KR20100003753A - 여드름 발병균의 항체 생산방법과 이를 함유한 여드름 질환치료용 화장품 조성물 - Google Patents

여드름 발병균의 항체 생산방법과 이를 함유한 여드름 질환치료용 화장품 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여드름 발병균에 대한 항체 생산방법과 이를 함유하는 여드름 질환 치료용 화장품 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 여드름 증상을 나타내는 주요 원인균인 프로피오니박테리움 아크네(propionibacterium acnes)에 대한 항체를 동물로부터 생산하고 이 항체에 항산화 및 면역증강효능이 있는 겨우살이, 마늘에서 분리한 만노오즈 결합 렉틴, 피부 보호 및 재생효능이 있는 진주(pearl층)을 혼합조성한 화장품 조성물을 제공하므로서 여드름균에 대해 특이적인 항균작용을 나타내는 여드름 치료에 매우 뛰어난 효과가 있다.
여드름치료, 프로피오니박테리움 아크네, 항체, 보체, 만노스, 겨우살이

Description

여드름 발병균의 항체 생산방법과 이를 함유한 여드름 질환 치료용 화장품 조성물{mehod of production antibody against propionibacterium acnes and cosmetic composition for treatment of disease using the same}
본 발명은 여드름 발병균에 대한 항체 생산방법과 이 방법에 의해 생산된 항체를 함유하는 여드름 질환 치료용 화장품에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 여드름 증상을 나타내는 주요 원인균인 프로피오니박테리움 아크네(propionibacterium acnes) 균에 대한 항체를 동물로부터 생산하고, 이 항체에 면역증강효능이 있는 겨우살이, 마늘에서 분리한 만노오즈 결합 렉틴, 피부를 보호해주는 진주펄층을 배합한 항 여드름균 화장료 조성물에 관한 것이다.
여드름은 피지모낭에 대한 남성호르몬과 세균의 복합작용에 의해 발생한다. 사춘기와 젊은 연령층에 많이 발생되는데 여드름의 원인으로는 호르몬, 가족력, 환경요인 등이 있다. 특히 안드로젠이라는 남성호르몬이 피지선을 자극하면 피지선이 커지고 피지분비를 많이 하게 된다. 이러한 피지들은 땀, 먼지 등과 함께 모낭의 입구를 막아 여드름의 특징인 면포를 생성하는데 여기에 여드름을 일으키는 세균들이 모여 염증을 일으키는 것이다. 이렇게 생기는 여드름은 피부 중 특히 얼굴, 가슴, 등,목 등에 잘 나타난다.
이와같은 여드름균활성 억제 및 치료법으로는 피지 생성을 억제하는 호르몬제와 비타민 A 제제 화합물, 항염제로 사용하는 비스테로이드 소염제, 항균효과가 있는 레조시놀, 피부를 제거하기 위한 벤조일 퍼옥사이드와 박테리아균의 증식을 억제하기 이한 테트라사이클린, 에리스로마이신, 클린다마인 및 머크로라이드 등에 의한 여드름균 활성 억제 방법과 레티노익산 등의 비타민 A 유도체를 이용한 치료법 등이 이용되고 있다.
여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네 균 대한 항균력을 갖는 치료방법은 크게 화학약품이거나 식물 추출물인데, 화학약품의 경우에는 피부 자극, 항생제의 경우에는 내성 문제가 있고, 식물 추출물은 민감한 피부일 경우에는 알레르기반응을 보일 수도 있기 때문에 그 안정성과 효능면에서 문제를 갖고 있다.
보체(complement)는 면역반응이나 알레르기 반응의 매개물질로 작용하는 혈청단백질의 총칭으로써, 병원 미생물 등에 대한 생체방어 메커니즘의 발현에 중요한 역할을 한다. 일반적으로 생체 내에 침입한 세균이나 바이러스(항원)에 항체가 반응하여 항원항체 복합물을 형성하여도 그것만으로 무독화되는 것이 아니라, 혈청 속에 존재하는 보체가 항원항체복합물에 접촉하고 반응해야 비로소 병원체가 파괴되거나 식세포에 의한 식작용이 일어난다. 본 발명에서는 보체가 포함된 혈청을 그대로 사용하고, 이 보체 활성 경로를 활성시키는 겨우살이 렉틴과 만노우즈 결합 렉틴을 사용함으로, 항체의 여드균에 대한 항균력을 증진시키고자 한다.
겨우살이(mistletoe, Viscum album)는 여러종류의 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생식물로서, 한방에서는 요통 및 치통과 같은 통증의 완화, 고혈압 및 동맥경화와 같은 혈액순환개선, 유산방지 및 종양의 제거 등에 사용되어져 왔다. 최근 겨우살이 추출물의 항암 및 면역활성에 대한 연구가 진행중이고, 특히 겨우살이가 함유하고 있는 렉틴의 경우 여러 가지 면역학적인 기능들을 가지고 있는 물질로 알려져 있으며, 특히 한국산 겨우살이 렉틴의 경우에는 점막면역 활성화를 일으킬 수 있다는 논문이 발표되었다. 또한 한국산 겨우살이 렉틴은 경구 투여나 복강 접종에 있어서 면역화된 항체 생산에서의 면역증강제인 adjuvant로서 많이 사용되어지고 있다.
만노우즈 결합 렉틴(mannose binding lectin; MBL)은 보체의 활성 경로중의 하나(Lectin pathway)로써, 혈액중에 미량 존재하여 면역반응에 관여한다. 만노우즈 결합 렉틴이 항원의 표면에 있는 만노우즈에 결합하면서 이 보체경로의 활성이 시작되는데, 본 발명에서는 마늘로부터 이 물질을 분리하여 사용하였다.
진주에서 분리한 진주펄(pearl)은 20여종의 미네랄과 각종 생리활성 물질을 함유함으로서 피부를 약산성으로 유지시켜 피부의 면역력을 높여주며 피부노쇠를 막고 보습효과를 가져오며 혈액순환과 세포재생을 촉진하고 반점을 소제하는 독특한 효능을 갖고 있다.
본 발명의 목적은 기존 치료제의 부작용을 최소화함과 동시에 안정성과 여드름치료에 탁월한 효능을 가진 새로운 여드름 치료제를 제공하는데 있다.
따라서, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네 균에 대해 특이적인 항체를 토끼에서부터 얻고, 다른 면역증강 효능을 갖는 만노오즈 결합 렉틴과 겨우살이 추출물, 피부보호와 재생을 위한 진주펄층을 사용하였는데 그 특징이 있다.
본 발명의 상기 목적은 프로피오니박테리움 아크네 균에 대해 특이적인 항체와 피부보호 및 면역증강효능을 갖는 물질을 첨가하여 안정성과 항균 효능을 동시에 가지는 여드름 치료용 화장료 조성물을 제공함으로써 달성하였다.
본 발명은 프로피오니박테리움 아크네 균에 대한 항체와 면역활성효능이 있 는 한국산 겨우살이 렉틴, 마늘에서 분리된 만노우즈 결합 렉틴과 진주펄층을 함유한 실험군이 대조군에 비해 프로피오니막테리움 아크네 균에 대한 항균효능에 현저한 효과가 있고 기존의 여드름 치료제에 비해 안정성이 크게 향상 효과가 있으므로 여드름 치료 화장품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 토끼에 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네 항원을 한국산 겨우살이 렉틴을 면역증강제로 사용하여 토끼 등의 피하에 2회에 걸쳐 접종 하는 단계와, 체혈을 통해 혈청을 취하고, 혈청으로부터 항체를 분리한 후, 항체 역가를 측정하는 단계와 이 항체와 마늘에서 분리한 면역 증강효능을 갖는 만노우즈 결합 렉틴과 겨우살이을 함유 유무에 따른 프로피오니박테리움 아크네 균에 대한 생존 억제율을 측정, 비교하는 단계로 구성한다.
본 발명에 의한 프로피오니박테리움 아크네에 대한 항균효능 결과를 기초로 항체 및 면역증강효능을 갖는 물질과 진주펄층을 더 포함하는 여드름 화장료 조성물을 제공함을 특징으로 한다.
이하 본 발명이 여드름질환 치료에 대한 화장료 조성물의 기능성을 확인하기 위해 이하, 실시예, 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예, 비교에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프로피오니박테리움 아크네( propionibacterium acnes ) 항원의 제조.
프로피오니박테리움 아크네는 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC 3314) 에서 분양받아 사용하였다.
프로피오니박테리움 아크네를 10mL의 액티노마이세스배지(Actinomyces broth)에 3시간동안 1차 증균시켰다. 1차 증균액을 대량의 액티노마이세스 배지에 접종하여 10% CO2 항온기에서 증균시켰다. 항온기에서 48시간 배양된 균액의 0.2%가 되도록 포름알데하이드(formaldehyde)를 혼합하고 실온에서 24시간 불활화시켰다.
불활화된 균액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 수확하고 멸균생리식염수로 3회 세척하였다. 불활화의 확인은 고체배지에 도말하여 증균되지 않는 균체로 확인하였다.
상기 확인된 불활화된균체는 멸균생리식염수로 3회 세척하고 -20℃에 보관하여 항원으로 사용하였다.
실시예 2: 프로피오니박테리움 아크네 항원의 접종
상기의 실시예 1의 방법으로 제조한 항원 3mg을 생후 3개월 된 토끼의 등에 면역증강제인 한국산 겨우살이 렉틴과 1:1의 비율로 섞어 1주와, 5주차(boost)에 피하주사의 방법으로 접종하였다.
실시예 3: 프로피오니박테리움 아크네에 대한 항체 분리
상기의 방법으로 프로피오니박테리움 아크네 항원을 토끼에 접종한 날로부터 2주 후 경정맥으로부터 체혈을 실시하여 2000 rcf에서 10분간 원심분리하여 혈구를 제거함으로써 혈청을 분리하여 -20℃에서 보관하였다.
실시예 4: 항체의 역가 조사
상기의 방법으로 분리한 항체는 Time-resolved fluoroscence Immunoassay (TR-FIA)의 방법으로 역가 조사를 실시하였다. 전 과정은 Kensner등(Steriods, 59, 1994, 206)의 방법에 따라 실시하였다.
프로피오니박테리움 아크네 항원(약 10ug/mL)을 분석판(96 well plate)에 0.1mL로 37℃에서 2시간동안 피복시키고 여기에 0.1mL의 분리한 항체와 0.1mL의 표준항체(normal IgG 항체)를 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응을 시켰다.
이 후, 5~6회 반복 자동세척기로 세척하고 양 유래 항 토끼 면역글로불린 이차항체에 Eu 입자가 연결된 rabbit IgG Anti-Goat IgG-Eu particle conjugate를 1:5000의 희석농도로 37℃에서 2시간동안 반응시켰다.
그 후, 다시 5~6회 반복 자동세척기로 세척하고 200uL의 증가용액(Enhancement solution)을 넣고 5분간 추가 반응시킨 후에 측정하였다. 사용된 기기는 DELFIA(Wallac by Model 1420)였다.
본 발명의 항체 역가 조사를 위한 최신 기법 TR-FIA의 원리는 도 1에 나타내었다.
도 1의 방법으로 실시한 항체의 역가조사결과는 도 2, 3에 나타냈다. 도 2는 토끼에 항원을 접종한 후 일수별로 역가를 측정한 것이고, 도3은 최종 접종 후, 1주일 후에 얻은 항 혈청과 다른 대조군과 비교한 그래프이다.
실시예 5: 항 프로피오니박테리움 아크네 기능을 갖는 조성물의 생존억제 효과
상기 실시예 4의 방법으로 분리한 항체와 보체가 함유된 혈장에 추가적으로 만노우즈 결합 렉틴을 각각 농도별로 항균력을 측정하여 최적의 조건을 선택하였다. 항체의 희석 비율에 따른 프로피오니박테리움 아크네의 생존억제율은 도 4이며, 이로부터 항체의 희석배율을 설정하였다. 결정된 희석배율의 항체에 겨우살이 렉틴을 첨가하여 프로피오니박테리움 아크네의 생존억제율을 측정하였으며, 결과는 도 5와 같다. 프로피오니박테리움 아크네에 대한 생존억제에 대한 모든 실험 과정은 하기 희석생균측정법을 따랐다
즉, 콜롬비아 평판 배지에서 이틀 동안 배양한 프로피오니박테리움 아크네 균을 브루셀라 브로스 100ml에 옮겨 shaking incubator에서 배양하되, spectrophotometer를 이용하여 600nm의 파장에 0.6의 흡광도를 나타낼 때까지 배양한다. 이 각각의 배양액에 처방예 1의 표 2와 같은 물질을 첨가하여 농도별로 30분 동안 반응시킨 후, 10배씩 109배까지 희석한 배양액 중에서 106, 107, 108, 109배 희석 배양액을 콜롬비아 평판 배지에 접종하여 생균수를 측정하였다.
상기 방법으로 조사된 프로피오니박테리움 아크네 균의 생존억제율은 도 6과 같다.
또한 본 발명의 항균성 식물추출물을 함유하는 여드름 피부용 화장료 조성물을 화장품 제형별로 구체적인 처방예 1∼3[표 1내지 3]을 통해 나타내었다.
[표 1] <처방예 1> 수면팩(Sleeping pack)
성 분 명 함 량 (중량%)
항체 및 보체를 포함한 혈청 1.0
겨우살이 추출물 0.5
만노우즈 결합 렉틴 0.3
진주펄 가루 2.0
디메치콘 3.0
난황분말 3.0
녹차추출물 2.0
프로필렌글리콜 5.0
글리세린 6.0
폴리아크릴아마이드 4.0
항산화제 적당량
항,방부제 미량
정제수 to 100
[표 2] <처방예 2> 크림(Cream)
성 분 명 함 량 (중량%)
항체 및 보체를 포함한 혈청 2.0
겨우살이 추출물 1.0
만노우즈 결합 렉틴 0.5
진주펄 가루 2.0
옥틸도데카놀 3.0
유동 파라핀 6.0
스테아린 산 8.0
프로필렌글리콜 5.0
글리세린 5.0
바셀린 7.0
산화방지제 적당량
항,방부제 미량
정제수 to 100
[표 3] <처방예 3> 비누(soup)
성 분 명 함 량 (중량%)
항체 및 보체를 포함한 혈청 1.0
겨우살이 추출물 2.0
만노우즈 결합 렉틴 0.5
진주펄 가루 2.0
글리세린 2.0
에틸렌아민 테트라 초산나트륨 0.2
이산화티탄 0.5
색소 적당량
산화방지제 적당량
항,방부제 미량
비누칩 to 100
도 1은 항체 역가 조사를 위한 최신 방법인 TR-FIA의 원리를 나타낸 그림,
도 2는 접종 후 일수별로 항체의 역가를 나타낸 그래프,
도 3는 최후 접종 후 얻은 항체의 역가를 나타낸 그래프,
도 4은 항체의 희석 비율에 따른 프로피오니박테리움 아크네 균의 생존억제율을 나타낸 그래프,
도 5는 한국산 겨우살이 렉틴과 만노우즈 결합 렉틴의 농도별 처리에 따른 프로피오니박테리움 아크네 균의 생존억제율을 나타낸 그래프,
도 6는 각 첨가물 별 프로피오니박테리움 아크네 균의 생존억제율을 나타낸 그래프이다.

Claims (3)

  1. 토끼에 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네 항원과 면역보조제인 한국산 겨우살이 추출물을 접종하는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네에 특이적인 항체와 보체를 포함한 여드름 균의 혈청생산방법.
  2. 제1항의 방법으로 생산된 항혈청을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 여드름질환 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 수면팩, 크림, 비누 중 어느 하나인 화장품.
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