JP4315907B2 - マラリア原虫のgpiの生合成を阻害する化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Description
本発明は、マラリア原虫のGPIの生合成を阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。
マラリアは、寄生原虫による最大の感染性のヒト疾患である。この疾患は、マラリア原虫がハマダラ蚊を媒介として感染することにより引き起こされる。毎年の推定マラリア感染者数は5億人であり、そのうち死亡者数は200万人以上にのぼる(Gardner, et al, Nature 2003, 419:498-511)。世界人口の40%はマラリア流行地に住んでいるのが現状であり、そのような地域では、乳幼児の3人に1人がマラリアによって死亡するといわれている。
本発明の目的は、GPIの生合成を阻害する抗マラリア剤を提供することにある。より詳細には、本発明は、GPIの生合成に関与する蛋白質(GPI生合成酵素)の一つであるGWT1蛋白質をコードするマラリア原虫DNAを提供する。また、本発明は、抗マラリア剤のスクリーニング方法における該DNAの利用法を提供する。さらに本発明は、マラリア原虫のGPI生合成蛋白質をコードするDNAの縮重変異DNAを提供する。これらの縮重変異DNAは、もとのDNAと比較してAT含率が低下している。本発明はまた、抗マラリア剤のスクリーニング方法における該縮重変異DNAの使用法も提供する。
(a)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または3に記載の塩基配列を含むDNA、
(c)配列番号:1または3に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
(d)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
[2] [1]に記載のDNAによりコードされる蛋白質。
[3] [1]に記載のDNAが挿入されたベクター。
[4] [1]に記載のDNAまたは[3]に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
[5] [2]に記載の蛋白質の活性を抑制する化合物を有効成分として含有する抗マラリア剤。
[6] [2]に記載の蛋白質の活性を抑制する化合物が、下記式
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物である、[5]に記載の抗マラリア剤。
[7] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[2]に記載の蛋白質と、被検試料及び該蛋白質に結合活性を有する標識化合物を接触させる工程、
(2)該蛋白質に結合する標識化合物を検出する工程、および
(3)該蛋白質に結合する標識化合物の量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
[8] 該蛋白質に結合活性を有する標識化合物が、[6]に記載の化合物(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を標識することによって産生される、[7]に記載の方法。
[9] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[2]に記載の蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
(2)GlcN-(アシル)PIを検出する工程、および
(3)GlcN-(アシル)PIレベルを減少させる被検化合物を選択する工程、を含む方法。
[10] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[2]に記載の蛋白質が過剰発現している細胞に被検試料を接触させる工程、
(2)該細胞におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を決定する工程、および
(3)工程(2)において決定されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
[11] [2]に記載の蛋白質の活性を阻害する化合物を投与する工程を含む、マラリアを治療する方法。
[12] [2]に記載の蛋白質の活性を阻害する化合物が、[5]に記載の化合物である、[11]に記載の方法。
[13] GPI合成酵素遺伝子欠失酵母の表現型の相補活性を有する蛋白質をコードするDNAであって、マラリア原虫のGPI生合成に関与する蛋白質をコードするDNAの縮重変異体であり、且つもとのDNAと比較してAT含率が低下したDNA。
[14] GPI合成酵素遺伝子欠失酵母の表現型の相補活性を有する蛋白質をコードするDNAであって、マラリア原虫のGPI生合成に関与する蛋白質をコードするDNAの縮重変異体であり、且つAT含率が70%低下したDNA。
[15] 以下の(a)から(d)からなる群より選択される、[13]または[14]に記載のDNA:
(a)配列番号:2および4、ならびに6〜47の奇数番号に記載のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA、
(b)配列番号:1および3、ならびに6〜47の偶数番号に記載のいずれかの塩基配列を含むDNA、
(c)配列番号:1および3、ならびに6〜47の偶数番号に記載のいずれかの塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
(d)配列番号:2および4、ならびに6〜47の奇数番号に記載のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするDNA。
[16] 配列番号:5に記載の塩基配列を含むDNA。
[17] [13]〜[16]のいずれかに記載のDNAが挿入されたベクター。
[18] [13]〜[16]のいずれかに記載のDNAまたは[17]に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
[19] GPI合成酵素遺伝子欠失真菌である、[18]に記載の形質転換体。
[20] GPI合成酵素遺伝子欠失酵母である、[18]に記載の形質転換体。
[21] [18]〜[20]のいずれかに記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、[13]〜[16]のいずれかに記載のDNAによりコードされる蛋白質の製造方法。
[22] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[13]〜[16]のいずれかに記載のDNAが発現しているGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に被検試料を接触させる工程、
(2)該真菌の増殖を測定する工程、および
(3)該真菌の増殖を阻害する被検化合物を選択する工程、を含む方法。
[23] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[13]〜[16]のいずれかに記載のDNAが発現しているGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に被検試料を接触させる工程、
(2)該真菌におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を決定する工程、および
(3)工程(2)において決定されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
[24] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)[13]〜[16]のいずれかに記載のDNAをGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に導入し、該DNAによりコードされる蛋白質を発現させる工程、
(2)工程(1)で発現させた蛋白質を調製する工程、
(3)調製した蛋白質と、被検試料及び該蛋白質に結合活性を有する標識化合物を接触させる工程、
(4)該蛋白質に結合する標識化合物を検出する工程、および
(5)該蛋白質に結合する標識化合物の量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
[25] 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)(i) GWT1遺伝子欠失酵母の表現型の相補活性を有する蛋白質をコードするDNAであって、マラリア原虫のGWT1蛋白質をコードするDNAの縮重変異体であり、もとのDNAと比較してAT含率が低下したDNA、または(ii) 該縮重変異DNAが挿入されたベクターを、GWT1遺伝子欠失真菌に導入し、該縮重変異DNAによりコードされる蛋白質を発現させる工程、
(2)工程(1)で発現させた蛋白質を調製する工程、
(3)調製した蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
(4)GlcN-(アシル)PIを検出する工程、ならびに
(5)GlcN-(アシル)PIレベルを減少させる被検化合物を選択する工程、を含む方法。
化合物(1):1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
化合物(2):4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
化合物(3):5-ブチル-2-(1-イソキノリルメチル)フェノール
化合物(4):2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-メトキシピリジン
化合物(5):N-[2-(4-ブチルベンジル)-3-ピリジル]-N-メチルアミン
以下に本発明に記載された2つの方法、即ち、(1) マラリア原虫のGWT1遺伝子産物(以下マラリア原虫のGWT1蛋白質と記載する)を調製する方法、(2) 標識化合物の結合実験(以下結合アッセイと記載する)の方法について開示する。
マラリア原虫のGWT1蛋白質は、マラリア原虫のGWT1蛋白質(配列番号:2)をコードするDNAを導入した細胞、好ましくは真菌細胞、更に好ましくはS.セレビシエ(S. cerevisiae)に由来の細胞の膜画分から調製する。GWT1遺伝子を欠失している細胞にそのようなDNAを導入することが好ましい。結合アッセイは、調製した膜画分をそのまま使用してもよいし、使用の前に更に精製して用いてもよい。以下にS.セレビシエを使用した方法について具体的に説明する。
本発明に使用されるマラリア原虫GWT1遺伝子は、天然型の遺伝子であってもよいが、好ましくは、配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列を元に合成することができる。マラリア原虫GWT1遺伝子は非常にアデニンもしくはチミンに富んでいる。そのため、通常の遺伝子組換え操作の困難なこと、および、酵母や細胞等での遺伝子発現が十分ではないことが予想された。したがって、各アミノ酸に対応するコドンを、酵母もしくは細胞等において効率よく発現すると考えられるものに変換した塩基配列を設計し、これをもとにDNA合成を行い人工マラリア原虫GWT1遺伝子を作製する配列を設計し、以下の実験に用いることが好ましい。
マラリア原虫のGWT1遺伝子を導入したS.セレビシエ細胞を、適当な培地(例えばSD(ura-)液体培地)にて、適当な温度(例えば30℃)で振とうしながら培養する。この真菌細胞を、対数増殖中期の時点で集菌し、洗浄した後、適量(例えば真菌細胞量の3倍量)のホモジナイゼーション(Homogenization)緩衝液(例えば50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, Complete(商標)(Roche社製))に懸濁する。適量(例えば真菌細胞量の4倍量)のガラスビーズを懸濁液に加える。この混合物をボルテックスしては氷上に置く。この操作を数回繰り返して真菌細胞を破砕する。
(a) 標識化合物の合成
標識化合物は、GWT1蛋白質と結合することが確認された化合物から調製される。GWT1蛋白質と結合することができるいかなる化合物も使用することができる。好ましくは国際公開公報第02/04626号に記載の化合物、更に好ましくは、上記化合物(1)〜(5)の化合物である。
調製した膜画分に標識化合物を加え、氷上にて適当な時間、例えば1〜2時間静置して、標識化合物と膜画分との結合反応を行う。その後、混合物を、例えば15,000 rpm, 3分間遠心して、膜画分を沈殿させる。沈殿を結合緩衝液に再度懸濁し、懸濁液を遠心する。この操作を適宜(2回)繰り返して、結合していない標識化合物を除去する。沈殿を結合緩衝液に再び懸濁する。得られた懸濁液を放射能測定用バイアルに移してシンチレーターを加える。液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定する。
調製した膜画分に被検試料及び標識化合物を加え、混合物を氷上にて適当な時間、例えば1〜2時間静置して、膜画分との結合反応を行う。本発明のスクリーニング方法に用いる被検試料としては、単一の天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質またはペプチド、並びに化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
GPIへのアシル基の転移は、Costello L.C. and Orlean P., J. Biol. Chem. (1992) 267:8599-8603; またはFranzot S.P. and Doering T.L., Biochem. J.(1999) 340:25-32に報告されている方法により検出可能である。以下に具体的な方法の例を挙げる。以下の実験条件は、使用する各々のマラリア原虫のGWT1蛋白質に合わせて最適化することが好ましい。
マラリア原虫のGWT1蛋白質の活性を阻害する被検試料の能力は、マラリア原虫のGWT1蛋白質を細胞、好ましくは真菌細胞に発現させて細胞膜表面のGPIアンカー蛋白質を検出する工程を含むGPIアンカー蛋白質検出系によっても決定することができる。本発明における真菌は、接合菌、子嚢菌、担子菌および不完全菌門に属する菌種であり、好ましくは病原性真菌、ケカビ属(Mucor)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichosporon)、マラセジア属(Malassezia)、アスペルギルス属(Aspergillus)、白癬菌属(Trichophyton)、小胞子菌属(Microsporum)、スポロトリクス属(Sporothrix)、ブラストミセス属(Blastomyces)、コクシジオイデス属(Coccidioides)、パラコクシジオイデス属(Paracoccidioides)、ペニシリウム属(Penicillinium)およびフザリウム属(Fusarium)であり、より好ましくはC.アルビカンス、C.グラブラタ(C. glabrata)、C.ネオフォルマンスおよびA.フミガーツスであり、さらに好ましくは酵母である。酵母としては、S.セレビシエ及びS.ポンベが挙げられる。マラリア原虫のGWT1蛋白質をコードするDNAが挿入された発現ベクターを上記真菌細胞へ導入する方法は、当業者に周知である。
GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程は、GPIアンカー蛋白質を放射性同位元素で標識し、真菌細胞壁画分を得た後、GPIアンカー蛋白質に対する抗体による免疫沈降を行うといったトレーサー実験により定量することが可能である。または、下記のように、より容易に定量することができる。即ち、GPIアンカー蛋白質に共通して見られ、輸送のシグナルとして機能すると考えられるC末端配列を、測定の容易な酵素(レポーター酵素)との融合蛋白質として発現させ、真菌細胞壁画分を得て、各画分の酵素活性を測定するレポーター系を使用することができる。(Van Berkel MAA et al, FEBS Letters, 349: 135-138, 1994)。以下にレポーター酵素を用いた方法について説明するが、これは本発明を限定するものではない。
GPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現に影響を与える被検試料の能力は、真菌細胞壁中のGPIアンカー蛋白質と反応する抗体によって定量することが可能である。
GPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現における被検試料の影響を、真菌細胞壁中のGPIアンカー蛋白質の活性、好ましくは真菌の動物細胞への付着能等を測定することにより、検定可能である。GPIアンカー蛋白質の活性としては、動物細胞への付着に関与するAls1p、Hwp1等の他に、接合(mating)に関与するα-アグルチニン、酵母の凝集に関与するFlo1p等が含まれる。以下に、真菌の動物細胞への付着能による方法について詳細に記載するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
GPIアンカー蛋白質の真菌表層での発現における被検試料の影響は、真菌細胞壁の構造を電子顕微鏡により観察することにより検定が可能である。
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(1)熱帯熱マラリア原虫GWT1(PfGWT1)の塩基配列(配列番号:1)は、熱帯熱マラリア原虫ゲノムデータベース(PlasmoDB database, http://plasmodb.org/) 上に公開されている。PfGWT1遺伝子は、熱帯熱マラリア原虫(3D7 strain)より精製したゲノムDNAを鋳型としたPCRによってクローニングされた。PfGWT1遺伝子の5'側半分と3'側半分が分割して調製され、この両者はXbaI(TCTAGA)制限酵素切断部位にて結合された。このようにして全長のPfGWT1遺伝子を作製した。また、コード領域の外側に制限酵素切断部位が含まれるため、発現ベクターへの挿入が可能になった。
[pf152F] ATGACAATGTGGGGAAGTCAACGGg (配列番号:48)
[pf136R] TGTGTGGTTACCGTTCTTTGAATACATAGA (配列番号:49)
[pf137F] ATAGAAAATGATTTATGGTACAGCTCAAA (配列番号:50)
[pf151R] AGACCAAATTAATTATGCCTTTACATGTAC (配列番号:51)
[pf154FE] agaattcaccATGAGCAACATGAATATACTTGCGTATCTT (配列番号:52)
[pf157R] GAAATTCCAATGTATTCCATATTCACTTAT (配列番号:53)
[pf168BK] AAGATCTAATACATTAAAACATTTTAGATTAATGAATATGTG (配列番号:54)
[pf155RK] aggtaccGTACACTCCACTCTATGATGATCATTC (配列番号:55)
熱帯熱マラリア原虫のDNAはアデニンおよびチミン(AT)の割合が非常に高く(80%またはそれ以上)、一般的な分子生物学的手法(PCR、大腸菌を用いた遺伝子操作、組換え蛋白質の発現系など)を適用できない場合が多い(Sato and Horii, 蛋白質核酸酵素Vol.48, 149-155, 2003)。PfGWT1のDNAのAT含率も80.41%であり、しかもAまたはTが連続している箇所が多く含まれる。そのため、酵母内での複製および蛋白質発現は困難であることが予想された。実際に過剰発現型の酵母ベクターに天然型のPfGWT1をつなぎ、GWT1を破壊した酵母細胞株に導入したところ、PfGWT1はgwt1破壊株の致死性を全く相補できなかった。そこで、AT含率を下げる目的で本来のアミノ酸配列と変わらない形で、コドンを同等のコドンに置換した。
opfGWT1発現酵母を用いて、抗マラリア活性を持つ化合物をスクリーニングする系を構築した。
酵母GWT1阻害作用を示す代表化合物(1)〜(5)について赤血球培養系を用いた抗マラリア活性の測定を行った。
化合物(1):1-(4-ブチルベンジル)イソキノリン
化合物(2):4-[4-(1-イソキノリルメチル)フェニル]-3-ブチン-1-オール
化合物(3):5-ブチル-2-(1-イソキノリルメチル)フェノール
化合物(4):2-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)-3-メトキシピリジン
化合物(5):N-[2-(4-ブチルベンジル)-3-ピリジル]-N-メチルアミン
本発明により、マラリア原虫のGWT1を発現する真菌の作製に成功した。これを用いることにより、マラリア原虫を用いることなくGPI生合成経路をターゲットとした抗マラリア剤をスクリーニングすることが可能である。
Claims (12)
- 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)下記(a)または(b)に記載のGlcN-PIアシル-トランスフェラーゼ活性を有するマラリア原虫の蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)GlcN-(アシル)PIを検出する工程、および
(3)GlcN-(アシル)PIレベルを減少させる被検化合物を選択する工程、を含む方法。 - 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)下記(a)または(b)に記載のGlcN-PIアシル-トランスフェラーゼ活性を有するマラリア原虫の蛋白質が過剰発現している細胞に被検試料を接触させる工程、
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および/または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)該細胞におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を決定する工程、および
(3)工程(2)において決定されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。 - 配列番号:5に記載の塩基配列を含むDNA。
- 請求項3に記載のDNAが挿入されたベクター。
- 請求項3に記載のDNAまたは請求項4に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
- GPI合成酵素遺伝子欠失真菌である、請求項5に記載の形質転換体。
- GPI合成酵素遺伝子欠失酵母である、請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項5〜7のいずれかに記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項3に記載のDNAによりコードされる蛋白質の製造方法。
- 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)請求項3に記載のDNAが発現しているGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に被検試料を接触させる工程、
(2)該真菌の増殖を測定する工程、および
(3)該真菌の増殖を阻害する被検化合物を選択する工程、を含む方法。 - 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)請求項3に記載のDNAが発現しているGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に被検試料を接触させる工程、
(2)該真菌におけるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を決定する工程、および
(3)工程(2)において決定されるGPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。 - 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)請求項3に記載のDNAをGPI合成酵素遺伝子欠失真菌に導入し、該DNAによりコードされる蛋白質を発現させる工程、
(2)工程(1)で発現させた蛋白質を調製する工程、
(3)調製した蛋白質と、被検試料及び該蛋白質に結合活性を有する標識化合物を接触させる工程、
(4)該蛋白質に結合する標識化合物を検出する工程、および
(5)該蛋白質に結合する標識化合物の量を減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。 - 抗マラリア作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
(1)(i) 請求項3に記載のDNA、または(ii) 請求項3に記載のDNAが挿入されたベクターを、GWT1遺伝子欠失真菌に導入し、該DNAによりコードされる蛋白質を発現させる工程、
(2)工程(1)で発現させた蛋白質を調製する工程、
(3)調製した蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
(4)GlcN-(アシル)PIを検出する工程、ならびに
(5)GlcN-(アシル)PIレベルを減少させる被検化合物を選択する工程、を含む方法。
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