의 opfGWT1 의존적 성장에 대해서도 억제 활성을 나타내었다.
도 3은 항말라리아 활성을 나타내는 그림이다. 열대열말라리아 기생충(P. falciparum)을 사람 적혈구에 감염시켰다. 상기 적혈구에 GWT1 억제 화합물을 첨가하여 말라리아 감염의 억제를 측정하였다. 항진균 활성을 나타내는 모든 5종 화합물은 또한 적혈구의 말라리아 감염을 억제하였다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 한층 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 열대열말라리아 기생충 GWT1(P. falciparum GWT1)(PfGWT1)
(1) 열대열말라리아 기생충 GWT1(PfGWT1)의 염기 서열(서열 번호 1)은 열대열말라리아 기생충 게놈 데이타베이스(PlasmoDB database, http://plasmodb.org/) 상에 공개되어 있다. PfGWT1 유전자는 열대열말라리아 기생충(3D7 strain)보다 정제한 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해 클로닝되었다. PfGWT1 유전자의 5' 절반과 3'절반은 분할해 제조되어 이 양자는 XbaI(TCTAGA) 제한 효소 절단 부위에서 결합되었다. 이와 같이 상기 전체 길이 PfGWT1 유전자를 제조하였다. 또, 코드 영역의 외측에 제한 효소 절단 부위가 포함되기 때문에 발현 벡터에의 삽입이 가능하게 되었다.
(2) PfGWT1 유전자의 5'절반은 열대열말라리아 기생충 게놈 DNA를 주형이라 하고, pf152F(서열 번호 48) 및 pf136R(서열 번호 49)를 프라이머에 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 또, 3'절반은 pf137F(서열 번호 50) 및 pf151R(서열 번호 51)를 이용해, 상기와 같은 방법에 의해 증폭시켰다. 증폭 DNA 단편은 pT7-Blue 벡터(Novagen)에 서브 클로닝하였고, 인서트의 염기 서열은 서열 번호 1과 상동인 것을 확인하였다. PfGWT1 유전자의 5'옆반을 포함하는 클론을 PF15-5와 이름 붙였다. 3'옆반을 포함하는 클론을 PF20-9와 이름 붙였다.
(3) PfGWT1 유전자를 발현 벡터에 삽입할 수 있도록 PCR에 의해 코드 영역외에 제한 효소 절단 부위를 부가하였다. 5'절반에 있어서의 EcoRI 효소 절단 부위의 부가는 PF15-5를 주형으로서 pf154FE(서열 번호 52) 및 pf157R(서열 번호 53)을 프라이머에 이용한 PCR에 의해 행하였다. 증폭 DNA 단편을 pT7-Blue 벡터(Novagen)에 서브 클로닝하는 것으로서 클론 pT7-plasmN2를 얻었다. 또한, 3' 절반에 대해서는 PF20-9를 주형에 pf168BK(서열 번호 54) 및 pf155RK(서열 번호 55)를 프라이머에 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭한 DNA를 서브 클로닝하여 클론 pT7-plasmBK5를 조제하였다.
(4) 전체 길이 PfGWT1 유전자의 조제는 이하의 방법으로 행하였다. 효모 발현 벡터 YEp352GAPII를 제한 효소 EcoRI와 KpnI로 절단하였다. 이 벡터 절단 부위에 pT7-plasmN2 유래의 EcoRI-XbaI 단편(약 1500 bp)과 pT7-plasmBK5 유래의 XbaI-KpnI 단편(약 1100 bp)을 삽입하였다. 전체 길이의 PfGWT1를 포함하는 발현 벡터 YEp352GAPII-PfGWT1를 완성하였다.
[pf152F] ATGACAATGTGGGGAAGTCAACGGg (서열 번호 48)
[pf136R] TGTGTGGTTACCGTTCTTTGAATACATAGA (서열 번호 49)
[pf137F] ATAGAAAATGATTTATGGTACAGCTCAAA (서열 번호 50)
[pf151R] AGACCAAATTAATTATGCCTTTACATGTAC (서열 번호 51)
[pf154FE] agaattcaccATGAGCAACATGAATATACTTGCGTATCTT (서열 번호 52)
[pf157R] GAAATTCCAATGTATTCCATATTCACTTAT (서열 번호 53)
[pf168BK] AAGATCTAATACATTAAAACATTTTAGATTAATGAATATGTG (서열 번호 54)
[pf155RK] aggtaccGTACACTCCACTCTATGATGATCATTC (서열 번호 55)
<실시예 2> 전체 합성 PfGWT1 유전자
　열대열말라리아 기생충의 DNA에서 아데닌 및 티민(AT)의 비율이 매우 높아서(80% 또는 그 이상) 일반적인 분자생물학적 수법(PCR, 대장균을 이용한 유전자 조작, 재조합 단백질의 발현 시스템 등)을 적용할 수 없는 경우가 있다(Sato and Horii, Protein, Nucleic acid and Enzyme, Vol. 48, 149-155, 2003). PfGWT1의 DNA의 AT 함량도 80.41%이고, 게다가 A 또는 T가 연속하고 있는 곳이 많이 포함된다. 그 때문에, 효모내에서의 복제 및 단백질 발현이 어렵다고 예상되었다. 실제로 과발현형태의 효모 벡터에 자연형의 PfGWT1를 연결하여 GWT1 파괴 효모에 도입했을 때, PfGWT1는 GWT1 파괴균주의 치사 표현형을 전혀 구제할 수 없었다. AT 함량을 감소시키기 위하여, 원래의 아미노산 서열을 변화하지 않은 형태로, 코돈을 동등(synonymous) 코돈에 치환하였다.
열대열말라리아 기생충 게놈 데이타베이스(PlasmoDB database, http://plasmodb.org/)상에 공개되어 있는 열대열말라리아 기생충 GWT1의 염기 서열(서열 번호 1)을 기초로 코돈 치환을 하였다. 그 결과로 얻어진 염기 서열을 「optimized PfGWT1(opfGWT1)」(서열 번호 5)로 이름 붙였다.
상기의 염기 서열을 코드 영역의 외측에 부가적인 서열, 즉 EcoRI에 의한 절단 부위 서열(GAATTC, 5＇말단), Kozak 서열(ACC, 5＇말단) 및 KpnI에 의한 절단 부위 서열(GGTACC, 3＇말단)을 포함하도록 설계하였다. 이러한 서열은 미국 Blue Heron사에 합성 위탁하였다. 전체 합성된 opfGWT1를 부가한 제한 효소 부위를 이용해 YEp352GAPII 벡터에 연결하여 opfGWT1 과발현 플라스미드를 제조하였다. 이 컨스트럭트를 GWT1 유전자가 1 카피만 파괴되어 있는 2배 체세포(WDG2)에 도입하였다. 얻을 수 있던 형질 전환체를 포자 형성 배지상에서 배양하는 것으로서 포자를 형성시키고 4 분자 분석을 하였다.
새롭게 설계된 코돈-수정 opfGWT1의 AT 함량은 61.55%까지 감소하였다. 4 분자 분석의 결과를 도 1에 나타낸다. opfGWT1 과발현 플라스미드가 도입된 후, gwt1 파괴균주는 생육 가능해졌다. 상기의 발견은 PfGWT1 유전자가 코돈 수정에 의해 AT 함량이 감소할 경우, 효모 세포내에서 발현할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 3> opfGWT1 발현 효모를 이용한 항말라리아 약물의 분석
opfGWT1 발현 효모를 이용해, 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝 하는 시스템을 구축하였다.
S. 세레비지에 GWT1 터미네이터 및 싱글 카피 벡터 pRS316의 SacI-KpnI 부위간에 S. 세레비지에 GAPDH 프로모터와 멀티 클로닝 사이트를 삽입해 발현 카세트를 구축하였다. 이 멀티 클로닝 사이트에 S. 세레비지에 GWT1 및 opfGWT1를 삽입해, pGAP-ScGWT1 및 pGAP-opfGWT1 플라스미드를 얻었다. 이러한 플라스미드를 GWT1 파괴균주에 도입하였다. 화합물(1)을 최종의 최고 농도가 50 μg/ml이 되도록 YPAD에서 2배 연속희석하였다. 희석 화합물을 96 웰 플레이트에 50 μl/웰이 되도록 각 웰에 첨가하였다. 여기에 각각의 플라스미드를 가진 효모 세포의 밤새 배양액을 1000 분의 1 희석한 것을 50 μl/웰씩 첨가하였다. 플레이트를 30℃에서 2일간 보온한 후, 660 nm로 배양액의 탁도를 측정했다(도 2 및 표 1).
　
0 6.25 12.5 25 50
pGAP-ScGWT1 0.7560 0.7370 0.6670 0.1140 0.0420
pGAP-opfGWT1 0.7150 0.6990 0.6910 0.3630 0.0530
GWT1 파괴주는 생육 불능이지만, 각각의 플라스미드를 도입한 균주은 생육이 가능해졌다(화합물 농도 0 μg/ml의 포인트). ScGWT1를 발현시킨 효모의 성장은 GWT1 특이적 억제제인 화합물(1)에 의해 억제되었다. 25 μg/ml의 화합물을 사용할 경우 약 85%의 성장 억제 효과가 인정되었다. 50 μg/ml의 화합물을 사용할 경우는, 효모는 완전하게 생육 불능이었다. 같이 opfGWT1를 발현시킨 효모의 성장도 화합물(1)에 의해 억제되었다. 25 μg/ml의 화합물을 사용할 경우에는 약 50%의 성장 억제 효과가 인정되었다. 50 μg/ml의 화합물을 사용할 경우 효모는 완전하게 생육 불능이 되었다. opfGWT1 발현 효모의 성장은 도입한 opfGWT1 활성에 의존하고 있기 때문에, 이 성장 억제 효과는 화합물 (1)이 opfGWT1의 기능을 억제한 것에 의한다고 생각된다. 이상은 이 분석 시스템을 이용해 화합물 스크리닝함으로써, 열대열말라리아 기생충 GWT1-특이적인 억제 활성을 나타내는 화합물을 확인할 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 4> 항말라리아 활성
효모 GWT1 억제 작용을 나타내는 대표 화합물 (1) 내지 (5)에 대해서 적혈구 배양 시스템을 이용한 항말라리아 활성을 측정하였다.
Figure pat00011
화합물(1)：1-(4-부틸 벤질) 이소퀴놀린
Figure pat00012
화합물(2)：4-[4-(1-이소퀴놀릴 메틸) 페닐]-3-부틴-1-올
Figure pat00013
화합물(3)：5-부틸-2-(1-이소퀴놀릴 메틸) 페놀
Figure pat00014
화합물(4)：2-(4-브로모-2-플루오로벤질)-3-메톡시 피리딘
Figure pat00015
화합물(5)：N-[2-(4-부틸 벤질)-3-피리딜]-N-메틸아민
구체적으로는, 100% DMSO에 용해한 피검화합물을 배지에서 희석해, 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 상기 희석물을 80 μl씩 더하였다. 열대열말라리아 기생충 FCR3균주는 10% 사람 혈청 함유 RPMI1640 배지에서 37℃으로 전 배양되었고, 그런 다음 20μl의 배양 세포(적혈구 10%를 함유)를 각 웰에 첨가하였다. 이때, 0.47%의 적혈구가 감염되어 있었다. 5% O2, 5% CO2 및 90% N2 하에서 37℃ 48시간 배양 후, 김자(Giemsa) 염색을 이용하여 말라리아 기생충을 염색하였다. 원생동물 감염 적혈구 수를 측정해, 감염율을 산출했다(도 3). 그 결과, 화합물 (3)은 강한 항말라리아 활성을 가지는 것으로 나타났다. 나머지 4 화합물 또한 항말라리아 활성을 나타내었다. 화합물 (4)가 가장 약한 활성을 나타냈다. 따라서, GWT1 억제 화합물은 열대열말라리아 기생충 GWT1를 억제하는 활성을 가지는 화합물을 포함하며, 이러한 화합물을 기초로 항말라리아 약물을 합성하는 것이 가능하다라고 하는 것이 시사되었다.
본 발명은 말라리아 기생충의 GWT1을 발현하는 진균의 생산에 성공하였다. 이러한 진균을 사용하여, GPI 생합성 경로를 타겟으로 한 항말라리아 약물가 말라리아 기생충을 이용하는 일 없이 스크리닝하는 것이 가능하다.
<110> Eisai Co., Ltd. <120> Methods of screening for compounds that inhibit the biosynthesis of GPI in malaria parasites <130> 10FPI-01-11 <150> US 60/428,589 <151> 2002-11-22 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2625 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 1 atgagcaaca tgaatatact tgcgtatctt ttgatatgtc cctttaactt aatatatata 60 tttgaccttc cttcatatat acctgagtta aataaaaagc tggagaatga cgaggtgttt 120 atatatggaa aagaaataag aaagaatgaa tctgcatatt ctttacatta tgaaaaatat 180 ttatatgaat tatcaagaag atattatgag ataatattaa aatataataa ggagctcggg 240 gttaatcaag aaaaagaata taatttaata ataagtagag agatagataa aaaaaaaaaa 300 aaacaaaaaa atagtacaca aggagaatat aataatgatg atgataataa ttggaaatta 360 ttccaaatat atgagaagga agaacccaga tcatacgaat taatacgtgt tgagatttac 420 aaaaaagata ttcttttaat ttataaaaat gaaaaaacca aatcatcaat aaaatttata 480 ataaagaaaa gaaaagatat aaaaaattat ttctcattat gttatcaaaa ttgtataaat 540 aaattagata aaaatgatta taatatttta aaaagtacaa taaataatag taaagaaaat 600 ataattaata gtgcttatat 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ttgggtttgt tttcttgtgc cttgagtttt 2340 tccttagaag atatattatt aagatataaa aaatataaaa taaatattga tataacagta 2400 ttggataaga taaataaaaa tacattgata gtttttcttt tctcgaatat acttgtgggc 2460 atgttcaata ttctatttca aactttatta ttacctctta tatttgtaat acctatattg 2520 gtattttatt ctttcttaat actgcttttt acaaaatgct taccaccttc catacgccat 2580 ccaaaaaaaa aaacacatca tgaggaaaag caaaaaaaag aatga 2625 <210> 2 <211> 874 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 2 Met Ser Asn Met Asn Ile Leu Ala Tyr Leu Leu Ile Cys Pro Phe Asn 1 5 10 15 Leu Ile Tyr Ile Phe Asp Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Glu Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Leu Glu Asn Asp Glu Val Phe Ile Tyr Gly Lys Glu Ile Arg Lys 35 40 45 Asn Glu Ser Ala Tyr Ser Leu His Tyr Glu Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Tyr Tyr Glu Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Lys Glu Leu Gly 65 70 75 80 Val Asn Gln Glu Lys Glu Tyr Asn Leu Ile Ile Ser Arg Glu Ile Asp 85 90 95 Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Asn Ser Thr Gln Gly Glu Tyr Asn Asn 100 105 110 Asp Asp Asp Asn Asn Trp Lys Leu Phe Gln 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Glu Lys Glu Glu Ile Cys 325 330 335 Asp Glu Lys Glu Glu Ile Leu Asp Lys Lys Lys Lys Ile His Glu Lys 340 345 350 Lys Lys Lys Ile His Asp Lys Lys Glu Glu Ile Asp Glu Lys Lys Lys 355 360 365 Lys Ile His Asp Lys Lys Asp Glu Ser His Asp Lys Asn Glu Asp Ile 370 375 380 Thr Tyr Pro Val Gln Tyr Asn Ile Glu Asn Asp Leu Trp Tyr Ser Ser 385 390 395 400 Lys Asn Val Asp Ile Lys Met Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Gly Glu Glu 405 410 415 Tyr Ile Ile Gln Asn Thr Leu Lys His Phe Arg Leu Met Asn Met Cys 420 425 430 Met Thr Tyr Ile Cys Ile Phe Ala Val Asp Phe Tyr Phe Phe Pro Asn 435 440 445 His Phe Cys Lys Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Leu Met Asp Ile Gly 450 455 460 Ile Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Ala Tyr Ser Gln Glu Ile Lys Lys 465 470 475 480 Phe Thr Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Arg Ile Ile Glu Leu Lys His Ile 485 490 495 Val Leu Phe Ile Leu Gly Ile Ser Arg Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Phe 500 505 510 Asn Tyr Asn Tyr Asn Ile Ser Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe 515 520 525 Leu Thr Leu Cys Thr Thr Phe Leu Ile Ser Asn Ile Cys Phe Ile Leu 530 535 540 Leu Lys Arg Ile Arg Tyr Ile Phe Leu Phe Ser Ile Ile Ser Ile Ile 545 550 555 560 Leu Phe Glu Ile Ala Ile Tyr Tyr Phe Asp Leu His Asn Tyr Ile Leu 565 570 575 Leu Lys Asn Asp Arg Leu Asn Phe Phe Ser Ser Asn Lys Glu Gly Leu 580 585 590 Phe Asn Ile Ile Gly Ser Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu 595 600 605 Phe Lys Tyr Leu Thr Lys Gln Arg Thr Tyr Ile Thr Thr Ser Asn Ile 610 615 620 Pro Lys Asn Lys Lys Asp Met Asn Asn Ser Met Tyr Ser Lys Asn Gly 625 630 635 640 Asn His Thr Asn Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asn His Lys Ile Val Ile 645 650 655 Arg Asn Asn His Ile Asn Lys Tyr Glu Gln Asp Asn Thr Asn Lys Tyr 660 665 670 Ile Asn Lys Gln Ile Asn Asn Asn Lys Asn Lys Leu Asp Glu Glu Glu 675 680 685 Lys Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Lys Asn Lys Lys Lys Asn Leu Lys 690 695 700 Lys Lys Ile Lys Tyr Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Ile Asn Ile 705 710 715 720 Tyr Lys Glu Glu Tyr Tyr Thr Ile Tyr Tyr Asn Ile Lys Leu Ile Ile 725 730 735 Ser Ser Phe Ile Phe Tyr Leu Leu His Ile Ile Leu Asn Leu Tyr Lys 740 745 750 Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Phe Leu Ile 755 760 765 Thr Ser Leu Gly Leu Phe Ser Cys Ala Leu Ser Phe Ser Leu Glu Asp 770 775 780 Ile Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Tyr Lys Ile Asn Ile Asp Ile Thr Val 785 790 795 800 Leu Asp Lys Ile Asn Lys Asn Thr Leu Ile Val Phe Leu Phe Ser Asn 805 810 815 Ile Leu Val Gly Met Phe Asn Ile Leu Phe Gln Thr Leu Leu Leu Pro 820 825 830 Leu Ile Phe Val Ile Pro Ile Leu Val Phe Tyr Ser Phe Leu Ile Leu 835 840 845 Leu Phe Thr Lys Cys Leu Pro Pro Ser Ile Arg His Pro Lys Lys Lys 850 855 860 Thr His His Glu Glu Lys Gln Lys Lys Glu 865 870 <210> 3 <211> 1956 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <400> 3 atggcgcatt tgaacctcct cgtctacctc atcatgtgcc ccttcaatgt gaggcacatg 60 ctggatgcgc ccagcttccc attccggtta ggaagcaaag cagcaagtgg tgaaaccttc 120 acgtatggag cgactgcaag agagaacctg gggagttact ctcccgcaca tgacgagcta 180 tacatgttag agttagccaa aatgtactat aaaattgtgt taacatataa gaaggatgtt 240 aggaaaggac aggaggagag ttacaacttg gtggtaggct 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Lys Arg Thr 405 410 415 Phe His Leu Ser Cys Val Leu Ile Cys Leu Tyr Glu Ile Ile Ile Trp 420 425 430 Arg Leu Asp Ile Thr Ser Tyr Leu Val Val Asp Glu Ala Glu Arg Ser 435 440 445 Gly Phe Phe Ser Gln Asn Arg Glu Gly Leu Met Asn Val Ile Gly Ser 450 455 460 Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu Trp Asn Gly Tyr Val Phe 465 470 475 480 Pro Asp Glu Gly Gln Gln Trp Glu Arg Gly Lys Ala Ala Arg Arg Pro 485 490 495 Asp Glu Ala Ala Arg Thr Pro Gly Glu Gly His Gly Gln Arg Ser Pro 500 505 510 Val Arg Leu Thr Leu Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Phe His Leu 515 520 525 Leu His Leu Leu Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu 530 535 540 Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Cys Val Val Ser Ser Val Ser Leu Phe Ala 545 550 555 560 Ala Ala Leu Ser Tyr Leu Val Glu Lys Val Leu Leu Arg Glu Lys Thr 565 570 575 Thr Thr Ile Pro Val Leu Gln Gln Met Asn Arg His Ser Leu Ala Val 580 585 590 Phe Leu Phe Cys Asn Val Thr Met Gly Thr Phe Asn Leu Leu Phe Gln 595 600 605 Ser Leu Leu Phe Pro Leu Phe Phe Ala Cys Leu Val Leu Ala Ala Tyr 610 615 620 Ser Tyr Gly Met Leu Arg Phe Ala Ser Leu Leu Pro Gly Pro Ala Gln 625 630 635 640 Gly Glu Lys Gly Glu Lys Arg Glu Lys Gln Gln 645 650 <210> 5 <211> 2625 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 5 atgagtaaca tgaacatcct ggcctacctg ctgatctgtc cattcaacct gatctacatc 60 ttcgacctgc ctagctacat ccctgagcta aacaagaagc tggagaacga cgaagtcttc 120 atctacggta aggagatccg taagaacgaa tccgcatact ctctacacta cgagaagtac 180 ctatacgaat tgtcacgaag atactacgag atcatcctga agtacaacaa ggagttggga 240 gtcaaccaag agaaggaata caacctgatt atctccagag agatcgataa gaagaagaag 300 aagcagaaga atagtaccca gggtgaatac aataacgacg atgataacaa ttggaagttg 360 ttccagattt acgagaagga agaacctagg agctatgaat tgatcagggt agagatatac 420 aagaaggaca ttctgttgat ctacaagaat gagaagacga agtcctctat caagttcatt 480 atcaagaagc gtaaggatat caagaattac ttctccttgt gttaccagaa ctgtatcaat 540 aagctggaca agaatgatta caacatcttg aagtctacca tcaacaattc caaggaaaac 600 attatcaact ctgcatacat ttacatgtac attatcttct tcttcctgtg catatacgtc 660 gagaagaacc tgttcttgta cttcccaata ttgcttcaga agtatgagat tctcactacg 720 ttgttcatcc tcttcatccc attgatccta ttcgtattct tctatttcta cttcacgatt 780 atcaagctga tttgctcatg cttagtccta tacgtgactt tccagttgat ctactatacg 840 cagggaatgc ctatttacat ggaacatagt attctcaagc acaaggagaa ggaagagatt 900 tgcgatgaga aggaggaaat ctgtgatgaa aaggaagaga tttgcgatga gaaggaagag 960 atttgcgatg agaaggaaga gatttgtgat gagaaggaag aaatctgcga tgagaaagaa 1020 gaaatccttg ataagaagaa gaagatccac gagaagaaga agaagatcca tgataagaaa 1080 gaggaaatcg atgagaagaa gaagaagatt catgacaaaa aggacgaaag tcatgataag 1140 aacgaggaca ttacgtatcc agtccagtac aatatcgaga atgacctatg gtattcatcc 1200 aagaacgtgg acatcaagat gtattcatcc agcaacaagg gtgaagaata cattatccag 1260 aacacgttga aacatttccg attgatgaac atgtgtatga cgtacatttg tatcttcgct 1320 gttgacttct acttcttccc taaccatttc tgcaagtcct actattacgg aaatacgttg 1380 atggacattg gaatcggtgc atccatttct tccagtgcat actcgcagga gatcaagaag 1440 ttcacgtaca ttaaggagaa gaaacgaatt atcgagttga 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tctcctgtgc attatccttc 2340 tccctggagg acatcctact ccgttataag aaatacaaga tcaatatcga tattactgtg 2400 ctagataaga ttaacaagaa caccttaatc gtgttcctgt ttagtaatat cctagtggga 2460 atgttcaaca tcctgttcca aactttgctc ctaccactga tattcgttat ccctattcta 2520 gtattctaca gcttcttgat cctgctgttc accaagtgtt tgccaccttc tatccgacat 2580 cctaagaaga agacgcatca cgaagagaag cagaagaaag agtga 2625 <210> 6 <211> 2010 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <400> 6 atgtgcacta caaaaaatga agacaataat aaagtgaatt atctgtatct catttattat 60 aataatatac ctatatttaa aaaaaaaagt ggaaatgaac aaaacataag tgcgctattt 120 attttatatg atgtaaaaaa gtatgtgtat aatatggttc atgatcacgt aaatacatta 180 gtcctagaag cttttagaag agaagacata ataaaaaaaa taaaagtaaa agaaaaacaa 240 aataataatg ataaaaataa agaaagtaat attgaaaaag ataaaaatga acaaaccaaa 300 tttacagata tatatgatac aaatagtaag agtgacaaag atatacaaaa gaataatatg 360 aacgatggtg atagtaataa taaaaatagt agtttattta ttgatccttt tgaaagtgat 420 tcatatgaaa agaataattt tagtaatgaa aaatgtgctt tccaaaatgt cgataaatca 480 aaaaaagata aagaacatat atattctgaa aatattactc ctagtagtag taataataat 540 aatgataata ataaagaaaa tgattgtgat aaggaacaat tagataaata taataaagat 600 aaagaaaata aattaaaatt aaatgataag gatgaatata tttctttcaa ttttattgaa 660 gataaattaa ccgaatcatt tcatatgaat caaataattc atttaattaa taaaaaatgt 720 gtatttacca aatgcctaga aaattataaa aatagatatt ttgtactgaa aaaagaagag 780 attttaaaaa aaaaaaaaaa gcaaaaaaaa atgtctatat tttcatatat tgtatcaatc 840 atattatttt ttacatatat catatcactt ataaatagtt gtttatatta tataatatgt 900 acaccaaaat tgttcagtga atatatattt tcaaaaaaat gtgatggata tctgcagaat 960 tcggcttacc ctaaatttat atttccttct gaatggcata atatattccg cagcttcatg 1020 aaaaataaac aaaacccatc tgaatattat aaatatagag aaatcttatt aattcgtatt 1080 atcaatttaa taatcgatat tttcttggga tttctgatat ttttactact ttattttaac 1140 gtaataaacc tacattatat atcagagaag gctcaaatat tttatggaac cagtacttta 1200 acttctatct tgggtacctt gttacagaat ccattaggat ttaaattaaa taataatttt 1260 acgtctttca ttggtagcat ccttgtttcg atattagaca aatgggattt atttacaaat 1320 accatccctg tgaataatag tacagttttg aattttgttg gatatacatc actgctgggt 1380 ttttcttttt ttttgtcttt tgttattgat tatttgagat tcgtaacagc acatgttacc 1440 attatttatt tatttttgaa aaaaatatgt accctttttc ataaaaatat gtattcctta 1500 tacctattat tcaatgggaa aaaatggaac atactaaaac taagagttga tacaaattac 1560 tactcaaatg aagaagtact tttaggaacc atattattta ccattttaat ttttttgtac 1620 cctaccattt ttgttcttgt tttggttttt ggtcttatat atcttataat aaatagaatt 1680 atataccttt tgtgtgttat ggagaaaata attttgtaca cccctttcta tattttcttt 1740 attcaaccga attgtaataa atatattagt aagggtttca agtttacaaa atatgaagtt 1800 ggggaacatg aactgttaaa aaggtatccg actaacagct acttgttgct agaaaagatt 1860 cattttttat tttttgataa aataaaattg tttataaata ttttccttta ttttaaaaac 1920 ctcgagtcaa tgtcatcata ttcatatata tttatttctt tttgtttttg tcttttaaaa 1980 aaaaaatata tatatatata tataatataa 2010 <210> 7 <211> 669 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 7 Met Cys Thr Thr Lys Asn Glu Asp Asn Asn Lys Val Asn Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Ile Tyr Tyr Asn Asn Ile Pro Ile Phe Lys Lys Lys Ser Gly Asn 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Phe Thr Lys Cys Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Arg Tyr Phe Val Leu 245 250 255 Lys Lys Glu Glu Ile Leu Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Lys Met Ser 260 265 270 Ile Phe Ser Tyr Ile Val Ser Ile Ile Leu Phe Phe Thr Tyr Ile Ile 275 280 285 Ser Leu Ile Asn Ser Cys Leu Tyr Tyr Ile Ile Cys Thr Pro Lys Leu 290 295 300 Phe Ser Glu Tyr Ile Phe Ser Lys Lys Cys Asp Gly Tyr Leu Gln Asn 305 310 315 320 Ser Ala Tyr Pro Lys Phe Ile Phe Pro Ser Glu Trp His Asn Ile Phe 325 330 335 Arg Ser Phe Met Lys Asn Lys Gln Asn Pro Ser Glu Tyr Tyr Lys Tyr 340 345 350 Arg Glu Ile Leu Leu Ile Arg Ile Ile Asn Leu Ile Ile Asp Ile Phe 355 360 365 Leu Gly Phe Leu Ile Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Asn Val Ile Asn Leu 370 375 380 His Tyr Ile Ser Glu Lys Ala Gln Ile Phe Tyr Gly Thr Ser Thr Leu 385 390 395 400 Thr Ser Ile Leu Gly Thr Leu Leu Gln Asn Pro Leu Gly Phe Lys Leu 405 410 415 Asn Asn Asn Phe Thr Ser Phe Ile Gly Ser Ile Leu Val Ser Ile Leu 420 425 430 Asp Lys Trp Asp Leu Phe Thr Asn Thr Ile Pro Val Asn Asn Ser Thr 435 440 445 Val Leu 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aaaaaaaaat taataatatc 780 ttctttttat catcttctaa aagaaatgaa aatagttata gtttattttc cagtagttat 840 ttaagcgttt caacggtcga cagatttaca taccattttt ttaattatct tcaacaaata 900 cataaaatat atgaaaaaga accatctaaa aatataaaag ccttttcatt atataacatt 960 ttaaattatt taaaaacaca acatattatg tcagaaccta ctacaaataa ttctaaattt 1020 aattcgtcca tttttttaca tgataaaaat attcttttct tcaattctaa tttgttaatt 1080 atacataaag atgatgtttc tataatatat caagataaac aaacacacaa tcacaaatat 1140 atatgtttgg ataatctatc taaatgtggt catataaaaa ataatgtaca taaaaaaatg 1200 caaactctat atgaacaaac gttatattat aataataatc aacagaattt cttttctaat 1260 catatgtcta attttacaga ttattttttt acacatgata tatataatat atataatata 1320 tataatgtat ataatatata taatgtatat aatatatata atgtatatga tatatataat 1380 gtatattctt ttcttatatt attgctctct ttatttttta ttatgtgttc tcttcttaca 1440 tattatattg ttttttttac agaaaaggct aaaatgacat aa 1482 <210> 9 <211> 493 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 9 Met Gly Ile Lys Ile Ile Ile Tyr Ile Phe Phe Leu Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Trp 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gatacaatta ctccatatat aataccagat aaatcatttt attggtttgg tcatcatcat 2100 tttaataaaa aaaataattt tcaatatatt tatcaaaaca ttaatttgtc atgtttaaat 2160 tatagatttc atataccttt acaaggacaa ttacctactt atatagttac aacaactatt 2220 gaacttacac atttacaatt atttctgagt acatataatt ataaacttga aacaaagcct 2280 tttttttctt attttatgat aagtgaagca aaaggaatag ttccagtata tcattacata 2340 ttcaagaggg ttccttccta a 2361 <210> 13 <211> 786 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 13 Met Ile Tyr Asn Asp Ile Leu Thr Leu Cys Ala Asn Lys Leu Arg Gly 1 5 10 15 Leu Ile Asp Ser Lys Ile Phe Ile Trp Leu Leu Ile Phe Phe Arg Ile 20 25 30 Phe Asn Cys Leu Phe Val Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Glu Tyr Phe 35 40 45 Gln Ser Val Glu Ile Ala His Phe Trp Ala Tyr Gly Tyr Gly His Met 50 55 60 Ser Trp Glu Trp Glu Pro Cys Val Ala Leu Arg Ser Val Ile Thr Pro 65 70 75 80 Phe Ile Tyr Tyr Val Leu Phe Leu Phe Leu Lys Leu Ile Asn Ile Asp 85 90 95 His Pro Val Cys Val Leu Tyr Ile Pro Lys Leu Cys His Gly Ile Cys 100 105 110 Ala Ala Leu Cys Asp Leu Gly Ile 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tttaatatgc gcatatagca taatgaaatt atttaaatca 1140 acgatattta gaagctacat aaatttttta acaggtttct acacttattt gattacaata 1200 ttaattattt ccctacctat atatttaatt tcaacaaata aaaaatttta tgagttgttg 1260 aattttgaag aaaattatat tccttcatgt tatgaatggc atcctgataa ttttgataaa 1320 tatataaaaa ttgcaaatat atggtggaat gttttatttt tctcaatttt tggtgcattt 1380 ttttttaatt tatttatttc ttttttagtt aataaaaaaa gaaaagttat accaaaaaaa 1440 aatgatcaaa atgaatcatt tgatggctat aaaaaggtag agaaggtaga acgaatttta 1500 atattagaaa aaatcaaaga attgcaaaat gaaataatga aacgaaaagg tattacaaat 1560 aatcataata atattaaaaa ttataatatt tatacaaatg aaaatatata caataataat 1620 ataaataata taaataataa taataatatt tatgaaaact tatatgataa tggagaagta 1680 aaaaaaaaca ttctggttaa accaaaaatt ataaatagcg atgatgaaga ttttcttctt 1740 gaaaaaaaaa attccgaatt cattaaaaaa atagaaaaac aaatagaaat attagaagaa 1800 aaattggaat ttttaagtaa tgatgaaaat gtaaaatata ttttttataa taattctata 1860 gcaccattta atacaatgat gatatatatg aatatttttt atttcatatt agtagcgcta 1920 ttaagttcgt tatataattg gtcctattct gtattattta gcctgctatt tgtaattcct 1980 atatcaattt tacataattt aaaaacaaaa ccagtcagaa tttttaagaa gattattctt 2040 tcacttttta ttctttgtat gtttatttat atgtatccta atgataatca tctttggaat 2100 ataagacaga agctaactaa tttatttagg aataatatat caaaatgttg taaatattta 2160 gacaagcaca aaatattaca aagcaaatat ttcccagaaa gtttgcaatt tatttgttcg 2220 aataggttat ttgattcatt ttactcaaat aaatattttt tggataatct aaatattaaa 2280 tttagttatg tcttggatat tcaaaatgga ttcttattaa ctttatacaa tttagcaaga 2340 aatcattttt gtattggtac agctacctat cctttaatat gctttacctt attcccaata 2400 gtattttata tagttttttt atttttttgt taa 2433 <210> 19 <211> 810 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 19 Met Gly Phe Ser Glu Asn Pro Lys Phe Cys Leu Leu Ile Asn Lys Leu 1 5 10 15 Ile Lys Lys Ser Lys Val Ile Gly Val Phe Leu Ser Ile Ile Gly Val 20 25 30 Ile Phe Phe Leu Val Phe Asn Lys Phe Asn Lys Asn Ala Glu Leu Asp 35 40 45 Ala Arg Thr Phe Thr Gln Phe Val Gly Asn Ser Val Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Tyr Asn Asp Thr Asn Ser Tyr Phe Met 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120 gatagaaaat tatcagaagc tgctcgcgct caaattaggt tggattttat aagtttctac 180 caaaccatat tgaacacttc tttcatttac atcactttta catatattta ctattatggc 240 ttcgatccta ttccgccaac tattttcctt tcatttataa cattgattat atcaaggacg 300 aaagtcgacc ctctattgtc ctcattcatg gacgtaaagt cttcgctgat tatcacattt 360 gcaatgttga ctctctctcc agtcctcaaa tctctttcta aaacaactgc atctgattcc 420 atatggacat tgtctttttg gctgacccta tggtacattt tcgttatttc gtcaacaaag 480 tccaaagata aaccctctaa cctttccacc aatatacttg tcgcccttgt tgctgtccta 540 tcatcgaggc tttcgaccac aatcgacgta ttctgttttc ttttaatttg tattcagttg 600 aatatcattc tacccactta tttatcggtg acgaataagg tagtaccaat aatttcaaat 660 attattgtat actcattttt gaatgttgct ctaggttgga tttatatgct gttgattttc 720 tttgcttcag tattttatat tactgtttta cctaagtggt tcatctactg gaaaatcaat 780 tatcataaac gggataacga tctactaagt acatgggatg caagaacacc aatattggat 840 tag 843 <210> 23 <211> 280 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 23 Met Thr Arg Ser Pro Trp Lys Arg Leu Leu Trp Leu Lys Gln Glu Tyr 1 5 10 15 Pro 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tccatcgagc tggatgcttt tgtctttaga cacttggatc aattattcca caattccaca 600 ctgaactcaa cattggatta tgaaattagg caagacggta atgtattctt tctacatcta 660 ctaggttgcg atactgccgg acattcttat agaccatatt ctgccgagta ttatgacaat 720 gtcaaatata ttgatgatca aatccctatc cttatagaca aagtcaacaa gttttttgcg 780 gacgacaaaa ccgcatttat ttttacagca gatcatggta tgagtgcatt tggatcacat 840 ggtgacggtc atcctaacaa cacaaggacc cctcttgttg cttggggtgc gggtttgaat 900 aaaccagtac ataatccttt tccggtatcc gacaactata ctgaaaattg ggagctttcg 960 agcattaaaa gaaatgatgt caagcaagca gatattgctt ctttaatgtc atacttgatt 1020 ggtgtgaact atcctaaaaa ttcagttggt gagttaccaa tagcatatat cgatggaaaa 1080 gaaagtgaca agcttgccgc attgtacaac aacgcaagaa gcattttaga gcagtactta 1140 gtcaagcaag atgaggtaat agactctcaa tttttttata aggaatactt caagtttgtt 1200 gaaaagtctc attcacatta cttagaagag atagaaacct taattcagcg tatatctgaa 1260 ggagaaaact atttggaaca agaagcaatc acccttacag aggaattaat gcagataaca 1320 ttggaaggtt tacattattt gacaacctat aattggagat tcattagaac tattgttaca 1380 tttgggtttg 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1620 ataatggcat ctgctggttt tcaagtacta cattttattg tcactactat tttggtgggg 1680 ttgtgtttca cgtacaaaat ctcgtgggaa atcgtcaatg gtaaccaggc agaaataccg 1740 ctctttatgc atgatttact ggctaagata gactttgcac caactgaaag taacttgatt 1800 gtacttgcgc gcgttttctt ccaagcttgg gctattgttg tcatttcaag gttggtcctg 1860 acgaaattga aagtacttaa caagaactac ctcattaaag atatgaaagt ttatataaca 1920 attcttttga tgttccaaac ttcttctcag aacataggtc aatttctcgt tttccaaata 1980 ttagagtccc aaatttttta ctttttccaa aatattccaa ccgcctcatt aacatcaaca 2040 agtaagattt atttttcgaa tttggtgtcc ttaattttac aaaattttac atttttccaa 2100 ttcggtggca caaattccat ttctactata gaccttggaa acgcatacca tggtgtttcc 2160 tcagactaca acatctacgt agtggggata ttaatgtccg ttgccaattt cgcgccggca 2220 atatactggt ccatgctacc gtggtcaata aactacgcct ctattccagc acaagttaag 2280 ttgcaaacgt tcatcagaag taagttacct gccttcacct atcattgtat atttggaact 2340 tgtttgatga cggcatgcgt cgttttgaga tttcatctct ttatttggtc cgttttcagt 2400 ccaaaattat gttattttct tgggtggaat tttgtgatgg gattgctgaa tggctggtta 2460 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attcattaaa tggatcatgt acaagcgtta cgtggtttga tctctctcat 780 actattgatc tttctgaact ttcttcaatg gcctattacc cagaagattc tgcactgaat 840 ttagccatag tctttcctag tgcttcttca agtcccgatg gtctggcgtt cattaatggc 900 actcggattt cagacgaaat aaccacatta gattggaata gttatctagt tcctcaatgg 960 ggggttataa taataaataa aatgccgttg aagccaaatt cagtcattag cgaagattat 1020 ttagaaccta tgatgtaccg ttttgcgaca gatatttttc aactattggg attaacggag 1080 ggctcgcaag atttgttatc accttatatt accatagatt cattcaaaag gttgacaatt 1140 ttacagaatc tagataaagc tacggaaaca ttatggtcgt tagtgaaatt aactcaacaa 1200 tttcagggca tgtctatccc acgcgaagta tcggataatg ttatcgaagc tttagactta 1260 aggctacaga ttattgattt attaaatgat cctggaaagg gtggagatat cgtctggaac 1320 aatgccctgc atctaagtaa tgaattggtt aaactatgcg aaaaggcatt tttcaatgga 1380 gaaatggttc aacaaaattt cttcccacaa gagcacatga tagctgtgta tttaccttta 1440 ttaggcccaa tatcggcagt catgttcttt ggtttctaca acgtgatgaa ggaaaagaat 1500 caaaagagta aaaagaatgg aaccgagaga gaagttgcta aagaaaaatt agagttgaaa 1560 gaggctcaaa aattacatgc tattgatggt gaagatgaat tatga 1605 <210> 37 <211> 534 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 37 Met Ser Asn Ala Asn Leu Arg Lys Trp Val Gly Phe Cys Phe Val Ala 1 5 10 15 Ile Tyr Leu Phe Leu Gly Val Pro Leu Trp Tyr Lys Leu Thr Thr Val 20 25 30 Tyr Arg Ala Ser Leu Pro Ile Asn Tyr Ile Glu Ser Leu Gln Asn Asn 35 40 45 Lys Phe Gln Asp Ile His Leu Val Ile Pro Val Tyr Val Lys Ser Asp 50 55 60 Thr Tyr Arg Phe Pro Asp Val His Asp Ala Ile Gln Val Gln Val Asn 65 70 75 80 His Leu Leu Asn Ser Gln Glu Gln Arg Val Pro Trp Ser Leu Gln Val 85 90 95 Leu Pro Tyr Asn Glu Thr Ile Glu Gln Met Glu Ser Glu Gly Asn Gln 100 105 110 Phe His Val Val Thr Leu Lys Leu Asp Glu Phe Ile Gly Tyr Ser Ser 115 120 125 Ala Tyr Asp Thr Lys Glu Thr Leu Val Tyr Tyr Asp Asp Ala Ala Val 130 135 140 Leu Ser Asn Asp Leu Pro Phe Phe Val Ala Gln Thr Leu Val Glu His 145 150 155 160 Thr Phe Gln Leu Glu Trp Thr His Leu Asn Lys Thr Cys Glu Gly Val 165 170 175 Ser Thr Asn Asn Asp Val Ala Ile Ser Tyr Asp Pro Asn Ile His Leu 180 185 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tgtggtctcc 660 tctctctgca acggcctcat cgccgcccag ctgctcttct actggaatgc aaagcctccc 720 cacaagcaga aaaaggcgca gtag 744 <210> 47 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Ala Ala Glu Ala Asp Gly Pro Leu Lys Arg Leu Leu Val Pro Ile 1 5 10 15 Leu Leu Pro Glu Lys Cys Tyr Asp Gln Leu Phe Val Gln Trp Asp Leu 20 25 30 Leu His Val Pro Cys Leu Lys Ile Leu Leu Ser Lys Gly Leu Gly Leu 35 40 45 Gly Ile Val Ala Gly Ser Leu Leu Val Lys Leu Pro Gln Val Phe Lys 50 55 60 Ile Arg Gly Ala Lys Ser Ala Glu Gly Leu Ser Leu Gln Ser Val Met 65 70 75 80 Leu Glu Leu Val Ala Leu Thr Gly Thr Met Val Tyr Ser Ile Thr Asn 85 90 95 Asn Phe Pro Phe Ser Ser Trp Gly Glu Ala Leu Phe Leu Met Leu Gln 100 105 110 Thr Ile Thr Ile Cys Phe Leu Val Met His Tyr Arg Gly Gln Thr Val 115 120 125 Lys Gly Val Ala Phe Leu Ala Cys Tyr Gly Leu Val Leu Leu Val Leu 130 135 140 Leu Ser Pro Leu Thr Pro Leu Thr Val Val Thr Leu Leu Gln Ala Ser 145 150 155 160 Asn Val Pro Ala Val Val Val Gly Arg Leu Leu Gln Ala Ala Thr Asn 165 170 175 Tyr His Asn Gly Tyr Thr Gly Gln Leu Ser Ala Ile Thr Val Phe Leu 180 185 190 Leu Phe Gly Gly Ser Leu Ala Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gln Glu Thr 195 200 205 Gly Asp Pro Leu Met Ala Gly Thr Phe Val Val Ser Ser Leu Cys Asn 210 215 220 Gly Leu Ile Ala Ala Gln Leu Leu Phe Tyr Trp Asn Ala Lys Pro Pro 225 230 235 240 His Lys Gln Lys Lys Ala Gln 245 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 48 atgacaatgt ggggaagtca acggg 25 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 49 tgtgtggtta ccgttctttg aatacataga 30 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 50 atagaaaatg atttatggta cagctcaaa 29 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 51 agaccaaatt aattatgcct ttacatgtac 30 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 52 agaattcacc atgagcaaca tgaatatact tgcgtatctt 40 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 53 gaaattccaa tgtattccat attcacttat 30 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 54 aagatctaat acattaaaac attttagatt aatgaatatg tg 42 <210> 55 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 55 aggtaccgta cactccactc tatgatgatc attc 34

Claims (12)

  1. 말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 DNA의 축중(縮重, degenerate) 돌연변이체로서 원래의 DNA보다 낮은 AT 함량을 가지는, GPI 합성효소 유전자 결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA.
  2. 말라리아 기생충의 GPI 생합성에 관여하는 단백질을 코드하는 DNA의 축중(縮重, degenerate) 돌연변이체로서 70% 이하의 AT 함량을 가지는, GPI 합성효소 유전자 결실 효모의 표현형의 상보 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA.
  3. 제 1항에 있어서, DNA는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 DNA：
    (a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4 및 서열 번호 6-47의 홀수 번호의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
    (b) 서열 번호 1 및 서열 번호 3 및 서열 번호 6-47의 짝수 번호의 염기 서열 중 어느 하나를 포함하는 DNA,
    (c) 엄격한 조건하에서 서열 번호 1 및 서열 번호 3 및 서열 번호 6-47의 짝수 번호의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 DNA와 혼성화하는 DNA, 및
    (d) 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입된 서열 번호 2 및 서열 번호 4 및 서열 번호 6-47의 홀수 번호의 아미노산 서열중 어느하나를 포함하는 단백질을 코드하는 DNA.
  4. 제 1항에 있어서, 서열 번호 5로 기재되는 염기 서열을 포함하는 DNA.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 DNA가 삽입된 벡터.
  6. 제 5항의 벡터를 발현 가능하게 보유하는 형질 전환체.
  7. 제 6항에 있어서, 형질 전환체는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균인 형질 전환체.
  8. 제 7항에 있어서, GPI 합성효소 유전자 결실 진균은 효모인 형질 전환체.
  9. 제 6항의 상기 형질 전환체를 배양하고, 상기 형질 전환체 또는 그 배양 상청액(supernatant)으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 DNA에 의해 코드되는 단백질의 제조 방법.
  10. 하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
    (1) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 발현하는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균과 피검시료를 접촉시키는 단계,
    (2) 상기 진균의 성장을 측정하는 단계, 및
    (3) 상기 진균의 성장을 억제하는 피검 화합물을 선택하는 단계.
  11. 하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
    (1) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 발현하는 GPI 합성효소 유전자 결실 진균과 피검시료를 접촉시키는 단계,
    (2) 상기 진균의 세포벽에 수송된 GPI-앵커 단백질의 양을 결정하는 단계, 및
    (3) 단계 (2)에서 결정된 세포벽에 수송된 GPI-앵커 단백질의 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계.
  12. 하기의 단계를 포함하는 항말라리아 활성을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법:
    (1) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 GPI 합성효소 유전자 결실 진균에 도입해, 상기 DNA에 의해 코드되는 단백질을 발현시키는 단계,
    (2) 단계 (1)에서 발현된 단백질을 조제(preparation)하는 단계,
    (3) 상기 조제한 단백질과 피검시료 및 상기 단백질에 결합 활성을 가지는 표지된 화합물을 접촉시키는 단계,
    (4) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물을 검출하는 단계, 및
    (5) 상기 단백질에 결합하는 표지된 화합물의 양을 감소시키는 피검시료를 선택하는 단계.
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