CN101092628A - 筛选在疟原虫中抑制gpi生物合成的化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明人成功地分离出了GWT1(PfGWT1)，其是一种在恶性疟原虫中参与GPI生物合成的酶。此外，本发明人揭示比编码PfGWT1蛋白的DNA具有更低AT含量的简并突变体DNA，能补偿GWT1－缺陷型酵母的表型。在此发现的基础上，本发明提供了疟原虫的GWT1蛋白，以及该蛋白在筛选抗疟药物的方法中的用途。本发明还提供了编码参有GPI生物合成的蛋白的简并突变体DNA，该DNA比天然DNA具有更低的AT含量。本发明还提供了利用该简并突变体DNA筛选抗疟药物的方法。

Description

筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法
本申请是分案申请，其母案是2003年11月21日向国际局提出申请、在2005年7月22日进入中国国家阶段、并获得中国申请号200380109105.0的中国申请。本分案申请与其母案具有相同的发明名称。
技术领域
本发明涉及筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法。
背景技术
疟疾是由寄生性原虫引起的最常见的传染性人类疾病。该疾病由于感染疟原虫所致，以蚊子，冈比亚疟纹(Anopheles gambiae)为媒介。每年约有50亿病例感染疟疾，包括超过两百万的致死例(Gardner等，Nature419：498-511，2003)。目前，40％的世界人口生活在疟疾流行区，在该区域据说每3名新生儿中就有一名死于疟疾。
已知糖基磷脂酰肌醇(GPI)在寄生虫生长和感染过程中起着重要的作用，所述寄生虫包括疟原虫。在这些寄生虫的细胞表面上有许多GPI-锚定蛋白。GPI-锚定蛋白包括如在寄生虫侵入红细胞时起作用的MSP-1蛋白。GPI-锚定蛋白起寄生虫抗原的作用，在宿主中引发免疫应答。因此，它们长期以来是疫苗开发的研究对象。
GPI不仅作为将蛋白拴到细胞膜的锚，而且是疟原虫细胞膜的丰富糖脂成分。最近的研究揭示GPI有毒，并能促成致死症状。GPI诱导炎性细胞因子如TNF-α和粘附分子的表达。结果，受染红细胞粘附毛细管，阻塞血管(隔离作用(sequestration))，尤其是脑血管。它能引起进一步的炎症反应，而炎症反应认为能导致脑病。最近，Schofield等报道抗-GPI抗体降低利用鼠科疟原虫伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)创建的体内感染模型系统的致死率，并且该抗体在体外抑制由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的后期炎症反应(Schofield L等，Nature 418：785-789，2002)。此发现说明GPI是疟疾感染致死率的主要因素。
还报道肌醇酰基化对于甘露糖与GPI的结合来说是必需的(Gerold，P.等，Biochem.J.344：731-738，1999)，由过量葡糖胺引起的肌醇酰基化的抑制会抑制恶性疟原虫的成熟(Naik，R.S.等，J.Biol.Chem.278：2036-2042，2003)。因此，选择地抑制GPI生物合成尤其是肌醇酰基化的化合物可以是非常有用的抗疟药物。
发明的公开
本发明的目的是提供抑制GPI生物合成的抗疟药物。更具体地说，本发明提供了编码GWT1蛋白的疟原虫DNA，所述蛋白是参与GPI生物合成的蛋白质(GPI合酶)。本发明还提供了在筛选抗疟药物的方法中利用该DNA的方法。本发明还提供了编码疟原虫GPI生物合成蛋白的DNA的简并突变体DNA。该简并突变体DNA比天然DNA具有更低的AT含量。本发明还提供了在筛选抗疟药物的方法中利用该简并突变体DNA的方法。
最早发现GWT1基因编码真菌GPI-锚定蛋白合酶(WO 02/04626)，其在从酵母到人类的生物体中是保守的。本发明人证实GWT1同源物(恶性疟原虫(P.falciparum)GWT1的PfGWT1；约氏疟原虫(P.yoelii yoelii)GWT1的PyGWT1)包括在恶性疟原虫和约氏疟原虫的全基因组序列内(Gardner等，Nature 419：498-511，2003；Carlton等，Nature 419：512-519，2003)。本发明人还发现GWT1基因产物在GPI生物合成途径中起GlcN-PI酰基转移酶的作用。PfGWT1基因产物期望具有相似的活性，这样抑制其活性的化合物就可能是有价值的抗疟药物。
在WO 02/04626中，本发明人发现了一组抑制真菌GWT1基因产物的活性的化合物。抑制PfGWT1基因产物的活性的化合物有望成为抗疟药物。
在本发明中，本发明人成功地对几乎是PfGWT1全长的区域进行了分离。利用疟原虫如恶性疟原虫的GWT1基因产物，抗疟药物的筛选可以通过结合试验，葡糖胺(酰基)磷脂酰肌醇(PI-GlcN)酰基转移酶试验，或利用GPI-锚定蛋白检测系统来进行。从所述筛选方法获得的化合物可能是有价值的抗疟药物。更进一步地，本发明人揭示简并突变体DNA(编码疟原虫GPI生物合成蛋白的DNA简并突变体)，该DNA比天然DNA具有更低AT含量，补偿GWT1基因-缺陷型真菌的表型。因此，利用GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型作为指标，该真菌中导入了(比疟原虫中编码GPI生物合成蛋白的DNA)具有更低AT含量的简并突变体DNA，就有可能筛选出抑制在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白活性的化合物。
更具体地，本发明提供了下述[1]到[25]：
[1](a)到(d)中任一项的DNA，该DNA编码具有GlcN-PI酰基转移酶活性的疟原虫蛋白。
(a)编码包含SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的蛋白的DNA，
(b)包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的DNA，
(c)在严谨条件与包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和
(d)编码包含SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列，且其中已添加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸所得的蛋白的DNA；
[2]由项[1]的DNA编码的蛋白；
[3]插入项[1]的DNA的载体；
[4]在可表达状态包含项[1]的DNA或者项[3]的载体的转化体；
[5]一种抗疟药物，其包含抑制项[2]的蛋白的活性的化合物作为活性成分；
[6]项[5]的抗疟药物，其中抑制项[2]的蛋白的活性的化合物是选自下述化合物(1)-(5)中的至少一种化合物：
Figure A20071010428700061
Figure A20071010428700071
和
Figure A20071010428700072
[7]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：
(1)使项[2]的蛋白与试样和具有与该蛋白结合的活性的标记化合物接触，
(2)检测与该蛋白结合的标记化合物，和
(3)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样；
[8]项[7]的方法，其中具有与蛋白结合的活性的标记化合物是通过对选自项[6]的化合物(1)-(5)中的至少一种进行标记而获得的；
[9]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：
(1)使试样与项[2]的蛋白接触，
(2)检测GlcN-(酰基)PI，和
(3)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的试样；
[10]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：
(1)使试样与过量表达项[2]的蛋白的细胞接触，
(2)测定GPI-锚定蛋白转运到该细胞的细胞壁的量，和
(3)选出减少步骤(2)中所测定的GPI-锚定蛋白转运到该细胞的细胞壁的量的试样；
[11]一种治疗疟疾的方法，包括施用抑制项[2]的蛋白的活性的化合物；
[12]项[11]的方法，其中抑制项[2]的蛋白的活性的化合物是项[5]的化合物；
[13]一种编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量；
[14]一种编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其具有少于70％的AT含量；
[15]项[13]或[14]的DNA，其中该DNA选自下组：
(a)编码包含SEQ ID NOs：2和4以及SEQ ID NOs：6-47中奇数序列鉴定号中任一所示氨基酸序列的蛋白的DNA，
(b)包含SEQ ID NOs：1和3以及SEQ ID NOs：6-47中偶数序列鉴定号中任一所示核苷酸序列的DNA，
(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NOs：1和3以及SEQ ID NOs：6-47中偶数序列鉴定号中任一所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和
(d)编码包含SEQ ID NOs：2和4以及SEQ ID NOs：6-47中奇数序列鉴定号中任一所示氨基酸序列，且在所述氨基酸序列中添加，缺失，取代和/或插入一个或多个氨基酸而得到的蛋白的DNA；
[16]包含核苷酸序列SEQ ID NO：5的DNA；
[17]一种载体，其中插入项[13]-[16]中任一的DNA；
[18]在可表达状态包含项[13]-[16]中任一DNA或者项[17]的载体的转化体；
[19]项[18]的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型真菌；
[20]项[18]的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型酵母；
[21]一种制备由项[13]-[16]中任一DNA编码的蛋白的方法，该方法包括培养项[18]-[20]中的任一转化体，并从该转化体或其培养上清液收集表达的蛋白的步骤；
[22]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将试样与表达项[13]-[16]中任一DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌接触；
(2)分析该真菌的生长，和
(3)选出抑制该真菌生长的被试化合物；
[23]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将试样与表达项[13]-[16]中任一DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，
(2)检测GPI-锚定蛋白转运到真菌细胞壁的量，和
(3)选出使步骤(2)中所检测的GPI-锚定蛋白转运到真菌细胞壁的量减少的试样，
[24]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将项[13]-[16]中任一DNA导入GPI合酶基因-缺陷型真菌，并使该DNA编码的蛋白表达，
(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，
(3)使所得蛋白与试样和具有与该蛋白结合的活性的标记化合物接触，
(4)检测与该蛋白结合的标记化合物，和
(5)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样；和
[25]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将(i)编码具有补偿GWT1-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，其中所述DNA是编码疟原虫GWT1蛋白的DNA的简并突变体，该DNA比天然DNA具有更低的AT含量，或者(ii)插入DNA简并突变体且表达由该简并突变体DNA编码的蛋白的载体，导入GWT1-缺陷型真菌，
(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，
(3)使所得蛋白与试样接触，
(4)检测GlcN-(酰基)PI，和
(5)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的被试化合物。
本发明第一次分离出了编码恶性疟原虫GWT1蛋白的DNA(PfGWT1)。编码PfGWT1蛋白的DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，PfGWT1蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。另外，编码间日疟原虫(Plasmodium vivax)GWT1蛋白(PvGWT1)的DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3，PvGWT1蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。
GWT1蛋白参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)的生物合成，糖基磷脂酰肌醇对疟原虫的生长和感染性是必需的。因此，抑制疟原虫GWT1蛋白活性的化合物可以用作抗疟药物。所述抗疟药物可以利用此疟原虫GWT1蛋白来进行筛选。
本发明提供了编码疟原虫GWT1蛋白的DNA。所述DNA包括编码包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的DNA，和包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA。
本发明还提供了与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白功能等同的蛋白的编码DNA。在此，表述“功能等同”是指具有与目的蛋白的生物特性相同的生物特性，所述目的蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4(PfGWT1或PvGWT1蛋白)。PfGWT1和PvGWT1蛋白的生物特性包括GlcN-PI酰基转移酶活性。GlcN-PI酰基转移酶活性可采用Costello和Orlean(J.Biol.Chem.(1992)267：8599-8603)或Franzot和Doering(Biochem.J.(1999)340：25-32)所报道的方法来进行测定。
与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白功能等同的蛋白的编码DNA包括：在严谨条件中与包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和编码包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的DNA，所述氨基酸中添加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸。
本发明的DNA可以采用本领域技术人员所熟知的方法来进行分离。所述方法的实例包括利用杂交(Southern E.M.，J.Mol.Biol.98：503-517，1975)和聚合酶链式反应(PCR)(Saiki R.K.等，Science 230：1350-1354，1985；SaikiR.K.等，Science 239：487-491，1988)。更具体地，对于本领域技术人员来说，利用SEQ ID NO：1或3的DNA或其部分作为探针，或通过利用与包含SEQID NO：1或3核苷酸序列的DNA特异性杂交的DNA作为引物，从疟原虫中分离出与包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA高度同源的DNA是常规实验。另外，通过杂交或PCR技术分离出的DNA，以及与包含SEQ IDNO：1或3核苷酸序列的DNA杂交的DNA也包括在本发明的DNA之中。所述DNA包括含有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的疟原虫同源物的编码DNA。疟原虫同源物包括恶性疟原虫，间日疟原虫，三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)同源物，其包含SEQID NO：2或4的氨基酸序列。
优选，在严谨杂交条件利用杂交反应分离出上述DNA。如本文所用，表达“严谨杂交条件”是指，例如在65℃于4xSSC中进行杂交，然后在65℃于0.1xSSC中洗涤1小时。可选的严谨条件是在42℃于含50％甲酰胺的4xSSC中进行杂交。或者，在65℃于PerfectHybTM(TOYOBO)溶液中杂交2.5小时，然后如下洗涤(1)在25℃，于含0.05％SDS的2xSSC中洗涤5分钟；(2)在25，于含0.05％SDS的2xSSC中洗涤15分钟；及(3)在50℃，于含0.1％SDS的0.1x SSC中洗涤20分钟。如此分离的DNA有望编码与SEQ ID NO：2或4氨基酸序列在氨基酸水平具有高度同源性的多肽。在此，“高度同源性”是指与完整氨基酸序列有至少70％或更高的序列同一性，优选80％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高。
氨基酸序列水平或核苷酸序列水平的同一性程度可以采用Karlin和Altschul的BLAST算法(Karlin S.和Altschul S.F，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2264-2268，1990；Karlin S.和Altschul S.F，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：5873-5877，1993)来确定。已开发了基于BLAST算法的程序(称为BLASTN和BLASTX)(Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.215：403，1990)。当利用BLASTN对核苷酸序列进行分析时，例如，将参数设为：得分＝1 00，字长＝12。另外，当利用BLASTX对氨基酸序列进行分析时，例如，将参数设为：得分＝50，字长＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。所述分析的具体步骤是已知的(请参见美国国家生物技术信息中心(NationalInstitute of Biotechnology Information)网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本发明的DNA包含基因组DNA、cDNA和化学合成DNA。基因组DNA或cDNA可以根据本领域技术人员所熟知的常规方法来加以制备。例如，基因组DNA可以如下制备：(i)提取疟原虫基因组DNA；(ii)(利用如质粒、噬菌体、粘粒、BAC或PAC作载体)构建基因组文库；(iii)涂布该文库；然后(iv)利用探针进行菌落杂交或噬菌体杂交，所述探针是在编码本发明的疟原虫GWT1蛋白的DNA(例如SEQ ID NO：1或3)的基础上获得的。另外，利用编码本发明疟原虫GWT1蛋白的DNA(例如SEQ ID NO：1或3)的特异性引物，通过PCR制备基因组DNA。另一方面，cDNA可以如下制备：(i)在提取的疟原虫mRNA基础上合成cDNA；(ii)将该合成cDNA插入载体如λZAP中构建cDNA文库；(iii)涂布该cDNA文库；和(iv)如上所述，进行菌落杂交或噬菌体杂交。另外，也可以利用PCR制备eDNA。
本发明还提供了与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白结构相似的蛋白的编码DNA。所述DNA包括那些编码蛋白的核苷酸序列的DNA，所述蛋白包含其中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。对于上述蛋白中的氨基酸突变位点和数量并无限制，只要该突变蛋白仍保留原始蛋白的功能，如Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.&Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science 224，143 1-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413中所述。突变氨基酸的百分数一般为全部氨基酸残基的10％或更少，优选5％或更少，更优选1％或更少。此外，突变氨基酸的数量通常为30个氨基酸或更少，优选15个氨基酸或更少，更优选5个氨基酸或更少，还更优选3个氨基酸或更少，甚至更优选2个氨基酸或更少。
优选的突变氨基酸残基是在其突变(已知为保守氨基酸取代法)后保持侧链性质的氨基酸残基。氨基酸侧链性质的例子是疏水性(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)和亲水性(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)。侧链包括：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；碱性侧链(R，K，H)；和芳香族侧链(H，F，Y，W)。
包含疟原虫GWT1蛋白的融合蛋白是其中添加一个或多个氨基酸残基的蛋白实例。融合蛋白可利用本领域技术人员所熟知的技术来进行制备。例如，对此特定技术没有限制，将编码本发明疟原虫GWT1蛋白的DNA与编码另一肽或蛋白的DNA联合，使它们的阅读框匹配。本发明的蛋白可以与许多已知肽形成融合蛋白。所述肽包括FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)，6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-标签，HSV-标签，E-标签，SV40T抗原片段，lck标签，α-微管蛋白片段，B-标签和蛋白C(Protein C)片段。与本发明蛋白融合的蛋白例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，HA，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶和麦芽糖结合蛋白(MBP)。
除利用上述杂交和PCR技术外，本领域技术人员可通过下述方法制得上述DNA，该方法包括例如定点诱变而在该DNA中引入突变(Kramer W.and Fritz H-J.，Methods Enzymol.154：350，1987)。蛋白的氨基酸序列还可以由于编码该蛋白的核苷酸序列发生突变而使其自然突变。此外，简并突变体DNA，其核苷酸突变并不会引起蛋白中的氨基酸发生突变(简并突变体)也包括在本发明内。另外，本发明还包括由本发明上述DNA编码的蛋白。
本发明提供了包括本发明DNA的载体，包含本发明DNA或载体的转化体，和利用这些转化体制备本发明蛋白的方法。
本发明的载体并无限制，只要它能稳定地保留插入载体内的DNA。例如，当大肠杆菌作宿主时，优选用pBluescript载体(Stratagene)作为克隆载体。当使用载体来制备本发明的蛋白时，表达载体是特别有用的。表达载体并无特别的限制，只要它能在体外，在大肠杆菌中，在培养细胞中和在体内表达蛋白。表达载体的优选例子包括用于体外表达的pBEST载体(Promega Corporation)，用于在大肠杆菌中表达的pET载体(Novagen)，用于在培养细胞中表达的pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)，和用于体内表达的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8：466-472，1988)。可采用常规方法将本发明的DNA插入载体内，例如采用限制性酶位点进行连接酶反应(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.1987，Section 11.4-11.11)。
导入本发明载体的宿主细胞并无特别地限制，并且可以根据发明目的使用各种宿主细胞。例如，用于表达蛋白的细胞包括但不限于：细菌细胞(如链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，大肠杆菌，链霉菌(Streptomyces)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞(如酵母，曲霉(Aspergillus))，昆虫细胞(如果蝇(Drosophila)S2，夜蛾(Spodoptera)SF9)，动物细胞(如CHO，COS，HeLa，C127，3T3，BHK，HEK293，Bowes黑素瘤细胞)，以及植物细胞。将载体转染入宿主细胞可以采用常规方法进行，如磷酸钙沉淀，电穿孔(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.1987，Section 9.1-9.9)，Lipofectamine法(GIBCO-BRL)和显微注射。
通过将合适的分泌信号掺入目的蛋白内，可以将在宿主细胞中表达的蛋白分泌到内质网的腔，细胞周围空腔(cavity)或细胞外环境内。这些信号对于目的蛋白来讲可以是内源的或外源的。
当本发明的蛋白分泌到培养基中时，从该培养基中收集蛋白。如果本发明的蛋白是在细胞内产生的，就将该细胞裂解，然后收集蛋白。
利用本领域熟知的方法可从重组的细胞培养物中对本发明蛋白进行收集和纯化，所述方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和外源凝集素(lectin)层析。
包括本发明DNA的化合物是分离的化合物。在此，术语“分离的”是指从原来的环境中分离出来(例如，如果是自然存在，即为天然环境)。样品中的目的化合物非常丰富，和/或样品中的目的化合物是部分或基本纯化的，则该样品中的化合物是“分离的”化合物。在本文中，术语“基本纯化的”是指化合物从天然环境分离的状态，而且该状态中已除去了至少60％，优选75％，最优选90％的其它共存的天然成分。
本发明提供了抗疟药物，该药物抑制疟原虫GWT1基因产物的活性。抑制疟原虫GWT1基因产物活性的优选化合物是WO 02/04626所述的化合物，和包括化合物(1)至(5)：
化合物(1)：1-(4-丁基苄基)异喹啉
Figure A20071010428700142
化合物(2)：4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇
Figure A20071010428700143
化合物(3)：5-丁基-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚
化合物(4)：2-(4-溴-2-氟苄基)-3-甲氧基吡啶
Figure A20071010428700152
化合物(5)：N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N-甲胺
象这样，抑制疟原虫GWT1基因产物的活性的化合物或其盐或其水合物可以给药于哺乳动物(优选人)。还可以利用常规方法将它配制成片剂，粉剂，微粒剂，颗粒剂，包衣片剂，胶囊，糖浆，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，糊剂，洗剂等，然后给药。
为配制药物，可以使用药物制剂常用的助剂(例如填充剂，粘合剂，滑润剂，着色剂，调味剂，以及需要时的稳定剂，乳化剂，吸收促进剂，表面活性剂，pH调节剂，防腐剂和抗氧化剂)。药物制剂可以用常规方法，通过将通常用作药剂成分的各组分混合来制备。
例如，口服制剂可以如下制备：将本发明的化合物或其药学上可接受的盐与填充剂，必要时还有粘合剂，崩解剂，润滑剂，着色剂，调味剂等组合，并通过常规方法将该混合物配制成粉剂，微粒剂，颗粒剂，片剂，包衣片剂，胶囊等。
这些组分的例子包括：动物脂肪和植物油，如大豆油，牛脂(tallow)，以及合成甘油酯；烃，如液体石蜡，角鲨烯，以及固体石蜡；酯油，如肉豆蔻酸辛基十二醇酯和肉豆蔻酸异丙酯；高级醇，如十六醇十八醇混合物以及二十二醇；硅氧烷树脂；硅油；表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯硬化的蓖麻油，以及聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物；水溶性大分子，如羟乙基纤维素，聚丙烯酸，羧基乙烯基聚合物，聚乙二醇，聚乙烯基吡咯烷酮，以及甲基纤维素；低级醇，如乙醇和异丙醇；多元醇，如甘油，丙二醇，二丙二醇，以及山梨醇；糖，如葡萄糖和蔗糖；无机粉末，如硅酸酐，硅酸铝镁，以及硅酸铝；和纯水。填充剂的实例子包括乳糖，玉米淀粉，精制白糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，结晶纤维素，以及二氧化硅。粘合剂的例子包括聚乙烯醇，聚乙烯醚，甲基纤维素，乙基纤维素，阿拉伯树胶，黄芪胶，明胶，虫胶，羟丙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙二醇聚氧乙烯嵌段聚合物，甲葡胺(meglumine)等。崩解剂的例子包括淀粉，琼脂，粉状明胶，结晶纤维素，碳酸钙，碳酸氢钠，柠檬酸钙，糊精，果胶，以及羧甲基纤维素钙。润滑剂是硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，二氧化硅，硬化的植物油等。着色剂的例子为那些允许加入药物中的着色剂。调味剂是可可粉，l-薄荷醇，芳香分散剂，薄荷油，冰片，肉桂粉等。对于这些片剂和颗粒剂当然可以使用糖衣，必要时还可以使用其它适宜的包衣。
此外，液体制剂如糖浆和注射剂可以采用常规方法来制备。在该方法中，通过将pH调节剂，增溶剂，等渗剂等，以及必要时的增溶助剂，稳定剂等，加至本发明的化合物或其药学上可接受的盐中，来制备。
制备外用制剂的方法没有限制，而且可以通过常规方法来制备。也就是说，用于制剂的基础材料可以选自药物、准药物(quasi-drug)、化妆品等常用的各种材料。具体地，可使用的基础材料是，如动物脂肪和植物油，矿物油，酯油，蜡，高级醇，脂肪酸，硅油，表面活性剂，磷脂，醇，多元醇，水溶性大分子，粘土矿和纯化水。必要时，可以添加pH调节剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂和抗真菌剂，着色物质，香料等。但是本发明的外用制剂的基础材料并不限于此。再者，如果需要，还可以混入具有分化诱导作用的组分，血流促进剂，杀真菌剂，消炎剂，细胞活化剂，维生素，氨基酸，保湿剂，以及角质裂解剂。上述基础材料按外用制剂常用浓度的量加入。
如本发明所述，术语“盐”优选包括，如与无机或有机酸的盐，与无机或有机碱的盐，或与酸性或碱性氨基酸的盐。尤其优选是药学上可接受的盐。酸和碱以0.1-5个酸或碱分子与1个化合物分子的适当比形成盐。
与无机酸的盐的优选例子是与盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸和磷酸的盐。与有机酸的盐优选包括与醋酸，琥珀酸，延胡索酸，马来酸，酒石酸，柠檬酸，乳酸，硬脂酸，苯甲酸，甲磺酸，对甲苯磺酸的盐。
与无机碱的盐的优选例子是碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如钙盐和镁盐；铝盐，和铵盐。与有机碱的盐优选包括与二乙胺，二乙醇胺，甲葡胺和N，N’-二苄基乙二胺的盐。
与酸性氨基酸的盐的优选例子是与天冬氨酸和谷氨酸的盐，与碱性氨基酸的盐优选包括与精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸的盐。
施用本发明的化合物或其盐或其水合物时，对其形式没有特别的限制，它们可以根据常规方法经口或经非胃肠道途径给药。它们可以配制成如片剂，粉剂，微粒剂，胶囊，糖浆，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，糊剂和洗剂剂型。本发明的药物组合物的剂量可以根据症状程度，患者年龄，性别和体重，剂型，盐的类型，疾病的具体类型等适当地选择。
将治疗有效量的本发明的化合物给药于患者。在此，“治疗有效量”是指产生所需药理效果并且有效地恢复或或缓解所要治疗的患者之症状的药剂量。所述剂量根据疾病的类型，症状的程度，患者的体重、年龄、性别、对制剂的敏感性而显著地不同。但通常，成人的日剂量为约0.03mg-1000mg，优选0.1mg-500mg，更优选0.1mg-100mg，并且每日给药一次或几次，或者每若干天给药一次或几次。注射剂量一般为约1-3000μg/kg，优选约3-1000μg/kg。
此外，本发明涉及利用疟原虫GWT1基因产物筛选抗疟药物的方法。所述筛选方法包括但不限于：[1]结合试验，该试验筛选与标记化合物竞争结合疟原虫GWT1基因产物的化合物；[2]GlcN-PI酰基转移酶分析系统，该系统筛选能抑制疟原虫GWT1基因产物的GlcN-PI酰基转移酶活性的化合物；和[3]GPI-锚定蛋白检测系统，其中在细胞，优选真菌细胞中表达疟原虫GWT1基因产物，然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白。本发明并不限于这些方法，而且包括利用疟原虫GWT1基因产物筛选抗疟药物的任何方法。上面列出的方法[1]-[3]在下面进行详细描述。
[1]筛选与标记化合物竞争结合疟原虫GWT1基因产物的化合物的结合试验
本发明的两种方法公开如下，即(1)制备疟原虫GWT1基因产物(下文中称为疟原虫GWT1蛋白)的方法和(2)涉及标记化合物的结合实验法(下文中称为结合试验)
(1)制备疟原虫GWT1蛋白的方法
疟原虫GWT1蛋白是从细胞膜级分，优选从真菌细胞，更优选从酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞中制得的，其中引入了SEQ ID NO：2的疟原虫GWT1蛋白的编码DNA。优选将所述DNA导入GWT1基因-缺陷型细胞中。在结合试验中，可以在未进行任何其它处理的条件下使用所制的膜级分，或者在使用前对膜级分进行进一步的纯化。利用酿酒酵母的方法将在下面进行详细描述。
(a)疟原虫GWT1基因的导入
本发明使用的疟原虫GWT1基因可以是天然存在的基因，或优选是基于SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列进行合成的。疟原虫GWT1基因富含腺嘌呤和胸腺嘧啶。因此，可以推断利用常规的基因重组技术将很难对该基因进行操作，且该基因在酵母，细胞等中的表达效率将会很低(inefficient)。因此，优选对核苷酸序列进行设计，将其中与每个相应氨基酸对应的密码子替换为那些认为可以在酵母，细胞等中能有效表达的密码子，在该设计序列的基础上进行DNA合成，制备人工的疟原虫GWT1基因，然后在下述实验中使用该基因。
疟原虫GWT1的表达质粒是通过将疟原虫GWT1基因插入到酿酒酵母表达载体内来加以制备的，例如，通过将适合的启动子和终止子，如pKT10-衍生的GAPDH启动子和GAPDH终止子，插到YEp352的多克隆位点内来制备表达载体(Tanaka等，Mol.Cell Biol.，10：4303-4313，1990)。将酿酒酵母(如G2-10菌株)培养在合适的培养基(如YPD培养基(酵母提取物-聚蛋白胨-葡萄糖培养基))中，并在适宜的温度(如30℃)振荡，在对数生长晚期收获细胞。洗涤后，采用如乙酸锂法将GWT1-表达质粒导入酿酒酵母细胞中。该方法描述于User Manual of YEAST MAKERTM Yeast Transformation System(BD Biosciences Clontech)。疟原虫GWT1-过表达菌株和携带阴性对照载体的菌株可通过将转化细胞于30℃，在SD(ura-)培养基上培养两天而获得。
适合除酿酒酵母之外的真菌种类的表达载体和基因转移法见下述报道：适合粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe，S.pombe)的表达载体如pcL和其转移法由Igarashi等描述(Nature 353：80-83，1991)，适合白色念珠菌(C.Albicans)的表达载体如pRM10和其转移法由Pla J.等描述(Yeast，12：1677-1702，1996)；适合烟曲霉(A.Fumigatus)的表达载体如pAN7-1和其转移法由Punt P.J.等描述(GENE，56：117-124，1987)；适合新生隐球菌(C.Neoformans)的表达载体如pPM8及其转化法由Monden P.等描述(FEMSMicrobiol.Lett.，187：41-45，2000)。
(b)制备膜级分的方法
在适合的培养基(如SD(ura-)液体培养基)中培养，并在适合的温度(如30℃)振荡导入了疟原虫GWT1基因的酿酒酵母细胞。在对数生长中期时收获真菌细胞，然后用合适量(如真菌细胞的3倍体积)的匀浆缓冲液(如50mMTris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA，CompleteTM(Roche))悬浮。将合适量的玻璃珠(如真菌细胞的4倍体积)加至悬浮液中。涡旋混合物，并置于冰上。重复此操作数次将真菌细胞破碎。
将1毫升的匀浆缓冲液加入所得的裂解液中。离心混合物；如2,500rpm离心5分钟，使玻璃珠和未碎的真菌细胞沉淀。将上清液移到另一试管内。离心该试管，如13,500rpm离心10分钟，使含有细胞器的膜级分(总膜级分)沉淀。用1ml结合缓冲液(如0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.0，0.05％Tween 20，CompleteTM(Roche))悬浮沉淀物，然后离心，如2,500rpm离心1分钟，除去未悬浮的物质。然后离心上清液，如15,000rpm离心5分钟。沉淀物用150-650μl的结合缓冲液重悬浮来制备膜级分。
采用适合粟酒裂殖酵母的Yoko-o等的方法(Eur.J.Biochem.257：630-637，1998)；适合白色念珠菌的Sentandreu M等的方法(J.Bacteriol.，180：282-289，1998)；适合烟曲霉的Mouyna I等的方法(J.Biol.Chem.，275：14882-14889，2000)；和适合新生隐球菌的Thompson JR等的方法(J.Bacteriol.，181：444-453，1999)可以从除酿酒酵母之外的真菌物种中制备膜级分。
另外，可以通过在大肠杆菌，昆虫和哺乳动物细胞或其他非真菌细胞中表达来制备疟原虫GWT1蛋白。
当使用哺乳动物细胞时，将疟原虫GWT1基因与含有如CMV启动子的过表达载体连接，导入哺乳动物细胞中。然后，按照Petaja-Repo等的方法(J.Biol.Chem.，276：4416-23，2001)制备膜级分。
表达疟原虫GWT1基因的昆虫细胞(如Sf9细胞)可以利用，例如杆状病毒表达试剂盒如BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(Invitrogen)来进行制备。然后，按照Okamoto等的方法(J.Biol.Chem.，276：742-751，2001)制备膜级分。
可通过下述步骤从大肠杆菌制备疟原虫GWT1蛋白：例如将疟原虫GWT1基因与大肠杆菌表达载体如pGEX载体(Amersham Biosciences Corp.)连接，将此构建体导入大肠杆菌如BL21中。
(2)结合分析法
(a)标记化合物的合成
标记化合物从已证实结合GWT1蛋白的化合物制备。与GWT1蛋白结合的任何化合物都是可以使用的。标记化合物优选从WO 02/04626中所述的化合物制备，更优选从上述(1)至(5)的化合物制备。
任何标记方法都是可以使用的。化合物优选是用放射性同位素，更优选用3H标记的化合物。采用放射性化合物作为起始物质，用常规制备方法制得放射性标记的化合物。另外，3H标记可以通过3H交换反应获得。
(b)特异性结合的确定
将标记化合物加至制得的膜级分中，将该混合物置于冰上适当长的时间，如1至2小时，直到标记化合物和膜级分间发生结合反应。离心混合物，使膜级分沉淀，如15,000rpm离心3分钟。沉淀物用结合缓冲液重悬浮，离心悬浮液。适当地重复(两次)，除去未结合的标记化合物。再用结合缓冲液悬浮沉淀物。将所得的悬浮液移至闪烁小管，加入闪烁剂。利用液体闪烁计数器测定放射性。
确认标记化合物与GWT1蛋白的特异性结合可以通过下述评估来进行：是否标记化合物的结合会被加入的严重过量未标记化合物(10倍或更多)所抑制，以及该化合物是否是可忽略地与由不表达GWT1蛋白的真菌细胞制得的膜级分结合。
(c)由试样引起的标记化合物的结合抑制
将试样和标记化合物加至制得的膜级分中，将该混合物置于冰上适当长的时间，如1至2小时，期间与膜级分发生结合反应。在本发明的筛选方法中使用的待测化合物包括：简单的天然存在化合物，有机化合物，无机化合物，蛋白或肽，以及化合物文库，基因文库的表达产物，细胞提取物，细胞培养物上清液，来自发酵细菌的产物，海洋生物体提取物，植物提取物和类似物。
将混合物离心，例如15,000rpm离心3分钟，使膜级分沉淀。在结合缓冲液中重悬浮沉淀物，离心该悬浮液。适当地重复此步骤(两次)，从而除去所有未结合的标记化合物。用结合缓冲液悬浮沉淀物。将悬浮液移至闪烁小管，加入闪烁剂。利用液体闪烁计数器测定放射性。
当在试样存在的条件下，标记化合物与膜级分的结合被抑制，就判定该试样具有结合疟原虫GWT1蛋白的活性。
[2]用于筛选抑制疟原虫GWT1蛋白GlcN-PI酰基转移酶活性的化合物的GlcN-PI酰基转移酶分析系统
酰基到GPI的转移可以利用下述方法来进行检测：Costello L.C和OrleanP.，J.Biol.Chem.(1992)267：8599-8603；或Franzot S.P和Doering T.L.，Biochem.J.(1999)340：25-32。该方法的具体实例在下面进行了描述。下述实验条件优选是对所用的各种疟原虫GWT1蛋白进行了优化的。
根据上述部分1所述的方法制备疟原虫GWT1蛋白。将包含疟原虫GWT1蛋白的膜级分加至缓冲液中，所述缓冲液含有合适的金属离子(Mg2+，Mn2+)，ATP，辅酶A，优选含有防止在其它反应中消耗UDP-GlcNAc的抑制剂，如作为几丁质合成抑制剂的尼可霉素(nikkomycin)Z，或作为天冬酰胺-连接的糖基化抑制剂的衣霉素(tunicamycin)。然后，将试样加到该混合物中，将所得的混合物在合适的温度下孵育适当长的时间(如24℃孵育15分钟)。
将已适当标记的，优选放射性标记的GlcN-(酰基)PI前体(如UDP-GlcNAc，Acyl-辅酶A，优选UDP-[14C]GlcNAc)加到混合物中。将所得的混合物孵育适当长的时间(如24℃孵育1小时)。加入氯仿和甲醇(1∶2)的混合物，搅拌所得混合物以使反应停止，提取脂质。将提取的反应产物溶解在合适的溶剂中，优选丁醇。然后，利用如HPLC或薄层层析(TLC)，优选TLC法分离反应产生的GlcN-(酰基)PI。当使用TLC时，展开剂(developing solvent)可以适当地选自，如CHCl3/CH3OH/H2O(65∶25∶4)，CHCl3/CH3OH/1M NH4OH(10∶10∶3)和CHCl3/吡啶/HCOOH(35∶30∶7)。优选的展开剂是CHCl3/CH3OH/H2O(65∶25∶4)。采用对所用标记而言恰当的方法，对分离的GlcN-(酰基)PI进行定量。当用放射性同位素作标记时，可以基于其放射性对分离的GlcN-(酰基)PI进行定量。
当在试样存在的条件下，制得的GlcN-(酰基)PI量减少时，就判定该试样具有抑制由疟原虫GWT1蛋白引起的酰基转移的活性。
[3]包括在细胞中表达疟原虫GWT1蛋白然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白的GPI-锚定蛋白检测系统
试样抑制疟原虫GWT1蛋白活性的能力可以利用GPI-锚定蛋白检测系统来进行测定，该系统包括在细胞，优选真菌细胞中表达GWT1蛋白，然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白。本发明的真菌是指属于接合菌门(Zygomycota)，子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)及半知菌纲(Deuteromycete)的真菌，且优选的真菌是致病性真菌，毛霉属(Mucor)，酵母属(Saccharomyces)，念珠菌属(Candida)，隐球菌属(Cryptococcus)，丝孢酵母属(Trichosporon)，鳞斑霉属(Malassezia)，曲霉属(Aspergillus)，发癣菌属(Trichophyton)，小孢子菌属(Microsporum)，孢子丝菌属(Sporothrix)，芽生酵母属(Blastmyces)，球孢子菌属(Coccidioides)，副球孢子菌属(Paracoccidioides)，青霉属(Penicillinium)和镰孢属(Fusarium)，更优选的真菌为白色念珠菌，光滑念珠菌(C.glabrata)，新生隐球菌和烟曲霉，甚至更优选的真菌是酵母。所述酵母包括酿酒酵母和粟酒裂殖酵母。用于将包含编码疟原虫GWT1蛋白的插入DNA的表达载体导入上述真菌细胞的方法是本领域技术人员所熟知的。
当疟原虫GWT1蛋白在真菌细胞中表达时，转运到真菌细胞壁的GPI-锚定蛋白量可通过下述方法测定：(1)利用报告酶的方法；(2)利用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法；(3)利用该蛋白粘附动物细胞的能力；或者(4)在光学显微镜或电子显微镜下观察真菌细胞的方法。
(1)-(4)的方法已在WO 02/04626中公开，所述方法在该发明的实施例中进行了详细描述。利用(1)-(4)的方法，并且优选(1)-(4)的方法的组合可以判断试样是否抑制GPI-锚定蛋白到细胞壁上的转运过程或者GPI-锚定蛋白在真菌细胞表面的表达。
在下文中，将描述方法(1)-(4)。
(1)  利用报告酶进行的方法
GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程可通过示踪实验定量：如用放射性同位素标记GPI-锚定蛋白，获得真菌细胞壁级分，并用抗GPI-锚定蛋白的抗体进行免疫沉淀反应。也可以用另一种方法更简便地定量：在各种GPI-锚定蛋白中常见的、被认为起转运信号作用的C-末端序列可与便于测量的酶(报告酶)表达为融合蛋白，获得真菌细胞壁级分；然后采用报告系统测量每一级分的酶活性(Van Berkel MAA等，FEBSLetters，349：135-138，1994)。在下文中，将要会对一种采用报告酶进行的方法进行描述，但是本发明并不仅限于此。
首先，构建报告基因并将其引入真菌中。报告基因是这样构建的：使在真菌中起作用的启动子序列，以与阅读框匹配的方式连接分别编码信号序列、报告酶和GPI-锚定蛋白C-末端序列的DNA。启动予序列的实例包括GAL10及ENO1。信号序列的实例包括如α-因子，转化酶，溶菌酶。报告酶的实例是β-内酰胺酶，溶菌酶，碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。可以使用易于检出的绿色萤光蛋白(GFP)，即便它不具有酶活性。GPI-锚定蛋白C-末端序列包括α-凝集素(agglutinin)C-末端序列，CWP2 C-末端序列等。此外，优选将适宜的选择标记物如LEU2和URA3插到包含所构建的报告基因的载体中。
将所构建的报告基因通过适宜的方法插到真菌中，如乙酸锂法(Gietz D等，Nucl.Acids Res.20：1425，1992)。并且在需要时，利用适于选择标记物的方法(如适于LEU2的Leu-培养基，以及适于URA3的Ura-培养基)培养真菌，然后挑选其中引入了DNA的真菌。
通过下列方法测定试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程的影响：
在试样存在时，于适宜的条件下(如30℃48小时)培养引入了报告基因的真菌。培养之后，离心培养物上清液，并测量培养物上清液级分的报告酶活性。洗涤所得细胞级分，然后通过适当的方法分离细胞壁成分，例如用葡聚糖酶降解细胞壁葡聚糖，然后测量细胞壁级分和细胞质级分的报告酶活性。该试验可以如下简单地进行：离心确定细胞级分中报告酶的量，然后在不洗涤细胞的情况下按比例计算来源于培养物上清液级分但残留在细胞级分中的报告酶的量，从细胞级分的报告酶的量中减去此量。
如果试样显示出增加培养物上清液级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，或者降低细胞壁级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，那么就可以判定该试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程有影响。
(2)  采用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法
对于试样影响GPI-锚定蛋白在真菌表面层的表达的能力，可以通过利用与真菌细胞壁中的GPI-锚定蛋白反应的抗体进行定量来测定。
抗体可以如下制备：例如，可以由GPI-锚定蛋白的氨基酸序列预测抗原决定簇，所述GPI-锚定蛋白如α-凝集素，Cwp2p，或Als1p(Chen MH等，J.Biol.Chem.，270：26168-26177，1995；Van Der Vaat JM等，J.Bacteriol.，177：3104-3110，1995；Hoyer LL等，Mol.Microbiol.，15：39-54，1995)，合成该区的肽，将其与抗原性物质如载体蛋白结合，然后通过免疫兔子等得到多克隆抗体，或者通过免疫小鼠等得到单克隆抗体。优选是针对Als1p肽的兔多克隆抗体。
在可供选择的方法中，可以通过用真菌，优选过量表达GPI-锚定蛋白，如α-凝集素，Cwp2p及Als1p的真菌免疫小鼠等获得抗GPI-锚定蛋白的单克隆抗体，(在某些情况下，可以进一步用部分纯化的GPI-锚定蛋白进行免疫)，并利用ELISA，Western印迹分析等以此制备抗体为基础选出产生的克隆。
通过下述方法可以检测试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程的影响，以及试样对来源于细胞壁中GPI-锚定蛋白的蛋白量的影响。
在试样存在时，于适宜的条件下如30℃48小时培养真菌。通过离心收集所培养的真菌并将细胞破碎，优选采用玻璃珠。优选用SDS离心提取洗涤过的破碎细胞，然后洗涤沉淀物。提取之后，用降解葡聚糖的酶，优选葡聚糖酶处理破碎的细胞，其经离心处理的上清液即为GPI-锚定蛋白样品。
将抗-Als1p肽的抗体经4℃过夜温育包被在96-孔板上。用洗涤溶液，优选含0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤板之后，用封闭96-孔板非特异性吸附位点的试剂，优选蛋白如BSA或明胶蛋白，更优选BlockAce(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)进行封闭。用洗涤溶液，优选PBST，再次洗涤之后，加入适当稀释的GPI-锚定蛋白样品。在室温进行适当长时间如2小时的反应。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，使针对酶标记的白色念珠菌的抗体，优选HRP-标记的抗-念珠菌抗体，在室温反应适当长的时间如2小时。标记方法可以是酶标记法或放射性同位素标记法。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，通过适于标记类型即酶标记的方法计算GPI-锚定蛋白样品中Als1p的量，加入底物溶液，然后在终止反应时测量在490nm处的吸光度。
(3)  利用粘附动物细胞的能力进行的方法
试样对GPI-锚定蛋白在真菌表面的表达的影响可以通过测量真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白的活性，优选通过测量真菌对动物细胞等的粘附能力来进行测定。除了Als1p，Hwp1p等参与粘附动物细胞的活性之外，GPI-锚定蛋白活性还包括α-凝集素参与交配的活性，Flo1p参与酵母聚集的活性等。在下文中，将详细描述利用真菌对动物细胞的粘附活性进行的方法，但是本发明并不仅限于此。
使用对细胞具有粘附能力的真菌，优选的真菌为白色念珠菌。对于哺乳动物细胞采用粘附真菌的细胞，优选小肠上皮细胞。培养哺乳动物细胞并通过适当的方法，如乙醇固定法将其固定。将试样和真菌培养适当长的时间，如30℃温育48小时，然后接种并培养一定长的时间，如在30℃温育1小时。移出培养物上清液，用缓冲液洗涤，加样至琼脂培养基，如Sabouraud Dextrose Agar培养基(Becton Dickinson Company，Ltd.)。30℃过夜培养后，计数菌落的数目，并计算粘附率。
如果与未经该化合物处理的真菌相比，观察到试样具有使细胞粘附而形成的菌落数目降低的活性，则可以判定该试样已经影响了GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程。
(4)  利用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法
可以通过用电子显微镜观察真菌细胞壁的结构来确定试样对GPI-锚定蛋白在真菌表面的表达的影响。
在试样存在的条件下，将真菌如白色念珠菌培养一定长的时间，如30℃培养48小时，用透射电子显微镜观察其超微形态结构。在此，利用透射电子显微镜进行的观察可以通过例如根据Electron Microscope Chart Manual(Medical Publishing Center)的方法来进行。真菌细胞最外层的絮状纤维结构具有高电子密度，并且可通过透射电子显微镜观察到。此结构不受其它现有抗真菌剂的影响，并认为是包括GPI-锚定蛋白作为其构成成分的表面糖蛋白层。与未经处理的细胞相比，当此结构消失，只留下具有高电子密度的微层时，可以判定所述试样已经影响了GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程。
当在透射电子显微镜以及光学显微镜下的观察都显示真菌细胞大量溶胀且出芽(分裂)受到抑制时，可以判定试样对细胞壁有影响。
本发明还提供了治疗疟疾的方法，该方法包括施用抑制疟原虫GWT1蛋白的活性的化合物的步骤。所述化合物包括WO 02/04626中所述化合物(如本文(1)-(5)中所述化合物)。
天然PfGWT1蛋白的核苷酸序列的特点是具有非常高的AT含量(80.41％)，因此其密码子使用是有偏好的(biased)。此外，所述基因包含在23个分离位置含六个或更多个连续A残基的序列段，且这些序列段作为假(pseudo)-poly(A)位点来制备截短的蛋白。由于如上所述的特性，该基因只能少量地在酵母中表达，而且很难利用PCR进行扩增或者在大肠杆菌中进行复制。也很难确定其核苷酸序列。然而，利用该DNA的简并突变体(SEQID NO：5)，其AT含量低于编码PfGWT1蛋白的DNA，本发明人成功地使PfGWT1蛋白高效表达。本发明人还揭示简并突变体DNA的引入能拯救GWT1-缺陷型酵母的表型。此项发现说明疟原虫的GPI合酶与真菌如酵母的GPI合酶是可以互换的。
编码疟原虫GPI合酶的基因的AT含量例如对于恶性疟原虫的GPI8为79.35％，对于恶性疟原虫的GPI13为77.89％。其AT含量与PfGWT1的AT含量一样高。由于恶性疟原虫基因组翻译区内的平均AT含量为76.3％，可以推断大多数恶性疟原虫基因几乎不能在其它物种中表达。本发明人成功地使比编码PfGWT1蛋白的DNA具有更低AT含量的DNA简并突变体在酵母中表达。因此，通过利用该简并DNA突变体，可以在疟原虫之外的宿主中表达疟原虫GPI合酶。此外，GPI-缺陷型酵母和GWT1-缺陷型酵母已知表现出相似的表型，包括致死性等特性。这样，可以采用上述简并突变体DNA拯救GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型。
已导入了上述简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型由疟原虫GPI合酶的活性来决定。相应地，可以利用GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型作为指标，经筛选选出抑制疟原虫GPI合酶活性的化合物。这样，事实上并不需要利用疟原虫就能选出靶向GPI生物合成路径的的抗疟药物。
本发明提供了编码具有拯救GPI合酶基因-缺陷型真菌表型的活性的蛋白的简并突变体DNA，其比编码参与GPI生物合成的天然DNA具有更低的AT含量。所述DNA可以在本发明的筛选方法中使用。
如本文所用，术语“AT含量”是指GPI合酶基因编码区完整核苷酸序列中的腺嘌呤和胸腺嘧啶含量。本发明简并突变体DNA中的AT含量范围优选从50％到70％，更优选从53％到65％，更加优选从55％到62％。
GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型包括温度敏感性(优选高温敏感性)和致死性。
在疟原虫中参与GPI生物合成的本发明蛋白包括GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013 W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1，DPM1，GPI2，GPI15，YDR437W，GPI12，MCD4，GPI11，GPI7，GPI17，GPI16，CDC91，DPM2，DPM3和SL15。上述蛋白中，已知GPI1和GPI8存在于疟原虫中，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1也认为存在于疟原虫中(Delorenzi等，Infect.Immun.70：4510-4522，2002)。恶性疟原虫GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NOs：6-21中的偶数序列鉴定号中。各相应氨基酸序列示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NOs：6-21中的奇数序列鉴定编号中。此外，间日疟原虫GWT1的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3，相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。采用本领域技术人员熟知的方法，如采用杂交或PCR，利用包含SEQ ID NO：1和3，以及偶数号的SEQ ID NOs：6-21中任一核苷酸序列的DNA，可以对其它疟原虫的GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1或DPM1进行克隆。
另外，利用酵母或人GPI合酶基因可以对疟原虫的除GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1之外的GPI合酶基因进行克隆。酵母(酿酒酵母)GPI2，GPI15，YDR437W，GPI12，MCD4，GPI11，GPI7，GPI17，GPI16和CDC91的核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs：22-41中的偶数序列鉴定号中；各相应氨基酸序列示于SEQ ID NOs：22-41中的奇数序列鉴定号中。此外，人DPM2，DPM3和SL1 5的核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs：42-47中的偶数序列鉴定号中；各相应氨基酸序列示于SEQ ID NOs：42-47中的奇数序列鉴定号中。
编码参与疟原虫GPI生物合成的蛋白的简并突变体DNA的制备由两步组成：设计和合成，所述简并突变体DNA的AT含量比天然DNA低。在设计步骤中，首先对目的蛋白的氨基酸序列进行反向翻译，然后列出各氨基酸残基的可能密码子。反向翻译可以利用商购基因分析软件(例如DNASIS-Pro；Hitachi Software Engineering Co.，Ltd)来实现。在列出的密码子中，为各个氨基酸选出符合目的的密码子(例如，AT含量较低的密码子和在用于基因表达的宿主中使用的常规密码子)。简并突变体DNA可以通过利用这些选出的密码子重排目的蛋白的氨基酸序列来对其进行设计。
如此设计的DNA可以通过本领域技术人员所熟知的方法来进行合成。本发明的简并突变体DNA可以基于设计的核苷酸序列，通过如利用商购DNA合成仪来进行合成。
本发明还提供了插入了上述简并突变体DNA的载体，以及在可表达状态包含该DNA或该载体的转化体(优选GPI合酶基因-缺陷型真菌)。载体和宿主可以是前面所述的载体和宿主。
如本文所用，表达“GPI合酶基因缺陷”是指该基因的功能产物未表达或表达水平减少。本发明的GPI合酶基因-缺陷型真菌可通过破坏GPI基因来加以制备。破坏可以通过在同源重组技术等的基础上嵌入与该基因无关的DNA如选择标记来实现。更具体的说，所述突变型真菌可通过将选择标记盒导入酵母，该选择标记盒含有利用引物扩增的粟酒裂殖酵母his5基因或卡那霉素抗性基因(Longtine等，Yeast，14：953-961，1998)，其均含有与部分该基因(50-70个核苷酸)同源的核苷酸序列。
本发明的GPI合酶基因-缺陷型真菌包括，如GWT1温度敏感突变株gwt1-20，GPI7破坏菌株，GPI8突变株gpi8-1，以及GPI10温度敏感突变株per13-1。
转化了本发明简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌可以通过将插入了该简并突变体DNA的载体导入真菌中来进行制备。pRS316，YEp351等可用作酿酒酵母的载体，pcL，pALSK等可用作粟酒裂殖酵母的载体。
本发明还提供了筛选抗疟药物的方法，该方法包括利用上述GPI合酶基因-缺陷型真菌。
在该方法中，第一步包括将试样与GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，其中所述真菌转化了比参与疟原虫GPI生物合成的蛋白的编码DNA具有更低AT含量的简并突变体DNA。所述“接触”可通过将试样加到上述真菌培养物中来实现。当试样是蛋白时，可以将包含该蛋白的编码DNA的载体导入上述真菌中。
在本发明的方法中，下一步包括测量上述真菌的生长程度。更具体地说，在常规培养条件下接种真菌，具体地，将真菌接种至液体培养基，如酵母提取物聚蛋白胨葡萄糖培养基(YPD培养基)或琼脂平板上，然后在25-37℃温育4-72小时。这样，就可以对已转化本发明简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌进行生长评估。生长程度还可以以培养基液体的混浊度，菌落数量，或者琼脂平板上形成的斑点大小或颜色作为指标来进行测定。在本发明的方法中，下一步包括选出抑制上述真菌生长的化合物。
在另一可选的方法中，第一步包括将试样与GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，其中该真菌已导入了上述简并突变体DNA。下一步包括测定转运到酵母细胞壁上的GPI-锚定蛋白量。该检测方法包括(1)利用报告酶的方法；(2)利用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法；(3)利用粘附动物细胞的能力的方法；和(4)利用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法。在本发明的方法中，下一步包括选出降低转运到细胞壁的GPI-锚定蛋白量的样品。
本发明提供了利用参与GPI生物合成的蛋白筛选抗疟药物的方法，该蛋白是利用本发明的简并突变体DNA制得的。所述方法包括例如结合分析系统，在该系统中进行筛选是为了选出结合参与GPI生物合成的蛋白的化合物，该化合物与结合所述蛋白的标记化合物竞争。具体地说，将本发明的简并突变体DNA导入GPI合酶基因-缺陷型真菌中，在该真菌中表达该DNA编码的蛋白，获得所表达的蛋白。然后，将制得的蛋白与试样和能结合该蛋白的标记化合物接触。在下一步中，检测结合该蛋白的标记化合物，选出降低结合该蛋白的标记化合物量的试样。
本发明还提供了GlcN-PI酰基转移酶分析系统。该系统包括使用GWT1蛋白，该蛋白是利用编码具有补偿GWT1-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA制得的，其中所述DNA是编码疟原虫GWT1蛋白的DNA简并突变体，它比天然DNA具有更低的AT含量。具体地，将简并突变体DNA导入GWT1-缺陷型真菌，在该真菌中表达该简并突变体DNA编码的蛋白，获得所表达的蛋白。然后，将此蛋白与试样接触，检测GlcN-(酰基)PI，选出降低GlcN-(酰基)PI量的试样。
本文引用的所有专利，专利申请和公开物其全部引入以供参考。
附图的简单说明
图1显示四分体分析结果的照片。在导入了opfGWT1-过表达质粒后，gwt1遭破坏的菌株存活。将衍生自单个双倍体细胞的四个孢子垂直点样。
如果一个拷贝的GWT1基因被破坏，则仅有一半的孢子生长。在这种情况下，[菌落-形成的斑点]∶[未显示生长的斑点]的比率为2∶2。在用箭头标记的纵列中，gwt1破坏体(disruptant)的致死表型由于导入了opfGWT1而得到补偿，因此4个斑点全部生长，均形成菌落。
图2的图表显示化合物对于表达opfGWT1基因的酵母生长的抑制活性。在GWT1基因遭破坏的酵母中表达酵母GWT1基因或opfGWT1基因。
具有抑制酵母GWT1-依赖性生长活性的化合物也显示了对于酵母的opfGWT1-依赖性生长的抑制活性，其中opfGWT1在该酵母中表达。
图3是显示抗疟活性的图表。用恶性疟原虫感染人红细胞。将GWT1-抑制性化合物加至这些红细胞中，并确定对疟原虫感染的抑制。
表现抗真菌活性的5种化合物均抑制了红细胞的疟原虫感染。
实施本发明的最佳方式
下面，将利用实施例详细地描述本发明，但是本发明并不限于此。
[实施例1]恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)
(1)恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)已公开于恶性疟原虫基因组数据库(PlasmoDB database， http://plasmodb.org/)中。用纯化自恶性疟原虫(3D7菌株)的基因组DNA作为模板，通过PCR克隆PfGWT1基因。将PfGWT1基因的5和3’两部分分别制备，并在XbaI(TCTAGA)限制酶位点对两部分进行组装。这样，就制得全长PfGWT1基因。另外，在编码区外的限制酶位点也包含在其中，从而可以插入到表达载体内。
(2)用恶性疟原虫基因组DNA作为模板，以及引物pf152F(SEQ ID NO：48)和pf136R(SEQ ID NO：49)，通过PCR扩增PfGWT1基因的5’部分。用pf137F(SEQ ID NO：50)和pf151R(SEQ ID NO：51)作为引物，通过上述相同的方法，扩增PfGWT1基因的3’部分。将扩增出的DNA片断亚克隆到pT7-Blue载体(Novagen)中，对插入子的核苷酸序列进行测序，以确定其与SEQ ID NO：1的同源性。含有PfGWT1基因5’部分的克隆命名为PF15-5克隆。含有PfGWT1基因3’部分的克隆命名为PF20-9克隆。
(3)利用PCR将限制酶的切割位点添加到编码区的外侧，从而可以使PfGWT1基因插到表达载体内。用PF15-5作为模板，以及引物pf154FE(SEQID NO：52)和pf157R(SEQ ID NO：53)，通过PCR将EcoRI切割位点加至5’部分。将扩增的DNA片断亚克隆到pT7-Blue载体(Novagen)中，制得pT7-plasmN2克隆。同样地，用PF20-9作为模板，以及引物pf168BK(SEQID NO：54)和pf155RK(SEQ ID NO：55)，通过PCR扩增3’部分。对扩增的DNA片断进行亚克隆，制得pT7-plasmBK5克隆。
(4)用下述方法制备全长PfGWT1基因。用限制性内切酶EcoRI和KpnI消化酵母表达载体YEp352GAPII。将来源于pT7-plasmN2的EcoRI-XbaI片断(约1500bp)，和来源于pT7-plasmBK5的XbaI-KpnI片断(约1100bp)插入载体的切割位点。这样，就构建成了包含全长PfGWT1的表达载体YEp352GAPII-PfGWT1。
[pf152F]ATGACAATGTGGGGAAGTCAACGGg(SEQ ID NO：48)
[pf136R]TGTGTGGTTACCGTTCTTTGAATACATAGA(SEQ ID NO：49)
[pf137F]ATAGAAAATGATTTATGGTACAGCTCAAA(SEQ ID NO：50)
[pf151R]AGACCAAATTAATTATGCCTTTACATGTAC(SEQ ID NO：51)
[pf154FE]a gaattcaccATGAGCA ACATGA ATATACTTGCGTATCTT (SEQ TDNO：52)
[pf157R]GAAATTCCAATGTATTCCATATTCACTTAT(SEQ ID NO：53)
[pf168BK]AAGATCTAATACATTAAAACATTTTAGATTAATGAATATGTG(SEQ ID NO：54)
[pf155RK]a ggtaccGTACACTCCACTCTATGATGATCATTC (SEQ ID NO：55)
[实施例2]全合成的PfGWT1基因
恶性疟原虫DNA中的腺嘌呤和胸腺嘧啶(AT)比例非常高(80％或更高)，因此通常无法使用常规的生物技术(PCR，以大肠杆菌为基础的基因工程，重组蛋白的表达系统等)(Sato和Horii；Protein，Nucleic acid，and Enzyme Vol.48，149-155，2003)。同样地，PfGWT1 DNA的AT含量是80.41％，其包含多个连续的A或T序列段。因此，可以推断该基因将很难在酵母中复制并以蛋白形式表达。实际上，当将连有酵母过表达载体的天然PfGWT1导入GWT1遭破坏的酵母时，PfGWT1根本不能拯救GWT1破坏体的致死表型。为了降低AT含量，用不改变原本氨基酸顺序的同义密码子替换密码子。
在恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的基础上进行密码子取代，所述核苷酸序列已在恶性疟原虫基因组数据库(PlasmoDBdatabase， http://plasmodb.org/)中公开。将所得核苷酸序列命名为“优化的PfGWT1(opfGWT1)”(SEQ ID NO：5)。
将上述序列设计为编码区外包含额外的序列；即EcoRI切割位点序列(GAATTC，5’末端)，Kozak序列(ACC，3’末端)，和KpnI切割位点序列(GGTACC，3’末端)。所得序列的合成委托美国的Blue Heron Inc。用这些额外的限制酶位点将完全合成的opfGWT1与YEp352GAPII载体连接，从而构建opfGWT1的过表达质粒。将该构建体引入仅仅单个GWT1基因拷贝被破坏的二倍体细胞(WDG2)中。在含孢子形成培养基的平板上培养获得的转化体，形成用于四分体分析的孢子。
新设计的密码子-修饰opfGWT1的AT含量减少至61.55％。四分体分析结果示于图1。在导入opfGWT1过表达质粒后，gwt1遭破坏的菌株存活。上述发现表明：在通过密码子修饰而使AT含量降低时，PfGWT1基因可以在酵母细胞中表达。
[实施例3]利用opfGWT1-表达型酵母进行抗疟活性分析
利用opfGWT1-表达型酵母构建抗疟活性化合物的筛选系统。
通过将酿酒酵母GWT1终止子，酿酒酵母GAPDH启动子以及多克隆位点插到单拷贝载体pRS316的SacI-KpnI位点来构建表达盒。分别将酿酒酵母GWT1和opfGWT1插到多克隆位点，制备pGAP-ScGWT1和pGAP-opfGWT1质粒。将这些质粒导入GWT1破坏体。用YPAD连续的两倍稀释化合物(1)，使其最高的终浓度为50μg/ml。将稀释化合物的50μl等分试样加到96-孔板的每个孔中。将含有各种质粒的酵母细胞过夜培养物稀释1000倍，然后将稀释物的50μl等分试样加到各孔中。将平板在30℃温育2天，然后在660nm测定培养物混浊度(图2和表1)
[表1]
 0  6.25  12.5  25  50
 pGAP-ScGWT1  0.7560  0.7370  0.6670  0.1140  0.0420
 pGAP-opfGWT1  0.7150  0.6990  0.6910  0.3630  0.0530
虽然GWT1破坏体不能存活，但菌株在导入每种质粒后能存活(如0μg/ml的化合物浓度所示)。化合物(1)抑制ScGWT1-表达型酵母的生长，化合物(1)是GWT1-特异性抑制剂。以25μg/ml使用该化合物，约有85％的生长受抑制。当以50μg/ml使用该化合物时，酵母完全不能存活。化合物(1)也抑制opfGWT1-表达型酵母的生长。以25μg/ml使用该化合物，约有50％的生长受抑制。当以50μg/ml使用该化合物时，酵母完全不能存活。由于opfGWT1-表达型酵母的生长是由导入的opfGWT1的活性来决定的，因此生长抑制可归因于化合物(1)对opfGWT1功能的抑制作用。此发现说明：利用该分析系统，通过筛选化合物可以鉴定出具有恶性疟原虫GWT1-特异性抑制活性GWT1的化合物。
[实施例4]抗疟活性
利用红细胞培养系统，对抑制酵母GWT1的典型化合物(1)-(5)进行抗疟活性分析。
Figure A20071010428700331
化合物(1)：1-(4-丁基苄基)异喹啉
Figure A20071010428700332
化合物(2)：4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇
Figure A20071010428700333
化合物(3)：5-丁基-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚
Figure A20071010428700341
化合物(4)：2-(4-溴-2-氟苄基)-3-甲氧基吡啶
化合物(5)：N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N-甲胺
具体地说，将待测化合物溶解在100％DMSO中，用培养基稀释，然后将稀释物的80μl等分试样加到96-孔培养板的每个孔中。恶性疟原虫FCR3菌株在37℃用含10％人血清的RPMI1640培养基预培养，然后在每个孔中加入20μl的培养细胞(含1 0％红细胞)。此时，0.47％的红细胞被感染。在5％O2，5％CO2，和90％N2的37℃条件培养48小时后，将疟原虫用吉姆萨(Giemsa)染色法染色。测定原虫-感染的红细胞数量，以估计感染率(图3)。结果，显示化合物(3)具有很强的抗疟活性。其它4种化合物也显示了抗疟活性。化合物(4)表现的活性最低。这样，抑制酵母GWT1的化合物包括具有抑制恶性疟原虫GWT1活性的化合物，这说明抗疟药物可以在这些化合物的基础上进行合成。
工业实用性
本发明成功地制得能表达疟原虫GWT1的真菌。采用该真菌，而不采用疟原虫，能筛选出靶向GPI生物合成途径的抗疟药物。
到目前为止，还从未进行过在真菌细胞中表达疟原虫基因以及筛选抑制该基因功能的物质的尝试。本发明的方法并不需要利用疟原虫，因此本方法证明了在后基因组时代，采用比较基因组进行用于药物发现的全新筛选方法的可能性。
序列表
<110>卫材株式会社(Eisai Co.，Ltd.)
<120>  筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法
<130>  E1-A0210P
<150>  US60/428,589
<151>  2002-11-22
<160>  55
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  2625
<212>  DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))
<220>
<221>CDS
<222> (1)..(2625)
<223>
<400> 1
atg agc aac atg aat ata ctt gcg tat ctt ttg ata tgt ccc ttt aac    48
Met Ser Asn Met Asn Ile Leu Ala Tyr Leu Leu Ile Cys Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
tta ata tat ata ttt gac ctt cct tca tat ata cct gag tta aat aaa    96
Leu Ile Tyr Ile Phe Asp Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Glu Leu Asn Lys
    20                          25                   30
aag ctg gag aat gac gag gtg ttt ata tat gga aaa gaa ata aga aag    144
Lys Leu Glu Asn Asp Glu Val Phe Ile Tyr Gly Lys Glu Ile Arg Lys
    35                      40                   45
aat gaa tct gca tat tct tta cat tat gaa aaa tat tta tat gaa tta    192
Asn Glu Ser Ala Tyr Ser Leu His Tyr Glu Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu
    50                   55                 60
tca aga aga tat tat gag ata ata tta aaa tat aat aag gag ctc ggg    240
Ser Arg Arg Tyr Tyr Glu Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Lys Glu Leu Gly
65                  70                   75                 80
gtt aat cag gaa aaa gaa tat aat tta ata ata agt aga gag ata gat    288
Val Asn Gln Glu Lys Glu Tyr Asn Leu Ile Ile Ser Arg Glu Ile Asp
                85                   90                  95
aaa aaa aaa aaa aaa caa aaa aat agt aca caa gga gaa tat aat aat    336
Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Asn Set Thr Gln Gly Glu Tyr Asn Asn
            100                 105                 110
gat gat gat aat aat tgg aaa tta ttc caa ata tat gag aag gaa gaa    384
Asp Asp Asp Asn Asn Trp Lys Leu Phe Gln Ile Tyr Glu Lys Glu Glu
        115                 120                 125
ccc aga tca tac gaa tta ata cgt gtt gag att tac aaa aaa gat att    432
Pro Arg Ser Tyr Glu Leu Ile Arg Val Glu Ile Tyr Lys Lys Asp Ile
    130                 135                 140
ctt tta att tat aaa aat gaa aaa acc aaa tca tca ata aaa ttt ata    480
Leu Leu Ile Tyr Lys Asn Glu Lys Thr Lys Ser Ser Ile Lys Phe Ile
145                 150                 155                 160
ata aag aaa aga aaa gat ata aaa aat tat ttc tca tta tgt tat caa    528
Ile Lys Lys Arg Lys Asp Ile Lys Asn Tyr Phe Ser Leu Cys Tyr Gln
                165                  170                175
aat tgt ata aat aaa tta gat aaa aat gat tat aat att tta aaa agt    576
Asn Cys Ile Asn Lys Leu Asp Lys Asn Asp Tyr Asn Ile Leu Lys Ser
            180                 185                 190
aca ata aat aat agt aaa gaa aat ata att aat agt gct tat ata tat    624
Thr Ile Asn Asn Ser Lys Glu Asn Ile Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Tyr
        195                 200                 205
atg tat ata ata ttt ttc ttt tta tgt ata tat gta gaa aaa aat tta    672
Met Tyr Ile Ile Phe Phe Phe Leu Cys Ile Tyr Val Glu Lys Asn Leu
    210                 215                 220
ttt tta tac ttt cct ata tta tta caa aag tat gaa ata cta aca aca    720
Phe Leu Tyr Phe Pro Ile Leu Leu Gln Lys Tyr Glu Ile Leu Thr Thr
225                  230                 235                240
tta ttt att tta ttt att cct cta att ctt ttt gtt ttt ttt tat ttt    768
Leu Phe Ile Leu Phe Ile Pro Leu Ile Leu Phe Val Phe Phe Tyr Phe
                245                 250                 255
tat ttt act ata atc aag ttg ata tgt tct tgt cta gtt tta tat gta    816
Tyr Phe Thr Ile Ile Lys Leu Ile Cys Ser Cys Leu Val Leu Tyr Val
            260                 265                 270
aca ttt caa tta att tat tat act caa ggt atg cct ata tat atg gaa    864
Thr Phe Gln Leu Ile Tyr Tyr Thr Gln Gly Met Pro Ile Tyr Met Glu
        275                 280                  285
cat agc ata ttg aaa cat aaa gaa aaa gaa gaa att tgt gat gaa aaa    912
His Ser Ile Leu Lys His Lys Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys
    290                 295                 300
gaa gaa att tgt gat gaa aaa gaa gaa att tgt gat gaa aaa gaa gaa    960
Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu
305                 310                  315                320
att tgt gat gaa aaa gaa gaa att tgt gat gaa aaa gaa gaa att tgt    1008
Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys
                325                 330                 335
gat gaa aaa gaa gaa att ctt gat aaa aaa aaa aaa att cat gaa aaa    1056
Asp Glu Lys Glu Glu Ile Leu Asp Lys Lys Lys Lys Ile His Glu Lys
            340                 345                 350
aaa aaa aaa att cat gat aaa aaa gaa gaa att gat gaa aaa aaa aaa    1104
Lys Lys Lys Ile His Asp Lys Ly1s Glu Glu Ile Asp Glu Lys Lys Lys
        355                 360                 365
aaa att cat gat aaa aaa gac gaa agt cat gat aaa aat gaa gac ata    1152
Lys Ile His Asp Lys Lys Asp Glu Ser His Asp Lys Asn Glu Asp Ile
    370                 375                 380
aca tat cct gtt caa tat aat ata gaa aat gat tta tgg tac agc tca    1200
Thr Tyr Pro Val Gln Tyr Asn Ile Glu Asn Asp Leu Trp Tyr Ser Ser
385                 390                  395                400
aaa aat gta gat att aaa atg tat tca tct tca aat aaa gga gaa gaa    1248
Lys Asn Val Asp Ile Lys Met Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Gly Glu Glu
                405                 410                 415
tat att ata cag aat aca tta aaa cat ttt aga tta atg aat atg tgt    1296
Tyr Ile Ile Gln Asn Thr Leu Lys His Phe Arg Leu Met Asn Met Cys
            420                 425                 430
atg aca tat ata tgt atc ttt gct gtt gat ttt tat ttc ttt cca aat    1344
Met Thr Tyr Ile Cys Ile Phe Ala Val Asp Phe Tyr Phe Phe Pro Asn
        435                 440                 445
cat ttt tgt aaa tcc tat tat tat gga aat aca cta atg gat ata ggg    1392
His Phe Cys Lys Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Leu Met Asp Ile Gly
    450                 455                 460
ata ggt gct tct ata agc tcc agt gca tat tct caa gaa ata aaa aag    1440
Ile Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Ala Tyr Ser Gln Glu Ile Lys Lys
465                 470                 475                 480
ttt aca tat ata aaa gag aag aaa aga ata att gaa tta aaa cat ata    1488
Phe Thr Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Arg Ile Ile Glu Leu Lys His Ile
                485                  490                495
gtt tta ttt att tta gga ata tct aga ttt att gga ata tat ctt ttt    1536
Val Leu Phe Ile Leu Gly Ile Ser Arg Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Phe
            500                 505                 510
aat tat aat tat aat ata agt gaa tat gga ata cat tgg aat ttc ttt    1584
Asn Tyr Asn Tyr Asn Ile Ser Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe
        515                 520                525
tta aca tta tgt act aca ttt ctt ata tct aat ata tgt ttt att tta    1632
Leu Thr Leu Cys Thr Thr Phe Leu Ile Ser Asn Ile Cys Phe Ile Leu
    530                 535                 540
tta aaa agg ata cgt tat att ttt ctt ttt agt ata atc tct ata att    1680
Leu Lys Arg Ile Arg Tyr Ile Phe Leu Phe Ser Ile Ile Ser Ile Ile
545                 550                 555                 560
ctt ttt gaa ata gcc ata tac tat ttt gac tta cat aat tat ata tta    1728
Leu Phe Glu Ile Ala Ile Tyr Tyr Phe Asp Leu His Asn Tyr Ile Leu
                565                 570                 575
tta aaa aat gat aga tta aat ttc ttt tca tca aac aaa gaa ggc tta    1776
Leu Lys Asn Asp Arg Leu Asn Phe Phe Ser Ser Asn Lys Glu Gly Leu
            580                 585                 590
ttt aat att ata ggt tct gtt aat ttg tat tta ttt tct ttc tca tta    1824
Phe Asn Ile Ile Gly Ser Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu
        595                 600                 605
ttt aaa tat tta aca aaa caa agg aca tac ata aca acc tcg aac att    1872
Phe Lys Tyr Leu Thr Lys Gln Arg Thr Tyr Ile Thr Thr Ser Asn Ile
    610                 615                 620
cca aaa aat aaa aag gat atg aat aat tct atg tat tca aag aac ggt    1920
Pro Lys Asn Lys Lys Asp Met Asn Asn Ser Met Tyr Ser Lys Asn Gly
625                 630                 635                  640
aac cac aca aat agc aat ata aat aat agg aat cat aaa att gta att    1968
Asn His Thr Asn Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asn His Lys Ile Val Ile
                645                  650                655
cgg aat aat cat ata aat aaa tat gaa caa gat aac aca aat aag tat    2016
Arg Asn Asn His Ile Asn Lys Tyr Glu Gln Asp Asn Thr Asn Lys Tyr
            660                 665                 670
att aat aaa caa ata aat aat aat aag aat aaa ctt gat gaa gaa gaa    2064
Ile Asn Lys Gln Ile Asn Asn Asn Lys Asn Lys Leu Asp Glu Glu Glu
        675                 680                 685
aaa tta aaa aaa tta aaa aaa tta aaa aac aaa aaa aaa aat tta aaa    2112
Lys Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Lys Asn Lys Lys Lys Asn Leu Lys
    690                 695                 700
aaa aaa att aaa tat tat ttg tta tac ctt caa tat ata ata aat ata    2160
Lys Lys Ile Lys Tyr Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Ile Asn Ile
705                 710                 715                 720
tat aaa gaa gaa tat tat act att tat tat aat ata aaa tta att ata    2208
Tyr Lys Glu Glu Tyr Tyr Thr Ile Tyr Tyr Asn Ile Lys Leu Ile Ile
                 725                 730                735
tca tct ttt att ttt tat tta tta cat ata att ctt aat tta tat aaa    2256
Ser Ser Phe Ile Phe Tyr Leu Leu His Ile Ile Leu Asn Leu Tyr Lys
            740                 745                 750
aat tat agt gtg cgt ata tta tgt aat gca aat tat att ttt tta ata    2304
Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Phe Leu Ile
        755                 760                 765
aca tca ttg ggt ttg ttt tct tgt gcc ttg agt ttt tcc tta gaa gat    2352
Thr Ser Leu Gly Leu Phe Ser Cys Ala Leu Ser Phe Ser Leu Glu Asp
    770                 775                 780
ata tta tta aga tat aaa aaa tat aaa ata aat att gat ata aca gta    2400
Ile Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Tyr Lys Ile Asn Ile Asp Ile Thr Val
785                 790                 795                 800
ttg gat aag ata aat aaa aat aca ttg ata gtt ttt ctt ttc tcg aat    2448
Leu Asp Lys Ile Asn Lys Asn Thr Leu Ile Val Phe Leu Phe Ser Asn
                805                 810                  815
ata ctt gtg ggc atg ttc aat att cta ttt caa act tta tta tta cct    2496
Ile Leu Val Gly Met Phe Asn Ile Leu Phe Gln Thr Leu Leu Leu Pro
             820                 825                830
ctt ata ttt gta ata cct ata ttg gta ttt tat tct ttc tta ata ctg    2544
Leu Ile Phe Val Ile Pro Ile Leu Val Phe Tyr Ser Phe Leu Ile Leu
        835                 840                 845
ctt ttt aca aaa tgc tta cca cct tcc ata cgc cat cca aaa aaa aaa    2592
Leu Phe Thr Lys Cys Leu Pro Pro Ser Ile Arg His Pro Lys Lys Lys
     850                855                  860
aca cat cat gag gaa aag caa aaa aaa gaa tga                        2625
Thr His His Glu Glu Lys Gln Lys Lys Glu
865                 870
<210> 2
<211> 874
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400> 2
Met Ser Asn Met Asn Ile Leu Ala Tyr Leu Leu Ile Cys Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
Leu Ile Tyr Ile Phe Asp Leu Pro Ser Tyr Ile Pro Glu Leu Asn Lys
            20                  25                   30
Lys Leu Glu Asn Asp Glu Val Phe Ile Tyr Gly Lys Glu Ile Arg Lys
        35                  40                  45
Asn Glu Ser Ala Tyr Ser Leu His Tyr Glu Lys Tyr Leu Tyr Glu Leu
    50                  55                   60
Ser Arg Arg Tyr Tyr Glu Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Lys Glu Leu Gly
65                   70                  75                 80
Val Asn Gln Glu Lys Glu Tyr Asn Leu Ile Ile Ser Arg Glu Ile Asp
                85                   90                  95
Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Asn Ser Thr Gln Gly Glu Tyr Asn Asn
            100                 105                 110
Asp Asp Asp Asn Asn Trp Lys Leu Phe Gln Ile Tyr Glu Lys Glu Glu
        115                 120                 125
Pro Arg Ser Tyr Glu Leu Ile Arg Val Glu Ile Tyr Lys Lys Asp Ile
    130                 l35                 140
Leu Leu Ile Tyr Lys Asn Glu Lys Thr Lys Ser Ser Ile Lys Phe Ile
145                 150                 155                 160
Ile Lys Lys Arg Lys Asp Ile Lys Asn Tyr Phe Ser Leu Cys Tyr Gln
                l65                  170                 175
Asn Cys Ile Asn Lys Leu Asp Lys Asn Asp Tyr Asn Ile Leu Lys Ser
            180                 185                 190
Thr Ile Asn Asn Ser Lys Glu Asn Ile Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Tyr
        195                 200                 205
Met Tyr Ile Ile Phe Phe Phe Leu Cys Ile Tyr Val Glu Lys Asn Leu
    210                 215                 220
Phe Leu Tyr Phe Pro Ile Leu Leu Gln Lys Tyr Glu Ile Leu Thr Thr
225                 230                  235                240
Leu Phe Ile Leu Phe Ile Pro Leu Ile Leu Phe Val Phe Phe Tyr Phe
                245                 250                 255
Tyr Phe Thr Ile Ile Lys Leu Ile Cys Ser Cys Leu Val Leu Tyr Val
             260                265                 270
Thr Phe Gln Leu Ile Tyr Tyr Thr Gln Gly Met Pro Ile Tyr Met Glu
        275                 280                 285
His Ser Ile Leu Lys His Lys Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys
    290                 295                 300
Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu
305                 310                  315                320
Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys Asp Glu Lys Glu Glu Ile Cys
                325                 330                  335
Asp Glu Lys Glu Glu Ile Leu Asp Lys Lys Lys Lys Ile His Glu Lys
            340                 345                 350
Lys Lys Lys Ile His Asp Lys Lys Glu Glu Ile Asp Glu Lys Lys Lys
        355                 360                 365
Lys Ile His Asp Lys Lys Asp Glu Ser His Asp Lys Asn Glu Asp Ile
    370                 375                 380
Thr Tyr Pro Val Gln Tyr Asn Ile Glu Asn Asp Leu Trp Tyr Ser Ser
385                 390                  395                400
Lys Asn Val Asp Ile Lys Met Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Gly Glu Glu
                405                 410                 415
Tyr Ile Ile Gln Asn Thr Leu Lys His Phe Arg Leu Met Asn Met Cys
            420                 425                 430
Met Thr Tyr Ile Cys Ile Phe Ala Val Asp Phe Tyr Phe Phe Pro Asn
        435                 440                 445
His Phe Cys Lys Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Leu Met Asp Ile Gly
    450                 455                 460
Ile Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Ala Tyr Ser Gln Glu Ile Lys Lys
465                 470                 475                 480
Phe Thr Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Arg Ile Ile Glu Leu Lys His Ile
                485                 490                 495
Val Leu Phe Ile Leu Gly Ile Ser Arg Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Phe
            500                 505                 510
Asn Tyr Asn Tyr Asn Ile Ser Glu Tyr Gly Ile His Trp Asn Phe Phe
        515                 520                 525
Leu Thr Leu Cys Thr Thr Phe Leu Ile Ser Asn Ile Cys Phe Ile Leu
    530                 535                 540
Leu Lys Arg Ile Arg Tyr Ile Phe Leu Phe Ser Ile Ile Ser Ile Ile
545                 550                 555                  560
Leu Phe Glu Ile Ala Ile Tyr Tyr Phe Asp Leu His Asn Tyr Ile Leu
                565                 570                 575
Leu Lys Asn Asp Arg Leu Asn Phe Phe Ser Ser Asn Lys Glu Gly Leu
            580                 585                 590
Phe Asn Ile Ile Gly Ser Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu
        595                 600                 605
Phe Lys Tyr Leu Thr Lys Gln Arg Thr Tyr Ile Thr Thr Ser Asn Ile
    610                 615                  620
Pro Lys Asn Lys Lys Asp Met Asn Asn Ser Met Tyr Ser Lys Asn Gly
625                 630                 635                 640
Asn His Thr Asn Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asn His Lys Ile Val Ile
                645                 650                 655
Arg Asn Asn His Ile Asn Lys Tyr Glu Gln Asp Asn Thr Asn Lys Tyr
            660                  665                670
Ile Asn Lys Gln Ile Asn Asn Asn Lys Asn Lys Leu Asp Glu Glu Glu
        675                 680                 685
Lys Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Lys Asn Lys Lys Lys Asn Leu Lys
    690                 695                 700
Lys Lys Ile Lys Tyr Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Ile Asn Ile
705                 710                 715                 720
Tyr Lys Glu Glu Tyr Tyr Thr Ile Tyr Tyr Asn Ile Lys Leu Ile Ile
                725                 730                 735
Ser Ser Phe Ile Phe Tyr Leu Leu His Ile Ile Leu Asn Leu Tyr Lys
            740                 745                 750
Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Phe Leu Ile
        755                 760                 765
Thr Ser Leu Gly Leu Phe Ser Cys Ala Leu Ser Phe Ser Leu Glu Asp
    770                  775                780
Ile Leu Leu Arg Tyr Lys Lys Tyr Lys Ile Asn Ile Asp Ile Thr Val
785                 790                 795                 800
Leu Asp Lys Ile Asn Lys Asn Thr Leu Ile Val Phe Leu Phe Ser Asn
                805                 810                 815
Ile Leu Val Gly Met Phe Asn Ile Leu Phe Gln Thr Leu Leu Leu Pro
            820                 825                 830
Leu Ile Phe Val Ile Pro Ile Leu Val Phe Tyr Ser Phe Leu Ile Leu
        835                 840                 845
Leu Phe Thr Lys Cys Leu Pro Pro Ser Ile Arg His Pro Lys Lys Lys
    850                 855                 860
Thr His His Glu Glu Lys Gln Lys Lys Glu
865                 870
<210>  3
<211> 1956
<212>DNA
<213> 间日疟原虫(Plasmodium vivax))
<220>
<221>CDS
<222> (1)..(19 56)
<223>
<400> 3
 atg gcg cat ttg aac ctc ctc gtc tac ctc atc atg tgc ccc ttc aat    48
Met Ala His Leu Asn Leu Leu Val Tyr Leu Ile Met Cys Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
 gtg agg cac atg ctg gat gcg ccc agc ttc cea ttc cgg tta gga agc    96
Val Arg His Met Leu Asp Ala Pro Ser Phe Pro Phe Arg Leu Gly Ser
            20                   25                 30
aaa gca gca agt ggt gaa acc ttc acg tat gga gcg act gca aga gag    144
Lys Ala Ala Ser Gly Glu Thr Phe Thr Tyr Gly Ala Thr Ala Arg Glu
        35                  40                  45
aac ctg ggg agt tac tct ccc gca cat gac gag cta tac atg tta gag    192
Asn Leu Gly Ser Tyr Ser Pro Ala His Asp Glu Leu Tyr Met Leu Glu
    50                  55                  60
tta gcc aaa atg tac tat aaa att gtg tta aea tat aag aag gat gtt    240
Leu Ala Lys Met Tyr Tyr Lys Ile Val Leu Thr Tyr Lys Lys Asp Val
65                  70                   75                 80
agg aaa gga cag gag gag agt tac aac ttg gtg gta ggc tcc ttt ggg    288
Arg Lys Gly Gln Glu Glu Ser Tyr Asn Leu Val Val Gly Ser Phe Gly
                85                   90                  95
aag gaa gcc aaa ggg gag gtc tcc ctc caa aga gtt ctc atc aca aat    336
Lys Glu Ala Lys Gly Glu Val Ser Leu Gln Arg Val Leu Ile Thr Asn
            100                 105                 110
gat gcc gtg tac ctg tcg tac cag gat gtg caa aac gaa cgt ggg atc    384
Asp Ala Val Tyr Leu Ser Tyr Gln Asp Val Gln Asn Glu Arg Gly Ile
        115                 120                 125
caa gtt aag ata aaa agg ggg gaa ata tct tcc tat tta gac ctc cta    432
Gln Val Lys Ile Lys Arg Gly Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Asp Leu Leu
    130                 135                 140
tcg tgg gat tct tgt ttg tat aag ctt aac tca gac gat tat aat tta    480
Ser Trp Asp Ser Cys Leu Tyr Lys Leu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Leu
145                 150                 155                 160
atg aag agc gca tcg gat cat agc aag cca atg gtg gtc agc aca tac    528
Met Lys Ser Ala Ser Asp His Ser Lys Pro Met Val Val Ser Thr Tyr
                165                 170                 175
cac ata tac atg ctg ctg ctg gtg ttt tct ctt tgc act tac gtg gag    576
His Ile Tyr Met Leu Leu Leu Val Phe Ser Leu Cys Thr Tyr Val Glu
            180                 185                 190
aag agc ctc ctg ctt gaa ttc cct gcg ttg aaa aag tgc caa gta ttt    624
Lys Ser Leu Leu Leu Glu Phe Pro Ala Leu Lys Lys Cys Gln Val Phe
        195                 200                 205
cta acc cta tgt ttg gtg tac tgc ccg ata atc agt tac ctt ttt ttt    672
Leu Thr Leu Cys Leu Val Tyr Cys Pro Ile Ile Ser Tyr Leu Phe Phe
    210                  215                220
ttt tac tcc cat gtg agc cta ctt ggg gtg tta ctc gtc tat gtg ttt    720
Phe Tyr Ser His Val Ser Leu Leu Gly Val Leu Leu Val Tyr Val Phe
225                 230                 235                 240
ttt tgc ggg ctc ttc agg ggc gtc tct tgc aga agg ggg ggg cag cac    768
Phe Cys Gly Leu Phe Arg Gly Val Ser Cys Arg Arg Gly Gly Gln His
                245                 250                  255
atg ggg gag caa acg ggc caa cac acg ggc gat tgg cac acc atc cgc    816
Met Gly Glu Gln Thr Gly Gln His Thr Gly Asp Trp His Thr Ile Arg
            260                 265                  270
ggc aac cca caa ggt gat gat acg caa gag gag aga cgc aag tgt ttg    864
Gly Asn Pro Gln Gly Asp Asp Thr Gln Glu Glu Arg Arg Lys Cys Leu
        275                 280                 285
gtc cat atg agg cta gcc aac ctg tgc atc acc tac ata tgc ata ttc    912
Val His Met Arg Leu Ala Asn Leu Cys Ile Thr Tyr Ile Cys Ile Phe
    290                 295                 300
gct gtg gac ttt tat ttt ttc cca agg caa ttt tcc aag tct ttt ttt    960
Ala Val Asp Phe Tyr Phe Phe Pro Arg Gln Phe Ser Lys Ser Phe Phe
305                 310                 315                 320
ttt ggt aac act ttg atg gat tta ggg gtg ggg ggg tgc atc aca tcg    1008
Phe Gly Asn Thr Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Gly Cys Ile Thr Ser
                325                 330                 335
agc gcg tat tct cta aac agt aaa aag ctc cat tct gcg aac cgc aag    1056
Ser Ala Tyr Ser Leu Asn Ser Lys Lys Leu His Ser Ala Asn Arg Lys
            340                 345                 350
gga cac cta atc gat tgg aag cat ttc att tta ttt ttc ctt gga ata    1104
Gly His Leu Ile Asp Trp Lys His Phe Ile Leu Phe Phe Leu Gly Ile
        355                 360                 365
gct aga tac att gca gtg aag ctt ttc aat tat aat tac agc tta act    1152
Ala Arg Tyr Ile Ala Val Lys Leu Phe Asn Tyr Asn Tyr Ser Leu Thr
    370                 375                 380
gag tat ggg atg cac tgg aat ttt ttt ctt act ctc ttt ttt act ctc    1200
Glu Tyr Gly Met His Trp Asn Phe Phe Leu Thr Leu Phe Phe Thr Leu
385                 390                  395                400
cta act tgt aac gcc cta ctc tgc ttg ata aga ggg gtt aaa cgc acc    1248
Leu Thr Cys Asn Ala Leu Leu Cys Leu Ile Arg Gly Val Lys Arg Thr
                 405                410                415
ttt cac ctg agc tgc gtc ctc atc tgt ttg tat gaa att ata att tgg    1296
Phe His Leu Ser Cys Val Leu Ile Cys Leu Tyr Glu Ile Ile Ile Trp
            420                  425                430
cgc ctg gac att acg agt tat tta gtg gtt gac gag gca gaa cgg agc    1344
Arg Leu Asp Ile Thr Ser Tyr Leu Val Val Asp Glu Ala Glu Arg Ser
        435                 440                 445
ggc ttt ttt tcg cag aac aga gag ggc ctt atg aac gtc atc ggg tcc    1392
Gly Phe Phe Ser Gln Asn Arg Glu Gly Leu Met Asn Val Ile Gly Ser
    450                 455                 460
gtc aat ttg tac ctc ttt tcg ttt tcg cta tgg aat ggc tat gtg ttt    1440
Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu Trp Asn Gly Tyr Val Phe
465                 470                  475                480
ccg gat gag ggg cag cag tgg gag cga gga aag gcg gcg cga aga ccg    1488
Pro Asp Glu Gly Gln Gln Trp Glu Arg Gly Lys Ala Ala Arg Arg Pro
                485                 490                 495
gat gag gcg gcg cga acg ccg ggg gag gga cat ggc cag cgc tcc cct    1536
Asp Glu Ala Ala Arg Thr Pro Gly Glu Gly His Gly Gln Arg Ser Pro
            500                 505                 510
gtc cgc ctc acc ctg aag ttg ctt gcc ctg tcc ctc ctc ttc cac ctg    1584
Val Arg Leu Thr Leu Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Phe His Leu
        515                 520                 525
ctg cac ctg ctg ttg aat tac tac cga aat tac agt gtg cgc atc ctt    1632
Leu His Leu Leu Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu
    530                 535                 540
tgc aac gcg aac tac ata tgt gtt gtc tcc tcc gtg agt ctc ttc gcg    1680
Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Cys Val Val Ser Ser Val Ser Leu Phe Ala
545                 550                 555                 560
gct gcc ctg agc tac ctc gta gag aag gta ctc ctc cgc gag aag acc    1728
Ala Ala Leu Ser Tyr Leu Val Glu Lys Val Leu Leu Arg Glu Lys Thr
                565                 570                 575
acc acc atc cca gtt ttg caa caa atg aac cgg cac tcc ctg gca gtg    1776
Thr Thr Ile Pro Val Leu Gln Gln Met Asn Arg His Ser Leu Ala Val
            580                 585                 590
ttc ctc ttt tgc aac gta aca atg ggc act ttc aac ctc ctc ttt cag    1824
Phe Leu Phe Cys Asn Val Thr Met Gly Thr Phe Asn Leu Leu Phe Gln
        595                 600                 605
tct ctc ttg ttt ccc cta ttt ttt gcg tgc ctc gtt ttg gcg gcg tac    1872
Ser Leu Leu Phe Pro Leu Phe Phe Ala Cys Leu Val Leu Ala Ala Tyr
    610                 615                 620
tcc tat ggc atg ttg cgc ttc gcc tcc ctg ttg ccc ggc ccc gcg cag    1920
Ser Tyr Gly Met Leu Arg Phe Ala Ser Leu Leu Pro Gly Pro Ala Gln
625                 630                 635                 640
ggg gag aag gga gag aag cgg gag aag cag caa taa    1936
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Arg Glu Lys Gln Gin
                645                 650
<210>4
<211>651
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>4
 Met Ala His Leu Asn Leu Leu Val Tyr Leu Ile Met Cys Pro Phe Asn
 1               5                   10    1             5
 Val Arg His Met Leu Asp Ala Pro Ser Phe Pro Phe Arg Leu Gly Ser
             20                  25                  30
Lys Ala Ala Ser Gly Glu Thr Phe Thr Tyr Gly Ala Thr Ala Arg Glu
        35                  40                  45
Asn Leu Gly Ser Tyr Ser Pro Ala His Asp Glu Leu Tyr Met Leu Glu
    50                  55                  60
Leu Ala Lys Met Tyr Tyr Lys Ile Val Leu Thr Tyr Lys Lys Asp Val
65                  70                  75                   80
Arg Lys Gly Gln Glu Glu Ser Tyr Asn Leu Val Val Gly Ser Phe Gly
                85                  90                  95
Lys Glu Ala Lys Gly Glu Val Ser Leu Gln Arg Val Leu Ile Thr Asn
            100                 105                 110
Asp Ala Val Tyr Leu Ser Tyr Gln Asp Val Gln Asn Glu Arg Gly Ile
        115                 120                 125
Gln Val Lys Ile Lys Arg Gly Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Asp Leu Leu
    130                 135                 140
Ser Trp Asp Ser Cys Leu Tyr Lys Leu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Leu
145                 150                 l55                 160
Met Lys Ser Ala Ser Asp His Ser Lys Pro Met Val Val Ser Thr Tyr
                165                 170                 175
His Ile Tyr Met Leu Leu Leu Val Phe Ser Leu Cys Thr Tyr Val Glu
            180                 185                 190
Lys Ser Leu Leu Leu Glu Phe Pro Ala Leu Lys Lys Cys Gln Val Phe
        195                 200                 205
Leu Thr Leu Cys Leu Val Tyr Cys Pro Ile Ile Ser Tyr Leu Phe Phe
    210                 215                 220
Phe Tyr Ser His Val Ser Leu Leu Gly Val Leu Leu Val Tyr Val Phe
225                 230                 235                 240
Phe Cys Gly Leu Phe Arg Gly Val Ser Cys Arg Arg Gly Gly Gln His
                245                 250                 255
Met Gly Glu Gln Thr Gly Gln His Thr Gly Asp Trp His Thr Ile Arg
            260                 265                 270
Gly Asn Pro Gln Gly Asp Asp Thr Gln Glu Glu Arg Arg Lys Cys Leu
        275                 280                 285
Val His Met Arg Leu Ala Asn Leu Cys Ile Thr Tyr Ile Cys Ile Phe
    290                 295                 300
Ala Val Asp Phe Tyr Phe Phe Pro Arg Gln Phe Ser Lys Ser Phe Phe
305                 310                 315                 320
Phe Gly Asn Thr Leu Met Asp Leu Gly Val Gly Gly Cys Ile Thr Ser
                325                 330                 335
Ser Ala Tyr Ser Leu Asn Ser Lys Lys Leu His Ser Ala Asn Arg Lys
            340                 345                 350
Gly His Leu Ile Asp Trp Lys His Phe Ile Leu Phe Phe Leu Gly Ile
        355                 360                 365
Ala Arg Tyr Ile Ala Val Lys Leu Phe Asn Tyr Asn Tyr Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Glu Tyr Gly Met His Trp Asn Phe Phe Leu Thr Leu Phe Phe Thr Leu
385                 390                 395                 400
Leu Thr Cys Asn Ala Leu Leu Cys Leu Ile Arg Gly Val Lys Arg Thr
                405                 410                 415
Phe His Leu Ser Cys Val Leu Ile Cys Leu Tyr Glu Ile Ile Ile Trp
            420                 425                 430
Arg Leu Asp Ile Thr Ser Tyr Leu Val Val Asp Glu Ala Glu Arg Ser
        435                 440                 445
Gly Phe Phe Ser Gln Asn Arg Glu Gly Leu Met Asn Val Ile Gly Ser
    450                 455                 460
Val Asn Leu Tyr Leu Phe Ser Phe Ser Leu Trp Asn Gly Tyr Val Phe
465                 470                 475                 480
Pro Asp Glu Gly Gln Gln Trp Glu Arg Gly Lys Ala Ala Arg Arg Pro
                485                 490                 495
Asp Glu Ala Ala Arg Thr Pro Gly Glu Gly His Gly Gln Arg Ser Pro
            500                 505                 510
Val Arg Leu Thr Leu Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Phe His Leu
        515                 520                 525
Leu His Leu Leu Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Tyr Ser Val Arg Ile Leu
    530                 535                 540
Cys Asn Ala Asn Tyr Ile Cys Val Val Ser Ser Val Ser Leu Phe Ala
545                 550                 555                 560
Ala Ala Leu Ser Tyr Leu Val Glu Lys Val Leu Leu Arg Glu Lys Thr
                565                 570                 575
Thr Thr Ile Pro Val Leu Gln Gln Met Asn Arg His Ser Leu Ala Val
            580                 585                 590
Phe Leu Phe Cys Asn Val Thr Met Gly Thr Phe Asn Leu Leu Phe Gln
        595                 600                 605
Ser Leu Leu Phe Pro Leu Phe Phe Ala Cys Leu Val Leu Ala Ala Tyr
    610                 615                 620
Ser Tyr Gly Met Leu Arg Phe Ala Ser Leu Leu Pro Gly Pro Ala Gln
625                 630                 635                 640
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Arg Glu Lys Gln Gln
                645                 650
<210>5
<211>262 5
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的序列
<400> 5
atgagtaaca tgaacatcct ggcctacctg ctgatctgtc cattcaacct gatctacatc    60
ttcgacctgc ctagctacat ccctgagcta aacaagaagc tggagaacga cgaagtcttc   120
atctacggta aggagatccg taagaacgaa tccgcatact ctctacacta cgagaagtac   180
ctatacgaat tgtcacgaag atactacgag atcatcctga agtacaacaa ggagttggga   240
gtcaaccaag agaaggaata caacctgatt atctccagag agatcgataa gaagaagaag   300
aagcagaaga atagtaccca gggtgaatac aataacgacg atgataacaa ttggaagttg   360
ttccagattt acgagaagga agaacctagg agctatgaat tgatcagggt agagatatac   420
aagaaggaca ttctgttgat ctacaagaat gagaagacga agtcctctat caagttcatt   480
atcaagaagc gtaaggatat caagaattac ttctccttgt gttaccagaa ctgtatcaat   540
aagctggaca agaatgatta caacatcttg aagtctacca tcaacaattc caaggaaaac   600
attatcaact ctgcatacat ttacatgtac attatcttct tcttcctgtg catatacgtc   660
gagaagaacc tgttcttgta cttcccaata ttgcttcaga agtatgagat tctcactacg   720
ttgttcatcc tcttcatccc attgatccta ttcgtattct tctatttcta cttcacgatt   780
atcaagctga tttgctcatg cttagtccta tacgtgactt tccagttgat ctactatacg   840
cagggaatgc ctatttacat ggaacatagt attctcaagc acaaggagaa ggaagagatt   900
tgcgatgaga aggaggaaat ctgtgatgaa aaggaagaga tttgcgatga gaaggaagag   960
atttgcgatg agaaggaaga gatttgtgat gagaaggaag aaatctgcga tgagaaagaa  1020
gaaatccttg ataagaagaa gaagatccac gagaagaaga agaagatcca tgataagaaa  1080
gaggaaatcg atgagaagaa gaagaagatt catgacaaaa aggacgaaag tcatgataag  1140
aacgaggaca ttacgtatcc agtccagtac aatatcgaga atgacctatg gtattcatcc  1200
aagaacgtgg acatcaagat gtattcatcc agcaacaagg gtgaagaata cattatccag  1260
aacacgttga aacatttccg attgatgaac atgtgtatga cgtacatttg tatcttcgct  1320
gttgacttct acttcttccc taaccatttc tgcaagtcct actattacgg aaatacgttg  1380
atggacattg gaatcggtgc atccatttct tccagtgcat actcgcagga gatcaagaag  1440
ttcacgtaca ttaaggagaa gaaacgaatt atcgagttga aacatatcgt gttattcatt  1500
ctgggaatta gcagatttat cggtatctac ctattcaact ataactacaa catttctgag  1560
tatggaatcc attggaactt ctttcttacg ctatgtacaa cctttctgat tagcaacatt  1620
tgtttcatcc tcctcaagag gattcgttat atcttcctat tcagtattat ctcgatcatc  1680
ttattcgaaa tcgctattta ctacttcgat ctacataatt acatcctcct gaagaatgac  1740
cgtttaaact tcttctcttc taacaaggag ggtctattca acattatcgg ttccgtgaac  1800
ctttatttgt tcagtttctc actcttcaag taccttacga agcagcgtac gtatatcacg  1860
acgtccaata tccctaagaa caagaaagat atgaataact caatgtattc gaagaatgga  1920
aaccatacta attcgaatat caacaaccgt aaccataaga tcg tcatccg taataaccac 1980
attaacaagt atgagcagga caacacgaac aagtacatca acaagcaaat caataacaac  2040
aagaacaaat tggatgagga agagaagctg aagaaactca agaagcttaa gaataagaag  2100
aagaacctca agaagaaaat caagtactat ctattgtacc ttcagtatat catcaacatc  2160
tacaaggagg aatactatac gatctactat aacatcaagc taatcatttc gtcgtttata  2220
ttctacctcc ttcacataat ccttaatctg tacaagaact actctgtgcg tattctgtgt  2280
aatgcaaact acatcttcct gattacgagt ctgggtctgt tctcctgtgc attatccttc  2340
tccctggagg acatcctact ccgttataag aaatacaaga tcaatatcga tattactgtg  2400
ctagataaga ttaacaagaa caccttaatc gtgttcctgt ttagtaatat cctagtggga  2460
atgttcaaca tcctgttcca aactttgctc ctaccactga tattcgttat ccctattcta  2520
gtattctaca gcttcttgat cctgctgttc accaagtgtt tgccaccttc tatccgacat  2580
cctaagaaga agacgcatca cgaagagaag cagaagaaag agtga                  2625
<210>6
<211>2010
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>6
atgtgcacta caaaaaatga agacaataat aaagtgaatt atctgtatct catttattat    60
aataatatac ctatatttaa aaaaaaaagt ggaaatgaac aaaacataag tgcgctattt   120
attttatatg atgtaaaaaa gtatgtgtat aatatggttc atgatcacgt aaatacatta   180
gtcctagaag cttttagaag agaagacata ataaaaaaaa taaaagtaaa agaaaaacaa   240
aataataatg ataaaaataa agaaagtaat attgaaaaag ataaaaatga acaaaccaaa   300
tttacagata tatatgatac aaatagtaag agtgacaaag atatacaaaa gaataatatg   360
aacgatggtg atagtaataa taaaaatagt agtttattta ttgatccttt tgaaagtgat   420
tcatatgaaa agaataattt tagtaatgaa aaatgtgctt tccaaaatgt cgataaatca   480
aaaaaagata aagaacatat atattctgaa aatattactc ctagtagtag taataataat   540
aatgataata ataaagaaaa tgattgtgat aaggaacaat tagataaata taataaagat   600
aaagaaaata aattaaaatt aaatgataag gatgaatata tttctttcaa ttttattgaa   660
gataaattaa ccgaatcatt tcatatgaat caaataattc atttaattaa taaaaaatgt   720
gtatttacca aatgcctaga aaattataaa aatagatatt ttgtactgaa aaaagaagag   780
attttaaaaa aaaaaaaaaa gcaaaaaaaa atgtctatat tttcatatat tgtatcaatc   840
atattatttt ttacatatat catatcactt ataaatagtt gtttatatta tataatatgt   900
acaccaaaat tgttcagtga atatatattt tcaaaaaaat gtgatggata tctgcagaat   960
tcggcttacc ctaaatttat atttccttct gaatggcata atatattccg cagcttcatg  1020
aaaaataaac aaaacccatc tgaatattat aaatatagag aaatcttatt aattcgtatt  1080
atcaatttaa taatcgatat tttcttggga tttctgatat ttttactact ttattttaac  1140
gtaataaacc tacattatat atcagagaag gctcaaatat tttatggaac cagtacttta  1200
acttctatct tgggtacctt gttacagaat ccattaggat ttaaattaaa taataatttt  1260
acgtctttca ttggtagcat ccttgtttcg atattagaca aatgggattt atttacaaat  1320
accatccctg tgaataatag tacagttttg aattttgttg gatatacatc actgctgggt  1380
ttttcttttt ttttgtcttt tgttattgat tatttgagat tcgtaacagc acatgttacc  1440
attatttatt tatttttgaa aaaaatatgt accctttttc ataaaaatat gtattcctta  1500
tacctattat tcaatgggaa aaaatggaac atactaaaac taagagttga tacaaattac  1560
tactcaaatg aagaagtact tttaggaacc atattattta ccattttaat ttttttgtac  1620
cctaccattt ttgttcttgt tttggttttt ggtcttatat atcttataat aaatagaatt  1680
atataccttt tgtgtgttat ggagaaaata attttgtaca cccctttcta tattttcttt   1740
attcaaccga attgtaataa atatattagt aagggtttca agtttacaaa atatgaagtt   1800
ggggaacatg aactgttaaa aaggtatccg actaacagct acttgttgct agaaaagatt   1860
cattttttat tttttgataa aataaaattg tttataaata ttttccttta ttttaaaaac   1920
ctcgagtcaa tgtcatcata ttcatatata tttatttctt tttgtttttg tcttttaaaa   1980
aaaaaatata tatatatata tataatataa                                    2010
<210>7
<211>669
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>7
Met Cys Thr Thr Lys Asn Glu Asp Asn Asn Lys Val Asn Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Ile Tyr Tyr Asn Asn Ile Pro Ile Phe Lys Lys Lys Ser Gly Asn
            20                  25                  30
Glu Gln Asn Ile Ser Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Asp Val Lys Lys Tyr
        35                  40                  45
Val Tyr Asn Met Val His Asp His Val Asn Thr Leu Val Leu Glu Ala
    50                   55                 60
Phe Arg Arg Glu Asp Ile Ile Lys Lys Ile Lys Val Lys Glu Lys Gln
65                  70                   75                 80
Asn Asn Asn Asp Lys Asn Lys Glu Ser Asn Ile Glu Lys Asp Lys Asn
                85                  90                   95
Glu Gln Thr Lys Phe Thr Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Set Lys Ser Asp
           100                  105                 110
Lys Asp Ile Gln Lys Asn Asn Met Asn Asp Gly Asp Ser Asn Asn Lys
        115                 120                 125
Asn Ser Ser Leu Phe Ile Asp Pro Phe Glu Ser Asp Ser Tyr Glu Lys
    130                 135                 140
Asn Asn Phe Ser Asn Glu Lys Cys Ala Phe Gln Asn Val Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Lys Lys Asp Lys Glu His Ile Tyr Ser Glu Asn Ile Thr Pro Ser Ser
                165                 170                 175
Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Lys Glu Asn Asp Cys Asp Lys Glu
            180                 185                 190
Gln Leu Asp Lys Tyr Asn Lys Asp Lys Glu Asn Lys Leu Lys Leu Asn
        195                 200                 205
Asp Lys Asp Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Phe Ile Glu Asp Lys Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Ser Phe His Met Asn Gln Ile Ile His Leu Ile Asn Lys Lys Cys
225                 230                 235                 240
Val Phe Thr Lys Cys Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Arg Tyr Phe Val Leu
                245                 250                 255
Lys Lys Glu Glu Ile Leu Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Lys Met Ser
            260                 265                 270
Ile Phe Ser Tyr Ile Val Ser Ile Ile Leu Phe Phe Thr Tyr Ile Ile
        275                 280                 285
Ser Leu Ile Asn Ser Cys Leu Tyr Tyr Ile Ile Cys Thr Pro Lys Leu
    290                 295                 300
Phe Ser Glu Tyr Ile Phe Ser Lys Lys Cys Asp Gly Tyr Leu Gln Asn
305                 310                 315                 320
Ser Ala Tyr Pro Lys Phe Ile Phe Pro Ser Glu Trp His Asn Ile Phe
                325                 330                 335
Arg Ser Phe Met Lys Asn Lys Gln Asn Pro Ser Glu Tyr Tyr Lys Tyr
            340                 345                 350
Arg Glu Ile Leu Leu Ile Arg Ile Ile Asn Leu Ile Ile Asp Ile Phe
        355                 360                 365
Leu Gly Phe Leu Ile Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Asn Val Ile Asn Leu
    370                 375                 380
His Tyr Ile Ser Glu Lys Ala Gln Ile Phe Tyr Gly Thr Ser Thr Leu
385                 390                 395                 400
Thr Ser Ile Leu Gly Thr Leu Leu Gln Asn Pro Leu Gly Phe Lys Leu
                405                 410                 415
Asn Asn Asn Phe Thr Ser Phe Ile Gly Ser Ile Leu Val Ser Ile Leu
            420                 425                 430
Asp Lys Trp Asp Leu Phe Thr Asn Thr Ile Pro Val Asn Asn Ser Thr
        435                 440                 445
Val Leu Asn Phe Val Gly Tyr Thr Ser Leu Leu Gly Phe Ser Phe Phe
    450                 455                 460
Leu Ser Phe Val Ile Asp Tyr Leu Arg Phe Val Thr Ala His Val Thr
465                 470                 475                 480
Ile Ile Tyr Leu Phe Leu Lys Lys Ile Cys Thr Leu Phe His Lys Asn
                485                 490                 495
Met Tyr Ser Leu Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Lys Lys Trp Asn Ile Leu
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Lys Leu Arg Val Asp Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Glu Val Leu Leu
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Gly Thr Ile Leu Phe Thr Ile Leu Ile Phe Leu Tyr Pro Thr Ile Phe
    530                 535                 540
Val Leu Val Leu Val Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Ile Ile Asn Arg Ile
545                 550                 555                 560
Ile Tyr Leu Leu Cys Val Met Glu Lys Ile Ile Leu Tyr Thr Pro Phe
                565                 570                 575
Tyr Ile Phe Phe Ile Gln Pro Asn Cys Asn Lys Tyr Ile Ser Lys Gly
            580                 585                 590
Phe Lys Phe Thr Lys Tyr Glu Val Gly Glu His Glu Leu Leu Lys Arg
        595                 600                 605
Tyr Pro Thr Asn Ser Tyr Leu Leu Leu Glu Lys Ile His Phe Leu Phe
    610                 615                 620
Phe Asp Lys Ile Lys Leu Phe Ile Asn Ile Phe Leu Tyr Phe Lys Asn
625                 630                 635                 640
Leu Glu Ser Met Ser Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Ile Ser Phe Cys Phe
                645                 650                 655
Cys Leu Leu Lys Lys Lys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Ile Ile
            660                 665
<210> 8
<211>1482
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>8
atggggataa aaattataat ttatatattt tttctatcgt gggcgaaatg ggtgtgtggg     60
tctgttaatt ttaccgggtt tgataacaaa aatatgatag gtaagcacgt ggaactagaa    120
gggaggtata aaaaggaata tatagatagg ttttttttag aagaattaag aaaacacaat    180
tatatgaata acaatgttat attattaagt acatcaagac attattttaa ttatagacat    240
accactaatt tattgattgc atataaatat cttaaatatt tcggtgatac tatggataag    300
aatattttat taatgattcc atttgatcaa gcttgtgatt gtaggaatat aagagaaggt    360
caaatatttc gagaatatga attatttcct agtagtcata ataaagaaac aaaaatagaa    420
aatataaatt tatatgagaa tttaaatatt gattataaaa ataataatgt acgtgatgaa    480
caaattagaa gagtacttag acatagatat gatgctttta cacctaaaaa aaatagatta    540
tataataatg gaaataatga gaaaaattta tttctttata tgaccggaca tggtggtgtg    600
aattttttaa aaattcaaga atttaatatt attagttctt ctgaatttaa tatatatata    660
caagaattac ttatcaaaaa tttttataaa tatatattcg taattattga tacgtgtcaa   720
ggatatagtt tttatgatga tattctaaat tttgtatata aaaaaaaaat taataatatc   780
ttctttttat catcttctaa aagaaatgaa aatagttata gtttattttc cagtagttat   840
ttaagcgttt caacggtcga cagatttaca taccattttt ttaattatct tcaacaaata   900
cataaaatat atgaaaaaga acgatctaaa aatataaaag ccttttcatt atataacatt   960
ttaaattatt taaaaacaca acatattatg tcagaaccta ctacaaataa ttctaaattt  1020
aattcgtcca tttttttaca tgataaaaat attcttttct tcaattctaa tttgttaatt  1080
atacataaag atgatgtttc tataatatat caagataaac aaacacacaa tcacaaatat  1140
atatgtttgg ataatctatc taaatgtggt catataaaaa ataatgtaca taaaaaaatg  1200
caaactctat atgaacaaac gttatattat aataataatc aacagaattt cttttctaat  1260
catatgtcta attttacaga ttattttttt acacatgata tatataatat atataatata  1320
tataatgtat ataatatata taatgtatat aatatatata atgtatatga tatatataat  1380
gtatattctt ttcttatatt attgctctct ttatttttta ttatgtgttc tcttcttaca  1440
tattatattg ttttttttac agaaaaggct aaaatgacat aa                     1482
<210>9
<211>493
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>9
Met Gly Ile Lys Ile Ile Ile Tyr Ile Phe Phe Leu Ser Trp Ala Lys
1                5                  10                  15
Trp Val Cys Gly Ser Val Asn Phe Thr Gly Phe Asp Asn Lys Asn Met
            20                  25                  30
Ile Gly Lys His Val Glu Leu Glu Gly Arg Tyr Lys Lys Glu Tyr Ile
        35                  40                  45
Asp Arg Phe Phe Leu Glu Glu Leu Arg Lys His Asn Tyr Met Asn Asn
    50                  55                  60
Asn Val Ile Leu Leu Ser Thr Ser Arg His Tyr Phe Asn Tyr Arg His
65                  70                  75                  80
Thr Thr Asn Leu Leu Ile Ala Tyr Lys Tyr Leu Lys Tyr Phe Gly Asp
                85                  90                  95
Thr Met Asp Lys Asn Ile Leu Leu Met Ile Pro Phe Asp Gln Ala Cys
            100                 105                 110
Asp Cys Arg Asn Ile Arg Glu Gly Gln Ile Phe Arg Glu Tyr Glu Leu
        115                 120                 125
Phe Pro Ser Ser His Asn Lys Glu Thr Lys Ile Glu Asn Ile Asn Leu
    130                  135                 140
Tyr Glu Asn Leu Asn Ile Asp Tyr Lys Asn Asn Asn Val Arg Asp Glu
145                 150                 155                 160
Gln Ile Arg Arg Val Leu Arg His Arg Tyr Asp Ala Phe Thr Pro Lys
                165                 170                 175
Lys Asn Arg Leu Tyr Asn Asn Gly Asn Asn Glu Lys Asn Leu Phe Leu
            180                 185                 190
Tyr Met Thr Gly His Gly Gly Val Asn Phe Leu Lys Ile Gln Glu Phe
        195                 200                 205
Asn Ile Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asn Ile Tyr Ile Gln Glu Leu Leu
    210                 215                 220
Ile Lys Asn Phe Tyr Lys Tyr Ile Phe Val Ile Ile Asp Thr Cys Gln
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Ser Phe Tyr Asp Asp Ile Leu Asn Phe Val Tyr Lys Lys Lys
                245                 250                 255
Ile Asn Asn Ile Phe Phe Leu Ser Ser Ser Lys Arg Asn Glu Asn Ser
            260                 265                 270
Tyr Ser Leu Phe Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Thr Val Asp Arg
        275                 280                 285
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Leu Asn Tyr Leu Lys Thr Gln His Ile Met Ser Glu Pro Thr Thr Asn
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Asn Ser Lys Phe Asn Ser Ser Ile Phe Leu His Asp Lys Asn Ile Leu
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Phe Phe Asn Ser Asn Leu Leu Ile Ile His Lys Asp Asp Val Ser Ile
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Ile Tyr Gln Asp Lys Gln Thr His Asn His Lys Tyr Ile Cys Leu Asp
    370                 375                 380
Asn Leu Ser Lys Cys Gly His Ile Lys Asn Asn Val His Lys Lys Met
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Gln Thr Leu Tyr Glu Gln Thr Leu Tyr Tyr Asn Asn Asn Gln Gln Asn
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Phe Phe Ser Asn His Met Ser Asn Phe Thr Asp Tyr Phe Phe Thr His
            420                 425                 430
Asp Ile Tyr Asn Ile Tyr Asn Ile Tyr Asn Val Tyr Asn Ile Tyr Asn
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Val Tyr Asn Ile Tyr Asn Val Tyr Asp Ile Tyr Asn Val Tyr Ser Phe
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Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Phe Phe Ile Met Cys Ser Leu Leu Thr
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Tyr Tyr Ile Val Phe Phe Thr Glu Lys Ala Lys Met Thr
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<210>10
<211>1494
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Pla smodium falciparum)
<400>10
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acgaatagag aaaatttagt tttgagaaca gaaagtaatc catataaaac gtcagttata    600
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agaataaata ttattgttat aagtaggtta acatatagaa aaggtataga tttgatagtt    720
aaggtaatac cattagtatg tcaaaaatat ccattcataa aatttattat agggggagaa    780
ggtcctaaaa gattgttatt agaagaaatg agagaaaagt atcacttaca taattctgtt    840
gtattattag gaaaagtaaa acaagaaaat gtaaaaaata ttttacaaac tggtcatata    900
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<210>11
<211>497
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>11
Met Glu Ser Ala Val Ser Glu Cys Asn Ile Tyr Lys Lys Glu Lys Asp
1               5                   10                  15
Lys Asn Ile Ile Tyr Lys Gln Glu Arg Lys Cys Cys Ile Cys Met Val
            20                  25                  30
Ser Asp Phe Phe Tyr Pro Asn Leu Gly Gly Ile Glu Thr His Ile Phe
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Glu Leu Ser Lys Asn Leu Ile Lys Lys Gly Phe Lys Val Ile Val Val
    50                  55                  60
Thr Asn Phe Asn Asn Asn Arg His Gly Ile Arg Trp Met Gly Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ile Lys Val Tyr Tyr Leu Pro Phe Gln Pro Phe Leu Asp Val Val Ser
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Phe Pro Asn Ile Ile Gly Thr Leu Pro Leu Cys Arg Asn Ile Leu Tyr
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Arg Glu Lys Val Asp Ile Val His Gly His Gln Ala Thr Ser Ala Leu
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Ala His Gln Phe Ile Leu His Ala Lys Thr Leu Gly Ile Lys Thr Ile
    130                 135                 140
Tyr Thr Asp His Ser Leu Tyr Ser Phe Ser Asp Lys Gly Cys Ile His
145                 150                 155                 160
Val Asn Lys Leu Leu Lys Tyr Cys Ile Asn Asp Val Asp His Ser Ile
                165                 170                 175
Cys Val Ser His Thr A sn Arg Glu Asn Leu yal Leu Arg Thr Glu Ser
            180                 185                 190
Asn Pro Tyr Lys Thr Ser Val Ile Gly Asn Ala Leu Asp Thr Thr Lys
        195                 200                 205
Phe Val Pro Cys Ile Ser Lys Arg Pro Lys Phe Pro Arg Ile Asn Ile
    210                 215                 220
Ile Val Ile Ser Arg Leu Thr Tyr Arg Lys Gly Ile Asp Leu Ile Val
225                 230                 235                 240
Lys Val Ile Pro Leu Val Cys Gln Lys Tyr Pro Phe Ile Lys Phe Ile
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Ile Gly Gly Glu Gly Pro Lys Arg Leu Leu Leu Glu Glu Met Arg Glu
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Gly Leu Leu Val Ile Ser Thr Asp Val Gly Gly Ile Ser Glu Val Leu
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Pro His Asp Met Met Ile Leu Ala Lys Pro Asn His Ile Glu Leu Cys
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Leu Phe His Glu Arg Val Asn Met Ser Leu Leu Thr Tyr Val Asn Ile
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Tyr Ile Tyr Ile Tyr Ile Tyr Ile Tyr Ile Ile Tyr Met Asn Asn Phe
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Met Asn Val Leu Asn Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Phe Asn Arg Ile Arg
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Thr Lys Ile Lys Met Lys Asn Lys Ser Phe Lys Met Ser Ile Tyr Thr
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Thr
<210>12
<211>2361
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>12
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tatggacata tgtcatggga atgggaacct tgtgtagcat taagatcagt gataactcct    240
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gtattataca ttcctaaatt atgtcatggt atatgtgctg ctttgtgtga tttaggtatt    360
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<210>13
<211>786
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>13
Met Ile Tyr Asn Asp Ile Leu Thr Leu Cys Ala Asn Lys Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Leu Ile Asp Ser Lys Ile Phe Ile Trp Leu Leu Ile Phe Phe Arg Ile
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Phe Ile Tyr Tyr Val Leu Phe Leu Phe Leu Lys Leu Ile Asn Ile Asp
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His Pro Val Cys Val Leu Tyr Ile Pro Lys Leu Cys His Gly Ile Cys
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Ala Ala Leu Cys Asp Leu Gly Ile Tyr Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Tyr
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Val Glu Leu Tyr Asn Asp Ala Trp Ile Asn Glu Asp Asn Ile Lys Arg
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Asn Glu Lys Asp Glu Asn Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
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Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Tyr Tyr Tyr His Asn Asn
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His His Ile Asn Ser Thr Tyr Gly Asp Thr Ile Thr Pro Tyr Ile Ile
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Pro Asp Lys Ser Phe Tyr Trp Phe Gly His His His Phe Asn Lys Lys
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Asn Asn Phe Gln Tyr Ile Tyr Gln Asn Ile Asn Leu Ser Cys Leu Asn
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        755                760                 765
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Pro Ser
785
<210>14
<211>1233
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>14
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<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>15
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1               5                   10                  15
Phe Phe Glu Trp Leu Ile Phe Phe Val Gly Ile Ile Ile Arg Ile Ile
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Met Asn Lys Ser Pro Tyr Glu Arg Tyr Thr Tyr Arg Tyr Thr Pro Leu
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Leu Ala Tyr Ile Met Ile Pro Asn Phe Phe Val His Phe Ser Phe Gly
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Leu Asn Tyr Glu Gln Phe Leu Phe Ala Ile Cys Ser Ser Ser Val Phe
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Leu Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Arg Thr Asn Leu Glu Leu Ser Met Phe
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Tyr Phe Ile Trp Cys Ile Pro Phe Leu Pro Ile Ile Leu Cys Ala Ile
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Phe Ile Val Ala Lys Val Gly Ser Lys Arg Phe Leu Leu Leu Tyr Lys
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Tyr Val Phe Ser Tyr Ile Ile Phe Phe Ser
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<210>16
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<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>16
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<211>1283
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>17
Met Lys Ile Lys Asn Asn Ile Lys Lys Lys Asn Asp Asn Leu His His
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Phe Leu Lys His Phe Tyr Tyr Tyr Ser Lys Leu Asn Tyr Tyr His Lys
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Tyr His Met Ser Ala Lys Arg Asn Met Asn Ile Thr Asn Asn Asp Thr
785                 790                 795                 800
Tyr His Thr Ser His Lys Asp Arg Lys Ser Phe Thr Asn Lys Glu Glu
                805                 810                 815
Lys Gln Asn Asn Thr Leu Met Asn Ile Phe Tyr Asn Ile Ile Tyr Phe
            820                 825                 830
Leu Arg Ile Ile Arg Lys Lys Ile Val Gln Tyr Ile Ile Phe Ile His
        835                 840                 845
Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Gly Asn Ile Ile Phe Ile Leu Phe
    850                 855                 860
Lys Leu Phe Pro Lys Ile Ile Thr Asn Ser Phe Gln Ile Leu Arg Ser
865                 870                 875                 880
Asn Tyr Phe Leu Leu Phe Val Ile Ile Trp Ser Cys Cys Glu Met Ser
                885                 890                 895
Phe Asn Tyr Ile Asp Lys Glu Arg Tyr Tyr Ile His Tyr Ile Leu Ile
            900                 905                 910
Val Tyr Val Ile Phe Gly Met Leu Lys Trp Lys Tyr His Arg Val Phe
        915                 920                 925
Asn Ile Leu Lys Ala Phe Ile Leu Leu Val Leu Leu Ile Ile Asn Ala
    930                 935                 940
Leu Tyr Ser His Thr Pro Glu Tyr Phe Asp His Gly Lys Glu Lys Ile
945                 950                 955                 960
Tyr Leu Lys Glu Ser Val Leu Lys Ser Val Phe Pro Ile Ser Ser Tyr
                965                 970                 975
Ile Leu Ser Leu Ile Leu Ile Asn Ser Gly Ile Asn Asn Leu Leu Lys
            980                 985                 990
Lys Arg Ile Lys Ile Ile Ile Thr Gln Ile Trp Thr Leu Gln Tyr Ile
        995                 1000                1005
Leu Val Phe Leu Phe Leu Asn Asn Ile Tyr His Arg Tyr Ile Gln
    1010                1015                 1020
Phe Ile Thr Pro Pro Ser Ile Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Thr Phe
1025                1030                1035
Ile Phe Ile Phe Asn Thr Asn Leu Gly Val Leu Phe Leu Phe Tyr
                1040                1045                1050
Met Thr Phe Leu Phe Phe Tyr Phe Ile Leu Ile Ser Ser Asn Cys
            1055                1060                1065
Ser Glu Asn Met Ile Gln Met Asn Asp Ile Thr Ser Thr Trp Ile
        1070                1075                1080
Asn Glu Asn Ile His Asn Arg Asn Asp Pro Ile Ile Thr Lys Gly
    1085                1090                1095
Asn Leu Glu Asn Lys Glu Lys Cys Thr Ser Cys Asn Thr Ser Ile
1100                1105                1110
Lys Glu Lys Phe Tyr Tyr Lys Leu Met Ile Glu Lys Phe Lys Leu
                1115                1120                1125
Leu Asn Thr Cys Ser Val Leu Asn Glu Glu Glu Ile Met Gly Ile
            1130                1135                1140
Gln Ile Tyr Lys Leu Ile Arg Asp Ile Ser Tyr Phe Tyr Ile Asn
        1145                1150                1155
Glu Thr Asp Phe Tyr Ile Leu Ser Cys Val Leu Leu Ile Tyr Ser
    1160                1165                1170
Phe Phe Ile Thr Gly His Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Pro Leu
1175                1180                1185
Val Ser Gly Tyr Val Gly Leu Tyr Lys Tyr Val Trp Pro Ile Ser
                1190                1195                1200
Gln Phe Tyr Ile Phe Asn His Ile Phe Phe Pro Phe Phe Phe Ser
            1205                1210                1215
Leu Phe Phe Ile Ile Tyr Ile Tyr Asn Ile Arg Arg Ile Lys Ile
        1220                1225                1230
Ile Asn Ser Phe Lys Gln Phe Asp Leu Tyr Tyr Phe Tyr Val Tyr
    1235                1240                1245
Pro Leu Met Asn Phe Ser Phe Lys Ala Ser Phe Leu Phe Cys Cys
1250                1255                1260
Lys Phe Ile Ile Ser Val Trp Val Ser Tyr Tyr Leu Asn Leu His
                1265                1270                1275
Ile Met Val Lys Ile
    1280
<210>18
<211>2433
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>18
atgggatttt cagaaaatcc caaattctgc ctgctcataa ataagcttat caagaaatct    60
aaagttatag gcgttttctt atcaattatt ggtgtgattt tctttttggt gtttaataag   120
tttaataaga atgctgaatt agacgctagg acatttaccc aatttgttgg taattcagta   180
ttgaacaaaa agaatgagaa gttttataat gatacaaatt cttatttcat gaactataca   240
tatgaaggga aagaagatat aataaagttg atatatgatt atattagaaa aaatatatta   300
gtaaatgtag agaatgagat ggttaaaata aaattaacgg atagaattga acagaatata   360
ttgataagta atgtaggatg taaatattgt aataatatgg aaagtttagt tgtggtaata   420
aattttgatt ttaaagaaag gaaatatttt catagcgtaa ttatcggttt aacgttaatg   480
gaacattttt ctaaatgtaa ctatatgagt aaggatgtga cttttttatt taccaataaa   540
gaattattat attctttagg tgttcaagaa tttatacaaa aatattttta taataatact   600
aatagaattg gaaaaaaaat tattagatct tctactatta ttgaatttga ttctatttat   660
ccttcttata ttaaaattaa ttatgaagga ttaaatggta tgttacctaa tcaagactta   720
atattattat taacaaatga acttcatttt tattctattc ctattaaaat ggagcttact   780
catggttcca tatttgatat ggccctagaa aagaattatg aaaatggtca catatacttt   840
ctgaggtaca aaaaaaaata tgaatatata cgtgatgata atgatgaaat caagaacatt   900
cccgcattta ctgcaacggg gggtagcaaa gtacccataa gaaataaaat gattaatttg   960
ttcaacttaa ccaaagcatt acaaagttat ttaagaagtc agagtaatac acatgaaggc  1020
ttttgtcatt cttcaaattt ttattttttt aatacattca gaaggcatat accaataagt  1080
atatattgtt atagtgttta tttaatatgc gcatatagca taatgaaatt atttaaatca  1140
acgatattta gaagctacat aaatttttta acaggtttct acacttattt gattacaata  1200
ttaattattt ccctacctat atatttaatt tcaacaaata aaaaatttta tgagttgttg  1260
aattttgaag aaaattatat tccttcatgt tatgaatggc atcctgataa ttttgataaa  1320
tatataaaaa ttgcaaatat atggtggaat gttttatttt tctcaatttt tggtgcattt  1380
ttttttaatt tatttatttc ttttttagtt aataaaaaaa gaaaagttat accaaaaaaa  1440
aatgatcaaa atgaatcatt tgatggctat aaaaaggtag agaaggtaga acgaatttta  1500
atattagaaa aaatcaaaga attgcaaaat gaaataatga aacgaaaagg tattacaaat  1560
aatcataata atattaaaaa ttataatatt tatacaaatg aaaatatata caataataat  1620
ataaataata taaataataa taataatatt tatgaaaact tatatgataa tggagaagta  1680
aaaaaaaaca ttctggttaa accaaaaatt ataaatagcg atgatgaaga ttttcttctt  1740
gaaaaaaaaa attccgaatt cattaaaaaa atagaaaaac aaatagaaat attagaagaa  1800
aaattggaat ttttaagtaa tgatgaaaat gtaaaatata ttttttataa taattctata  1860
gcaccattta atacaatgat gatatatatg aatatttttt atttcatatt agtagcgcta  1920
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tcacttttta ttctttgtat gtttatttat atgtatccta atgataatca tctttggaat  2100
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gacaagcaca aaatattaca aagcaaatat ttcccagaaa gtttgcaatt tatttgttcg  2220
aataggttat ttgattcatt ttactcaaat aaatattttt tggataatct aaatattaaa  2280
tttagttatg tcttggatat tcaaaatgga ttcttattaa ctttatacaa tttagcaaga  2340
aatcattttt gtattggtac agctacctat cctttaatat gctttacctt attcccaata  2400
gtattttata tagttttttt atttttttgt taa                               2433
<210>19
<211>810
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>19
Met Gly Phe Ser Glu Asn Pro Lys Phe Cys Leu Leu Ile Asn Lys Leu
1               5                    10                 15
Ile Lys Lys Ser Lys Val Ile Gly Val Phe Leu Ser Ile Ile Gly Val
            20                  25                  30
Ile Phe Phe Leu Val Phe Asn Lys Phe Asn Lys Asn Ala Glu Leu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Thr Phe Thr Gln Phe Val Gly Asn Set Val Leu Asn Lys Lys
    50                  55                  60
Asn Glu Lys Phe Tyr Asn Asp Thr Asn Ser Tyr Phe Met Asn Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Glu Gly Lys Glu Asp Ile Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Tyr Ile Arg
                85                  90                  95
Lys Asn Ile Leu Val Asn Val Glu Asn Glu Met Val Lys Ile Lys Leu
            100                 105                 110
Thr Asp Arg Ile Glu Gln Asn Ile Leu Ile Ser Asn Val Gly Cys Lys
        115                  120                125
Tyr Cys Asn Asn Met Glu Ser Leu Val Val Val Ile Asn Phe Asp Phe
    130                 135                 140
Lys Glu Arg Lys Tyr Phe His Ser Val Ile Ile Gly Leu Thr Leu Met
145                 150                 155                 160
Glu His Phe Ser Lys Cys Asn Tyr Met Ser Lys Asp Val Thr Phe Leu
                165                 170                 175
Phe Thr Asn Lys Glu Leu Leu Tyr Ser Leu Gly Val Gln Glu Phe Ile
            180                 185                 190
Gln Lys Tyr Phe Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Ile Gly Lys Lys Ile Ile
        195                  200                 205
Arg Ser Ser Thr Ile Ile Glu Phe Asp Ser Ile Tyr Pro Ser Tyr Ile
    210                 215                 220
Lys Ile Asn Tyr Glu Gly Leu Asn Gly Met Leu Pro Asn Gln Asp Leu
225                 230                 235                 240
Ile Leu Leu Leu Thr Asn Glu Leu His Phe Tyr Ser Ile Pro Ile Lys
                245                 250                 255
Met Glu Leu Thr His Gly Ser Ile Phe Asp Met Ala Leu Glu Lys Asn
            260                 265                 270
Tyr Glu Asn Gly His Ile Tyr Phe Leu Arg Tyr Lys Lys Lys Tyr Glu
        275                 280                 285
Tyr Ile Arg Asp Asp Asn Asp Glu Ile Lys Asn Ile Pro Ala Phe Thr
    290                 295                 300
Ala Thr Gly Gly Ser Lys Val Pro Ile Arg Asn Lys Met Ile Asn Leu
305                 310                 315                 320
Phe Asn Leu Thr Lys Ala Leu Gln Ser Tyr Leu Arg Ser Gln Ser Asn
                325                 330                 335
Thr His Glu Gly Phe Cys His Ser Ser Asn Phe Tyr Phe Phe Asn Thr
            340                 345                 350
Phe Arg Arg His Ile Pro Ile Ser Ile Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Leu
        355                 360                 365
Ile Cys Ala Tyr Ser Ile Met Lys Leu Phe Lys Ser Thr Ile Phe Arg
    370                 375                 380
Ser Tyr Ile Asn Phe Leu Thr Gly Phe Tyr Thr Tyr Leu Ile Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu Ile Ile Ser Leu Pro Ile Tyr Leu Ile Ser Thr Asn Lys Lys Phe
                405                 410                 415
Tyr Glu Leu Leu Asn Phe Glu Glu Asn Tyr Ile Pro Ser Cys Tyr Glu
            420                 425                 430
Trp His Pro Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Ile Lys Ile Ala Asn Ile Trp
        435                 440                 445
Trp Asn Val Leu Phe Phe Ser Ile Phe Gly Ala Phe Phe Phe Asn Leu
    450                 455                 460
Phe Ile Ser Phe Leu Val Asn Lys Lys Arg Lys Val Ile Pro Lys Lys
465                 470                 475                 480
Asn Asp Gln Asn Glu Ser Phe Asp Gly Tyr Lys Lys Val Glu Lys yal
                485                 490                 495
Glu Arg Ile Leu Ile Leu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Gln Asn Glu Ile
            500                 505                 510
Met Lys Arg Lys Gly Ile Thr Asn Asn His Asn Asn Ile Lys Asn Tyr
        515                 520                 525
Asn Ile Tyr Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile
    530                 535                 540
Asn Asn Asn Asn Asn Ile Tyr Glu Asn Leu Tyr Asp Asn Gly Glu Val
545                 550                 555                 560
Lys Lys Asn Ile Leu Val Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Asp Asp Glu
                565                 570                 575
Asp Phe Leu Leu Glu Lys Lys Asn Ser Glu Phe Ile Lys Lys Ile Glu
            580                 585                 590
Lys Gln Ile Glu Ile Leu Glu Glu Lys Leu Glu Phe Leu Ser Asn Asp
        595                 600                 605
Glu Asn Val Lys Tyr Ile Phe Tyr Asn Asn Ser Ile Ala Pro Phe Asn
    610                 615                 620
Thr Met Met Ile Tyr Met Asn Ile Phe Tyr Phe Ile Leu Val Ala Leu
625                 630                 635                 640
Leu Ser Ser Leu Tyr Asn Trp Ser Tyr Ser Val Leu Phe Ser Leu Leu
                645                 650                 655
Phe Val Ile Pro Ile Ser Ile Leu His Asn Leu Lys Thr Lys Pro Val
            660                 665                 670
Arg Ile Phe Lys Lys Ile Ile Leu Ser Leu Phe Ile Leu Cys Met Phe
        675                 680                 685
Ile Tyr Met Tyr Pro Asn Asp Asn His Leu Trp Asn Ile Arg Gln Lys
    690                 695                 700
Leu Thr Asn Leu Phe Arg Asn Asn Ile Ser Lys Cys Cys Lys Tyr Leu
705                 710                 715                 720
Asp Lys His Lys Ile Leu Gln Ser Lys Tyr Phe Pro G1u Ser Leu Gln
                725                 730                 735
Phe Ile Cys Ser Asn Arg Leu Phe Asp Ser Phe Tyr Ser Asn Lys Tyr
            740                 745                 750
Phe Leu Asp Asn Leu Asn Ile Lys Phe Ser Tyr Val Leu Asp Ile Gln
        755                 760                 765
Asn Gly Phe Leu Leu Thr Leu Tyr Asn Leu Ala Arg Asn His Phe Cys
    770                 775                 780
Ile Gly Thr Ala Thr Tyr Pro Leu Ile Cys Phe Thr Leu Phe Pro Ile
785                 790                 795                 800
Val Phe Tyr Ile Val Phe Leu Phe Phe Cys
                805                 810
<210>20
<211>780
<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>20
atggttattc gatttttcct gtttgtcatt acactcttag gcttatgcat aaatatggtg   60
tgttgtaatt ttaaatattc gattatatta cctacttaca atgaaaaaga aaacttacca  120
tatcttattt atatgataat tgatgaatta aataaacatg aaattaaatt tgaaataatt  180
gtaatagatg ataatagtca agatggtact gcagatgtgt acaaaaagtt acaaaacatt  240
tttaaggatg aagaattatt attaatacaa agaaaaggaa aattagggtt aggttctgca  300
tatatggaag gtttaaaaaa tgtaacagga gattttgtta taataatgga tgctgattta  360
tcacatcatc ctaaatatat ttataacttt attaaaaaac aaagagaaaa aaattgtgac  420
attgttacag gcacaagata taagaaccaa ggtggaatat caggatggtc atttaataga  480
attataataa gtagagtagc aaatttttta gctcaatttc tattattcat taatctatca  540
gatttaaccg ggtcttttag attatataaa actaatgtac tgaaggaact tatgcaatct  600
attaataata caggttatgt ttttcaaatg gaagttcttg taagagcata taaaatggga  660
aaatctatag aagaagttgg ttacgttttt gttgatagat tatttggaaa atcaaaactg  720
gaaactacag atattttaca atacttatca ggtcttttca agttattctg gtcaatataa  780
<210>21
<211>259
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>21
Met Val Ile Arg Phe Phe Leu Phe Val Ile Thr Leu Leu Gly Leu Cys
1               5                   10                  15
Ile Asn Met Val Cys Cys Asn Phe Lys Tyr Ser Ile Ile Leu Pro Thr
            20                  25                  30
Tyr Asn Glu Lys Glu Asn Leu Pro Tyr Leu Ile Tyr Met Ile Ile Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Lys His Glu Ile Lys Phe Glu Ile Ile Val Ile Asp Asp
    50                  55                  60
Asn Ser Gln Asp Gly Thr Ala Asp Val Tyr Lys Lys Leu Gln Asn Ile
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asp Glu Glu Leu Leu Leu Ile Gln Arg Lys Gly Lys Leu Gly
                85                  90                  95
Leu Gly Ser Ala Tyr Met Glu Gly Leu Lys Asn Val Thr Gly Asp Phe
            100                 105                 110
Val Ile Ile Met Asp Ala Asp Leu Ser His His Pro Lys Tyr Ile Tyr
         115                120                 125
Asn Phe Ile Lys Lys Gln Arg Glu Lys Asn Cys Asp Ile Val Thr Gly
    130                 135                 140
Thr Arg Tyr Lys Asn Gln Gly Gly Ile Ser Gly Trp Ser Phe Asn Arg
145                 150                 155                 160
Ile Ile Ile Ser Arg Val Ala Asn Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu Phe
                165                 170                 175
Ile Asn Leu Ser Asp Leu Thr Gly Ser Phe Arg Leu Tyr Lys Thr Asn
           180                 185                 190
Val Leu Lys Glu Leu Met Gln Ser Ile Asn Asn Thr Gly Tyr Val Phe
        195                 200                 205
Gln Met Glu Val Leu Val Arg Ala Tyr Lys Met Gly Lys Ser Ile Glu
    210                 215                 220
Glu Val Gly Tyr Val Phe Val Asp Arg Leu Phe Gly Lys Ser Lys Leu
225                 230                 235                 240
Glu Thr Thr Asp Ile Leu Gln Tyr Leu Ser Gly Leu Phe Lys Leu Phe
                245                 250                 255
Trp Ser Ile
<210> 22
<211> 843
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>22
atgacaagat ctccctggaa gcgcctacta tggttgaaac aggagtaccc agataattat    60
acagatccaa gttttattga gttgagagca agacaaaagg ctgagagtaa ccagaagtct    120
gatagaaaat tatcagaagc tgctcgcgct caaattaggt tggattttat aagtttctac    180
caaaccatat tgaacacttc tttcatttac atcactttta catatattta ctattatggc    240
ttcgatccta ttccgccaac tattttcctt tcatttataa cattgattat atcaaggacg    300
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atatggacat tgtctttttg gctgacccta tggtacattt tcgttatttc gtcaacaaag    480
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aatatcattc tacccactta tttatcggtg acgaataagg tagtaccaat aatttcaaat    660
attattgtat actcattttt gaatgttgct ctaggttgga tttatatgct gttgattttc    720
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<210>23
<211>280
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>23
Met Thr Arg Ser Pro Trp Lys Arg Leu Leu Trp Leu Lys Gln Glu Tyr
1               5                    10                 15
Pro Asp Asn Tyr Thr Asp Pro Ser Phe Ile Glu Leu Arg Ala Arg Gln
            20                  25                  30
Lys Ala Glu Ser Asn Gln Lys Ser Asp Arg Lys Leu Ser Glu Ala Ala
        35                  40                  45
Arg Ala Gln Ile Arg Leu Asp Phe Ile Ser Phe Tyr Gln Thr Ile Leu
    50                  55                  60
Asn Thr Ser Phe Ile Tyr Ile Thr Phe Thr Tyr Ile Tyr Tyr Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Phe Asp Pro Ile Pro Pro Thr Ile Phe Leu Ser Phe Ile Thr Leu Ile
                85                  90                  95
Ile Ser Arg Thr Lys Val Asp Pro Leu Leu Ser Ser Phe Met Asp Val
            100                 105                 110
Lys Ser Ser Leu Ile Ile Thr Phe Ala Met Leu Thr Leu Ser Pro Val
        115                 120                 125
Leu Lys Ser Leu Ser Lys Thr Thr A1a Ser Asp Ser Ile Trp Thr Leu
    130                 135                 140
Ser Phe Trp Leu Thr Leu Trp Tyr Ile Phe Val Ile Ser Set Thr Lys
145                 150                 155                 160
Ser Lys Asp Lys Pro Ser Asn Leu Ser Thr Asn Ile Leu Val Ala Leu
                165                 170                 175
Val Ala Val Leu Ser Ser Arg Leu Ser Thr Thr Ile Asp Val Phe Cys
            180                 185                 190
Phe Leu Leu Ile Cys Ile Gln Leu Asn Ile Ile Leu Pro Thr Tyr Leu
        195                 200                 205
Ser Val Thr Asn Lys Val Val Pro Ile Ile Ser Asn Ile Ile Val Tyr
    210                 215                 220
Ser Phe Leu Asn Val Ala Leu Gly Trp Ile Tyr Met Leu Leu Ile Phe
225                 230                 235                 240
Phe Ala Ser Val Phe Tyr Ile Thr Val Leu Pro Lys Trp Phe Ile Tyr
                245                 250                 255
Trp Lys Ile Asn Tyr His Lys Arg Asp Asn Asp Leu Leu Ser Thr Trp
            260                 265                 270
Asp Ala Arg Thr Pro Ile Leu Asp
        275             280
<210>24
<211>764
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>24
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ttagttatcg atgaagacaa gaatggcaat tttataagat ttaccgtttt acctgtatct  120
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tatcaccaaa ttgtacttat tttactactg aatattttgt tctatgtaat ttgcctaaga  240
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atcttaatta taatgggatt gtttgcctta ggtacaatta tacttgtgag gggacctagt  360
gtggaaactg taacaatttt caaagaaagt ggactacagc tgtccagagt gaagggtatg  420
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gaaagaatta ttgatgtagt gatcaatgaa ggattctgtc ggggatttcg agtgatattc  540
tatcttgcag caattgtacg taaatcgtct acgcttaagc tattatttcc agtatgtatt  600
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atctcagtaa gcaagaaaaa cccctgagca gaccaaaaga ttga                     764
<210>25
<211>229
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>25
Met Ile Ser Lys Glu Tyr Glu Phe Gly Lys Thr Ser Ile Leu Asn Arg
1               5               10               15
Lys Lys Tyr Thr Leu Val Ile Asp Glu Asp Lys Asn Gly Asn Phe Ile
            20              25              30
Arg Phe Thr Val Leu Pro Val Ser Asn Arg Lys Phe Lys Lys Val Lys
        35              40              45
Gln Asn Gly Arg Val Glu Ile Asn Met Gly Ile Gln Tyr His Gln Ile
    50              55              60
Val Leu Ile Leu Leu Leu Asn Ile Leu Phe Tyr Val Ile Cys Leu Arg
65              70              75              80
Ser Arg Phe Leu Glu His Ile Asn Arg Thr Phe Glu Val Thr Ile Ala
            85              90              95
Arg Ser Phe Gln Ile Leu Ile Ile Met Gly Leu Phe Ala Leu Gly Thr
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Ile Ile Leu Val Arg Gly Pro Ser Val Glu Thr Val Thr Ile Phe Lys
    115             120             125
Glu Ser Gly Leu Gln Leu Ser Arg Val Lys Gly Met Val Ile Phe Pro
130             135             140
Gln Gln Trp Asn Arg Lys Phe Phe Glu Gln Val Glu Phe Ile Ser Asn
            145             150             155             160
Glu Arg Ile Ile Asp Val Val Ile Asn Glu Gly Phe Cys Arg Gly Phe
        165             170             175
Arg Val Ile Phe Tyr Leu Ala Ala Ile Val Arg Lys Ser Ser Thr Leu
    180             185             190
Lys Leu Leu Phe Pro Ser Asn Leu Pro Ser Ile Asp Asp Gln Arg Leu
195             200             205
Ile Tyr Asn Ile Ser Arg Lys Tyr Leu Ser Lys Gln Glu Lys Pro Leu
            210             215             220
Ser Arg Pro Lys Asp
225
<210>26
<211>423
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>26
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<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>27
Met Tyr Thr Lys Glu Tyr Tyr Trp Phe Ser Gln Tyr Met Ile Ile Thr
1               5               10              15
Ser Thr Leu Val Leu Thr Ile Ile Trp Ser Ile Leu Pro Ser Ser Leu
            20               25              30
Gly Glu Ala Ala Pro Lys Gln Phe Ile Asn Thr Leu Leu Asp Ile Phe
        35              40              45
Pro Gln Arg Arg Trp Ile Ile Thr Leu Glu Ser Ile Met Leu Met Gly
    50              55              60
Met Leu Cys Thr Tyr Ile Gly Leu Leu Met Tyr Asn Glu Asp Thr Leu
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Thr Pro Pro Leu Asp Ser Leu Ser Thr Val Thr Asp Ala Gly Gly Gln
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Leu Val Ile Glu Asp Asp Pro Asp Val Phe Val Lys Lys Trp Ala Phe
        100             105             110
Lys Glu Thr Ser Gly Ile Tyr Asp Leu Ser Leu Met Asp Ala Cys Gln
    115             120             125
Leu Leu Tyr Leu Tyr Asp Asn Asp His Thr Ser Thr
130             135             140
<210>28
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<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>28
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<210>29
<211>304
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>29
Met Lys Met Leu Arg Arg Thr Lys Val Asn Phe Ser Lys Leu Leu Tyr
1               5                   10                 15
Lys Ile Thr Lys Leu Ala Ile Val Leu Thr Ile Leu Tyr Ile Tyr Phe
            20                  25                  30
Thr Pro Lys Ile Val Ser Arg Asn Asn Ala Ser Leu Gln His Ile Phe
        35                  40                  45
Pro His Lys Tyr Gly Asp Tyr Glu Ile Asn Leu Val Ile Ala His Pro
    50                   55                 60
Asp Asp Glu Val Met Phe Phe Ser Pro Ile Ile Ser Gln Leu Asn Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Phe Pro Arg Thr Val Pro Phe Asn Ile Ile Cys Leu Ser Lys Gly
                 85                 90                  95
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            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Leu His Asn Glu Arg Ala Val Ser Val Gln Val Met
        115                 120                 125
Asp Phe Gln Asp Gly Met Asp Glu Ile Trp Asp Ile Asp Ser Ile Thr
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Ser Gln Lys Ile Asp Ile Lys Asn His Asn Leu Asn Gln
145                 150                 155                 160
Ile Ile Val Thr Phe Asp Ser Tyr Gly Val Ser Asn His Ile Asn His
                165                 170                 175
Lys Ser Cys Tyr Ala Ala Val Lys Lys Leu Val Asp Asp Tyr Ala Gln
            180                 185                 190
Pro Lys Thr Lys Arg Asn Glu Gln Pro Pro His Val Thr Ala Leu Tyr
        195                 200                 205
Leu Arg Ser Tyr Lys Asn Asn Ile Val Leu Lys Tyr Asn Ser Phe Ile
    210                 215                 220
Trp Glu Ile Leu Lys Ile Leu Tyr Asp Leu Ile Ser Pro Phe Arg Arg
225                 230                 235                 240
Ile Ile Gln Ala Leu Pro Pro Asn Thr Ala Ala Glu Lys Asp Lys Leu
                245                 250                 255
Ser Leu Met Asn Thr His Ala Gln Tyr Val Leu Ala Phe Ala Thr Met
            260                 265                 270
Leu Asn Ala His Glu Ser Gln Val Val Trp Phe Arg Tyr Gly Trp Trp
        275                 280                 285
Ile Phe Ser Arg Phe Val Phe Val Asn Glu Phe Asp Val Tyr Thr Tyr
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<210>30
<211>2760
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevi siae)
<400>30
atgtggaaca aaaccagaac gacgcttctg gctgttggtg tcttatttca tttattttac     60
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<210>31
<211>919
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>31
Met Trp Asn Lys Thr Arg Thr Thr Leu Leu Ala Val Gly Val Leu Phe
1               5                   10                  15
His Leu Phe Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Asp Ile Tyr Phe Ile Ser Pro
            20                  25                  30
Leu Val His Gly Met Ser Pro Tyr Gln Ser Thr Pro Thr Pro Pro Ala
        35                  40                  45
Lys Arg Leu Phe Leu Ile Val Gly Asp Gly Leu Arg Ala Asp Thr Thr
    50                  55                  60
Phe Asp Lys Val Thr His Pro Val Ser Gly Lys Thr Glu Phe Leu Ala
65                  70                  75                  80
Pro Phe Ile Arg Ser Leu Val Met Asn Asn Ala Thr Tyr Gly Ile Ser
                85                  90                  95
His Thr Arg Met pro Thr Glu Ser Arg Pro Gly His Val Ala Met Ile
            100                 105                 110
Ala Gly Phe Tyr Glu Asp Val Ser Ala Val Thr Lys Gly Trp Lys Ser
        115                 120                 125
Asn Pro Val Asn Phe Asp Ser Phe Phe Asn Gln Ser Thr His Thr Tyr
    130                 135                 140
Ser Phe Gly Ser Pro Asp Ile Leu Pro Met Phe Lys Asp Gly Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Pro Asn Lys Val Asp Thr Trp Met Tyr Asp His Thr Phe Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Thr Gln Ser Ser Ile Glu Leu Asp Ala Phe Val Phe Arg His Leu
            180                 185                 190
Asp Gln Leu Phe His Asn Ser Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asp Tyr Glu
        195                 200                 205
Ile Arg Gln Asp Gly Asn Val Phe Phe Leu His Leu Leu Gly Cys Asp
    210                 215                 220
Thr Ala Gly His Ser Tyr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Tyr Tyr Asp Asn
225                 230                 235                 240
Val Lys Tyr Ile Asp Asp Gln Ile Pro Ile Leu Ile Asp Lys Val Asn
                245                 250                 255
Lys Phe Phe Ala Asp Asp Lys Thr Ala Phe Ile Phe Thr Ala Asp His
            260                 265                 270
Gly Met Ser Ala Phe Gly Ser His Gly Asp Gly His Pro Asn Asn Thr
        275                 280                 285
Arg Thr Pro Leu Val Ala Trp Gly Ala Gly Leu Asn Lys Pro Val His
    290                 295                 300
Asn Pro Phe Pro Val Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Asn Trp Glu Leu Ser
305                 310                 315                 320
Ser Ile Lys Arg Asn Asp Val Lys Gln Ala Asp Ile Ala Ser Leu Met
                325                 330                 335
Ser Tyr Leu Ile Gly Val Asn Tyr Pro Lys Asn Ser Val Gly Glu Leu
            340                 345                 350
Pro Ile Ala Tyr Ile Asp Gly Lys Glu Ser Asp Lys Leu Ala Ala Leu
        355                 360                 365
Tyr Asn Asn Ala Arg Ser Ile Leu Glu Gln Tyr Leu Val Lys Gln Asp
    370                 375                 380
Glu Val Ile Asp Ser Gln Phe Phe Tyr Lys Glu Tyr Phe Lys Phe Val
385                 390                 395                 400
Glu Lys Ser His Ser His Tyr Leu Glu Glu Ile Glu Thr Leu Ile Gln
                405                 410                 415
Arg Ile Ser Glu Gly Glu Asn Tyr Leu Glu Gln Glu Ala Ile Thr Leu
            420                 425                 430
Thr Glu Glu Leu Met Gln Ile Thr Leu Glu Gly Leu His Tyr Leu Thr
        435                 440                 445
Thr Tyr Asn Trp Arg Phe Ile Arg Thr Ile Val Thr Phe Gly Phe Val
    450                 455                 460
Gly Trp Ile Phe Phe Ser Phe Ile Ile Phe Leu Lys Ser Phe Ile Leu
465                 470                 475                 480
Glu Asn Val Ile Asp Asp Gln Lys Ala Ser Pro Leu Ser His Ala Val
                485                 490                 495
Phe Gly Ser Ile Gly Ile Leu Leu Asn Trp Ile Leu Phe Tyr Gln His
            500                 505                 510
Ser Pro Phe Asn Phe Tyr Met Tyr Leu Leu Phe Pro Leu Tyr Phe Trp
        515                 520                 525
Ser Tyr Ile Phe Thr Asn Arg Ser Val Leu Arg Ser Gly Ile Lys Glu
    530                 535                 540
Phe Phe Lys Gly Thr Ser Pro Trp Lys Arg Val Leu Ile Thr Ile Ser
545                 550                 555                 560
Ile Ile Ser Val Tyr Glu Gly Ile Val Tyr Gly Phe Phe His Arg Trp
                565                 570                 575
Thr Phe Thr Leu Ile Thr Asn Ile Leu Ala Phe Tyr Pro Phe Ile Cys
            580                 585                 590
Gly Val Arg Glu Leu Ser Val Asn Ile Leu TrpIle Ile Thr Ser Val
        595                 600                605
Leu Leu Ser Thr Phe Thr Leu Phe Asp Ala Val Lys Ile Glu Asp Leu
    610                 615                 620
Asn Gln Ile His Leu Ala Gly Leu Leu Ile Ile Leu Ser Ala Phe Tyr
625                 630                 635                 640
Ala Leu Tyr Lys Ile His Ser Arg Ile Asn Ser Tyr Thr Arg Ala Ile
                645                 650                 655
Phe Ala Ile Gln Ile Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Ala Val Thr His
            660                 665                 670
Arg Ser Val Ile Ser Leu Gln Leu Arg Gln Gly Leu Pro Arg Glu Ser
        675                 680                 685
Gln Val Ala Gly Trp Ile Ile Phe Phe Val Ser Leu Phe Val Met Pro
    690                 695                 700
Ile Leu His Tyr Arg Lys Pro Asn Asn Asp Tyr Lys Val Arg Leu Leu
705                 710                 715                 720
Ile Ile Tyr Leu Thr Phe Ala Pro Ser Phe Ile Ile Leu Thr Ile Ser
                725                 730                 735
Phe Glu Ser Leu Phe Tyr Phe Leu Phe Thr Ser Tyr Met Val Gln Trp
            740                 745                 750
Ile Glu Ile Glu Asn Lys Ile Lys GIu Met Lys Thr Gln Lys Asp Glu
        755                 760                 765
Asn Trp Leu Gln Val Leu Arg Val Ser Val Ile Gly Phe Phe Leu Leu
    770                 775                 780
Gln Val Ala Phe Phe Gly Thr Gly Asn Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe
785                 790                 795                 800
Ser Leu Glu Ser Val Cys Arg Leu Leu Pro Ile Phe Asp Pro Phe Leu
                805                 810                 815
Met Gly Ala Leu Leu Met Leu Lys Leu Ile Ile Pro Tyr Gly Leu Leu
            820                 825                 830
Ser Thr Cys Leu Gly Ile Leu Asn Leu Lys Leu Asn Phe Lys Asp Tyr
        835                 840                 845
Thr Ile Ser Ser Leu Ile Ile Ser Met Ser Asp Ile Leu Ser Leu Asn
    850                 855                 860
Phe Phe Tyr Leu Leu Arg Thr Glu Gly Ser Trp Leu Asp Ile Gly Ile
865                 870                 875                 880
Thr Ile Ser Asn Tyr Cys Leu Ala Ile Leu Ser Ser Leu Phe Met Leu
                885                 890                 895
Ile Leu Glu Val Leu Gly His Val Leu Leu Lys Asn Val Ile Ile Gln
            900                 905                 910
Asp Lys Thr Lys Lys Thr Gln
    915
<210>32
<211>660
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>32
atgccagcta aaaaaaggac tagaaagaca gtgaaaaaaa ccgtatcatt ctccgatgac     60
acaacattaa caacgcacca aaatcgtgag aaaaagaacg tagatcatga tcgtccacct    120
gtgtatgtga ggaaaacccc tctgatgaca tttccatacc atttagtagc actactttat    180
tactacgttt ttgtatcttc aaatttcaat acggtgaagt tgctaagttt tttgattcct    240
acacaagttg cttatttagt tttacaattc aataaatgca cagtttacgg taacaaaatc    300
attaagatca attactcatt gaccattatt tgtctaggtg ttacattttt gttgagcttt    360
cccacaatgt tattaactat attatttggt gcgccattaa tggacttatt gtgggaaacc    420
tggctgttgt cactgcattt tgcattttta gcataccctg cagtttattc tgtatttaat    480
tgtgatttca aagtgggatt atggaagaag tattttatct ttatcgttgt agggggttgg    540
attagttgtg ttgtcattcc tttggattgg gatagagatt ggcagaattg gccaattcct    600
 attgttgttg gaggttattt gggcgctttg gtgggctata ctatcggtgc ctatatataa    660
<210>33
<211>219
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>33
Met Pro Ala Lys Lys Arg Thr Arg Lys Thr Val Lys Lys Thr Val Ser
 1              5                    10                 15
Phe Ser Asp Asp Thr Thr Leu Thr Thr His Gln Asn Arg Glu Lys Lys
            20                   25                 30
Asn Val Asp His Asp Arg Pro Pro Val Tyr Val Arg Lys Thr Pro Leu
        35                  40                   45
Met Thr Phe Pro Tyr His Leu Val Ala Leu Leu Tyr Tyr Tyr Val Phe
    50                  55                   60
Val Ser Ser Asn Phe Asn Thr Val Lys Leu Leu Ser Phe Leu Ile Pro
65                  70                  75                  80
Thr Gln Val Ala Tyr Leu Val Leu Gln Phe Asn Lys Cys Thr Val Tyr
                85                  90                   95
Gly Asn Lys Ile Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Leu Thr Ile Ile Cys Leu
            100                 105                 110
Gly Val Thr Phe Leu Leu Ser Phe Pro Thr Met Leu Leu Thr Ile Leu
        115                 120                 125
Phe Gly Ala Pro Leu Met Asp Leu Leu Trp Glu Thr Trp Leu Leu Ser
    130                 135                 140
Leu His Phe Ala Phe Leu Ala Tyr Pro Ala Val Tyr Ser Val Phe Asn
145                 150                 155                 160
Cys Asp Phe Lys Val Gly Leu Trp Lys Lys Tyr Phe Ile Phe Ile Val
                165                 170                 175
Val Gly Gly Trp Ile Ser Cys Val Val Ile Pro Leu Asp Trp Asp Arg
            180                 185                 190
A sp Trp Gln Asn Trp Pro Ile Pro Ile Val Val Gly Gly Tyr Leu Gly
         195                 200                 2 05
Ala Leu Val Gly Tyr Thr Ile Gly Ala Tyr Ile
    210                 215
<210> 34
<211> 2493
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 34
atgaacttga agcagttcac gtgcctatca tgcgctcaat tactcgctat tctgctcttt    60
atctttgctt ttttccctag aaaaatcgtg ctgacaggta tatcaaagca agatccggat    120
caagaccgtg atctccagcg cgataggccc ttccagaaat tggtgtttgt gatcattgat    180
gctctcagat cagactttct ttttgattcg cagatttccc acttcaacaa cgtgcaccaa    240
tggctcaata cgggcgaagc atggggttac acgtcatttg ctaatccgcc taccgtgacg    300
ctgcctagac tcaaaagtat tactacggga tctacaccta gcttcattga cttgctgctg    360
aatgtagccc aggacataga ttccaacgat ctttcggagc acgattcctg gctgcagcag    420
ttcatccaac ataataacac gattcgtttc atgggcgatg acacctggct gaaactgttc    480
ceacagcaat ggtttgactt cgctgacccg acacactcgt tctttgtcag tgatttcact    540
caagtcgata ataatgtgac gaggaacttg cccgggaaat tatttcagga atgggcccag    600
tgggacgtgg ctatcctgca ttacttgggt cttgaccata tcgggcataa agatggcccg    660
cattcaaagt ttatggctgc taaacatcaa gaaatggaca gcattctgaa gtcaatatat    720
gatgaagtgt tggaacatga agatgacgat gatacactga tttgtgttct tggcgaccat    780
ggaatgaacg aactgggcaa ccatggtggc tcttcagccg gcgaaacatc agcaggattg    840
ttgtttttgt cacctaagct ggcgcaattt gctaggccag aatcgcaagt aaactacaca    900
ttgcccatca acgctagtcc ggactggaat ttccagtatt tagagactgt tcaacaaatt    960
gatatcgtcc ccaccatagc agcactgttt ggtatgccaa tccccatgaa cagtgttggg    1020
ataataatac ctgacttttt acaactgttg cccaataagt tggcaagtat gaaagaaaat    1080
tttatgcatt tgtggaaatt atcagaccat cacggcgagg ttgctcttga cgatttcact    1140
gccgaagata tttatacaaa gatgtacact attcaagaaa cgttaaccaa gtctgcaaca    1200
aattataatt atcctctttt gacactggct tttgttggtt tcctcataat aacaatcatc    1260
gccatttatg tattattacg ttattctggg cctgattttt ggcagttgcg cgtttcttcc    1320
ctgtctgttc tgttagtttc cattatacta ggcgtttcca catttgcaag tagtttcatt    1380
gaagaggagc accaactgtg gtggtggata gtaactgcat tctcggcggt ccctctgttc    1440
gtataccgat tgaatgtgct cataatcgtg cgctggttta taatgatggc atgcgtacgc    1500
tcaatcaagt tttggaataa cagtggccag aaattcattt attctaacgt tatgtccaat    1560
ctacttaatc agaatccttc ctggaagtgg tgcttaaata tgttgacatt tctagtgctg    1620
ataatggcat ctgctggttt tcaagtacta cattttattg tcactactat tttggtgggg    1680
ttgtgtttca cgtacaaaat ctcgtgggaa atcgtcaatg gtaaccaggc agaaataccg    1740
ctctttatgc atgatttact ggctaagata gactttgcac caactgaaag taacttgatt    1800
gtacttgcgc gcgttttctt ccaagcttgg gctattgttg tcatttcaag gttggtcctg    1860
acgaaattga aagtacttaa caagaactac ctcattaaag atatgaaagt ttatataaca    1920
attcttttga tgttccaaac ttcttctcag aacataggtc aatttctcgt tttccaaata    1980
ttagagtccc aaatttttta ctttttccaa aatattccaa ccgcctcatt aacatcaaca    2040
agtaagattt atttttcgaa tttggtgtcc ttaattttac aaaattttac atttttccaa    2100
ttcggtggca caaattccat ttctactata gaccttggaa acgcatacca tggtgtttcc    2160
tcagactaca acatctacgt agtggggata ttaatgtccg  ttgccaattt cgcgccggca   2220
atatactggt ccatgctacc gtggtcaata aactacgcct ctattccagc acaagttaag    2280
ttgcaaacgt tcatcagaag taagttacct gccttcacct atcattgtat atttggaact    2340
tgtttgatga cggcatgcgt cgttttgaga tttcatctet  ttatttggtc cgttttcagt   2400
ccaaaattat gttattttct tgggtggaat tttgtgatgg gattgctgaa tggctggtta    2460
cctgaattgg ccctcctttg cgctcttgat taa                                 2493
<210>35
<211> 830
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 35
Met Asn Leu Lys Gln Phe Thr Cys Leu Ser Cys Ala Gln Leu Leu Ala
1                 5                 10                  15
Ile Leu Leu Phe Ile Phe Ala Phe Phe Pro Arg Lys Ile Val Leu Thr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Lys Gln Asp Pro Asp Gln Asp Arg Asp Leu Gln Arg Asp
        35                  40                  45
Arg Pro Phe Gln Lys Leu Val Phe Val Ile Ile Asp Ala Leu Arg Ser
    50                   55                 60
Asp Phe Leu Phe Asp Ser Gln Ile Ser His Phe Asn Asn Val His Gln
65                  70                  75                  80
Trp Leu A sn Thr Gly Glu Ala Trp Gly Tyr Thr Ser Phe Ala Asn Pro
                 85                  90                  95
Pro Thr Val Thr Leu Pro Arg Leu Lys Ser Ile Thr Thr Gly Ser Thr
            100                 105                 110
Pro Ser Phe Ile Asp Leu Leu Leu Asn Val Ala Gln Asp Ile Asp Ser
        115                 120                 125
Asn Asp Leu Ser Glu His Asp Ser Trp Leu Gln Gln Phe Ile Gln His
    130                 135                 140
Asn Asn Thr Ile Arg Phe Met Gly Asp Asp Thr Trp Leu Lys Leu Phe
145                 150                 155                 160
Pro Gln Gln Trp Phe Asp Phe Ala Asp Pro Thr His Ser Phe Phe Val
               165                  170                 175
Ser Asp Phe Thr Gln Val Asp Asn Asn Val  Thr Arg Asn Leu Pro Gly
            180                 185                  190
Lys Leu Phe Gln Glu Trp Ala Gln Trp Asp Val Ala Ile Leu His Tyr
        195                 200                 205
Leu Gly Leu Asp His Ile Gly His Lys Asp Gly Pro Hi s Ser Lys Phe
    210                 215                 220
Met Ala Ala Lys His Gln Glu Met Asp Ser Ile Leu Lys Ser Ile Tyr
225                 230                 235                 240
Asp Glu Val Leu Glu Hi s Glu Asp Asp Asp Asp Thr Leu Ile Cys Val
                245                 250                  255
Leu Gly Asp His Gly Met Asn Glu Leu Gly Asn Hi s Gly Gly Ser Ser
            260                 265                 270
Ala Gly Glu Thr Ser Ala Gly Leu Leu Phe Leu Ser Pro Lys Leu Ala
        275                 280                 285
Gln Phe Ala Arg Pro Glu Ser Gln Val Asn Tyr Thr Leu Pro Ile Asn
    290                 295                 300
Ala Ser Pro Asp Trp Asn Phe Gln Tyr Leu Glu Thr Val Gln Gln Ile
305                 310                 315                 320
Asp Ile Val Pro Thr Ile Ala Ala Leu Phe Gly Met Pro Ile Pro Met
                325                 330                 335
Asn Ser Val Gly Ile Ile Ile Pro Asp Phe Leu Gln Leu Leu Pro Asn
            340                 345                 350
Lys Leu Ala Ser Met Lys Glu Asn Phe Met Hi s Leu Trp Lys Leu Ser
        355                 360                 365
Asp His His Gly Glu Val Ala Leu Asp Asp Phe Thr Ala Glu Asp Ile
    370                 375                 380
Tyr Thr Lys Met Tyr Thr Ile Gln Glu Thr Leu Thr Lys Ser Ala Thr
385                 390                 395                 400
Asn Tyr Asn Tyr Pro Leu Leu Thr Leu Ala Phe Val Gly Phe Leu Ile
                405                 410                 415
Ile Thr Ile Ile Ala Ile Tyr Val Leu Leu Arg Tyr Ser Gly Pro Asp
            420                 425                 430
Phe Trp Gln Leu Arg Val Ser Ser Leu Ser Val Leu Leu Val Ser Ile
        435                 440                  445
Ile Leu Gly Val Ser Thr Phe Ala Sel  Ser Phe Ile Glu Glu Glu His
    450                 455                 460
Gln Leu Trp Trp Trp Ile Val Thr Ala Phe Ser Ala Val Pro Leu Phe
465                 470                 475                 480
Val Tyr Arg Leu Asn Val Leu Ile Ile Val Arg Trp Phe Ile Met Met
                485                 490                 495
Ala Cys Val Arg Ser Ile Lys Phe Trp Asn Asn Ser Gly Gln Lys Phe
            500                 505                 510
Ile Tyr Ser Asn Val Met Ser Asn Leu Leu Asn Gln Asn Pro Ser Trp
        515                 520                 525
Lys Trp Cys Leu Asn Met Leu Thr Phe Leu Val Leu Ile Met Ala Ser
    530                 535                 540
Ala Gly Phe Gln Val Leu His Phe Ile Val Thr Thr Ile Leu Val Gly
545                 550                 555                 560
Leu Cys Phe Thr Tyr Lys Ile Ser Trp Glu Ile Val A sn Gly Asn Gln
                565                 570                 575
Ala Glu Ile Pro Leu Phe Met His Asp Leu Leu Ala Lys Ile Asp Phe
           580                  585                  590
Ala Pro Thr Glu Ser Asn Leu Ile Val Leu Ala Arg Val Phe Phe Gln
        595                 600                 605
Ala Trp Ala Ile Val Val Ile Ser Arg Leu Val Leu Thr Lys Leu Lys
    610                 615                 620
Val Leu Asn Lys Asn Tyr Leu Ile Lys Asp Met Lys Val Tyr Ile Thr
625                 630                 635                 640
Ile Leu Leu Met Phe Gln Thr Ser Ser Gln Asn Ile Gly Gln Phe Leu
                645                 650                 655
Val Phe Gln Ile Leu Glu Ser Gln Ile Phe Tyr Phe Phe Gln Asn Ile
            660                 665                 670
Pro Thr Ala Ser Leu Thr Ser Thr Ser Lys  Ile Tyr Phe Ser Asn Leu
        675                 680                 685
Val Ser Leu Ile Leu Gln Asn Phe Thr Phe Phe Gln Phe Gly Gly Thr
    690                 695                 700
Asn Ser Ile Ser Thr Ile Asp Leu Gly Asn Ala Tyr Hi s Gly Val Ser
 705                 710                 715                 720
Ser Asp Tyr Asn Ile Tyr Val Val Gly Ile Leu Met Ser Val Ala Asn
                725                 730                 735
Phe Ala Pro Ala Ile Tyr Trp Ser Met Leu Pro Trp Ser Ile Asn Tyr
            740                 745                 750
Ala Ser Ile Pro Ala Gln Val Lys Leu Gln Thr Phe Ile Arg Ser Lys
        755                 760                 76 5
Leu Pro Ala Phe Thr Tyr Hi s Cys Ile Phe Gly Thr Cys Leu Met Thr
    770                 775                 780
Ala Cys Val Val Leu Arg Phe Hi s Leu Phe Ile Trp Ser Val Phe Ser
785                 790                 795                 800
Pro Lys Leu Cys Tyr Phe Leu Gly Trp Asn Phe Val Met Gly Leu Leu
                805                 810                 815
Asn Gly Trp Leu Pro Glu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp
            820                 825                 830
<210>36
<211> 1605
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>36
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<210> 37
<211>534
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 37
Met Ser Asn Ala Asn Leu Arg Lys Trp Val Gly Phe Cys Phe Val Ala
1                5                   10                 15
Ile Tyr Leu Phe Leu Gly Val Pro Leu Trp Tyr Lys Leu Thr Thr Val
            20                   25                  30
Tyr Arg Ala Ser Leu Pro Ile Asn Tyr Ile Glu Ser Leu Gln Asn Asn
         35                 40                  45
Lys Phe Gln Asp Ile His Leu Val Ile Pro Val Tyr Val Lys Ser Asp
    50                   55                  60
Thr Tyr Arg Phe Pro Asp Val Hi s Asp Ala Ile Gln Val Gln Val Asn
65                 70                 75                  80
His Leu Leu Asn Set Gln Glu Gln Arg Val Pro Trp Ser Leu Gln Val
                 85                 90                  95
Leu Pro Tyr Asn Glu Thr Ile Glu Gln Met Glu Ser Glu Gly Asn Gln
            100                 l05                 110
Phe His Val Val Thr Leu Lys Leu Asp Glu Phe Ile Gly Tyr Ser Ser
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Ala Tyr Asp Thr Lys Glu Thr Leu Val Tyr Tyr Asp Asp Ala Ala Val
    130                 135                 140
Leu Ser Asn Asp Leu Pro Phe Phe Val Ala Gln Thr Leu Val Glu His
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Thr Phe Gln Leu Glu Trp Thr Hi s Leu Asn Lys Thr Cys Glu Gly Val
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Ser Thr Asn Asn Asp Val Ala Ile Ser Tyr Asp Pro Asn Ile His Leu
            180                 185                 190
Ser Val Thr Leu Leu Ser Gly Asp Gly Asn Pro Val Ala Trp Glu Ile
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Glu Pro Thr Leu Thr Asp Tyr Phe Ser Pro Phe Arg Lys Phe Leu Ser
    210                 215                 220
Pro Leu Val Asn Phe Thr Val Asp Ser Ser Ile Val Tyr His Asn Asp
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                245                 250                 255
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Ser Glu Asp Tyr Leu Glu Pro Met Met Tyr Arg Phe Ala Thr Asp Ile
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Phe Gln Gly Met Ser Ile Pro Arg Glu Val Ser Asp Asn Val Ile Glu
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Ala Leu Asp Leu Arg Leu Gln Ile Ile Asp Leu Leu Asn Asp Pro Gly
            420                 425                 430
Lys Gly Gly Asp Ile Val Trp Asn Asn Ala Leu Hi s Leu Ser Asn Glu
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Gln Asn Phe Phe Pro Gln Glu Hi s MetIle Ala Val Tyr Leu Pro Leu
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Leu Gly Pro Ile Ser Ala Val Met Phc Phe Gly Phe Tyr Asn Val Met
                485                 490                 495
Lys Glu Lys Asn Gln Lys Ser Lys Lys Asn Gly Thr Glu Arg Glu Val
            500                 505                 51 0
Ala Lys Glu Lys Leu Glu Leu Lys Glu Ala Gln Lys Leu His Ala Ile
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Asp Gly Glu Asp Glu Leu
    530
<210> 38
<211> 1833
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 38
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gcaggtgcct caggtgtgga attgtggtcg caagtgcagg ccatggatca ggaacaggcg    420
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<210> 39
<211> 610
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 39
Met Ile Leu Thr Leu Ala Tyr Phe Met Leu Gly Thr Leu Leu Leu Gly
1               5                   10                  l5
Val Phe Ala Glu Asp Thr Val Ser Gln Ile Gly Ile Asn Asp Ser Leu
            20                  25                   30
Trp Tyr Pro Tyr Asp Glu Ala Leu Val Leu Lys Pro Leu Pro Asn Asn
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Leu Ser Phe Ala Phe Gln Leu Gln Ser Glu Pro Phe Asp
    50                  55                  60
Pro Ala Val Ser Ser Met Ser Tyr Asp Ala Tyr Glu Hi s Tyr Thr Thr
65                  70                  75                    80
Phe Pro Arg Ala Ile Pro Pro Leu Leu Glu Ser Thr Ala Thr Arg Gln
                85                   90                 95
Phe His Leu Arg Phe Thr Arg Gly Phe Trp Asp Ala Leu Ser Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Leu Pro Hi s Ala Gly Lys Glu Ala Gly Ala Ser Gly Val Glu Leu
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Trp Ser Gln Val Gln Ala Met Asp Gln Glu Gln Ala Phe Hi s Asn Trp
    130                 135                 140
Lys Lys Leu Ser Asn Ser Leu Ser Gly Leu Phe Cys Ser Ser Leu Asn
145                 150                 155                 160
Phe Ile Asp Glu Ser Arg Thr Thr Phe Pro Arg Arg Ser Tyr Al a Ser
                165                 170                 175
Asp Ile Gly Ala Pro Leu Phe Asn Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Leu Met
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Leu Pro Asn Glu Pro Ile Cy s Thr Glu Asn Leu Thr Pro
        195                 2 00                 205
Phe Ile Lys Leu Leu Pro Thr Arg Gly Lys Ser Gly Leu Thr Ser Leu
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Leu Asp Gly His Lys Leu Phe Asp Ser Leu Trp Asn Ser Ile Ser Leu
225                 230                 235                 240
Asp Ile Ala Thr Ile Cys Ser Glu Asp Glu Asp Ala Leu Cys His Tyr
                245                 250                 255
Glu Met Asp Ala Arg Ile Glu Met Val Thr Hi s Val Pro Ser Ala Leu
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Ala Arg Gly Glu Arg Pro Ile Pro Lys Pro Leu Asp Gly Asn Thr Leu
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Arg Cys Asp Thr Asp Lys Pro Phe Asp Ser Tyr Gln Cy s Phe Pro Leu
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Pro Glu Pro Ser Gln Thr Hi s Phe Lys Leu Ser Gln Leu Phe Ala Arg
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Pro Ile Asn Asn Gly Asn Leu Phe Ala Asn Arg Pro Thr Arg Ile Cys
                325                 33 0                 335
Ala Glu Val Asp Arg Ser Thr Trp Thr Ala Phe Leu Ser Val Asp Asp
            340                 345                 350
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        355                  360                 365
Asn Glu Gly Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Ile Leu Glu Ser Thr A sp Thr
    370                 375                 380
Thr Lys Val Thr Pro Ile Val Pro Val Pro Ile Hi s Val Ser Arg Ser
385                 390                 395                 400
Leu Thr Gly Asn Gly Gln Asp Arg Gly Gly Met Arg Ile Val Phe His
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Ile Pro Ala Asn Thr Asp Ile Val Met Thr Tyr Gln Phe Asp Lys Ala
                485                 490                 495
Leu Leu Gln Phe Ala Glu Tyr Pro Pro Asp Ala Asn His Gly Phe Glu
            500                 505                 510
Ile Asp Ala Ala Val  Ile Thr Val Leu Ser Leu Glu Ser Ser Ser Ser
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Leu Tyr Glu Met Arg Thr Ser Thr Leu Leu Leu Ser Leu Ser Thr Pro
    530                 535                 540
Asp Phe Ser Met Pro Tyr Asn Val Ile Ile Leu Thr Ser Thr Ile Met
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Gly Leu Ile Phe Gly Met Leu Tyr Asn Leu Met Val Lys Arg Met Val
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Thr Val Glu Glu Ala Asp Lys Ile Thr Leu Gln Ser Gly Leu Lys Tyr
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Lys Leu Leu Lys Leu Lys Glu Lys Phe Leu Gly Lys Lys Lys Thr Lys
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Thr Asp
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agcctttttc cctctctaca acaacaactg gaccagtctg tagaattctc aactcccgta    120
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gataacggta tcccaaattt caaattgaag gtaacacaaa tttaa                    1185
<210>41
<211>394
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>41
Met Asp Ser Thr Ala Leu Lys Val Ala Leu Gly Cys Ile Ala Ile Arg
1               5                   10                  15
Leu Ala Val Asn Ser Leu Phe Pro Ser Leu Gln Gln Gln Leu Asp Gln
            20                  25                  30
Ser Val Glu Phe Ser Thr Pro Val Thr Ser Phe Arg Ser Leu Gln Glu
        35                  40                  45
Gly Ile Tyr Leu Leu Arg Asn Asn Ile Gln Val Tyr Asn His Gly Val
    50                  55                  60
Val His His Pro Pro Ile Leu Ile Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Asp Arg Leu Ile Ser Leu Ile Tyr Ala Leu Ile Asp Gly Leu Ile Ala
                85                  90                  95
Tyr Gln Leu Thr Glu Val Thr Lys Ala Phe Lys Asn Leu Lys Leu Lys
            100                 105                 110
Val Trp Leu Pro Gly Leu Leu Tyr Ala Val Asn Pro Leu Thr Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Cys Ile Ser Arg Ser Ser Ile Ile Phe Thr Asn Phe Ala Ile Ser
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Tyr Cys Ile Leu Ala Glu Gly Asn Val Leu Leu Ser Ser
145                 150                 155                 160
Val Met Ile Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Val Tyr Pro Ile Leu Leu
                165                 170                 175
Leu Ile Pro Leu Leu Gly Met Leu Lys Ser Trp Arg Gln Arg Ile Leu
            180                 185                 190
Ser Ala Ile Val Ser Ile Leu Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu Phe Ser
        195                 200                 205
Tyr Ser Ile Leu Gly Ser Gln Ser Trp Ser Phe Leu Thr Gln Val Tyr
    210                 215                 220
Gly Ser Ile Ile Thr Phe Glu Lys Val Phe Pro Asn Leu Gly Leu Trp
225                 230                 235                 240
Trp Tyr Phe Phe Ile Glu Met Phe Asp Thr Phe Ile Pro Phe Phe Lys
                245                 250                 255
Ala Val Phe Asn Ile Phe Ile Ala Val Phe Ile Thr Pro Phe Thr Leu
            260                 265                 270
Arg Tyr His Lys Gln Pro Phe Tyr Ala Phe Ile Leu Cys Ile Gly Trp
        275                 280                 285
Ile Val Leu Thr Lys Pro Tyr Pro Ser Leu Gly Asp Ala Gly Phe Phe
    290                 295                 300
Phe Ser Phe Leu Pro Phe Phe Thr Pro Leu Phe Gly Tyr Leu Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Pro Ile Ile Ser Ala Leu Leu Phe Leu His Ala Ile Val Leu Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Phe Tyr His Leu Trp Val Val Leu Gly Ser Gly Asn Ser Asn Phe
            340                 345                 350
Phe Tyr Ala Ile Ser Leu Val Tyr Ala Leu Ala Ile Ala Ser Ile Leu
        355                 360                 365
Val Asp Leu Asn Trp Ala Met Leu Arg Ile Glu Tyr Asp Asn Gly Ile
    370                 375                 380
Pro Asn Phe Lys Leu Lys Val Thr Gln Ile
385                 390
<210>42
<211>255
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>42
atggccacgg ggacagacca ggtggtggga ctcggcctcg tcgccgttag cctgatcatc     60
ttcacctact acaccgcctg ggtgattctc ttgccattca tcgacagtca gcatgtcatc    120
cacaagtatt tcctgccccg agcctatgct gtcgccatcc cactggctgc aggcctcctg    180
ctgctcctgt ttgtgggact gttcatctcc tatgtgatgc tgaagaccaa gagagtgacc    240
aagaaggctc agtga                                                        255
<210>43
<211>84
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>43
Met Ala Thr Gly Thr Asp Gln Val yal Gly Leu Gly Leu Val Ala Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Ile Phe Thr Tyr Tyr Thr Ala Trp Val Ile Leu Leu Pro
            20                  25                  30
Phe Ile Asp Ser Gln His Val Ile His Lys Tyr Phe Leu Pro Arg Ala
        35                  40                  45
Tyr Ala Val Ala Ile Pro Leu Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Phe
    50                  55                  60
Val Gly Leu Phe Ile Ser Tyr Val Met Leu Lys Thr Lys Arg Val Thr
65                  70                  75                  80
Lys Lys Ala Gln
<210>44
<211>369
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>44
atgctctccg tgggcgggct tcggttgagt ttggtccgct tttcctttct gctcctcagg    60
ggagcattgc ttccttctct cgcagtgacc atgacgaaat tagcgcagtg gctttgggga    120
ctagcgatcc tgggctccac ctgggtggcc ctgaccacgg gagccttggg cctggagctg    180
cccttgtcct gccaggaagt cctgtggcca ctgcccgcct acttgctggt gtccgccggc    240
tgctatgccc tgggcactgt gggctatcgt gtggccactt ttcatgactg cgaggacgcc    300
gcacgcgagc tgcagagcca gatacaggag gcccgagccg acttagcccg cagggggctg    360
cgct tctga                                                           369
<210>45
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>45
Met Leu Ser Val Gly Gly Leu Arg Leu Ser Leu Val Arg Phe Ser Phe
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Arg Gly Ala Leu Leu Pro Ser Leu Ala Val Thr Met Thr
            20                  25                  30
Lys Leu Ala Gln Trp Leu Trp Gly Leu Ala Ile Leu Gly Ser Thr Trp
        35                  40                  45
Val Ala Leu Thr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Glu Leu Pro Leu Ser Cys
    50                  55                  60
Gln Glu Val Leu Trp Pro Leu Pro Ala Tyr Leu Leu Val Ser Ala Gly
65                  70                  75                  80
Cys Tyr Ala Leu Gly Thr Val Gly Tyr Arg Val Ala Thr Phe His Asp
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Ala Ala Arg Glu Leu Gln Ser Gln Ile Gln Glu Ala Arg
            100                 105                 110
Ala Asp Leu Ala Arg Arg Gly Leu Arg Phe
        115                 120
<210>46
<211>744
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>46
atggcggccg aggcggacgg accgcttaaa cggctgctcg tgccgattct tttacctgag    60
aaatgctacg accaactttt cgttcagtgg gacttgcttc acgtcccctg cctcaagatt    120
ctcctcagca aaggcctggg gctgggcatt gtggctggct cacttctagt aaagctgccc    180
caggtgttta aaatccgggg agccaagagt gctgaagggt tgagtctcca gtctgtaatg    240
ctggagctag tggcattgac tgggaccatg gtctacagca tcactaacaa cttcccattc    300
agctcttggg gtgaagcctt attcctgatg ctccagacga tcaccatctg cttcctggtc    360
atgcactaca gaggacagac tgtgaaaggt gtcgctttcc tcgcttgcta cggcctggtc    420
ctgctggtgc ttctctcacc tctgacgccc ttgactgtag tcaccctgct ccaggcctcc    480
aatgtgcctg ctgtggtggt ggggaggctt ctccaggcag ccaccaacta ccacaacggg    540
tacacaggcc agctctcagc catcacagtc ttcctgctgt ttgggggctc cctggcccga    600
atcttcactt ccattcagga aaccggagat cccctgatgg ctgggacctt tgtggtctcc    660
tctctctgca acggcctcat cgccgcccag ctgctcttct actggaatgc aaagcctccc    720
cacaagcaga aaaaggcgca gtag                                           744
<210>47
<211>247
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>47
Met Ala Ala Glu Ala Asp Gly Pro Leu Lys Arg Leu Leu Val Pro Ile
1               5                   10                  15
Leu Leu Pro Glu Lys Cys Tyr Asp Gln Leu Phe Val Gln Trp Asp Leu
            20                  25                  30
Leu His Val Pro Cys Leu Lys Ile Leu Leu Ser Lys Gly Leu Gly Leu
        35                  40                  45
Gly Ile Val Ala Gly Ser Leu Leu Val Lys Leu Pro Gln Val Phe Lys
    50                  55                  60
Ile Arg Gly Ala Lys Ser Ala Glu Gly Leu Ser Leu Gln Ser Val Met
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Val Ala Leu Thr Gly Thr Met Val Tyr Ser Ile Thr Asn
                85                  90                  95
Asn Phe Pro Phe Ser Ser Trp Gly Glu Ala Leu Phe Leu Met Leu Gln
            100                 105                 110
Thr Ile Thr Ile Cys Phe Leu Val Met His Tyr Arg Gly Gln Thr Val
        115                 120                 125
Lys Gly Val Ala Phe Leu Ala Cys Tyr Gly Leu Val Leu Leu Val Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Pro Leu Thr Pro Leu Thr Val Val Thr Leu Leu Gln Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asn Val Pro Ala Val Val Val Gly Arg Leu Leu Gln Ala Ala Thr Asn
                165                 170                 175
Tyr His Asn Gly Tyr Thr Gly Gln Leu Ser Ala Ile Thr Val Phe Leu
            180                 185                 190
Leu Phe Gly Gly Ser Leu Ala Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gln Glu Thr
        195                 200                 205
Gly Asp Pro Leu Met Ala Gly Thr Phe Val Val Ser Ser Leu Cys Asn
    210                 215                 220
Gly Leu Ile Ala Ala Gln Leu Leu Phe Tyr Trp Asn Ala Lys Pro Pro
225                 230                 235                 240
His Lys Gln Lys Lys Ala Gln
                245
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>48
atgacaatgt ggggaagtca acggg                    25
<210>49
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>49
tgtgtggtta ccgttctttg aatacataga                30
<210>50
<211> 29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>50
atagaaaatg atttatggta cagctcaaa                 29
<210>51
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>51
agaccaaatt aattatgcct ttacatgtac               30
<210>52
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>52
 agaattcacc atgagcaaca tgaatatact tgcgtatctt    40
<210>53
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>53
gaaattccaa tgtattccat attcacttat                30
<210>54
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>54
aagatctaat acattaaaac attttagatt aatgaatatg tg    42
<210>55
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>55
aggtaccgta cactccactc tatgatgatc attc             34

Claims (10)

1、由核苷酸序列SEQ ID NO：5组成的DNA。
2、载体，其中插入权利要求1的DNA。
3、转化体，保留可表达状态的权利要求1所述DNA或者权利要求2所述载体。
4、权利要求3所述的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型真菌。
5、权利要求3所述的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型酵母。
6、一种制备由权利要求1所述DNA编码的蛋白的方法，该方法包括培养权利要求3-5中的任一转化体，并从该转化体或其培养上清液收集表达的蛋白的步骤。
7、一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将试样与表达权利要求1所述DNA的GPI合酶基因-缺陷型酵母接触；
(2)分析该酵母的生长，和
(3)选出抑制该酵母生长的被试化合物。
8、一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将试样与表达权利要求1所述DNA的GPI合酶基因-缺陷型酵母接触，
(2)检测GPI-锚定蛋白转运到酵母细胞壁的量，和
(3)选出使步骤(2)中所检测的GPI-锚定蛋白转运到酵母细胞壁的量减少的试样。
9、一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述DNA导入GPI合酶基因-缺陷型酵母，并使该DNA编码的蛋白表达，
(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，
(3)使所得蛋白与试样和具有与该蛋白结合的活性的标记化合物接触，
(4)检测与该蛋白结合的标记化合物，和
(5)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样。
10、一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将(i)权利要求1的DNA，或者(ii)插入了权利要求1的DNA的载体，导入GWT1-缺陷型酵母，且表达由该DNA编码的蛋白
(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，
(3)加入UDP-GlcNAc或酰基辅酶A，
(4)使所得蛋白与试样接触，
(5)检测GlcN-(酰基)PI，和
(6)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的被试化合物。
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