CN101092627B

CN101092627B - 筛选在疟原虫中抑制gpi生物合成的化合物的方法

Info

Publication number: CN101092627B
Application number: CN2007101042868A
Authority: CN
Inventors: 畑桂; 小川薰; 塚田格; 中本和孝; 相根康司; 田中圭悟; 塚原克平; 堀井俊宏
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: AU2003282393A1; EP1565749A2; US20060172404A1; CA2721200A1; CN101092627A; CA2704070A1; EP1565749B1; US7928215B2; ATE525654T1; KR100825547B1; JP2006506996A; WO2004048567A3; CN101092628A; CN100504392C; KR20070010088A; KR100933759B1; CA2505067A1; KR20070065452A; JP2009077715A; WO2004048567A2

Abstract

本发明人成功地分离出了GWT1(PfGWT1)，其是一种在恶性疟原虫中参与GPI生物合成的酶。此外，本发明人揭示比编码PfGWT1蛋白的DNA具有更低AT含量的简并突变体DNA，能补偿GWT1-缺陷型酵母的表型。在此发现的基础上，本发明提供了疟原虫的GWT1蛋白，以及该蛋白在筛选抗疟药物的方法中的用途。本发明还提供了编码参有GPI生物合成的蛋白的简并突变体DNA，该DNA比天然DNA具有更低的AT含量。本发明还提供了利用该简并突变体DNA筛选抗疟药物的方法。

Description

筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法

本申请是分案申请，其母案是2003年11月21日向国际局提出申请、在2005年7月22日进入中国国家阶段、并获得中国申请号200380109105.0的中国申请。本分案申请与其母案具有相同的发明名称。

技术领域

本发明涉及筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法。

背景技术

疟疾是由寄生性原虫引起的最常见的传染性人类疾病。该疾病由于感染疟原虫所致，以蚊子，冈比亚疟纹(Anopheles gambiae)为媒介。每年约有50亿病例感染疟疾，包括超过两百万的致死例(Gardner等，Nature419：498-511，2003)。目前，40％的世界人口生活在疟疾流行区，在该区域据说每3名新生儿中就有一名死于疟疾。

已知糖基磷脂酰肌醇(GPI)在寄生虫生长和感染过程中起着重要的作用，所述寄生虫包括疟原虫。在这些寄生虫的细胞表面上有许多GPI-锚定蛋白。GPI-锚定蛋白包括如在寄生虫侵入红细胞时起作用的MSP-1蛋白。GPI-锚定蛋白起寄生虫抗原的作用，在宿主中引发免疫应答。因此，它们长期以来是疫苗开发的研究对象。

GPI不仅作为将蛋白拴到细胞膜的锚，而且是疟原虫细胞膜的丰富糖脂成分。最近的研究揭示GPI有毒，并能促成致死症状。GPI诱导炎性细胞因子如TNF-α和粘附分子的表达。结果，受染红细胞粘附毛细管，阻塞血管(隔离作用(sequestration))，尤其是脑血管。它能引起进一步的炎症反应，而炎症反应认为能导致脑病。最近，Schofield等报道抗-GPI抗体降低利用鼠科疟原虫伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)创建的体内感染模型系统的致死率，并且该抗体在体外抑制由恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)引起的后期炎症反应(Schofield L等，Nature418：785-789，2002)。此发现说明GPI是疟疾感染致死率的主要因素。

还报道肌醇酰基化对于甘露糖与GPI的结合来说是必需的(Gerold，P等，Biochem.J.344：731-738，1999)，由过量葡糖胺引起的肌醇酰基化的抑制会抑制恶性疟原虫的成熟(Naik，R.S.等，J.Biol.Chem.278：2036-2042，2003)。因此，选择地抑制GPI生物合成尤其是肌醇酰基化的化合物可以是非常有用的抗疟药物。

发明的公开

本发明的目的是提供抑制GPI生物合成的抗疟药物。更具体地说，本发明提供了编码GWT1蛋白的疟原虫DNA，所述蛋白是参与GPI生物合成的蛋白质(GPI合酶)。本发明还提供了在筛选抗疟药物的方法中利用该DNA的方法。本发明还提供了编码疟原虫GPI生物合成蛋白的DNA的简并突变体DNA。该简并突变体DNA比天然DNA具有更低的AT含量。本发明还提供了在筛选抗疟药物的方法中利用该简并突变体DNA的方法。

最早发现GWT1基因编码真菌GPI-锚定蛋白合酶(WO02/04626)，其在从酵母到人类的生物体中是保守的。本发明人证实GWT1同源物(恶性疟原虫(P.falciparum)GWT1的PfGWT1；约氏疟原虫(P.yoelii yoelii)GWT1的PyGWT1)包括在恶性疟原虫和约氏疟原虫的全基因组序列内(Gardner等，Nature419：498-511，2003；Carlton等，Nature419：512-519，2003)。本发明人还发现GWT1基因产物在GPI生物合成途径中起GlcN-PI酰基转移酶的作用。PfGWT1基因产物期望具有相似的活性，这样抑制其活性的化合物就可能是有价值的抗疟药物。

在WO02/04626中，本发明人发现了一组抑制真菌GWT1基因产物的活性的化合物。抑制PfGWT1基因产物的活性的化合物有望成为抗疟药物。

在本发明中，本发明人成功地对几乎是PfGWT1全长的区域进行了分离。利用疟原虫如恶性疟原虫的GWT1基因产物，抗疟药物的筛选可以通过结合试验，葡糖胺(酰基)磷脂酰肌醇(PI-GlcN)酰基转移酶试验，或利用GPI-锚定蛋白检测系统来进行。从所述筛选方法获得的化合物可能是有价值的抗疟药物。更进一步地，本发明人揭示简并突变体DNA(编码疟原虫GPI生物合成蛋白的DNA简并突变体)，该DNA比天然DNA具有更低AT含量，补偿GWT1基因-缺陷型真菌的表型。因此，利用GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型作为指标，该真菌中导入了(比疟原虫中编码GPI生物合成蛋白的DNA)具有更低AT含量的简并突变体DNA，就有可能筛选出抑制在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白活性的化合物。

更具体地，本发明提供了下述[1]到[25]：

[1](a)到(d)中任一项的DNA，该DNA编码具有GlcN-PI酰基转移酶活性的疟原虫蛋白。

(a)编码包含SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的蛋白的DNA，

(b)包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的DNA，

(c)在严谨条件与包含SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和

(d)编码包含SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列，且其中已添加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸所得的蛋白的DNA；

[2]由项[1]的DNA编码的蛋白；

[3]插入项[1]的DNA的载体；

[4]在可表达状态包含项[1]的DNA或者项[3]的载体的转化体；

[5]一种抗疟药物，其包含抑制项[2]的蛋白的活性的化合物作为活性成分；

[6]项[5]的抗疟药物，其中抑制项[2]的蛋白的活性的化合物是选自下述化合物(1)-(5)中的至少一种化合物：

和

[7]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：

(1)使项[2]的蛋白与试样和具有与该蛋白结合的活性的标记化合物接触，

(2)检测与该蛋白结合的标记化合物，和

(3)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样；

[8]项[7]的方法，其中具有与蛋白结合的活性的标记化合物是通过对选自项[6]的化合物(1)-(5)中的至少一种进行标记而获得的；

[9]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：

(1)使试样与项[2]的蛋白接触，

(2)检测GlcN-(酰基)PI，和

(3)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的试样；

[10]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，其包括下述步骤：

(1)使试样与过量表达项[2]的蛋白的细胞接触，

(2)测定GPI-锚定蛋白转运到该细胞的细胞壁的量，和

(3)选出减少步骤(2)中所测定的GPI-锚定蛋白转运到该细胞的细胞壁的量的试样；

[11]一种治疗疟疾的方法，包括施用抑制项[2]的蛋白的活性的化合物；

[12]项[11]的方法，其中抑制项[2]的蛋白的活性的化合物是项[5]的化合物；

[13]一种编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量；

[14]一种编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其具有少于70％的AT含量；

[15]项[13]或[14]的DNA，其中该DNA选自下组：

(a)编码包含SEQ ID NOs：2和4以及SEQ ID NOs：6-47中奇数序列鉴定号中任一所示氨基酸序列的蛋白的DNA，

(b)包含SEQ ID NOs：1和3以及SEQ ID NOs：6-47中偶数序列鉴定号中任一所示核苷酸序列的DNA，

(c)在严谨条件下与包含SEQ ID NOs：1和3以及SEQ ID NOs：6-47中偶数序列鉴定号中任一所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和

(d)编码包含SEQ ID NOs：2和4以及SEQ ID NOs：6-47中奇数序列鉴定号中任一所示氨基酸序列，且在所述氨基酸序列中添加，缺失，取代和/或插入一个或多个氨基酸而得到的蛋白的DNA；

[16]包含核苷酸序列SEQ ID NO：5的DNA；

[17]一种载体，其中插入项[13]-[16]中任一的DNA；

[18]在可表达状态包含项[13]-[16]中任一DNA或者项[17]的载体的转化体；

[19]项[18]的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型真菌；

[20]项[18]的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型酵母；

[21]一种制备由项[13]-[16]中任一DNA编码的蛋白的方法，该方法包括培养项[18]-[20]中的任一转化体，并从该转化体或其培养上清液收集表达的蛋白的步骤；

[22]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将试样与表达项[13]-[16]中任一DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌接触；

(2)分析该真菌的生长，和

(3)选出抑制该真菌生长的被试化合物；

[23]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将试样与表达项[13]-[16]中任一DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，

(2)检测GPI-锚定蛋白转运到真菌细胞壁的量，和

(3)选出使步骤(2)中所检测的GPI-锚定蛋白转运到真菌细胞壁的量减少的试样，

[24]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将项[13]-[16]中任一DNA导入GPI合酶基因-缺陷型真菌，并使该DNA编码的蛋白表达，

(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，

(3)使所得蛋白与试样和具有与该蛋白结合的活性的标记化合物接触，

(4)检测与该蛋白结合的标记化合物，和

(5)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样；和

[25]一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将(i)编码具有补偿GWT1-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，其中所述DNA是编码疟原虫GWT1蛋白的DNA的简并突变体，该DNA比天然DNA具有更低的AT含量，或者(ii)插入DNA简并突变体且表达由该简并突变体DNA编码的蛋白的载体，导入GWT1-缺陷型真菌，

(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，

(3)使所得蛋白与试样接触，

(4)检测GlcN-(酰基)PI，和

(5)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的被试化合物。

本发明第一次分离出了编码恶性疟原虫GWT1蛋白的DNA(PfGWT1)。编码PfGWT1蛋白的DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，PfGWT1蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。另外，编码间日疟原虫(Plasmodium vivax)GWT1蛋白(PvGWT1)的DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3，PvGWT1蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。

GWT1蛋白参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)的生物合成，糖基磷脂酰肌醇对疟原虫的生长和感染性是必需的。因此，抑制疟原虫GWT1蛋白活性的化合物可以用作抗疟药物。所述抗疟药物可以利用此疟原虫GWT1蛋白来进行筛选。

本发明提供了编码疟原虫GWT1蛋白的DNA。所述DNA包括编码包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的DNA，和包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA。

本发明还提供了与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白功能等同的蛋白的编码DNA。在此，表述“功能等同”是指具有与目的蛋白的生物特性相同的生物特性，所述目的蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4(PfGWT1或PvGWT1蛋白)。PfGWT1和PvGWT1蛋白的生物特性包括GlcN-PI酰基转移酶活性。GlcN-PI酰基转移酶活性可采用Costello和Orlean(J.Biol.Chem.(1992)267：8599-8603)或Franzot和Doering(Biochem.J.(1999)340：25-32)所报道的方法来进行测定。

与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白功能等同的蛋白的编码DNA包括：在严谨条件中与包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA杂交的DNA，和编码包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的DNA，所述氨基酸中添加、缺失、取代和/或插入一个或多个氨基酸。

本发明的DNA可以采用本领域技术人员所熟知的方法来进行分离。所述方法的实例包括利用杂交(Southern E.M.，J.Mol.Biol.98：503-517，1975)和聚合酶链式反应(PCR)(Saiki R.K.等，Science230：1350-1354，1985；SaikiR.K.等，Science239：487-491，1988)。更具体地，对于本领域技术人员来说，利用SEQ ID NO：1或3的DNA或其部分作为探针，或通过利用与包含SEQID NO：1或3核苷酸序列的DNA特异性杂交的DNA作为引物，从疟原虫中分离出与包含SEQ ID NO：1或3核苷酸序列的DNA高度同源的DNA是常规实验。另外，通过杂交或PCR技术分离出的DNA，以及与包含SEQ IDNO：1或3核苷酸序列的DNA杂交的DNA也包括在本发明的DNA之中。所述DNA包括含有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白的疟原虫同源物的编码DNA。疟原虫同源物包括恶性疟原虫，间日疟原虫，三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)同源物，其包含SEQID NO：2或4的氨基酸序列。

优选，在严谨杂交条件利用杂交反应分离出上述DNA。如本文所用，表达“严谨杂交条件”是指，例如在65℃于4xSSC中进行杂交，然后在65℃于0.1xSSC中洗涤1小时。可选的严谨条件是在42℃于含50％甲酰胺的4xSSC中进行杂交。或者，在65℃于PerfectHyb^TM(TOYOBO)溶液中杂交2.5小时，然后如下洗涤(1)在25℃，于含0.05％SDS的2xSSC中洗涤5分钟；(2)在25℃，于含0.05％SDS的2xSSC中洗涤15分钟；及(3)在50℃，于含0.1％SDS的0.1x SSC中洗涤20分钟。如此分离的DNA有望编码与SEQ ID NO：2或4氨基酸序列在氨基酸水平具有高度同源性的多肽。在此，“高度同源性”是指与完整氨基酸序列有至少70％或更高的序列同一性，优选80％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高。

氨基酸序列水平或核苷酸序列水平的同一性程度可以采用Karlin和Altschul的BLAST算法(Karlin S.和Altschul S.F，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2264-2268，1990；Karlin S.和Altschul S.F，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：5873-5877，1993)来确定。已开发了基于BLAST算法的程序(称为BLASTN和BLASTX)(Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.215：403，1990)。当利用BLASTN对核苷酸序列进行分析时，例如，将参数设为：得分＝100，字长＝12。另外，当利用BLASTX对氨基酸序列进行分析时，例如，将参数设为：得分＝50，字长＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。所述分析的具体步骤是已知的(请参见美国国家生物技术信息中心(NationalInstitute of Biotechnology Information)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明的DNA包含基因组DNA、cDNA和化学合成DNA。基因组DNA或cDNA可以根据本领域技术人员所熟知的常规方法来加以制备。例如，基因组DNA可以如下制备：(i)提取疟原虫基因组DNA；(ii)(利用如质粒、噬菌体、粘粒、BAC或PAC作载体)构建基因组文库；(iii)涂布该文库；然后(iv)利用探针进行菌落杂交或噬菌体杂交，所述探针是在编码本发明的疟原虫GWT1蛋白的DNA(例如SEQ ID NO：1或3)的基础上获得的。另外，利用编码本发明疟原虫GWT1蛋白的DNA(例如SEQ ID NO：1或3)的特异性引物，通过PCR制备基因组DNA。另一方面，cDNA可以如下制备：(i)在提取的疟原虫mRNA基础上合成cDNA；(ii)将该合成cDNA插入载体如λZAP中构建cDNA文库；(iii)涂布该cDNA文库；和(iv)如上所述，进行菌落杂交或噬菌体杂交。另外，也可以利用PCR制备cDNA。

本发明还提供了与包含SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的蛋白结构相似的蛋白的编码DNA。所述DNA包括那些编码蛋白的核苷酸序列的DNA，所述蛋白包含其中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。对于上述蛋白中的氨基酸突变位点和数量并无限制，只要该突变蛋白仍保留原始蛋白的功能，如Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.&Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413中所述。突变氨基酸的百分数一般为全部氨基酸残基的10％或更少，优选5％或更少，更优选1％或更少。此外，突变氨基酸的数量通常为30个氨基酸或更少，优选15个氨基酸或更少，更优选5个氨基酸或更少，还更优选3个氨基酸或更少，甚至更优选2个氨基酸或更少。

优选的突变氨基酸残基是在其突变(已知为保守氨基酸取代法)后保持侧链性质的氨基酸残基。氨基酸侧链性质的例子是疏水性(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)和亲水性(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)。侧链包括：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；碱性侧链(R，K，H)；和芳香族侧链(H，F，Y，W)。

包含疟原虫GWT1蛋白的融合蛋白是其中添加一个或多个氨基酸残基的蛋白实例。融合蛋白可利用本领域技术人员所熟知的技术来进行制备。例如，对此特定技术没有限制，将编码本发明疟原虫GWT1蛋白的DNA与编码另一肽或蛋白的DNA联合，使它们的阅读框匹配。本发明的蛋白可以与许多已知肽形成融合蛋白。所述肽包括FLAG(Hopp，T.P等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)，6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-标签，HSV-标签，E-标签，SV40T抗原片段，lck标签，α-微管蛋白片段，B-标签和蛋白C(Protein C)片段。与本发明蛋白融合的蛋白例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，HA，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶和麦芽糖结合蛋白(MBP)。

除利用上述杂交和PCR技术外，本领域技术人员可通过下述方法制得上述DNA，该方法包括例如定点诱变而在该DNA中引入突变(Kramer W.and Fritz H-J.，Methods Enzymol.154：350，1987)。蛋白的氨基酸序列还可以由于编码该蛋白的核苷酸序列发生突变而使其自然突变。此外，简并突变体DNA，其核苷酸突变并不会引起蛋白中的氨基酸发生突变(简并突变体)也包括在本发明内。另外，本发明还包括由本发明上述DNA编码的蛋白。

本发明提供了包括本发明DNA的载体，包含本发明DNA或载体的转化体，和利用这些转化体制备本发明蛋白的方法。

本发明的载体并无限制，只要它能稳定地保留插入载体内的DNA。例如，当大肠杆菌作宿主时，优选用pBluescript

Figure S071A4286820070608D00010165913QIETU

载体(Stratagene)作为克隆载体。当使用载体来制备本发明的蛋白时，表达载体是特别有用的。表达载体并无特别的限制，只要它能在体外，在大肠杆菌中，在培养细胞中和在体内表达蛋白。表达载体的优选例子包括用于体外表达的pBEST载体(Promega Corporation)，用于在大肠杆菌中表达的pET载体(Novagen)，用于在培养细胞中表达的pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)，和用于体内表达的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8：466-472，1988)。可采用常规方法将本发明的DNA插入载体内，例如采用限制性酶位点进行连接酶反应(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.1987，Section11.4-11.11)。

导入本发明载体的宿主细胞并无特别地限制，并且可以根据发明目的使用各种宿主细胞。例如，用于表达蛋白的细胞包括但不限于：细菌细胞(如链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，大肠杆菌，链霉菌(Streptomyces)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞(如酵母，曲霉(Aspergillus))，昆虫细胞(如果蝇(Drosophila)S2，夜蛾(Spodoptera)SF9)，动物细胞(如CHO，COS，HeLa，C127，3T3，BHK，HEK293，Bowes黑素瘤细胞)，以及植物细胞。将载体转染入宿主细胞可以采用常规方法进行，如磷酸钙沉淀，电穿孔(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.1987，Section9.1-9.9)，Lipofectamine法(GIBCO-BRL)和显微注射。

通过将合适的分泌信号掺入目的蛋白内，可以将在宿主细胞中表达的蛋白分泌到内质网的腔，细胞周围空腔(cavity)或细胞外环境内。这些信号对于目的蛋白来讲可以是内源的或外源的。

当本发明的蛋白分泌到培养基中时，从该培养基中收集蛋白。如果本发明的蛋白是在细胞内产生的，就将该细胞裂解，然后收集蛋白。

利用本领域熟知的方法可从重组的细胞培养物中对本发明蛋白进行收集和纯化，所述方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和外源凝集素(lectin)层析。

包括本发明DNA的化合物是分离的化合物。在此，术语“分离的”是指从原来的环境中分离出来(例如，如果是自然存在，即为天然环境)。样品中的目的化合物非常丰富，和/或样品中的目的化合物是部分或基本纯化的，则该样品中的化合物是“分离的”化合物。在本文中，术语“基本纯化的”是指化合物从天然环境分离的状态，而且该状态中已除去了至少60％，优选75％，最优选90％的其它共存的天然成分。

本发明提供了抗疟药物，该药物抑制疟原虫GWT1基因产物的活性。抑制疟原虫GWT1基因产物活性的优选化合物是WO02/04626所述的化合物，和包括化合物(1)至(5)：

化合物(1)：1-(4-丁基苄基)异喹啉

化合物(2)：4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇

化合物(3)：5-丁基-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚

化合物(4)：2-(4-溴-2-氟苄基)-3-甲氧基吡啶

化合物(5)：N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N-甲胺

象这样，抑制疟原虫GWT1基因产物的活性的化合物或其盐或其水合物可以给药于哺乳动物(优选人)。还可以利用常规方法将它配制成片剂，粉剂，微粒剂，颗粒剂，包衣片剂，胶囊，糖浆，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，糊剂，洗剂等，然后给药。

为配制药物，可以使用药物制剂常用的助剂(例如填充剂，粘合剂，滑润剂，着色剂，调味剂，以及需要时的稳定剂，乳化剂，吸收促进剂，表面活性剂，pH调节剂，防腐剂和抗氧化剂)。药物制剂可以用常规方法，通过将通常用作药剂成分的各组分混合来制备。

例如，口服制剂可以如下制备：将本发明的化合物或其药学上可接受的盐与填充剂，必要时还有粘合剂，崩解剂，润滑剂，着色剂，调味剂等组合，并通过常规方法将该混合物配制成粉剂，微粒剂，颗粒剂，片剂，包衣片剂，胶囊等。

这些组分的例子包括：动物脂肪和植物油，如大豆油，牛脂(tallow)，以及合成甘油酯；烃，如液体石蜡，角鲨烯，以及固体石蜡；酯油，如肉豆蔻酸辛基十二醇酯和肉豆蔻酸异丙酯；高级醇，如十六醇十八醇混合物以及二十二醇；硅氧烷树脂；硅油；表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯硬化的蓖麻油，以及聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物；水溶性大分子，如羟乙基纤维素，聚丙烯酸，羧基乙烯基聚合物，聚乙二醇，聚乙烯基吡咯烷酮，以及甲基纤维素；低级醇，如乙醇和异丙醇；多元醇，如甘油，丙二醇，二丙二醇，以及山梨醇；糖，如葡萄糖和蔗糖；无机粉末，如硅酸酐，硅酸铝镁，以及硅酸铝；和纯水。填充剂的实例子包括乳糖，玉米淀粉，精制白糖，葡萄糖，甘露醇，山梨醇，结晶纤维素，以及二氧化硅。粘合剂的例子包括聚乙烯醇，聚乙烯醚，甲基纤维素，乙基纤维素，阿拉伯树胶，黄芪胶，明胶，虫胶，羟丙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙二醇聚氧乙烯嵌段聚合物，甲葡胺(meglumine)等。崩解剂的例子包括淀粉，琼脂，粉状明胶，结晶纤维素，碳酸钙，碳酸氢钠，柠檬酸钙，糊精，果胶，以及羧甲基纤维素钙。润滑剂是硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，二氧化硅，硬化的植物油等。着色剂的例子为那些允许加入药物中的着色剂。调味剂是可可粉，l-薄荷醇，芳香分散剂，薄荷油，冰片，肉桂粉等。对于这些片剂和颗粒剂当然可以使用糖衣，必要时还可以使用其它适宜的包衣。

此外，液体制剂如糖浆和注射剂可以采用常规方法来制备。在该方法中，通过将pH调节剂，增溶剂，等渗剂等，以及必要时的增溶助剂，稳定剂等，加至本发明的化合物或其药学上可接受的盐中，来制备。

制备外用制剂的方法没有限制，而且可以通过常规方法来制备。也就是说，用于制剂的基础材料可以选自药物、准药物(quasi-drug)、化妆品等常用的各种材料。具体地，可使用的基础材料是，如动物脂肪和植物油，矿物油，酯油，蜡，高级醇，脂肪酸，硅油，表面活性剂，磷脂，醇，多元醇，水溶性大分子，粘土矿和纯化水。必要时，可以添加pH调节剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂和抗真菌剂，着色物质，香料等。但是本发明的外用制剂的基础材料并不限于此。再者，如果需要，还可以混入具有分化诱导作用的组分，血流促进剂，杀真菌剂，消炎剂，细胞活化剂，维生素，氨基酸，保湿剂，以及角质裂解剂。上述基础材料按外用制剂常用浓度的量加入。

如本发明所述，术语“盐”优选包括，如与无机或有机酸的盐，与无机或有机碱的盐，或与酸性或碱性氨基酸的盐。尤其优选是药学上可接受的盐。酸和碱以0.1-5个酸或碱分子与1个化合物分子的适当比形成盐。

与无机酸的盐的优选例子是与盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸和磷酸的盐。与有机酸的盐优选包括与醋酸，琥珀酸，延胡索酸，马来酸，酒石酸，柠檬酸，乳酸，硬脂酸，苯甲酸，甲磺酸，对甲苯磺酸的盐。

与无机碱的盐的优选例子是碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如钙盐和镁盐；铝盐，和铵盐。与有机碱的盐优选包括与二乙胺，二乙醇胺，甲葡胺和N，N’-二苄基乙二胺的盐。

与酸性氨基酸的盐的优选例子是与天冬氨酸和谷氨酸的盐，与碱性氨基酸的盐优选包括与精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸的盐。

施用本发明的化合物或其盐或其水合物时，对其形式没有特别的限制，它们可以根据常规方法经口或经非胃肠道途径给药。它们可以配制成如片剂，粉剂，微粒剂，胶囊，糖浆，锭剂，吸入剂，栓剂，注射剂，软膏剂，眼膏，滴眼剂，滴鼻剂，滴耳剂，糊剂和洗剂剂型。本发明的药物组合物的剂量可以根据症状程度，患者年龄，性别和体重，剂型，盐的类型，疾病的具体类型等适当地选择。

将治疗有效量的本发明的化合物给药于患者。在此，“治疗有效量”是指产生所需药理效果并且有效地恢复或或缓解所要治疗的患者之症状的药剂量。所述剂量根据疾病的类型，症状的程度，患者的体重、年龄、性别、对制剂的敏感性而显著地不同。但通常，成人的日剂量为约0.03mg-1000mg，优选0.1mg-500mg，更优选0.1mg-100mg，并且每日给药一次或几次，或者每若干天给药一次或几次。注射剂量一般为约1-3000μg/kg，优选约3-1000μg/kg。

此外，本发明涉及利用疟原虫GWT1基因产物筛选抗疟药物的方法。所述筛选方法包括但不限于：[1]结合试验，该试验筛选与标记化合物竞争结合疟原虫GWT1基因产物的化合物；[2]GlcN-PI酰基转移酶分析系统，该系统筛选能抑制疟原虫GWT1基因产物的GlcN-PI酰基转移酶活性的化合物；和[3]GPI-锚定蛋白检测系统，其中在细胞，优选真菌细胞中表达疟原虫GWT1基因产物，然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白。本发明并不限于这些方法，而且包括利用疟原虫GWT1基因产物筛选抗疟药物的任何方法。上面列出的方法[1]-[3]在下面进行详细描述。

[1]筛选与标记化合物竞争结合疟原虫GWT1基因产物的化合物的结合试验

本发明的两种方法公开如下，即(1)制备疟原虫GWT1基因产物(下文中称为疟原虫GWT1蛋白)的方法和(2)涉及标记化合物的结合实验法(下文中称为结合试验)

(1)制备疟原虫GWT1蛋白的方法

疟原虫GWT1蛋白是从细胞膜级分，优选从真菌细胞，更优选从酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞中制得的，其中引入了SEQ ID NO：2的疟原虫GWT1蛋白的编码DNA。优选将所述DNA导入GWT1基因-缺陷型细胞中。在结合试验中，可以在未进行任何其它处理的条件下使用所制的膜级分，或者在使用前对膜级分进行进一步的纯化。利用酿酒酵母的方法将在下面进行详细描述。

(a)疟原虫GWT1基因的导入

本发明使用的疟原虫GWT1基因可以是天然存在的基因，或优选是基于SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列进行合成的。疟原虫GWT1基因富含腺嘌呤和胸腺嘧啶。因此，可以推断利用常规的基因重组技术将很难对该基因进行操作，且该基因在酵母，细胞等中的表达效率将会很低(inefficient)。因此，优选对核苷酸序列进行设计，将其中与每个相应氨基酸对应的密码子替换为那些认为可以在酵母，细胞等中能有效表达的密码子，在该设计序列的基础上进行DNA合成，制备人工的疟原虫GWT1基因，然后在下述实验中使用该基因。

疟原虫GWT1的表达质粒是通过将疟原虫GWT1基因插入到酿酒酵母表达载体内来加以制备的，例如，通过将适合的启动子和终止子，如pKT10-衍生的GAPDH启动子和GAPDH终止子，插到YEp352的多克隆位点内来制备表达载体(Tanaka等，Mol.Cell Biol.，10：4303-4313，1990)。将酿酒酵母(如G2-10菌株)培养在合适的培养基(如YPD培养基(酵母提取物-聚蛋白胨-葡萄糖培养基))中，并在适宜的温度(如30℃)振荡，在对数生长晚期收获细胞。洗涤后，采用如乙酸锂法将GWT1-表达质粒导入酿酒酵母细胞中。该方法描述于User Manual of YEAST MAKER^TM Yeast Transformation System(BD Biosciences Clontech)。疟原虫GWT1-过表达菌株和携带阴性对照载体的菌株可通过将转化细胞于30℃，在SD(ura-)培养基上培养两天而获得。

适合除酿酒酵母之外的真菌种类的表达载体和基因转移法见下述报道：适合粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe，S.pombe)的表达载体如pcL和其转移法由Igarashi等描述(Nature353：80-83，1991)，适合白色念珠菌(C.Albicans)的表达载体如pRM10和其转移法由Pla J.等描述(Yeast，12：1677-1702，1996)；适合烟曲霉(A.Fumigatus)的表达载体如pAN7-1和其转移法由Punt P.J.等描述(GENE，56：117-124，1987)；适合新生隐球菌(C.Neoformans)的表达载体如pPM8及其转化法由Monden P等描述(FEMSMicrobiol.Lett.，187：41-45，2000)。

(b)制备膜级分的方法

在适合的培养基(如SD(ura-)液体培养基)中培养，并在适合的温度(如30℃)振荡导入了疟原虫GWT1基因的酿酒酵母细胞。在对数生长中期时收获真菌细胞，然后用合适量(如真菌细胞的3倍体积)的匀浆缓冲液(如50mMTris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，Complete^TM(Roche))悬浮。将合适量的玻璃珠(如真菌细胞的4倍体积)加至悬浮液中。涡旋混合物，并置于冰上。重复此操作数次将真菌细胞破碎。

将1毫升的匀浆缓冲液加入所得的裂解液中。离心混合物，如2,500rpm离心5分钟，使玻璃珠和未碎的真菌细胞沉淀。将上清液移到另一试管内。离心该试管，如13,500rpm离心10分钟，使含有细胞器的膜级分(总膜级分)沉淀。用1ml结合缓冲液(如0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0，0.05％Tween20，Complete^TM(Roche))悬浮沉淀物，然后离心，如2,500rpm离心1分钟，除去未悬浮的物质。然后离心上清液，如15,000rpm离心5分钟。沉淀物用150-650μl的结合缓冲液重悬浮来制备膜级分。

采用适合粟酒裂殖酵母的Yoko-o等的方法(Eur.J.Biochem.257：630-637，1998)；适合白色念珠菌的Sentandreu M等的方法(J.Bacteriol.，180：282-289，1998)；适合烟曲霉的Mouyna I等的方法(J.Biol.Chem.，275：14882-14889，2000)；和适合新生隐球菌的Thompson JR等的方法(J.Bacteriol.，181：444-453，1999)可以从除酿酒酵母之外的真菌物种中制备膜级分。

另外，可以通过在大肠杆菌，昆虫和哺乳动物细胞或其他非真菌细胞中表达来制备疟原虫GWT1蛋白。

当使用哺乳动物细胞时，将疟原虫GWT1基因与含有如CMV启动子的过表达载体连接，导入哺乳动物细胞中。然后，按照Petaja-Repo等的方法(J.Biol.Chem.，276：4416-23，2001)制备膜级分。

表达疟原虫GWT1基因的昆虫细胞(如Sf9细胞)可以利用，例如杆状病毒表达试剂盒如BAC-TO-BAC

Figure S071A4286820070608D00016171014QIETU

杆状病毒表达系统(Invitrogen)来进行制备。然后，按照Okamoto等的方法(J.Biol.Chem.，276：742-751，2001)制备膜级分。

可通过下述步骤从大肠杆菌制备疟原虫GWT1蛋白：例如将疟原虫GWT1基因与大肠杆菌表达载体如pGEX载体(Amersham Biosciences Corp.)连接，将此构建体导入大肠杆菌如BL21中。

(2)结合分析法

(a)标记化合物的合成

标记化合物从已证实结合GWT1蛋白的化合物制备。与GWT1蛋白结合的任何化合物都是可以使用的。标记化合物优选从WO02/04626中所述的化合物制备，更优选从上述(1)至(5)的化合物制备。

任何标记方法都是可以使用的。化合物优选是用放射性同位素，更优选用³H标记的化合物。采用放射性化合物作为起始物质，用常规制备方法制得放射性标记的化合物。另外，³H标记可以通过³H交换反应获得。

(b)特异性结合的确定

将标记化合物加至制得的膜级分中，将该混合物置于冰上适当长的时间，如1至2小时，直到标记化合物和膜级分间发生结合反应。离心混合物，使膜级分沉淀，如15,000rpm离心3分钟。沉淀物用结合缓冲液重悬浮，离心悬浮液。适当地重复(两次)，除去未结合的标记化合物。再用结合缓冲液悬浮沉淀物。将所得的悬浮液移至闪烁小管，加入闪烁剂。利用液体闪烁计数器测定放射性。

确认标记化合物与GWT1蛋白的特异性结合可以通过下述评估来进行：是否标记化合物的结合会被加入的严重过量未标记化合物(10倍或更多)所抑制，以及该化合物是否是可忽略地与由不表达GWT1蛋白的真菌细胞制得的膜级分结合。

(c)由试样引起的标记化合物的结合抑制

将试样和标记化合物加至制得的膜级分中，将该混合物置于冰上适当长的时间，如1至2小时，期间与膜级分发生结合反应。在本发明的筛选方法中使用的待测化合物包括：简单的天然存在化合物，有机化合物，无机化合物，蛋白或肽，以及化合物文库，基因文库的表达产物，细胞提取物，细胞培养物上清液，来自发酵细菌的产物，海洋生物体提取物，植物提取物和类似物。

将混合物离心，例如15,000rpm离心3分钟，使膜级分沉淀。在结合缓冲液中重悬浮沉淀物，离心该悬浮液。适当地重复此步骤(两次)，从而除去所有未结合的标记化合物。用结合缓冲液悬浮沉淀物。将悬浮液移至闪烁小管，加入闪烁剂。利用液体闪烁计数器测定放射性。

当在试样存在的条件下，标记化合物与膜级分的结合被抑制，就判定该试样具有结合疟原虫GWT1蛋白的活性。

[2]用于筛选抑制疟原虫GWT1蛋白GlcN-PI酰基转移酶活性的化合物的GlcN-PI酰基转移酶分析系统

酰基到GPI的转移可以利用下述方法来进行检测：Costello L.C和OrleanP.，J.Biol.Chem.(1992)267：8599-8603；或Franzot S.P和Doering T.L.，Biochem.J.(1999)340：25-32。该方法的具体实例在下面进行了描述。下述实验条件优选是对所用的各种疟原虫GWT1蛋白进行了优化的。

根据上述部分1所述的方法制备疟原虫GWT1蛋白。将包含疟原虫GWT1蛋白的膜级分加至缓冲液中，所述缓冲液含有合适的金属离子(Mg²⁺，Mn²⁺)，ATP，辅酶A，优选含有防止在其它反应中消耗UDP-GlcNAc的抑制剂，如作为几丁质合成抑制剂的尼可霉素(nikkomycin)Z，或作为天冬酰胺-连接的糖基化抑制剂的衣霉素(tunicamycin)。然后，将试样加到该混合物中，将所得的混合物在合适的温度下孵育适当长的时间(如24℃孵育15分钟)。

将已适当标记的，优选放射性标记的GlcN-(酰基)PI前体(如UDP-GlcNAc，Acyl-辅酶A，优选UDP-[¹⁴C]GlcNAc)加到混合物中。将所得的混合物孵育适当长的时间(如24℃孵育1小时)。加入氯仿和甲醇(1:2)的混合物，搅拌所得混合物以使反应停止，提取脂质。将提取的反应产物溶解在合适的溶剂中，优选丁醇。然后，利用如HPLC或薄层层析(TLC)，优选TLC法分离反应产生的GlcN-(酰基)PI。当使用TLC时，展开剂(developing solvent)可以适当地选自，如CHCl₃/CH₃OH/H₂O(65:25:4)，CHCl₃/CH₃OH/1M NH₄OH(10:10:3)和CHCl₃/吡啶/HCOOH(35:30:7)。优选的展开剂是CHCl₃/CH₃OH/H₂O(65:25:4)。采用对所用标记而言恰当的方法，对分离的GlcN-(酰基)PI进行定量。当用放射性同位素作标记时，可以基于其放射性对分离的GlcN-(酰基)PI进行定量。

当在试样存在的条件下，制得的GlcN-(酰基)PI量减少时，就判定该试样具有抑制由疟原虫GWT1蛋白引起的酰基转移的活性。

[3]包括在细胞中表达疟原虫GWT1蛋白然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白的GPI-锚定蛋白检测系统

试样抑制疟原虫GWT1蛋白活性的能力可以利用GPI-锚定蛋白检测系统来进行测定，该系统包括在细胞，优选真菌细胞中表达GWT1蛋白，然后检测细胞表面上的GPI-锚定蛋白。本发明的真菌是指属于接合菌门(Zygomycota)，子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)及半知菌纲(Deuteromycete)的真菌，且优选的真菌是致病性真菌，毛霉属(Mucor)，酵母属(Saccharomyces)，念珠菌属(Candida)，隐球菌属(Cryptococcus)，丝孢酵母属(Trichosporon)，鳞斑霉属(Malassezia)，曲霉属(Aspergillus)，发癣菌属(Trichophyton)，小孢子菌属(Microsporum)，孢子丝菌属(Sporothrix)，芽生酵母属(Blastmyces)，球孢子菌属(Coccidioides)，副球孢子菌属(Paracoccidioides)，青霉属(Penicillinium)和镰孢属(Fusarium)，更优选的真菌为白色念珠菌，光滑念珠菌(C.glabrata)，新生隐球菌和烟曲霉，甚至更优选的真菌是酵母。所述酵母包括酿酒酵母和粟酒裂殖酵母。用于将包含编码疟原虫GWT1蛋白的插入DNA的表达载体导入上述真菌细胞的方法是本领域技术人员所熟知的。

当疟原虫GWT1蛋白在真菌细胞中表达时，转运到真菌细胞壁的GPI-锚定蛋白量可通过下述方法测定：(1)利用报告酶的方法；(2)利用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法；(3)利用该蛋白粘附动物细胞的能力；或者(4)在光学显微镜或电子显微镜下观察真菌细胞的方法。

(1)-(4)的方法已在WO02/04626中公开，所述方法在该发明的实施例中进行了详细描述。利用(1)-(4)的方法，并且优选(1)-(4)的方法的组合可以判断试样是否抑制GPI-锚定蛋白到细胞壁上的转运过程或者GPI-锚定蛋白在真菌细胞表面的表达。

在下文中，将描述方法(1)-(4)。

(1)利用报告酶进行的方法

GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程可通过示踪实验定量：如用放射性同位素标记GPI-锚定蛋白，获得真菌细胞壁级分，并用抗GPI-锚定蛋白的抗体进行免疫沉淀反应。也可以用另一种方法更简便地定量：在各种GPI-锚定蛋白中常见的、被认为起转运信号作用的C-末端序列可与便于测量的酶(报告酶)表达为融合蛋白，获得真菌细胞壁级分；然后采用报告系统测量每一级分的酶活性(Van Berkel MAA等，FEBSLetters，349：135-138，1994)。在下文中，将要会对一种采用报告酶进行的方法进行描述，但是本发明并不仅限于此。

首先，构建报告基因并将其引入真菌中。报告基因是这样构建的：使在真菌中起作用的启动子序列，以与阅读框匹配的方式连接分别编码信号序列、报告酶和GPI-锚定蛋白C-末端序列的DNA。启动予序列的实例包括GAL10及ENO1。信号序列的实例包括如α-因子，转化酶，溶菌酶。报告酶的实例是β-内酰胺酶，溶菌酶，碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。可以使用易于检出的绿色萤光蛋白(GFP)，即便它不具有酶活性。GPI-锚定蛋白C-末端序列包括α-凝集素(agglutinin)C-末端序列，CWP2C-末端序列等。此外，优选将适宜的选择标记物如LEU2和URA3插到包含所构建的报告基因的载体中。

将所构建的报告基因通过适宜的方法插到真菌中，如乙酸锂法(Gietz D等，Nucl.Acids Res.20：1425，1992)。并且在需要时，利用适于选择标记物的方法(如适于LEU2的Leu^-培养基，以及适于URA3的Ura^-培养基)培养真菌，然后挑选其中引入了DNA的真菌。

通过下列方法测定试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程的影响：

在试样存在时，于适宜的条件下(如30℃48小时)培养引入了报告基因的真菌。培养之后，离心培养物上清液，并测量培养物上清液级分的报告酶活性。洗涤所得细胞级分，然后通过适当的方法分离细胞壁成分，例如用葡聚糖酶降解细胞壁葡聚糖，然后测量细胞壁级分和细胞质级分的报告酶活性。该试验可以如下简单地进行：离心确定细胞级分中报告酶的量，然后在不洗涤细胞的情况下按比例计算来源于培养物上清液级分但残留在细胞级分中的报告酶的量，从细胞级分的报告酶的量中减去此量。

如果试样显示出增加培养物上清液级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，或者降低细胞壁级分中报告酶活性的活性(活性/细胞)，那么就可以判定该试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程有影响。

(2)采用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法

对于试样影响GPI-锚定蛋白在真菌表面层的表达的能力，可以通过利用与真菌细胞壁中的GPI-锚定蛋白反应的抗体进行定量来测定。

抗体可以如下制备：例如，可以由GPI-锚定蛋白的氨基酸序列预测抗原决定簇，所述GPI-锚定蛋白如α-凝集素，Cwp2p，或Alslp(Chen MH等，J.Biol.Chem.，270：26168-26177，1995；Van Der Vaat JM等，J.Bacteriol.，177：3104-3110，1995；Hoyer LL等，Mol.Microbiol.，15：39-54，1995)，合成该区的肽，将其与抗原性物质如载体蛋白结合，然后通过免疫兔子等得到多克隆抗体，或者通过免疫小鼠等得到单克隆抗体。优选是针对Alslp肽的兔多克隆抗体。

在可供选择的方法中，可以通过用真菌，优选过量表达GPI-锚定蛋白，如α-凝集素，Cwp2p及Alslp的真菌免疫小鼠等获得抗GPI-锚定蛋白的单克隆抗体，(在某些情况下，可以进一步用部分纯化的GPI-锚定蛋白进行免疫)，并利用ELISA，Western印迹分析等以此制备抗体为基础选出产生的克隆。

通过下述方法可以检测试样对GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程的影响，以及试样对来源于细胞壁中GPI-锚定蛋白的蛋白量的影响。

在试样存在时，于适宜的条件下如30℃48小时培养真菌。通过离心收集所培养的真菌并将细胞破碎，优选采用玻璃珠。优选用SDS离心提取洗涤过的破碎细胞，然后洗涤沉淀物。提取之后，用降解葡聚糖的酶，优选葡聚糖酶处理破碎的细胞，其经离心处理的上清液即为GPI-锚定蛋白样品。

将抗-Alslp肽的抗体经4℃过夜温育包被在96-孔板上。用洗涤溶液，优选含0.05％Tween20的PBS(PBST)洗涤板之后，用封闭96-孔板非特异性吸附位点的试剂，优选蛋白如BSA或明胶蛋白，更优选BlockAce(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)进行封闭。用洗涤溶液，优选PBST，再次洗涤之后，加入适当稀释的GPI-锚定蛋白样品。在室温进行适当长时间如2小时的反应。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，使针对酶标记的白色念珠菌的抗体，优选HRP-标记的抗-念珠菌抗体，在室温反应适当长的时间如2小时。标记方法可以是酶标记法或放射性同位素标记法。用洗涤溶液，优选PBST，洗涤之后，通过适于标记类型即酶标记的方法计算GPI-锚定蛋白样品中Alslp的量，加入底物溶液，然后在终止反应时测量在490nm处的吸光度。

(3)利用粘附动物细胞的能力进行的方法

试样对GPI-锚定蛋白在真菌表面的表达的影响可以通过测量真菌细胞壁中GPI-锚定蛋白的活性，优选通过测量真菌对动物细胞等的粘附能力来进行测定。除了Alslp，Hwplp等参与粘附动物细胞的活性之外，GPI-锚定蛋白活性还包括α-凝集素参与交配的活性，Flolp参与酵母聚集的活性等。在下文中，将详细描述利用真菌对动物细胞的粘附活性进行的方法，但是本发明并不仅限于此。

使用对细胞具有粘附能力的真菌，优选的真菌为白色念珠菌。对于哺乳动物细胞采用粘附真菌的细胞，优选小肠上皮细胞。培养哺乳动物细胞并通过适当的方法，如乙醇固定法将其固定。将试样和真菌培养适当长的时间，如30℃温育48小时，然后接种并培养一定长的时间，如在30℃温育1小时。移出培养物上清液，用缓冲液洗涤，加样至琼脂培养基，如Sabouraud Dextrose Agar培养基(Becton Dickinson Company，Ltd.)。30℃过夜培养后，计数菌落的数目，并计算粘附率。

如果与未经该化合物处理的真菌相比，观察到试样具有使细胞粘附而形成的菌落数目降低的活性，则可以判定该试样已经影响了GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程。

(4)利用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法

可以通过用电子显微镜观察真菌细胞壁的结构来确定试样对GPI-锚定蛋白在真菌表面的表达的影响。

在试样存在的条件下，将真菌如白色念珠菌培养一定长的时间，如30℃培养48小时，用透射电子显微镜观察其超微形态结构。在此，利用透射电子显微镜进行的观察可以通过例如根据Electron Microscope Chart Manual(Medical Publishing Center)的方法来进行。真菌细胞最外层的絮状纤维结构具有高电子密度，并且可通过透射电子显微镜观察到。此结构不受其它现有抗真菌剂的影响，并认为是包括GPI-锚定蛋白作为其构成成分的表面糖蛋白层。与未经处理的细胞相比，当此结构消失，只留下具有高电子密度的微层时，可以判定所述试样已经影响了GPI-锚定蛋白到细胞壁的转运过程。

当在透射电子显微镜以及光学显微镜下的观察都显示真菌细胞大量溶胀且出芽(分裂)受到抑制时，可以判定试样对细胞壁有影响。

本发明还提供了治疗疟疾的方法，该方法包括施用抑制疟原虫GWT1蛋白的活性的化合物的步骤。所述化合物包括WO02/04626中所述化合物(如本文(1)-(5)中所述化合物)。

天然PfGWT1蛋白的核苷酸序列的特点是具有非常高的AT含量(80.41％)，因此其密码子使用是有偏好的(biased)。此外，所述基因包含在23个分离位置含六个或更多个连续A残基的序列段，且这些序列段作为假(pseudo)-poly(A)位点来制备截短的蛋白。由于如上所述的特性，该基因只能少量地在酵母中表达，而且很难利用PCR进行扩增或者在大肠杆菌中进行复制。也很难确定其核苷酸序列。然而，利用该DNA的简并突变体(SEQID NO：5)，其AT含量低于编码PfGWT1蛋白的DNA，本发明人成功地使PfGWT1蛋白高效表达。本发明人还揭示简并突变体DNA的引入能拯救GWT1-缺陷型酵母的表型。此项发现说明疟原虫的GPI合酶与真菌如酵母的GPI合酶是可以互换的。

编码疟原虫GPI合酶的基因的AT含量例如对于恶性疟原虫的GPI8为79.35％，对于恶性疟原虫的GPI13为77.89％。其AT含量与PfGWT1的AT含量一样高。由于恶性疟原虫基因组翻译区内的平均AT含量为76.3％，可以推断大多数恶性疟原虫基因几乎不能在其它物种中表达。本发明人成功地使比编码PfGWT1蛋白的DNA具有更低AT含量的DNA简并突变体在酵母中表达。因此，通过利用该简并DNA突变体，可以在疟原虫之外的宿主中表达疟原虫GPI合酶。此外，GPI-缺陷型酵母和GWT1-缺陷型酵母已知表现出相似的表型，包括致死性等特性。这样，可以采用上述简并突变体DNA拯救GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型。

已导入了上述简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型由疟原虫GPI合酶的活性来决定。相应地，可以利用GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型作为指标，经筛选选出抑制疟原虫GPI合酶活性的化合物。这样，事实上并不需要利用疟原虫就能选出靶向GPI生物合成路径的的抗疟药物。

本发明提供了编码具有拯救GPI合酶基因-缺陷型真菌表型的活性的蛋白的简并突变体DNA，其比编码参与GPI生物合成的天然DNA具有更低的AT含量。所述DNA可以在本发明的筛选方法中使用。

如本文所用，术语“AT含量”是指GPI合酶基因编码区完整核苷酸序列中的腺嘌呤和胸腺嘧啶含量。本发明简并突变体DNA中的AT含量范围优选从50％到70％，更优选从53％到65％，更加优选从55％到62％。

GPI合酶基因-缺陷型真菌的表型包括温度敏感性(优选高温敏感性)和致死性。

在疟原虫中参与GPI生物合成的本发明蛋白包括GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1，DPM1，GPI2，GPI15，YDR437W，GPI12，MCD4，GPI11，GPI7，GPI17，GPI16，CDC91，DPM2，DPM3和SL15。上述蛋白中，已知GPI1和GPI8存在于疟原虫中，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1也认为存在于疟原虫中(Delorenzi等，Infect.Immun.70：4510-4522，2002)。恶性疟原虫GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NOs：6-21中的偶数序列鉴定号中。各相应氨基酸序列示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NOs：6-21中的奇数序列鉴定编号中。此外，间日疟原虫GWT1的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3，相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。采用本领域技术人员熟知的方法，如采用杂交或PCR，利用包含SEQ ID NO：1和3，以及偶数号的SEQ ID NOs：6-21中任一核苷酸序列的DNA，可以对其它疟原虫的GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1或DPM1进行克隆。

另外，利用酵母或人GPI合酶基因可以对疟原虫的除GWT1，GPI1，GPI8，GPI3/PIG-A，GPI10/PIG-B，YJR013W/PIG-M，GPI13/PIG-O，GAA1/GAA-1和DPM1之外的GPI合酶基因进行克隆。酵母(酿酒酵母)GPI2，GPI15，YDR437W，GPI12，MCD4，GPI11，GPI7，GPI17，GPI16和CDC91的核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs：22-41中的偶数序列鉴定号中；各相应氨基酸序列示于SEQ ID NOs：22-41中的奇数序列鉴定号中。此外，人DPM2，DPM3和SL15的核苷酸序列分别示于SEQ ID NOs：42-47中的偶数序列鉴定号中；各相应氨基酸序列示于SEQ ID NOs：42-47中的奇数序列鉴定号中。

编码参与疟原虫GPI生物合成的蛋白的简并突变体DNA的制备由两步组成：设计和合成，所述简并突变体DNA的AT含量比天然DNA低。在设计步骤中，首先对目的蛋白的氨基酸序列进行反向翻译，然后列出各氨基酸残基的可能密码子。反向翻译可以利用商购基因分析软件(例如DNASIS-Pro；Hitachi Software Engineering Co.，Ltd)来实现。在列出的密码子中，为各个氨基酸选出符合目的的密码子(例如，AT含量较低的密码子和在用于基因表达的宿主中使用的常规密码子)。简并突变体DNA可以通过利用这些选出的密码子重排目的蛋白的氨基酸序列来对其进行设计。

如此设计的DNA可以通过本领域技术人员所熟知的方法来进行合成。本发明的简并突变体DNA可以基于设计的核苷酸序列，通过如利用商购DNA合成仪来进行合成。

本发明还提供了插入了上述简并突变体DNA的载体，以及在可表达状态包含该DNA或该载体的转化体(优选GPI合酶基因-缺陷型真菌)。载体和宿主可以是前面所述的载体和宿主。

如本文所用，表达“GPI合酶基因缺陷”是指该基因的功能产物未表达或表达水平减少。本发明的GPI合酶基因-缺陷型真菌可通过破坏GPI基因来加以制备。破坏可以通过在同源重组技术等的基础上嵌入与该基因无关的DNA如选择标记来实现。更具体的说，所述突变型真菌可通过将选择标记盒导入酵母，该选择标记盒含有利用引物扩增的粟酒裂殖酵母his5基因或卡那霉素抗性基因(Longtine等，Yeast，14：953-961，1998)，其均含有与部分该基因(50-70个核苷酸)同源的核苷酸序列。

本发明的GPI合酶基因-缺陷型真菌包括，如GWT1温度敏感突变株gwt1-20，GPI7破坏菌株，GPI8突变株gpi8-1，以及GPI10温度敏感突变株per13-1。

转化了本发明简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌可以通过将插入了该简并突变体DNA的载体导入真菌中来进行制备。pRS316，YEp351等可用作酿酒酵母的载体，pcL，pALSK等可用作粟酒裂殖酵母的载体。

本发明还提供了筛选抗疟药物的方法，该方法包括利用上述GPI合酶基因-缺陷型真菌。

在该方法中，第一步包括将试样与GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，其中所述真菌转化了比参与疟原虫GPI生物合成的蛋白的编码DNA具有更低AT含量的简并突变体DNA。所述“接触”可通过将试样加到上述真菌培养物中来实现。当试样是蛋白时，可以将包含该蛋白的编码DNA的载体导入上述真菌中。

在本发明的方法中，下一步包括测量上述真菌的生长程度。更具体地说，在常规培养条件下接种真菌，具体地，将真菌接种至液体培养基，如酵母提取物聚蛋白胨葡萄糖培养基(YPD培养基)或琼脂平板上，然后在25-37℃温育4-72小时。这样，就可以对已转化本发明简并突变体DNA的GPI合酶基因-缺陷型真菌进行生长评估。生长程度还可以以培养基液体的混浊度，菌落数量，或者琼脂平板上形成的斑点大小或颜色作为指标来进行测定。在本发明的方法中，下一步包括选出抑制上述真菌生长的化合物。

在另一可选的方法中，第一步包括将试样与GPI合酶基因-缺陷型真菌接触，其中该真菌已导入了上述简并突变体DNA。下一步包括测定转运到酵母细胞壁上的GPI-锚定蛋白量。该检测方法包括(1)利用报告酶的方法；(2)利用与真菌细胞壁表面糖蛋白反应的抗体的方法；(3)利用粘附动物细胞的能力的方法；和(4)利用光学显微镜或电子显微镜观察真菌的方法。在本发明的方法中，下一步包括选出降低转运到细胞壁的GPI-锚定蛋白量的样品。

本发明提供了利用参与GPI生物合成的蛋白筛选抗疟药物的方法，该蛋白是利用本发明的简并突变体DNA制得的。所述方法包括例如结合分析系统，在该系统中进行筛选是为了选出结合参与GPI生物合成的蛋白的化合物，该化合物与结合所述蛋白的标记化合物竞争。具体地说，将本发明的简并突变体DNA导入GPI合酶基因-缺陷型真菌中，在该真菌中表达该DNA编码的蛋白，获得所表达的蛋白。然后，将制得的蛋白与试样和能结合该蛋白的标记化合物接触。在下一步中，检测结合该蛋白的标记化合物，选出降低结合该蛋白的标记化合物量的试样。

本发明还提供了GlcN-PI酰基转移酶分析系统。该系统包括使用GWT1蛋白，该蛋白是利用编码具有补偿GWT1-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA制得的，其中所述DNA是编码疟原虫GWT1蛋白的DNA简并突变体，它比天然DNA具有更低的AT含量。具体地，将简并突变体DNA导入GWT1-缺陷型真菌，在该真菌中表达该简并突变体DNA编码的蛋白，获得所表达的蛋白。然后，将此蛋白与试样接触，检测GlcN-(酰基)PI，选出降低GlcN-(酰基)PI量的试样。

本文引用的所有专利，专利申请和公开物其全部引入以供参考。

附图的简单说明

图1显示四分体分析结果的照片。在导入了opfGWT1-过表达质粒后，gwt1遭破坏的菌株存活。将衍生自单个双倍体细胞的四个孢子垂直点样。

如果一个拷贝的GWT1基因被破坏，则仅有一半的孢子生长。在这种情况下，[菌落-形成的斑点]：[未显示生长的斑点]的比率为2:2。在用箭头标记的纵列中，gwt1破坏体(disruptant)的致死表型由于导入了opfGWT1而得到补偿，因此4个斑点全部生长，均形成菌落。

图2的图表显示化合物对于表达opfGWT1基因的酵母生长的抑制活性。在GWT1基因遭破坏的酵母中表达酵母GWT1基因或opfGWT1基因。

具有抑制酵母GWT1-依赖性生长活性的化合物也显示了对于酵母的opfGWT1-依赖性生长的抑制活性，其中opfGWT1在该酵母中表达。

图3是显示抗疟活性的图表。用恶性疟原虫感染人红细胞。将GWT1-抑制性化合物加至这些红细胞中，并确定对疟原虫感染的抑制。

表现抗真菌活性的5种化合物均抑制了红细胞的疟原虫感染。

实施本发明的最佳方式

下面，将利用实施例详细地描述本发明，但是本发明并不限于此。

[实施例1]恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)

(1)恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)已公开于恶性疟原虫基因组数据库(PlasmoDB database，http://plasmodb.org/)中。用纯化自恶性疟原虫(3D7菌株)的基因组DNA作为模板，通过PCR克隆PfGWT1基因。将PfGWT1基因的5和3’两部分分别制备，并在XbaI(TCTAGA)限制酶位点对两部分进行组装。这样，就制得全长PfGWT1基因。另外，在编码区外的限制酶位点也包含在其中，从而可以插入到表达载体内。

(2)用恶性疟原虫基因组DNA作为模板，以及引物pf152F(SEQ ID NO：48)和pf136R(SEQ ID NO：49)，通过PCR扩增PfGWT1基因的5’部分。用pf137F(SEQ ID NO：50)和pf151R(SEQ ID NO：51)作为引物，通过上述相同的方法，扩增PfGWT1基因的3’部分。将扩增出的DNA片断亚克隆到pT7-Blue载体(Novagen)中，对插入子的核苷酸序列进行测序，以确定其与SEQ ID NO：1的同源性。含有PfGWT1基因5’部分的克隆命名为PF15-5克隆。含有PfGWT1基因3’部分的克隆命名为PF20-9克隆。

(3)利用PCR将限制酶的切割位点添加到编码区的外侧，从而可以使PfGWT1基因插到表达载体内。用PF15-5作为模板，以及引物pf154FE(SEQID NO：52)和pf157R(SEQ ID NO：53)，通过PCR将EcoRI切割位点加至5’部分。将扩增的DNA片断亚克隆到pT7-Blue载体(Novagen)中，制得pT7-plasmN2克隆。同样地，用PF20-9作为模板，以及引物pf168BK(SEQID NO：54)和pf155RK(SEQ ID NO：55)，通过PCR扩增3’部分。对扩增的DNA片断进行亚克隆，制得pT7-plasmBK5克隆。

(4)用下述方法制备全长PfGWT1基因。用限制性内切酶EcoRI和KpnI消化酵母表达载体YEp352GAPII。将来源于pT7-plasmN2的EcoRI-XbaI片断(约1500bp)，和来源于pT7-plasmBK5的XbaI-KpnI片断(约1100bp)插入载体的切割位点。这样，就构建成了包含全长PfGWT1的表达载体YEp352GAPII-PfGWT1。

[pf152F]ATGACAATGTGGGGAAGTCAACGGg(SEQ ID NO：48)

[pf136R]TGTGTGGTTACCGTTCTTTGAATACATAGA(SEQ ID NO：49)

[pf137F]ATAGAAAATGATTTATGGTACAGCTCAAA(SEQ ID NO：50)

[pf151R]AGACCAAATTAATTATGCCTTTACATGTAC(SEQ ID NO：51)

[pf154FE]agaattcaccATGAGCAACATGAATATACTTGCGTATCTT(SEQ IDNO：52)

[pf157R]GAAATTCCAATGTATTCCATATTCACTTAT(SEQ ID NO：53)

[pf168BK]AAGATCTAATACATTAAAACATTTTAGATTAATGAATATGTG(SEQ ID NO：54)

[pf155RK]aggtaccGTACACTCCACTCTATGATGATCATTC(SEQ ID NO：55)

[实施例2]全合成的PfGWT1基因

恶性疟原虫DNA中的腺嘌呤和胸腺嘧啶(AT)比例非常高(80％或更高)，因此通常无法使用常规的生物技术(PCR，以大肠杆菌为基础的基因工程，重组蛋白的表达系统等)(Sato和Horii；Protein，Nucleic acid，and Enzyme Vol.48，149-155，2003)。同样地，PfGWT1DNA的AT含量是80.41％，其包含多个连续的A或T序列段。因此，可以推断该基因将很难在酵母中复制并以蛋白形式表达。实际上，当将连有酵母过表达载体的天然PfGWT1导入GWT1遭破坏的酵母时，PfGWT1根本不能拯救GWT1破坏体的致死表型。为了降低AT含量，用不改变原本氨基酸顺序的同义密码子替换密码子。

在恶性疟原虫GWT1(PfGWT1)核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的基础上进行密码子取代，所述核苷酸序列已在恶性疟原虫基因组数据库(PlasmoDBdatabase，http://plasmodb.org/)中公开。将所得核苷酸序列命名为“优化的PfGWT1(opfGWT1)”(SEQ ID NO：5)。

将上述序列设计为编码区外包含额外的序列；即EcoRI切割位点序列(GAATTC，5’末端)，Kozak序列(ACC，3’末端)，和KpnI切割位点序列(GGTACC，3’末端)。所得序列的合成委托美国的Blue Heron Inc。用这些额外的限制酶位点将完全合成的opfGWT1与YEp352GAPII载体连接，从而构建opfGWT1的过表达质粒。将该构建体引入仅仅单个GWT1基因拷贝被破坏的二倍体细胞(WDG2)中。在含孢子形成培养基的平板上培养获得的转化体，形成用于四分体分析的孢子。

新设计的密码子-修饰opfGWT1的AT含量减少至61.55％。四分体分析结果示于图1。在导入opfGWT1过表达质粒后，gwt1遭破坏的菌株存活。上述发现表明：在通过密码子修饰而使AT含量降低时，PfGWT1基因可以在酵母细胞中表达。

[实施例3]利用opfGWT1-表达型酵母进行抗疟活性分析

利用opfGWT1-表达型酵母构建抗疟活性化合物的筛选系统。

通过将酿酒酵母GWT1终止子，酿酒酵母GAPDH启动子以及多克隆位点插到单拷贝载体pRS316的SacI-KpnI位点来构建表达盒。分别将酿酒酵母GWT1和opfGWT1插到多克隆位点，制备pGAP-ScGWT1和pGAP-opfGWT1质粒。将这些质粒导入GWT1破坏体。用YPAD连续的两倍稀释化合物(1)，使其最高的终浓度为50μg/ml。将稀释化合物的50μl等分试样加到96-孔板的每个孔中。将含有各种质粒的酵母细胞过夜培养物稀释1000倍，然后将稀释物的50μl等分试样加到各孔中。将平板在30℃温育2天，然后在660nm测定培养物混浊度(图2和表1)

[表1]

	0	6.25	12.5	25	50
						pGAP-ScGWT1	0.7560	0.7370	0.6670	0.1140	0.0420
pGAP-opfGWT1	0.7150	0.6990	0.6910	0.3630	0.0530

虽然GWT1破坏体不能存活，但菌株在导入每种质粒后能存活(如0μg/ml的化合物浓度所示)。化合物(1)抑制ScGWT1-表达型酵母的生长，化合物(1)是GWT1-特异性抑制剂。以25μg/ml使用该化合物，约有85％的生长受抑制。当以50μg/ml使用该化合物时，酵母完全不能存活。化合物(1)也抑制opfGWT1-表达型酵母的生长。以25μg/ml使用该化合物，约有50％的生长受抑制。当以50μg/ml使用该化合物时，酵母完全不能存活。由于opfGWT1-表达型酵母的生长是由导入的opfGWT1的活性来决定的，因此生长抑制可归因于化合物(1)对opfGWT1功能的抑制作用。此发现说明：利用该分析系统，通过筛选化合物可以鉴定出具有恶性疟原虫GWT1-特异性抑制活性GWT1的化合物。

[实施例4]抗疟活性

利用红细胞培养系统，对抑制酵母GWT1的典型化合物(1)-(5)进行抗疟活性分析。

化合物(1)：1-(4-丁基苄基)异喹啉

化合物(2)：4-[4-(1-异喹啉基甲基)苯基]-3-丁炔-1-醇

化合物(3)：5-丁基-2-(1-异喹啉基甲基)苯酚

化合物(4)：2-(4-溴-2-氟苄基)-3-甲氧基吡啶

化合物(5)：N-[2-(4-丁基苄基)-3-吡啶基]-N-甲胺

具体地说，将待测化合物溶解在100％DMSO中，用培养基稀释，然后将稀释物的80μl等分试样加到96-孔培养板的每个孔中。恶性疟原虫FCR3菌株在37℃用含10％人血清的RPMI1640培养基预培养，然后在每个孔中加入20μl的培养细胞(含10％红细胞)。此时，0.47％的红细胞被感染。在5％O₂，5％CO₂，和90％N₂的37℃条件培养48小时后，将疟原虫用吉姆萨(Giemsa)染色法染色。测定原虫-感染的红细胞数量，以估计感染率(图3)。结果，显示化合物(3)具有很强的抗疟活性。其它4种化合物也显示了抗疟活性。化合物(4)表现的活性最低。这样，抑制酵母GWT1的化合物包括具有抑制恶性疟原虫GWT1活性的化合物，这说明抗疟药物可以在这些化合物的基础上进行合成。

工业实用性

本发明成功地制得能表达疟原虫GWT1的真菌。采用该真菌，而不采用疟原虫，能筛选出靶向GPI生物合成途径的抗疟药物。

到目前为止，还从未进行过在真菌细胞中表达疟原虫基因以及筛选抑制该基因功能的物质的尝试。本发明的方法并不需要利用疟原虫，因此本方法证明了在后基因组时代，采用比较基因组进行用于药物发现的全新筛选方法的可能性。

序列表

<110>卫材株式会社(Ei sai Co.，Ltd.)

<120>筛选在疟原虫中抑制GPI生物合成的化合物的方法

<130>E1-A0210P

<150>US60/428,589

<151>2002-11-22

<160>55

<170>PatentIn ver sion3.1

<210>1

<211>2625

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Pla smodium falciparum))

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2625)

<223>

<400>1

<210>2

<211>874

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>2

<210>3

<211>1956

<212>DNA

<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax))

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1956)

<223>

<400>3

<210>4

<211>651

<212>PRT

<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)

<400>4

<210>5

<211>2625

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的序列

<400>5

<210>6

<211>2010

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>6

<210>7

<211>669

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Pla smodium falciparum)

<400>7

<210>8

<211>1482

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>8

<210>9

<211>493

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>9

<210>10

<211>1494

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>10

<210>11

<211>497

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>11

<210>12

<211>2361

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>12

<210>13

<211>786

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>13

<210>14

<211>1233

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>14

<210>15

<211>410

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>15

<210>16

<211>3852

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>16

<210>17

<211>1283

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>17

<210>l8

<211>2433

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>18

<210>19

<211>810

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>19

<210>20

<211>780

<212>DNA

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>20

<210>21

<211>259

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)

<400>21

<210>22

<211>843

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>22

<210>23

<211>280

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>23

<210>24

<211>764

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>24

<210>25

<211>229

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>25

<210>26

<211>423

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>26

<210>27

<211>140

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>27

<210>28

<211>915

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>28

<210>29

<211>304

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>29

<210>30

<211>2760

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>30

<210>31

<211>919

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>31

<210>32

<211>660

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>32

<210>33

<211>219

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>33

<210>34

<211>2493

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>34

<210>35

<211>830

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>35

<210>36

<211>1605

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>36

<210>37

<211>534

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>37

<210>38

<211>1833

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>38

<210>39

<211>610

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>39

<210>40

<211>1185

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>40

<210>41

<211>394

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>41

<210>42

<211>255

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>42

<210>43

<211>84

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>43

<210>44

<211>369

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>44

<210>45

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>45

<210>46

<211>744

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>46

<210>47

<211>247

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>47

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>48

<210>49

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>49

<210>50

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>50

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>51

<210>52

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>52

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>53

<210>54

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>54

<210>55

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>55

Claims

1.一种编码具有补偿糖基磷脂酰肌醇(GPI)合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量，其中该DNA编码由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的蛋白。

2.权利要求1的DNA，其具有50-70％的AT含量。

3.载体，其中插入权利要求1或2的DNA。

4.转化体，其保留可表达状态的权利要求1或2所述DNA或者权利要求3所述载体。

5.权利要求4所述的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型真菌。

6.权利要求4所述的转化体，其为GPI合酶基因-缺陷型酵母。

7.一种制备由权利要求1或2所述DNA编码的蛋白的方法，该方法包括培养权利要求4-6中的任一转化体，并从该转化体或其培养上清液收集表达的蛋白的步骤。

8.一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将试样与GPI合酶基因-缺陷型酵母接触；所述酵母表达编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量，其中该DNA编码由SEQ ID NOs：2和4任一所示氨基酸序列组成的蛋白，

(2)分析该酵母的生长，和

(3)选出抑制该酵母生长的被试化合物。

9.一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将试样与GPI合酶基因-缺陷型酵母接触，所述酵母表达编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA 具有更低的AT含量，其中该DNA编码由SEQ ID NOs：2和4任一所示氨基酸序列组成的蛋白，

(2)检测GPI-锚定蛋白转运到酵母细胞壁的量，和

(3)选出使步骤(2)中所检测的GPI-锚定蛋白转运到酵母细胞壁的量减少的试样。

10.一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA导入GPI合酶基因-缺陷型酵母，并使该DNA编码的蛋白表达，其中该DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量，其中该DNA编码由SEQ ID NOs：2和4任一所示氨基酸序列组成的蛋白，

(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，

(4)检测与该蛋白结合的标记化合物，和

(5)选出减少与该蛋白结合的标记化合物的量的试样。

11.一种筛选具有抗疟活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将(i)编码具有补偿GPI合酶基因-缺陷型酵母表型的活性的蛋白的DNA，或者(ii)插入了所述DNA的载体，导入GWT1-缺陷型真菌，且表达由该DNA编码的蛋白，其中所述DNA是编码在疟原虫中参与GPI生物合成的蛋白的DNA的简并突变体，其比天然DNA具有更低的AT含量，其中该DNA编码由SEQ ID NOs：2和4任一所示氨基酸序列组成的蛋白，

(2)获得步骤(1)中表达的蛋白，

(3)加入UDP-GlcNAc或酰基辅酶A，

(4)使所得蛋白与试样接触，

(5)检测GlcN-(酰基)PI，和

(6)选出减少GlcN-(酰基)PI水平的被试化合物。