KR20090132213A - 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법 - Google Patents

분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090132213A
KR20090132213A KR1020080058370A KR20080058370A KR20090132213A KR 20090132213 A KR20090132213 A KR 20090132213A KR 1020080058370 A KR1020080058370 A KR 1020080058370A KR 20080058370 A KR20080058370 A KR 20080058370A KR 20090132213 A KR20090132213 A KR 20090132213A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cabbage
seq
nos
oligonucleotides
brms
Prior art date
Application number
KR1020080058370A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101011694B1 (ko
Inventor
권용삼
최선필
이승인
김희열
진민아
김정선
박범석
Original Assignee
대한민국(국립종자원장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(국립종자원장) filed Critical 대한민국(국립종자원장)
Priority to KR1020080058370A priority Critical patent/KR101011694B1/ko
Publication of KR20090132213A publication Critical patent/KR20090132213A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101011694B1 publication Critical patent/KR101011694B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 배추 품종 식별 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 높은 다형성을 보이는 초위성체 마커의 조합을 선별하고, 이를 이용한 배추 품종 식별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 배추 품종 식별용 마커는 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 배추 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사간의 종자 분쟁, 품종 보호권의 침해 여부 등을 중재할 수 있는 보조적인 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.
배추, 품종 식별, 초위성체 마커

Description

분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법{A method for discriminating Chinese cabbage cultivars using molecular markers}
본 발명은 배추 품종 식별 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커(microsatellite marker)의 조합을 선별하고, 이를 이용한 배추 품종 식별 방법에 관한 것이다.
최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자 표지(marker)로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용되고 있는 실정이다. 품종 식별용 분자 표지 개발에 대한 국외의 연구 동향을 살펴보면, 네덜란드에서는 장미, 토마토에 대해 각 품종별 DNA 프로파일을 D/B화 한 바 있고, 일본의 경우 딸기, 벼 등의 작물에 대한 품종 식별 분자 표지를 개발하여 이를 품종 보호 침해나 자국 농산물의 보호에 이용하고 있다.
국제 신품종 보호 연맹(UPOV) 산하 분자생물학 실무 작업반 회의에서도 품종 보호에 있어 분자 표지의 활용 방안에 대한 지속적인 논의를 수행하고 있다. 최근의 회의 동향을 보면 품종 보호 제도에 분자 표지를 품종의 구별성 판단에 직접 도입하는 방안에 대한 논의보다는 품종 식별용 분자 표지를 개발하여 이를 품종 보호 침해에 활용하는 논의가 주된 내용이다. 실제로 국제 종자 연맹(ISF)과 국제 무성 생식 관상 작물 육종가 연합회(CIOPORA)에서도 품종 보호 침해 사례 발생시 유전자 분석 기법의 적극적인 활용 의지를 표명하고 있다. 한편, 국립 종자원에서도 고추, 수박, 멜론, 참외, 토마토 등에 대한 작물의 품종 식별 체계가 어느 정도 구축되어 몇몇 작물의 분자 표지는 분쟁종자대비시험, 회사간의 종자 분쟁 발생시 품종의 진위성 판단에 직접적으로 이용한 바 있다.
십자화과 채소인 배추는 그 재배 면적이 2004년 기준 44,623 ha로 국내 전체 채소 재배 면적 341,000 ha의 13%를 점유하고 있고 생산 수입 판매 신고된 708개 품종이 유통되고 있어 종자 산업에서 차지하는 비중이 큰 중요한 작물이다.
배추에 대한 분자 유전학적 연구 동향을 살펴보면, 외국의 경우 국제 브라시카 게놈 프로젝트(Brassica genome project)가 수행되어 유전자 지도, 분자 표지 정보 등을 D/B화하여 이를 공개하고 있다. 국내에서도 농촌 진흥청 농업생명공학원에서는 배추 게놈 프로젝트를 수행하면서 여러 가지 종류의 분자 표지를 개발하여 고밀도 유전자 지도 작성에 활용하고 있다. 국립종자원의 경우 2002년도에 AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 분석 방법을 이용하여 배추 59개 품종에 대한 품종 식별 방법을 제시한 바 있다. 그러나, AFLP 분석은 마커의 분리 양상이 우성(dominant)을 나타내기 때문에 배추 F1 품종의 식별에 적합하지 않 은 것으로 보고되고 있다. 또한, UPOV에서도 AFLP 마커의 경우 분석의 반복 재현성 등의 문제로 인해 SSR과 SNP 마커의 활용을 제안하고 있다.
이에 본 발명자는 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 다형성을 나타내는 초위성체 마커를 선별하고, 이들을 프라이머로 이용하여 배추 게놈 DNA를 증폭시킨 후 생성된 증폭 산물을 확인함으로써, 대립 유전자 패턴 및 PIC 값을 살펴 보았을 때 상기 초위성체 마커가 배추 품종 식별 방법에 적합하여 품종 보호 침해 사례나 분쟁 종자 대비 시험에 실용적으로 활용할 수 있음을 밝혀, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커의 조합을 선별하고, 이를 이용한 배추 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 국내 종묘회사에서 육성된 품종의 유전적 거리의 예측을 가능하게 하여 품종 보호 출원시 보조 자료로 활용될 수 있는 배추 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 배추 품종 식별에 분자생물학적 기술을 접목하여 실용화함으로써 농업인에 대한 신뢰도 높은 종자의 보급을 통한 소득 향상뿐만 아니라 품종 육종에 이용하여 신품종 개발 효율을 높이고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 초위성체 마커(서열번호 1 내지 34)를 사용하는 배추 품종 식별 방법 및 이를 위한 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 배추 품종 식별 방법을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 배추 품종 식별 방법은 배추로부터 유래된 게놈 DNA를 분리하는 단계; 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 마커(서열번호 1 내지 34에서 선택되는 하나 이상의 프라미어 세트를 포함)를 프라이머로 이용하여 상기 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 확인한 후, 밴드들을 분석하여 배추의 품종을 식별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배추 품종 식별 방법에서 배추로부터 유래된 게놈 DNA는 식물로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는 배추 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎 또는 줄기로부터 게놈 DNA를 채취한다.
본 발명의 배추 품종 식별 방법에서 사용되는 마커는 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 SSR(simple sequence repeat) 마커이다. 구체적으로, 본 발명의 마커는 하기 표 2에 기재된 배추 65개 품종에 대하여 높은 다형성을 나타내었다. 본 발명의 마커 중 대표적인 마커 BRMS-27, KS20640, KS30200, KS30260, KS30930, KS40270 및 KS51115가 배추 65개 품종에 대해 다형성을 나타내었음을 도 1에 나타내었다.
바람직하게는 본 발명의 마커는 하기 표 1에 기재된 염기 서열(서열번호 1 내지 34)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 마커는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16, 서열번호 17과 18, 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22, 서열번호 23과 24, 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32 및 서열번호 33과 34의 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함한다.
<표 1> 본 발명의 배추 품종 식별에 사용된 마커
서열번호 프라이머 이름 염기 서열(5'→3')
1 BRMS-27 정방향:GCAGGCGTTGCCTTTATGTA
2 역방향:TCGTTGGTCGGTCACTCCTT
3 BRMS-34 정방향:GATCAAATAACGAACGGAGAGA
4 역방향:GAGCCAAGAAAGGACCTAAGAT
5 BRMS-43 정방향:GCGATGTTTTTTCTTCAGTGTC
6 역방향:TTAATCCCTACCCACAATTTCC
7 BRMS-50 정방향:AACTTTGCTTCCACTGATTTTT
8 역방향:TTGCTTAACGCTAAATCCATAT
9 BRMS-56 정방향:ATCAAGGCTACGGAGAGAGAG
10 역방향:CGTGACGCTAGAGTAATCGAGT
11 KS10440 정방향:ACGTGGCATTCATTAAACGG
12 역방향:GAAAGAGAGATCCTTCAGCCAA
13 KS10621 정방향:TCCACGCAAAACCAAAAC
14 역방향:TCATCCCCTCCGTTCTTT
15 KS10970 정방향:GTGGGATCGATGGTGATCTA
16 역방향:GTGTGGCTTTCACAAATTCC
17 KS20640 정방향:GAAGAAGACGAAGTTGAGCTGT
18 역방향:GCCCATATTGATACTTAACGGA
19 KS30200 정방향:AGCTGCTAAAGAGGTTGTTGAC
20 역방향:AACATCAGCCTGTCAAGAGAAT
21 KS30260 정방향:CGATTTGGACAATGACTAGTGG
22 역방향:AACGCCATGGAAACAGAAAC
23 KS30270b 정방향:GCAGCAAAACCTCTCCCTTT
24 역방향:CCTTCAGAGGTGCGTTTGAC
25 KS30930 정방향:TGAACCCTCGAAACTGAAAGA
26 역방향:GGACGTTAACGAAGGCAAAA
27 KS31001 정방향:GAAACAAATTATTTAAAAATCAGACCA
28 역방향:TGGAACAATCCGTAAAACTATGC
29 KS40270 정방향:TCAAGCATGTCCTTAAAACTCTGA
30 역방향:GCGTTCACGTTTCCCATATC
31 KS40400 정방향:TCGAGGTGGTTACAATCCAA
32 역방향:CAATGCGGATCTACCTCTCA
33 KS51115 정방향:CATCACTTTTTCAGGTGGATTT
34 역방향:CTTTCTCTCTACCTGGTGATGG
본 발명의 배추 품종 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 배추로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.
본 발명에서 상기 증폭된 산물은 전기영동에 의해 확인한다. 본 발명에서 전기영동시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있고, 대표적인 예로 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 배추 품종 식별 방법에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 후, 조합된 밴드들의 분석을 통하여 각각의 품종을 식별할 수 있다. 이때 각각의 배추 품종으로부터 나온 조합된 밴드들은 개별적인 실험을 통해 미리 하나의 표로 정리되어질 수 있다. 하기 도 2는 하기 표 2의 배추 품종에 대해 각 품종 식별용 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성한 것이다. 구체적으로 도 2는 하기 표 2의 배추 65개 품종을 대상으로 본 발명의 17개 마커를 사용하여 각각 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 "1"로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸 것이다. 따라서, 품종을 식별하고자 하는 배추로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 마커를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 2의 결과를 비교 분석함으로써 배추 품종을 식별할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 포함하는 배추 품종 식별용 키트를 제공한다. PCR 완충용액에 포함되는 성분들은 상기에서 기술한 바와 같다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 배추 품종 식별용 마커만을 사용하여 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종을 식별할 수 있다. 따라서, 배추 품종의 진위성 규명, 농가와 회사 및 회사와 회사간의 종자 분쟁, 품종 보호권의 침해 여부 등을 중재할 수 있는 보조적인 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 : 배추 품종 식별
(1) 배추 시료
본 발명에서는 하기 표 2에 기재된 배추 65개 품종을 배추 품종 식별용 프라이머 세트의 선별 및 배추 품종 식별 가능성 검정을 위해 사용하였다.
<표 2> 품종 식별용 배추 65개 품종
연번 품종명 육성회사 연번 품종명 육성회사
1 춘광봄 사카타 34 CR입춘배추 농우바이오
2 옥황씨알 사카타 35 봄맛배추 농우바이오
3 노랑맛하장 사카타 36 CR으뜸배추 농우바이오
4 하대장군 사카타 37 CR여름맛배추 농우바이오
5 태봉 사카타 38 CR퍼펙트배추 농우바이오
6 CR장군 사카타 39 CR그린배추 농우바이오
7 CR명품 사카타 40 황복여름배추 농우바이오
8 휘파람 사카타 41 강서여름배추 농우바이오
9 보람 사카타 42 CR하계배추 농우바이오
10 CR귀족 사카타 43 강한배추 농우바이오
11 추광 사카타 44 CR맛배추 농우바이오
12 겨울노랑 사카타 45 가을맛배추 농우바이오
13 영웅 사카타 46 CR강풍배추 농우바이오
14 겨율강풍 사카타 47 금방울배추 농우바이오
15 노랑쌈 사카타 48 쌈맛배추 농우바이오
16 CR미락쌈 사카타 49 싱그런솎음배추 농우바이오
17 신록엇갈이 사카타 50 노랑만점 신젠타
18 CR새신록엇갈이 사카타 51 베타노랑봄 신젠타
19 겨우내솎음 사카타 52 만점 신젠타
20 진청배추 세미니스 53 CR파워 신젠타
21 썬그린배추 세미니스 54 여름황 신젠타
22 천하통일배추 세미니스 55 명진노랑 신젠타
23 챔피온배추 세미니스 56 노란속 신젠타
24 삼복노랑배추 세미니스 57 가을황 신젠타
25 노랑관동배추 세미니스 58 만점노랑겨울 신젠타
26 노랑추석배추 세미니스 59 황금알 신젠타
27 불암플러스배추 세미니스 60 금노랑만점 신젠타
28 노랑김치배추 세미니스 61 생생 코레곤
29 겨울811배추 세미니스 62 동미 다끼이
30 청풍배추 세미니스 63 노랑맛 코레곤
31 신동풍배추 세미니스 64 알찬통 코레곤
32 추동솎음배추 세미니스 65 CR탱크 코레곤
33 쌈노랭이배추 세미니스
(2) 게놈 DNA의 추출
상기 표 2에 기재된 공시 배추 품종의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하고 4주일 경과 후, 연한 부위의 유엽을 채취하여 게놈 DNA의 분리 재료로 이용하였다. 채취한 배추의 유엽이 보관되어 있는 2 ml 튜브에 텅스텐 구슬 3개와 세포 용해 버퍼(lysis buffer)를 넣고 볼텍싱(vortexing) 과정을 반복하면서 조직을 충분히 마쇄하였다. Nucleospin Plant Kit(Machery-Nagel Cat. No. 740.270.540.)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동 하여 DNA의 농도를 확인하였고, 정량한 후 PCR 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
(3) 프라이머 세트의 제작
본 발명의 프라이머 세트를 위한 후보 물질로는 Suwabe 등(2002)과 Lowe 등(2004) 및 농촌 진흥청 농업 생명공학연구원 배추 게놈팀에서 개발된 176개 프라이머 세트를 이용하였다. 국내 유통 품종을 구분할 수 있는 마커를 선발하기 위하여 세미니스 코리아에서 육성된 Tropic emperor, Tropic field, Green Mountain, Tropic top, Tropic star, Tropic queen, Sumo 60, 아리랑, 일본 타끼이 종묘에서 개발된 Muso, Salad, Kenshun 품종의 DNA를 추출하여 176개의 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭한 다음 반복 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗하며 다형성 정도가 높은 마커를 29개 선발하였다. 29개의 마커를 국내에서 유통되고 있는 배추 65개 품종에 확대하여 적용하였을 때 17개의 마커만으로 모든 품종이 구분되는 것으로 나타났다. 공시 배추 품종에 다형성을 보이는 프라이머 세트의 염기 서열을 상기 표 1에 나타내었다. 본 발명의 마커 중 대표적인 마커 BRMS-27, KS20640, KS30200, KS30260, KS30930, KS40270 및 KS51115가 배추 65개 품종에 대해 다형성을 나타내었음을 도 1에 나타내었다.
(4) PCR 증폭 및 전기 영동
상기 준비된 게놈 DNA와 상기 제작된 마커를 재료로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 상기 제조된 배추 게놈 DNA 20 ng, 0.1 μM의 상기 마커, 2.0㎕ dNTP 혼합물(2.5 mM), Taq polymerase 1U(Takara CAT. RR011A), 2.5 ㎕의 10 x PCR 버퍼(50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0 mM MgCl2)에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 25㎕로 조절하였다. PCR(Biometra, 독일) 증폭은 94℃에서 5분 동안 배추 게놈 DNA를 충분히 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 50-58℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 과정으로 35회 반복 수행하였다. PCR 산물의 최종 신장을 위하여 72℃에서 10분 동안 반응시켰고, 어닐링 온도는 각각의 프라이머에 따라 50-58℃로 설정하여 수행하였다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 하기 표 3에 나타내었다. PCR이 완료된 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 증폭된 시료들은 다음 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. PCR에 증폭된 시료들은 요소가 포함된 6% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩(loading)하여 1900v로 2시간 정도 전기 영동을 수행한 다음, 폴리아크릴아미드 겔을 은 염색 키트(silver staining kit)(Promega, USA)를 이용하여 염색하였다.
(5) 본 발명에 따른 마커의 배추 품종 식별 가능성 검정
상기에서 전기영동으로 확인한 밴드 패턴을 이용하여 본 발명에 따른 마커의 배추 품종 식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC(polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993, Genome 36: 181-186).
<식 1>
Figure 112008044307460-PAT00001
그 결과, 각 마커에 따른 증폭 산물의 크기(bp), 대립 유전자의 수 및 PIC 값을 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3> 마커의 특징
프라이머 이름 어닐링 온도(℃) 증폭 산물의 크기(bp) 대립 유전자의 수 PIC 값
BRMS-27 55 205 5 0.886
BRMS-34 50 145 9 0.882
BRMS-43 52 319 4 0.781
BRMS-50 50 186 7 0.882
BRMS-56 50 216 6 0.858
KS10440 58 256 4 0.575
KS10621 58 338 9 0.951
KS10970 58 346 5 0.870
KS20640 58 283 3 0.774
KS30200 58 296 3 0.807
KS30260 58 288 6 0.821
KS30270b 58 306 5 0.728
KS30930 58 310 4 0.849
KS31001 58 199 5 0.786
KS40270 58 217 5 0.795
KS40400 58 263 7 0.826
KS51115 58 337 5 0.821
상기 표 3에서 살핀 바와 같이, 본 발명의 마커 중 KS10440만이 0.575의 가장 낮은 PIC 값을 나타내었고, 나머지 16개 마커는 0.70 이상의 PIC 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 마커는 배추 품종을 충분히 식별가능하게 할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 마커에 대해 밴드의 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 1로 코드화하고 밴드가 존재하지 않을 경우에는 0으로 코드화하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 품종을 식별하고자 하는 배추로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물과 도 2의 결과를 비교 분석함으로써 배추 품종을 식별할 수 있는 자료로 사용될 수 있다.
상기 밴드의 유무에 따라 NTSYS pc(version 2.10b)(Rohlf, 2000, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System-Version 2.10b. Applied Biostatistics Inc., New York.) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법(Sneath and Sokal, 1973, Numerical taxonomy: The Priciples and Practice of Numerical Classification, W. H. Freeman, San Francisco.)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도(dendrogram)를 작성하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이에 따라 본 발명의 프라이머 세트는 모든 품종의 구별을 가능하게 함을 알 수 있다. 도 3에서 썬그린 배추, 천하통일 배추, 챔피온 배추, 삼복노랑 배추 및 노랑관동 배추는 유전적 유사도가 매우 큰 품종인 것으로 나타났다.
도 1은 배추 65개 품종을 대상으로 본 발명의 마커 BRMS-27, KS20640, KS30200, KS30260, KS30930, KS40270 또는 KS51115를 사용하여 PCR 증폭한 후 전기영동한 것이다.
도 2는 배추 65개 품종을 대상으로 본 발명의 17개 마커를 사용하여 증폭하였을 때 나타나는 밴드의 유무를 코드화한 것으로, 밴드가 존재할 때에는 "1"로 나타내었고 밴드가 존재하지 않을 때에는 "0"으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 마커에 의해 분석된 각 배추 품종을 코드화하고 NTSYSPC 컴퓨터 프로그램을 활용하여 배추 품종 식별 및 품종별 유전적 유사도를 나타낸 것이다.
<110> Korea seed and variety service <120> A method for discriminating Chinese cabbage cultivar using molecular markers <130> PN078298 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRMS-27 <400> 1 gcaggcgttg cctttatgta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRMS-27 <400> 2 tcgttggtcg gtcactcctt 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRMS-34 <400> 3 gatcaaataa cgaacggaga ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRMS-34 <400> 4 gagccaagaa aggacctaag at 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRMS-43 <400> 5 gcgatgtttt ttcttcagtg tc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRMS-43 <400> 6 ttaatcccta cccacaattt cc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRMS-50 <400> 7 aactttgctt ccactgattt tt 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRMS-50 <400> 8 ttgcttaacg ctaaatccat at 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRMS-56 <400> 9 atcaaggcta cggagagaga g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRMS-56 <400> 10 cgtgacgcta gagtaatcga gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS10440 <400> 11 acgtggcatt cattaaacgg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS10440 <400> 12 gaaagagaga tccttcagcc aa 22 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS10621 <400> 13 tccacgcaaa accaaaac 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS10621 <400> 14 tcatcccctc cgttcttt 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS10970 <400> 15 gtgggatcga tggtgatcta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS10970 <400> 16 gtgtggcttt cacaaattcc 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS20640 <400> 17 gaagaagacg aagttgagct gt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS20640 <400> 18 gcccatattg atacttaacg ga 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS30200 <400> 19 agctgctaaa gaggttgttg ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS30200 <400> 20 aacatcagcc tgtcaagaga at 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS30260 <400> 21 cgatttggac aatgactagt gg 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS30260 <400> 22 aacgccatgg aaacagaaac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS30270b <400> 23 gcagcaaaac ctctcccttt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS30270b <400> 24 ccttcagagg tgcgtttgac 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS30930 <400> 25 tgaaccctcg aaactgaaag a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS30930 <400> 26 ggacgttaac gaaggcaaaa 20 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS31001 <400> 27 gaaacaaatt atttaaaaat cagacca 27 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS31001 <400> 28 tggaacaatc cgtaaaacta tgc 23 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS40270 <400> 29 tcaagcatgt ccttaaaact ctga 24 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS40270 <400> 30 gcgttcacgt ttcccatatc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS40400 <400> 31 tcgaggtggt tacaatccaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS40400 <400> 32 caatgcggat ctacctctca 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KS51115 <400> 33 catcactttt tcaggtggat tt 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS51115 <400> 34 ctttctctct acctggtgat gg 22

Claims (5)

  1. 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 BRMS-27 프라이머 세트;
    서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 BRMS-34 프라이머 세트;
    서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 BRMS-43 프라이머 세트;
    서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 BRMS-50 프라이머 세트;
    서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 BRMS-56 프라이머 세트;
    서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS10440 프라이머 세트;
    서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS10621 프라이머 세트;
    서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS10970 프라이머 세트;
    서열번호 17과 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS20640 프라이머 세트;
    서열번호 19와 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS30200 프라이머 세트;
    서열번호 21과 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS30260 프라이머 세트;
    서열번호 23과 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS30270b 프라이머 세트;
    서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS30930 프라이머 세트;
    서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS31001 프라이머 세트;
    서열번호 29와 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS40270 프라이머 세트;
    서열번호 31과 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS40400 프라이머 세트; 및
    서열번호 33과 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KS51115 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배추 품종 식별용 마커.
  2. 배추로부터 유래된 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 마커를 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 확인한 후, 밴드들을 분석하여 배추의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 배추 품종 식별 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 배추의 잎 또는 줄기로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 각각의 배추 품종에 대해 제1항의 마커에 의한 증폭 산물의 유무를 표로 작성하고 상기 증폭된 산물과의 비교 분석에 의해 배추 품종을 식별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항의 배추 품종 식별용 마커, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 포함하는 배추 품종 식별용 키트.
KR1020080058370A 2008-06-20 2008-06-20 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법 KR101011694B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080058370A KR101011694B1 (ko) 2008-06-20 2008-06-20 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080058370A KR101011694B1 (ko) 2008-06-20 2008-06-20 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090132213A true KR20090132213A (ko) 2009-12-30
KR101011694B1 KR101011694B1 (ko) 2011-02-07

Family

ID=41691307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080058370A KR101011694B1 (ko) 2008-06-20 2008-06-20 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101011694B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101534278B1 (ko) * 2013-07-25 2015-07-06 서울대학교산학협력단 고함량 라이코펜을 축적하고 오렌지색을 나타내는 배추 품종을 구분하기 위한 crtiso1 유전자와 이를 검증하는 마커 및 이의 용도
KR20210156227A (ko) * 2020-06-17 2021-12-24 서울대학교산학협력단 순계 배추 품종의 유전형을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101650986B1 (ko) * 2013-01-24 2016-08-25 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 분자마커
KR101693068B1 (ko) * 2013-02-25 2017-01-05 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0424 및 이를 포함하는 분자마커
KR101636110B1 (ko) * 2013-02-25 2016-07-06 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0420 및 이를 포함하는 분자마커
KR101695051B1 (ko) * 2013-02-27 2017-01-10 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0842 및 이를 포함하는 분자마커
KR101650987B1 (ko) * 2013-02-27 2016-08-24 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0566 및 이를 포함하는 분자마커
KR101695053B1 (ko) * 2013-03-20 2017-01-10 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0264 및 이를 포함하는 분자마커
KR101636111B1 (ko) * 2013-03-20 2016-07-06 가톨릭대학교 산학협력단 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0084 및 이를 포함하는 분자마커

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100645445B1 (ko) * 2004-09-09 2006-11-15 강원대학교산학협력단 식물체의 다형성 검출용 마커의 제조방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101534278B1 (ko) * 2013-07-25 2015-07-06 서울대학교산학협력단 고함량 라이코펜을 축적하고 오렌지색을 나타내는 배추 품종을 구분하기 위한 crtiso1 유전자와 이를 검증하는 마커 및 이의 용도
KR20210156227A (ko) * 2020-06-17 2021-12-24 서울대학교산학협력단 순계 배추 품종의 유전형을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR101011694B1 (ko) 2011-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101011694B1 (ko) 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법
CN109762921B (zh) 用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记及其应用
KR102108750B1 (ko) 사과 과육색 판별용 마커
Bajpai et al. Molecular and morphological diversity in locally grown non-commercial (heirloom) mango varieties of North India
KR101555972B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법
KR101642702B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 배 품종식별 방법
Rasul et al. Response of different tomato accessions to biotic and abiotic stresses
Liu et al. Genetic diversity of coconut cultivars in China by microsatellite (SSR) markers
Efombagn et al. Genetic diversity in cocoa germplasm of southern Cameroon revealed by simple sequences repeat (SSRs) markers
KR101174409B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 오이 품종 식별 방법
Popescu et al. Evaluation of the genetic variability correlated with multileaflet trait in alfalfa
CN108977563B (zh) 基于萝卜全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
KR101783347B1 (ko) 배의 화분 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도
KR101359542B1 (ko) 복숭아 품종 식별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101301863B1 (ko) 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법
KR101531303B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 콩 품종 식별 방법
KR101301867B1 (ko) 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트
KR101125745B1 (ko) 분자 표지를 이용한 보리 품종 식별 방법
Ullah et al. Geneticalysis of economically important apricot cultivars in gilgit baltistan based on SSR molecular markers
Luciano-Rosario et al. Genetic diversity of puerto rican farmer-held papaya (Carica papaya) using SSR markers
Khatun et al. Genetic diversity analysis of soybean [Glycine max (L.) Merrill.] germplasms in Bangladesh using SSR markers
CN114736987B (zh) 苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法
Sharma et al. Characterization of guava (Psidium guajava L.) germplasm through morphological traits and SCoT markers
Hancı A first insight into genetic diversity of Jerusalem artichoke accessions collected from different regions of Turkey assessed by ISSR markers
KR102162805B1 (ko) 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant