KR20090127153A - 세포 및 세포 배양물의 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법 (예를 들어, 연골세포와 섬유모세포와의 구별 방법) 및 각 세포 (예를 들어, 연골세포)의 표현형을 평가하기 위한 방법을 개시한다. 상기 방법은 예를 들어 연골 결함의 치료에 사용되는 연골세포 배양물을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 섬유모세포 마커의 발현 수준을 기준으로 세포 배양 조성물 또는 세포의 동일성의 확인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 배양물 샘플 또는 각 세포에서 하나 이상의 연골세포 마커와 하나 이상의 섬유모세포 마커의 발현 수준의 비교를 포함한다. 예시적 실시양태에서, 연골세포 마커는 히알루로난 및 프로테오글리칸 연결 단백질 1 (HAPLN1)이고, 섬유모세포 마커는 미세원섬유 관련 단백질 5 (MFAP5)이다.
연골세포, 섬유모세포, 프로테오글리칸 연결 단백질 1, 미세원섬유 관련 단백질 5, 연골 결함
Description
본 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 2007년 4월 6일자로 출원된 가출원 제60/910,574호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 세포 배양물의 조성을 측정하는 방법, 보다 특히 연골세포와 섬유모세포를 구별하는 방법에 관한 것이다.
관절 연골에 대한 손상은 불량한 복원 속도를 갖는데, 부분적으로 연골 조직에의 혈액 공급의 결핍 때문이다 (문헌 [Basad et al., In: Hendrich et al., Cartilage Surgery and Future Perspectives, Thieme Verlag, 49-56 (2003)]). 슬관절에 대한 외상은 예를 들어 연골 (chondral) 및 골연골 (osteochondral) 병변을 유발할 수 있으며, 이러한 손상은 골관절염으로 진행될 수 있다 (문헌 [Brittberg et al., New England Journal of Medicine, 331 (14): 889-895 (1994)]). 골관절염의 심한 경우에서, 전 슬관절 치환술이 필요할 수 있다. 그러나, 슬관절 치환술에서 사용되는 인공 보철은 수명이 제한되며, 따라서 슬관절 치환술은 특히 비-중장년층 환자에 대하여 최적 치료법이 아니다 (Brittberg et al., 상기 문헌).
몇몇 경우에서, 관절 연골 손상은 자가 연골세포 이식에 의해 복구할 수 있다 (문헌 [Brittberg et al., Clin. Orthopaed. Rel. Res., 367S: S147-S155 (1999)]). 이러한 절차에서, 연골세포를 환자로부터 수집하고, 세포 배양물에서 확장시켜 연골세포의 수를 증가시키고, 이후 환자의 손상 부위에 다시 이식한다. 손상 부위에 연골세포로 봉하기 위한 골막 조직 편으로 연골세포를 덮는다. 배양된 연골세포가 배양물에서 탈분화되는 경향을 갖지만, 성공적인 이식에서, 탈분화된 연골세포는 그의 재분화 가능성이 유지되며, 이식시 유리질 연골 조직을 생성하는 연골세포로 재분화할 것이다.
매트릭스-유도 자가 연골세포 이식으로 알려진 변형된 기법 (MACI® 이식 절차)에서, 배양된 연골세포를 콜라겐 매트릭스에 로딩하고, 이후 이들을 환자에 이식한다 (Basad et al., 상기 문헌). 추가적으로, 콜라겐 매트릭스를 봉합 대신 피브린 접착제로 고정시켜, 보다 단순한 수술 기법이 되도록 할 수 있다.
다양한 기법 및 배지를 사용하여 연골세포를 배양할 수 있다. 연골세포 배양물을 위한 무혈청 배지의 예, 및 연골세포의 단리 및 증식을 위한 방법은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,150,163호 및 제7,169,610호, 및 미국 가출원 제60/805,307호에 기재되어 있다.
섬유모세포 또는 섬유모세포-유사 세포 (예컨대, 윤활세포)를 연골세포와 동시-단리시킬 수 있으며, 따라서 연골세포 이식물의 제조 과정에서 세포 배양물에서 동시-증식될 수 있다. 연골세포는 이들이 배양물에서 탈분화되는 경우 섬유모세포 외관과 비슷한 것으로 알려져 있다 (문헌 [Benya and Shaffer, Cell, 30: 215-224 (1982)]). 그러나 이들은 그의 분화 가능성을 유지하는데, 즉 이들은 이식시 연골세포 표현형을 재발현할 수 있다. 결과적으로, 이는 외관을 기준으로 배양된 탈분 화된 연골세포를 동시-배양된 섬유모세포 또는 섬유모세포-유사 세포로부터 구별하기 어렵게 할 수 있다.
추가적으로, 배양된 탈분화된 연골세포에서의 유전자 발현 패턴은 천연 연골 연골세포의 그것과 상이하다. 예를 들어, 천연 연골 연골세포에서 높게 발현되는 여러 마커는 배양된 연골세포에서 감소된 수준으로 발현된다 (문헌 [Binette et al., J. Orthopaed. Res., 16:207-216 (1998)]). 따라서, 이러한 연골세포 마커의 발현은 탈분화된 연골세포를 세포 배양물에 존재할 수 있는 다른 유형의 세포와 반드시 구별할 수 있는 것은 아니다. 추가적으로, 많은 알려진 섬유모세포 마커는 비록 상이한 수준이기는 하나 탈분화된 연골세포 및 천연 연골 연골세포 모두에서 발현된다. 따라서, 이러한 섬유모세포 마커의 발현 수준은 샘플에 존재하는 세포가 탈분화된 연골세포인지, 섬유모세포인지 또는 섬유모세포-유사 세포인지 반드시 나타내는 것은 아닐 수 있다.
연골세포, 섬유모세포 및 섬유모세포-유사 세포를 확인하는 방법, 특히 세포 배양물에 적용할 수 있는 방법에 대한 필요가 있다.
<발명의 개요>
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법 (예를 들어, 연골세포를 섬유모세포와 구별하기 위한 방법) 및 각 세포 (예를 들어, 연골세포)의 표현형을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 예를 들어 연골 결함의 치료에 사용되는 연골세포 배양물을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 섬유모세포 마커의 발현 수준을 기준으로 세포 배양물 조성 또는 세포의 동일성을 확인하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 배양물 샘플 또는 각 세포에서 하나 이상의 연골세포 마커 및 하나 이상의 섬유모세포 마커의 발현 수준을 비교하는 것을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 연골세포 마커는 히알루로난 및 프로테오글리칸 연결 단백질 1 (HAPLN1)이고, 섬유모세포 마커는 미세원섬유 관련 단백질 5 (MFAP5)이다.
본 발명은 적어도 일부 특정 비-연골 세포 유형, 예컨대 섬유모세포 및 윤활세포에서 높게 발현되되, 연골세포에서 유의하게 낮은 수준으로 발현되는 세포 표현형 마커로서 MFAP5의 확인을 기초로 한다. 추가적으로, 본 발명은 적어도 일부 MFAP5 및 연골세포 마커, 예컨대 HAPLN1의 발현 수준 비가 연골 생검으로부터 유래된 배양물에서의 세포 표현형의 신뢰성 있는 지시제라는 발견을 기초로 한다. 일부 조건 하에, 세포 배양물의 조성 또는 각 세포의 표현형을 확인하기 위해 마커의 유형 (즉, 섬유모세포 및 연골세포 마커) 둘 모두를 사용하는 것이 바람직할 수 있지만, 본 발명은 또한 MFAP5 마커 단독의 표준화된 발현 수준의 측정이 상기 목적에 충분할 수 있다는 실시양태를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 MFAP5가 아니며, 그의 표준화된 발현 수준은 섬유모세포에서에 비해 연골세포에서 보다 낮게 된다. 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 그의 표준화된 발현 수준이 섬유모세포 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포 (예를 들어, 일차 및/또는 계대배양된 연골세포)에서 보다 낮게 된다. 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 섬유모세포 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포에서 적어도 2배, 5배, 8배, 10배 또는 그 이상 낮게 발현된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 세포 배양물, 예를 들어 연골세포를 시험적으로 함유하는 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법 (방법 1); 및 각 세포의 표현형을 평가하는 방법 (방법 2)을 제공한다. 방법 1의 실시양태에서, 각각의 마커의 발현 수준을 복수개의 세포 (예를 들어, 배양물 샘플)에서의 마커의 평균 발현 수준으로서 측정한다. 방법 1의 실시양태에서, 세포 배양물의 조성을 총체적으로 평가하여 연골세포를 함유하는지를 측정할 수 있다. 방법 2의 실시양태에서, 마커의 발현 수준은 평가되는 각 세포에서의 상기 마커의 발현 수준으로서 측정된다. 따라서, 방법 1은 세포 배양물의 조성을 확인하는 반면, 방법 2는 각 세포의 표현형을 예를 들어 세포가 연골세포인지를 확인한다.
몇몇 실시양태에서, 방법 1은
a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;
b) 세포 배양물로부터의 복수개의 세포에서 본 발명의 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계
를 포함하며, 여기서 미리 측정된 역치 미만의 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 함유한다는 것을 나타낸다. 별법으로, 미리측정된 역치 초과의 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 배양물은 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 그 이상의 연골세포를 포함하지 않음).
몇몇 실시양태에서, 방법 1은 섬유모세포 마커 (MFAP5 또는 또 다른 섬유모 세포 마커) 및 연골세포 마커 (예를 들어, HAPLN1)의 발현 수준을 대조군과, 또는 서로와 비교하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커는 일차 및/또는 계대배양된 연골세포에서의 발현 수준의 비 (섬유모세포 마커에 대한 연골세포 마커의 비)가 배양된 섬유모세포에서의 발현 비와 동일하거나 또는 5, 10, 20, 30, 50, 75, 100배 또는 그 이상 크게 된다.
특히, 몇몇 실시양태에서, 방법 1은
a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;
b) 복수개의 세포에서 연골세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계;
c) 복수개의 세포에서 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계; 및
d) 연골세포 마커의 평균 발현 수준 및 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계
를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 초과인 반면 섬유모세포 마커의 발현수준이 미리 측정된 역치 미만인 경우, 배양물은 연골세포를 함유하는 것으로 확인된다. 별법으로, 미리측정된 역치 초과의 섬유모세포 마커의 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 배양물은 연골세포를 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 그 이상 포함하지 않음).
몇몇 실시양태에서, 배양물 조성을 측정하는 단계는 연골세포 마커의 평균 발현 수준과 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 비교하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 마커의 발현 수준을 서로에 대하여 비교한다 (따라서, 역치는 예를 들어 2개 마커의 발현 수준 간의 주어진 차이 또는 그의 비로서 정의될 수 있음). 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 미리측정된 역치에 비해 큰, 예를 들어 0.25, 0.55, 1, 2, 2.2, 5, 10, 25, 50 또는 그 이상의 섬유모세포 마커 (예를 들어, MFAP5) 발현 수준에 대한 연골세포 마커 (예를 들어, HAPLN1) 발현 수준의 비는 세포 배양물이 연골세포를 함유한다는 것을 나타낸다.
방법 1의 몇몇 실시양태에서, 연골세포 및 섬유모세포 마커의 발현 수준은 예를 들어 정량적 RT-PCR의 표준 곡선 방법, 또는 정량적 RT-PCR의 비교 CT 방법 (이는 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커에 대해 요구되는 역치 사이클 수의 차이를 측정함)에 의해 RNA 수준에서 측정한다.
관련된 측면에서, 본 발명은 예를 들어 유세포 분석법 또는 단일-세포 RT-PCR을 사용하여 각 세포의 표현형을 평가하는 방법 (방법 2)을 제공한다. 상기 방법은 연골 또는 윤활막, 연골세포 배양물, 섬유모세포 배양물, 윤활세포 배양물, 또는 임의의 다른 적합한 배양물로부터 유래된 세포 배양물을 비롯한 세포 배양물로부터 각 세포를 확인하는데 유용하다. 또한, 상기 방법은 임의의 적합한 생물학적 샘플로부터 유래된 각 세포를 확인하는데 유용하며, 여기서 이는 연골 샘플, 윤활막 샘플, 섬유모세포 샘플 등을 비롯한 각 세포를 확인하는데 바람직하다. 방법 2에서의 섬유모세포 및 연골세포 마커는 방법 1에 대해 기재된 것과 같이 선택하고 평가할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법 2는
a) 세포에서 본 발명의 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 섬유모세포 마커의 발현 수준을 기준으로 세포의 표현형을 측정하는 단계
를 포함하며, 여기서 미리 측정된 역치 미만의 발현 수준은 세포가 연골세포임을 나타낸다. 별법으로, 미리측정된 역치 초과의 발현 수준은 세포가 연골세포가 아님 (예를 들어, 섬유모세포 또는 윤활세포임)을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 방법 2는
a) 세포에서 연골세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 세포에서 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 연골세포 마커의 발현 수준 및 섬유모세포 마커의 발현 수준을 기준으로 세포의 표현형을 평가하는 단계
를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 초과인 반면 섬유모세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 미만인 경우, 세포는 연골세포로서 확인된다. 별법으로, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 미만인 반면 섬유모세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 초과인 경우, 세포는 연골세포가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 세포의 표현형을 평가하는 단계 c)는 연골세포 마커의 발현 수준과 섬유모세포 마커와의 발현 수준의 비교를 포함한다.
본 발명의 추가 측면을 하기 발명의 상세한 설명에서 설명할 것이다.
도 1은 연골세포 생검으로부터 배양된 연골세포를 제조하는데 사용되는 예시적 제조 방법에서의 단계를 예시하는 순서도이다.
도 2는 RT-PCR의 표준 곡선 방법에 의해 측정된 것과 같은 여러 세포주에서의 HAPLN1 발현 수준을 도시한다. 발현 수준을 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)에서의 발현 수준을 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다. 사용된 세포주를 표 2에 열거한다.
도 3은 RT-PCR의 표준 곡선 방법에 의해 측정된 것과 같은, 도 2에서 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 MFAP5의 발현 수준을 도시한다. 발현 수준을 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)에서의 발현 수준을 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다.
도 4는 도 2 및 도 3으로부터의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 일차 연골세포 (PC)에서의 비를 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다.
도 5는 도 2에서 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 발현 수준을 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 측정하였으며, 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 6은 여러 추가의 연골세포주 및 윤활세포주에서의 HAPLN1 발현 수준을 도시한다. 발현 수준을 RT-PCR의 표준 곡선 방법에 의해 측정하고, 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)에서의 발현 수준을 1로 조정하였으며, 다른 비를 그에 따라 조정하였다. 사용된 세포주를 표 3에 열거한다.
도 7은 도 6에서 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 MFAP5 발현 수준을 도시한다. 발현 수준을 RT-PCR의 표준 곡선 방법에 의해 측정하고, 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)에서의 발현 수준을 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다.
도 8은 도 6 및 도 7로부터의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 일차 연골세포 (PC)에서의 비를 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다.
도 9는 도 6에서 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 상기 발현 수준을 측정하였으며, 상기 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 10A는 도 2 및 도 6에서 나타낸 것과 동일한 세포주, 및 또한 표 4에서 확인된 추가의 연골세포주, 윤활세포주 및 피부 섬유모세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 실시예 3에서 기재된 것과 같은 맞춤형 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 발현 수준을 측정하였다. HAPLN1:MFAP5 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다. 도 10B는 표 5에서 확인된 추가 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 도 10A에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 발현 수준을 측정하였다.
도 11은 단층 및 콜라겐-스캐폴드 배양물에서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비 사이의 비교를 나타낸다. 사용된 세포주를 표 7에서 열거한다. RT- PCR의 표준 곡선 방법에 의해 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준을 측정하였다. 발현 수준을 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)의 단층 배양물에서의 비를 1로 조정하고, 다른 비를 그에 따라 조정하였다.
도 12는 도 11에서 나타낸 것과 동일한 세포주를 사용하여 단층 및 콜라겐-스캐폴드 배양물에서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비 사이의 비교를 나타낸다. HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준을 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 측정하였으며, 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 13은 배양물 수준의 함수로서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비에서의 변화를 도시한다. 도면에서 나타낸 것과 같이, 3개 윤활세포주를 일차 배양물 (배양물 수준 1)로부터 제4 계대 (배양물 수준 5)까지 배양하였다. RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준을 측정하였으며, 상기 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 14A 및 도 14B는 배양물 수준의 함수로서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비에서의 변화를 도시한다. 도 14A 및 도 14B에서, 연골세포주를 연골 (배양물 수준 0)로부터 샘플링하고, 이후 도면에서 나타낸 것과 같이 일차 (배양물 수준 1)부터 제2 계대 (배양물 수준 3)까지 배양하였다. 발현 수준을 실시예 5에서 기재된 것과 같은 맞춤형 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 측정하였다. HAPLN1:MFAP5 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 15는 연골세포 및 윤활세포의 혼합된 집단의 배양물에서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 비를 도시한다. 각각 다양한 비율의 2개 세포 형태로서 3회 시험을 수행하였다. 실시예 6에 기재된 것과 같은 맞춤형 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 발현 수준을 측정하였다. HAPLN1:MFAP5 비를 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
도 16은 절대 정량 방법에 의해 측정된 것과 같은 절대 카피수를 사용하여 표 12에 열거되어 있는 여러 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 몰 비를 도시한다. PCR 반응물 13 μL 당 cDNA 2 μl를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3에 기재된 것과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 103, 104 및 105 카피/반응물에서 수행하는 합성 HAPLN1 및 MFAP5 RNA 전사 표준물로부터 표준 곡선을 제조하였다. 각 시험 샘플에 존재하는 HAPLN1 및 MFAP5 mRNA 카피의 양을 이들 표준 곡선으로부터 측정하였다.
본 발명은 적어도 부분적으로는, 섬유모세포 및 윤활세포와 같은 특정 비-연골세포 세포 유형에서는 높게 발현되는 반면 연골세포에서는 유의하게 낮은 수준으로 발현되는 유전자로서의 MFAP5의 확인을 기초로 한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 세포 표현형 마커로서 MFAP5를 사용하는 방법을 제공한다. MFAP5는 피브릴린에 결합하는 세린-트레오닌-풍부 단백질이며, I형 프로콜라겐의 안정화와 관련된다고 보고되었다 (문헌 [Lemaire et al., Arthritis & Rheumatism, 52(6): 1812-1823 (2005)]). 인간 MFAP5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 진뱅크® 기탁 번호 NM_003480으로 찾을 수 있고, 그의 뉴클레오티드 서열은 또한 서열 1로 제공된다. MFAP5 이외에 또는 그를 대신해서, 다른 섬유모세포 마커도 하기 기재하는 바와 같이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 연골세포를 포함하는 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법 (방법 1) 및 각 세포의 표현형을 평가하는 방법 (방법 2)을 제공한다.
방법 1에 관한 실시양태에서, 각각의 마커의 발현 수준은 복수개의 세포에서의 상기 마커의 평균 발현 수준으로 결정된다. 방법 1의 실시양태에서, 세포 배양물의 조성을 총체적으로 평가하여 연골세포를 함유하는지를 측정할 수 있다. 방법 2의 실시양태에서, 마커의 발현 수준은 평가되는 각 세포에서의 상기 마커의 발현 수준으로서 측정된다. 따라서, 방법 1은 세포 배양물의 조성을 확인하는 반면, 방법 2는 개별 세포의 표현형, 예를 들어 세포가 연골세포인지를 확인한다.
몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 MFAP5가 아니며, 그의 표준화된 발현 수준은 섬유모세포에서에 비해 연골세포에서 보다 낮게 된다. 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 그의 표준화된 발현 수준이 섬유모세포 (예를 들어, 피부 섬유모세포) 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포 (예를 들어, 일차 연골세포, 배양된 탈분화된 연골세포)에서 보다 낮게 된다. 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 섬유모세포 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포에서 적어도 2배, 5배, 8배, 10배 또는 그 이상 낮게 발현된다. 이러한 추가의 마커는 예를 들면, 예컨대 문헌 [Leung et al., Trends in Genetics, 19(11): 649-659 (2003)]에 기재된 바와 같은 유전자 배열 분석(gene array analysis)을 사용하여 확인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법 1은 세포 배양물로부터의 복수개의 세포에서 본 발명의 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 미리측정된 역치 미만의 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 함유함을 나타낸다. 별법으로, 미리측정된 역치 초과의 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 함유하지 않음을 나타낸다 (예를 들어, 배양물은 연골세포를 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 그 이상 포함하지 않음).
예시적인 실시양태에서, 섬유모세포 마커는 MFAP5이며, 세포 배양물에 의한 역치보다 높은 MFAP5 발현은 상기 배양물이 상당한 수의 비-연골세포를 함유함을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 미리측정된 역치 수준은 1) 순수한 섬유모세포 배양물에서의 MFAP5 발현의 수준과 동일하거나 보다 낮거나 (예를 들어, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 낮음), 또는 2) 순수한 연골세포 배양물 (예를 들어, 연골 생검으로부터 얻은 일차 연골세포)에서의 MFAP5 발현의 수준과 동일하거나 보다 높다 (예를 들어, 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 높음). MFAP5 이외의 섬유모세포 마커의 경우, 미리측정된 역치는 순수한 섬유모세포 및/또는 연골세포에서의 각각의 마커의 발현 수준을 기준으로 유사하게 선택될 수 있다. "미리측정된" 수준은 마커 발현 수준을 측정하기 전에 선택될 필요는 없으며, 발현 수준이 측정된 후, 예를 들어 발현 결과의 통계학적 분석을 기초로 선택될 수 있다.
평가 대상 배양물로부터의 복수개의 세포는 상기 배양물로부터 얻은 샘플 또는 분취물에 의해 대표될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 매트릭스에서 성장된 배양물의 경우, 실시예에 기재한 바와 같이 펀치 샘플링을 사용할 수 있다. 복수개의 세포는, 전형적으로는 적어도 주어진 발현 분석 방법을 수행하기에 충분한 수 또는 그 이상의 세포를 함유할 것이다. 예를 들어, PCR의 경우, 10 내지 1,000개 만큼의 세포가 통상적으로 충분하나, 더 적은 수를 사용할 수도 있다.
몇몇 실시양태에서, 방법 1 및 방법 2는 섬유모세포 마커 (MFAP5 또는 다른 섬유모세포 마커) 및 연골세포 마커 (예를 들어, HAPLN1 또는 다른 연골세포 마커)의 발현 수준을 대조군과 또는 서로와 비교하는 것을 포함한다. 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 순서는 달라질 수 있다. 예를 들어, 연골세포 마커의 발현 수준을 먼저 측정한 후, 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정할 수 있고, 또는 그의 반대도 가능하다. 몇몇 실시양태에서, 두 유형의 마커의 발현 수준을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용한 몇몇 연골세포 마커의 예는 이들의 진뱅크™ 기탁 번호 및 서열 번호를 비롯하여 표 1에 제시된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 상기 연골세포 마커는 HAPLN1, MGP, EDIL3, WISP3, AGC1, COMP, COL2A1, COL9A1, COL11A1, LECT1, S100B, CRTAC1, SOX9 및 NEBL로부터 선택된다.
추가의 연골세포 마커는 예를 들면, 예컨대 문헌 [Leung et al., Trends in Genetics, 19(11): 649-659 (2003)]에 기재된 바와 같은 유전자 배열 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 일반적으로, 연골세포 마커는, 그의 표준화된 발현 수준이 섬유모세포 (예를 들어, 피부 섬유모세포) 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포 (예를 들어, 일차 연골세포, 배양된 탈분화된 연골세포)에서 보다 높은 유전자 또는 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 연골세포 마커는 섬유모세포 및/또는 윤활세포에서에 비해 연골세포에서 적어도 2배, 4배, 5배, 8배, 10배, 50배, 75배, 100배 또는 그보다 높게 발현된다.
몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커는 일차 연골세포 및/또는 계대배양된 연골세포에서의 상기 마커들의 발현 수준의 비가 피부 섬유모세포 및/또는 윤활세포에서의 비와 동일하거나 또는 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 75배, 100배 또는 그 이상 크도록 선택된다.
특히, 몇몇 실시양태에서, 방법 1은
a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;
b) 복수개의 세포에서 연골세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계;
c) 복수개의 세포에서 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계; 및
d) 연골세포 마커의 평균 발현 수준 및 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계
를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 초과인 반면 섬유모세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 미만인 경우, 배양물은 연골세포를 함유하는 것으로 확인된다. 별법으로, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 미만인 반면 섬유모세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 초과인 경우, 배양물은 연골세포를 함유하지 않는다 (예를 들어, 배양물은 연골세포를 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 그 이상 포함하지 않음).
방법 1의 추가의 실시양태에서, 본 발명은
a) 포유동물로부터 연골 생검을 얻는 단계;
b) 상기 생검으로부터 세포를 단리하는 단계;
c) 단계 b)에서 단리된 세포를 세포 배양물에서 배양하는 단계;
d) 세포 배양물의 샘플을 얻는 단계;
e) 샘플로부터의 하나 이상의 세포에서 MFAP5 및 HAPLN1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
f) MFAP5 및 HAPLN1의 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계
를 포함하는, 세포 배양물 조성을 평가하는 방법을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 배양물 조성을 측정하는 단계는 연골세포 마커의 평균 발현 수준 및 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 비교하는 것을 포함한다. 상기 몇몇 실시양태에서, 세포 배양물은 MFAP5 발현에 대한 HAPLN1 발현의 비가 0.25 초과일 때 연골세포을 함유한다고 평가된다. 특정 실시양태에서, 상기 비는 세포 배양물이 연골세포를 50％ 이상 함유하는 것을 나타낸다.
몇몇 실시양태에서, 마커의 발현 수준을 서로에 대해 비교한다 (따라서, 역치는 예를 들어 두 마커의 발현 수준 사이의 주어진 차이 또는 그의 비로서 정의될 수 있음). 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 섬유모세포 마커 (예를 들어, MFAP5)의 발현 수준에 대한 연골세포 마커 (예를 들어, HAPLN1) 발현 수준의 비가 미리측정된 역치 (예를 들어, 0.25, 0.55, 1, 2, 2.2, 5, 10, 25, 50 또는 그 이상)보다 크다는 것은 세포 배양물이 연골세포를 함유한다는 것을 나타낸다.
방법 1의 몇몇 실시양태에서, 연골세포 및 섬유모세포 마커의 발현 수준은 예를 들어 정량적 RT-PCR의 표준 곡선 방법 또는 정량적 RT-PCR의 비교 CT 방법 (이 방법은 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커에 대해 요구되는 역치 사이클 수의 차이를 측정함)에 의해 RNA 수준에서 측정된다.
관련 측면에서, 본 발명은 예를 들어 유세포 분석법을 이용하여, 각 세포의 표현형을 평가하는 방법 (방법 2)을 제공한다. 상기 방법은 연골 또는 윤활막으로부터 유도된 세포 배양물, 연골세포 배양물, 섬유모세포 배양물, 윤활세포 배양물 또는 임의의 다른 적절한 배양물을 비롯한 세포 배양물로부터 개별 세포를 확인하기에 유용하다. 상기 방법은 연골 샘플, 윤활막 샘플, 섬유모세포 샘플 등을 비롯한 개별 세포를 확인하기 위해 바람직한 임의의 적절한 임의의 생물학적 샘플로부터 유도된 개별 세포를 확인하기에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 방법 2는 세포에서 본 발명의 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 미리측정된 역치 미만의 발현 수준은 상기 세포가 연골세포임을 나타낸다. 별법으로, 미리측정된 역치 초과의 발현 수준은 상기 세포가 연골세포가 아님 (예를 들면, 상기 세포는 섬유모세포 또는 윤활세포임)을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 방법 2는
a) 세포에서 연골세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 세포에서 섬유모세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 연골세포 마커의 발현 수준 및 섬유모세포 마커의 발현 수준을 기준으로 세포의 표현형을 평가하는 단계
를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는, 연골세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 초과인 반면 섬유모세포 마커의 발현 수준이 미리측정된 역치 수준 미만인 경우, 연골세포라고 확인된다. 방법 2의 실시양태에서, 섬유모세포 및 연골세포 마커는 상기 방법 1에 대해 기재된 바와 같이 선택되고 평가될 수 있다.
유세포 분석법은 시판용 항체를 사용하여 수행할 수 있거나, 또는 상기 항체는 예를 들어 문헌 [Linsenmeyer et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 92(2): 440-6 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 평가되는 세포 및 배양물은 연골세포를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 임의의 조직, 세포 배양물 또는 다른 물질을 비롯한 임의의 생물학적 샘플로부터 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 평가되는 세포 또는 배양물은 포유동물, 특히 인간 기원이다. 몇몇 실시양태에서, 세포 배양물은 연골 생검으로부터 방출된 세포로부터 성장한다. 예를 들어, 자가 연골세포 이식에서, 그 절차를 위한 연골세포는 통상 이식물을 받는 환자의 연골 생검으로부터 배양된다. 카티셀(Carticel)® 자가 연골세포 생성물 (겐자임 코포레이션(Genzyme Corporation), 메사추세츠주 캠브리지 소재)이 배양된 연골세포 생성물의 예이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 세포 배양물은 연골세포로 로딩된 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 이러한 연골세포는 연골 생검으로부터 얻을 수 있고, 배양된 후 예를 들어 MACI® 이식 생성물에서 사용된 것과 같은 매트릭스 상에 로딩될 수 있다. 본 발명의 방법은 매트릭스를 이식하기 전에 콜라겐 지지체 상에 로딩된 세포를 확인하고/하거나 그 확인을 증명하는데 유용하다.
세포 배양물 측정 방법의 유용성의 예를 예시하기 위해, 도 1을 참조한다. 이 도면은 예컨대 카티셀® 자가 연골세포를 사용하여 자가 연골세포 이식용 배양된 연골세포 생성물을 제조하는 것과 관련된 단계 또는 MACI® 이식 절차용 배양된 연골세포 생성물을 제조하는 단계를 예시한다. 단계 1에서의 자가 연골세포를 이식받은 환자로부터의 연골 생검을 처리를 위해 수송한다 (단계 2). 생검 물질을 단계 3에서 분해시켜 연골로부터 연골세포를 방출시키고 수집한다. 방출된 세포를 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고, 단계 4에서 일차 배양물로 증식시키고 필요하다면 계대배양한다. 세포가 적절한 수에 도달하면, 세포를 임의로는 환자가 이식받을 준비가 될 때까지 단계 5에서 냉동보존할 수 있다. 환자가 세포를 이식받을 준비가 되면, 세포를 해동시키고 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고 성장시켜 조립 배양물을 제조한다 (단계 6).
자가 연골세포 이식에 사용하기 위해, 충분한 수의 세포가 조립 배양물에서 수득된다면, 세포를 세포 펠렛으로 원심분리하고 수송 매질 중에 재현탁시키는데, 이것이 카티셀® 자가 연골세포 생성물과 같은 "최종 생성물"이다 (단계 8). 이러한 "최종 생성물"은 예를 들어 멸균성 시험, 세포 생존성 시험, 내독소 시험, 마이코플라스마 시험 및 배양물 조성 시험을 비롯한 다수의 QC 시험을 거쳐 (본원에 기재된 바와 같은 단계 9 "QC 확인"), 배양된 세포가 충분한 수의 연골세포를 함유한다는 것을 보증한다. 배양된 세포가 모든 QC 시험을 통과한다면, 이식 (단계 11)을 위해 환자에게 수송한다 (단계 10).
별법으로, 단계 6으로부터의 조립 배양물을 MACI® 이식물에 사용하는 경우, 세포를 배지 중에 재현탁시키고, 콜라겐 스캐폴드 상에 시딩하고, 4일 동안 배양한다 (단계 7). 배양 기간 말기에, 세포를 수송 매질로 헹구어 MACI® 이식물을 위한 최종 생성물을 생성한다. 이 생성물도 상기 약술한 QC 시험을 거친다. 따라서, 최종 생성물이 카티셀® 자가 연골세포와 같은 배양된 연골세포의 현탁액인지 또는 최종 생성물이 MACI® 이식물을 위한 스캐폴드-시딩된 생성물인지 간에, 본 발명의 방법은 배양물의 수송 전에 연골세포를 함유하는 세포 배양물의 조성을 확인하기 위한 다수의 확인 분석 또는 로트 출하 분석에 유용하다. 예를 들어, "QC 확인" (단계 9)은 최종 생성물 조립 전 임의의 단계, 예를 들어 단계 4, 5, 6, 7 또는 8 전에 수행할 수 있다.
유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 다수의 방법이 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (eds.) Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. (eds.) New York: John Wiley and Sons, 1998)]에 기재된 바와 같이 당업자에게 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 중합효소 연쇄 반응 (PCR에 의한 절대적 정량화, 실시간 PCR (RT-PCR) 및 qRT-PCR, 다중 또는 단일 PCR 포함), 단일 세포 PCR, 노던 블롯(northern blot) 분석, 뉴클레아제 보호 분석, 계내 혼성화 분석, 면역조직화학 분석, 면역세포화학 분석, 겔 또는 모세관과 같은 전기영동 분석, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석, ELISA, 면역침전 분석, HPLC 또는 겔 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기재 분석, 질량 분광법 분석, RNase 보호 분석, 유세포 분석법, DNA 메틸화 분석 및 히스톤 변형 분석을 포함한다.
본 발명의 모든 방법에서, RNA 또는 단백질 수준에서의 발현 수준은 통상적인 방법 중 임의의 방법을 비롯한 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. RNA 수준은 예를 들어 정량적 RT-PCR (예를 들어, 태크만(TaqMan)™ RT-PCR 또는 RT-PCR), 노던 블롯팅 또는 RNA 수준을 측정하기 위한 임의의 다른 방법, 또는 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의해 측정할 수 있다. 단백질 수준은 예를 들어 웨스턴 블롯팅, ELISA, 유세포 분석법, 효소 활성 분석 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 임의의 다른 방법을 사용함으로써 측정할 수 있다. 발현 수준은 전형적으로 베타-액틴 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 또는 18S 리보솜 RNA 등과 같은 항존(housekeeping) 유전자일 수 있는 대조군 및/또는 샘플에서 RNA 또는 단백질의 총량에 대해 조정 및/또는 표준화할 수 있다. 표준화는 전형적으로 단백질, DNA 또는 RNA 유입량의 변화를 설명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 실시예에서, 발현 수준은 표준 곡선을 사용하여 18S 리보솜 RNA로 표준화한다.
예시적 실시양태에서, 섬유모세포 및 연골세포 마커의 발현 수준은 RT-PCR을 사용하여 표준 곡선에 의해 또는 상대적 정량화를 위한 비교 CT 방법에 의해 측정한다. 몇몇 실시양태에서, 마커 카피수의 절대적 정량화는 알려진 양의 마커를 사용하여 표준 곡선을 제조함으로써 측정할 수 있다. 이러한 분석을 수행하기 위한 일반적 방법은 예를 들어 문헌 [Real-Time PCR Systems: Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 7300/7500 Real-Time PCR Systems, Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005, Part No. 4348358 Rev. E]에 기재되어 있다.
비교 CT 방법을 사용하여 2개의 마커를 비교하는 경우, 섬유모세포 마커의 발현 수준 대 연골세포 마커의 발현 수준의 비의 양은 (1+E)^(CT,f - CT,c)로서 계산할 수 있으며, 여기서 CT,f는 섬유모세포 마커 역치 사이클의 수이고, CT,c는 연골세포 마커의 역치 사이클의 수이며, 증폭 효율 (E)은 두 마커에 대해 동일하고 두 마커의 출발 양은 (예를 들어, 2개의 중복 샘플에서와 같이) 내인성 대조군과 동일한 양으로 표준화된다고 가정한다. 실시예에서 예시된 바와 같이 E가 약 1인 경우, 비는 2^(CT,f - CT,c)로서 어림잡을 수 있다. 별법으로, 문헌 [Appendix A of Real-Time PCR Systems: Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 7300/7500 Real-Time PCR Systems, Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005, Part No. 4348358 Rev. E]에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태를 하기 실시예에 기재하며, 이는 예시적인 것으로 본 발명의 범위를 제한하고자 함은 아니다.
실시예 1: 연골세포, 윤활세포 및 섬유모세포에서 HAPLN1 및 MFAP5의 발현
세포 단리 및 배양 - 인간 연골세포 배양물을 카티셀® 자가 연골세포의 제조 방법 또는 배양된 연골세포의 제조를 위한 프로테아제 방법을 사용하여 연골로부터 단리하였다. 카티셀® 자가 연골세포의 제조 방법을 사용하여, 연골 조직을 뼈 및 윤활막에서 제거하고 제1 분해에 제공하여 조직을 37℃에서 18시간 동안 콜라게나제 용액 중에서 효소 처리하였다. 제1 분해로부터 방출된 세포를 소 태아 혈청 (FBS) 및 겐타마이신 함유 배지 (EGHXX)를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 제2 분해에 제공하여 제1 분해로부터 남은 조직을 37℃에서 2.5시간 동안 콜라게나제/트립신 용액으로 처리하였다. 제2 분해로부터 방출된 세포를 EGHXX를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 제2 분해 후 남은 조직편을 EGHXX를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 프로테아제 단리 방법을 사용하여, 연골 조직을 뼈 및 윤활막에서 제거하고, 37℃에서 1.5시간 동안 프로나제 E(Pronase E) (시그마-알드리치 인크.(Sigma-Aldrich Inc.), 미주리주 세인트 루이스 소재) 용액 중의 제1 분해에 제공하였다. 이어서, 프로나제 용액을 제거하고, 연골의 제2 분해를 37℃에서 18시간 동안 콜라게나제 용액 중에서 수행하였다. 이어서, 방출된 세포를 EGHXX를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 단리 후, 세포 배양 방법은 어느 단리 방법으로부터 수득한 세포이든지 동일하였다. 일차 세포 배양물에 2 내지 4일 마다 새로운 EGHXX를 재공급하였다. 일차 배양 플라스크가 50％ 내지 80％ 전면생장에 도달했을 때, 단일 세포 현탁액으로 트립신화하고, EGHXX에 의해 중화시켜 트립신을 불활성화고, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 생성된 세포 현탁액을 샘플링하거나, 계대배양에 의해 더 증식시키거나, 장기간 저장을 위해 냉동보존하였다. 일차 배양물의 계대배양은 이차 배양 또는 제1 계대라고 지칭된다. 후속 계대배양은 제2 계대, 제3 계대, 제4 계대 등으로 지칭된다. EGHXX를 함유하는 조직 배양 플라스크에 세포를 플레이팅하고, 2 내지 4일 마다 새로운 EGHXX를 재공급하여 계대배양을 수행하였다. 계대배양물이 80％ 내지 100％ 전면생장에 도달하였을 때, 단일 세포 현탁액 으로 트립신화하고, EGHXX에 의해 중화시켜 트립신을 불활성화하고, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 생성된 세포 현탁액을 샘플링하거나, 더 증식시키거나, 장기간 저장을 위해 냉동보존하였다.
인간 윤활세포 배양물 (또한 윤활막 섬유모세포로서 알려진 윤활막 유래 세포 배양물) S1 및 S2를 셀 어플리케이션즈 인크.(Cell Applications Inc.) (캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 냉동보존된 일차 배양 세포로서 입수하였다. 윤활세포를 EGHXX 배지를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고, 상기 기재된 바와 같은 카티셀® 자가 연골세포의 제조 방법을 사용하여 배양하였다. 인간 피부 섬유모세포 배양물을 냉동보존된 일차 배양 세포로서 셀 어플리케이션즈 인크.로부터 구입하였다. 피부 섬유모세포를 상기 기재된 바와 같은 카티셀® 자가 연골세포의 제조 방법을 사용하여 배양하였다.
본 실시예에 사용된 세포 배양물을 하기 표 2에 나열한다.
RNA 및 cDNA 제조 - RNA를 TRI-스핀 절차를 사용하여 세포 배양물로부터 단리하였다 (문헌 [Reno et al., Biotechniques 22: 1082-6 (1997)] 참조). 단리된 RNA 농축물을 분광광도계로 측정하였다. 샘플 PC, C1, C2, S1, S2, F1 및 F2로부터 cDNA를 제조하기 위해, 무작위 6량체 프라이머를 사용하는 제1 가닥 합성 키트(First Strand Synthesis Kit) (로슈(Roche), 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 제조자 설명서에 따라 실행하였다. 생성된 cDNA를 분석할 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다.
유전자 발현 분석 - 정량적 실시간 RT-PCR을 사용하여 표준 곡선 방법 또는 비교 CT 방법에 의해 유전자 발현 분석을 수행하였다. 실시간 PCR 방법은 이중 표지된 올리고 프로브의 5' 뉴클레아제 절단을 기초로 하여 표적 서열의 서열 특이적 프라이머 증폭을 보고하였다 ("태크만™" 분석). 연골 연결 단백질 (HAPLN1) 및 미세원섬유 관련 단백질 5 (MFAP5)를 코딩하는 유전자의 발현을 각각 태크만™ 유전자 발현 분석 Hs00157103_m1 및 Hs00185803_m1 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.(Applied Biosystems Inc.))을 사용하여 분석하였다. UNG 부재의 태크만™ 유니버설 PCR 마스터 믹스(TaqMan™ Universal PCR Master Mix) (카탈로그 번호 4324018, 어플라이드 바이오시스템즈 인크.)를 이용하여 실시간 PCR을 제조하고, 적절한 태크만™ 유전자 발현 분석 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 샘플 cDNA를 유니버설 PCR 믹스 프로토콜에 따라 사용하였다. 표준 태크만™ 사이클링 및 이러한 구성을 위한 데이타 수집 프로그램을 사용하여 ABI 7500 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.) 상에서 증폭을 실행하였다. 웰마다 5 ng 이하의 유입 cDNA를 이용하여 이중 25 μL 반응을 실행하였다. 모든 분석에 대해 0.1 단위의 역치를 사용하였다.
표준 곡선 방법 - 18S rRNA를 내부 대조군으로서 사용하여 RT-PCR 결과를 표준화함으로써 유입 변화를 설명하는 진핵생물 18S rRNA 내인성 대조군 분석 (카탈로그 번호 4319413E, 어플라이드 바이오시스템즈 인크.)을 사용하여 표준 곡선 방법을 수행하였다. 각 유전자의 상대적 발현 수준의 정량을 위해, 일차 연골세포 (PC) cDNA의 희석을 실행하여 7500 시스템 소프트웨어에 의해 표준 곡선을 생성하였다. 표준 곡선으로부터 각 시험 샘플의 발현 수준을 측정하고, 일차 연골세포 대조군 (PC)에 대한 생성된 mRNA 비를 PC에 대한 샘플 18S rRNA 비로 나누어 cDNA 로딩에 대해 표준화하였다.
비교 C T 방법 - 다양한 샘플에서 MFAP5에 대한 HAPLN1의 상대적인 유전자 발현 비를 판단하기 위하여 상기한 바와 같이 산출된 실시간 정량적 RT-PCR 유전자 발현 분석 원 데이터로부터 비교 CT 분석을 수행하였다. 비교 CT 방법은 MFAP5에 대한 HAPLN1의 비의 상대적인 측정치를 제공하여, 표준물, 표준 곡선 분석, 또는 실제 캘리브레이터(calibrator)의 필요없이 시험 샘플들 간의 직접 비교를 가능하게 하였다. 이 방법은 아래와 같은 네 가지 조건을 만족시켰기 때문에 본 실시예에서 사용하는 HAPLN1 및 MFAP5 분석 케이스에 채용할 수 있었다: 1) 유니버설 PCR 믹스 프로토콜에 따라 성능이 시종 일관되었고; 2) HAPLN1, MFAP5 및 내인성 대조군 분석에서 등량의 RNA가 전개되었고; 3) 각 분석에서 등량의 RNA를 전개시켰을 때 내인성 대조군 유전자, 18S rRNA의 CT 값이 항상 HAPLN1 CT 또는 MFAP5 CT 보다 낮아, HAPLN1 또는 MFAP5의 계량이 가능할 경우에 18S CT도 항상 계량이 가능하였고; 4) 위에 열거한 다른 세 가지 조건들이 만족될 경우 상기 방법은 HAPLN1 CT 값이 MFAP5 CT 값과 동일하게 산출되는 HAPLN1 / MFAP5 비를 갖는 이론상의 샘플로 정의된 임의로 선택한 이론상의 캘리브레이터를 사용하였다. 이러한 비교 CT 방법에 사용되는 방정식은 다음과 같이 유도한다. 샘플 중의 표적 유전자의 양, 내인성 대조군 유전자에 대해 표준화된 표적 유전자의 양, 및 캘리브레이터에 대한 상대적인 표적 유전자의 양을 다음과 같이 나타낼 경우:
(1+E)＾(-ΔΔCT,표적 유전자)
여기서, E = 증폭 효율이고,
ΔΔCT,표적 유전자 = 샘플 ΔCT,표적 유전자 - 캘리브레이터 ΔCT,표적 유전자이고,
ΔCT,표적 유전자 = CT,표적 유전자 - CT,내인성 대조군 유전자이다.
(문헌 [Liu, W. and Saint, D.A., Analytical Biochemistry, 302: 52-59 (2002)]; [Livak, K.J, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, User Bulletin 2, ABI publication 4303859, 1997] 참조). 이어서, MFAP5에 대한 HAPLN1의 비는 다음과 같이 기술할 수 있고:
(1+E)＾(-ΔΔCT,HAPLN1) / (1+E)＾(-ΔΔCT,MFAP5)
이것은
(1+E)＾(-{[샘플 CT,HAPLN1 - 샘플 CT,내인성 대조군 유전자] - [캘리브레이터 CT,HAPLN1 - 캘리브레이터 CT,내인성 대조군 유전자]}) / (1+E)＾(-{[샘플 CT,MFAP5 - 샘플 CT,내인성 대조군 유전자] - [캘리브레이터 CT,MFAP5 - 캘리브레이터 CT,내인성 대조군 유전자]})
와 같다.
각 분석에서 동일한 양의 샘플을 전개시킬 경우, 샘플 내인성 대조군 유전자의 CT는 용어 x로 표시할 수 있다. 각 분석에서 동일한 양의 캘리브레이터를 전개시킬 경우, 캘리브레이터 내인성 대조군 유전자의 CT는 용어 y로 표시할 수 있다. 이 용어들로 대체할 경우, 다음과 같은 방정식이 유도되고:
(1+E)＾(-{[샘플 CT,HAPLN1 - x] - [캘리브레이터 CT,HAPLN1 - y]}) / (1+E)＾(-{[샘플 CT,MFAP5 - x] - [캘리브레이터 CT,MFAP5 - y]})
이것은
(1+E)＾([x - 샘플 CT,HAPLN1] - [y - 캘리브레이터 CT,HAPLN1]) / (1+E)＾([x - 샘플 CT,MFAP5] - [y - 캘리브레이터 CT,MFAP5])
와 같다.
각 분석에서 등량의 캘리브레이터를 전개시킬 경우 캘리브레이터가 CT,MFAP5 값과 동일한 CT,HAPLN1 값을 산출하는 HAPLN1 / MFAP5 비를 갖는 이론상의 샘플로 정의되면, 캘리브레이터 CT,HAPLN1 및 캘리브레이터 CT,MFAP5는 용어 z로 대체할 수 있다. 따라서, 방정식은 아래와 같이 유도되고:
(1+E)＾([x - 샘플 CT,HAPLN1] - [y - z]) / (1+E)＾([x - 샘플 CT,MFAP5] - [y - z])
이것은
(1+E)＾([x - 샘플 CT,HAPLN1] - [y - z] - [x - 샘플 CT,MFAP5] + [y - z])
와 같고, 이것은
(1+E)＾([x - 샘플 CT,HAPLN1] - [x - 샘플 CT,MFAP5])
와 같고, 이것은
(1+E)＾(샘플 CT,MFAP5 - 샘플 CT,HAPLN1)
와 같다.
그리고, 만약 E = 1 (100％ 효율)일 경우, MFAP5에 대한 HAPLN1의 상대적인 비는 다음과 같다:
2＾(샘플 CT,MFAP5 - 샘플 CT,HAPLN1)
상기 방정식은 미지수로서 샘플 HAPLN1 CT 및 샘플 MFAP5 CT의 두 개의 변수 만을 남기고 최종 공식으로 유도된다. 이 공식은 샘플들을 상기한 조건 하에서 분석하며, 이용된 이론상의 캘리브레이터를 상기한 바와 같이 설정한 경우에 적용한다.
도 2는 RT-PCR의 표준 곡선 방법으로 측정한 여러 세포주에서의 HAPLN1 발현 수준을 도시한다. 도 3은 도 2에 나타낸 것과 동일한 세포 샘플에서의 RT-PCR의 표준 곡선 방법으로 측정한 MFAP5의 발현 수준을 도시한다. HAPLN1은 윤활세포 및 섬유모세포 배양물에서보다 연골세포 배양물에서 더 높은 수준으로 발현되었다. MFAP5는 연골세포 배양물에서보다 윤활세포 및 섬유모세포 배양물에서 더 높은 수준으로 발현되었다.
도 4는 도 2 및 3으로부터의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 비를 도시한다. 일차 연골세포 (PC)에서의 비를 1로 조정하고; 이에 따라 다른 비들을 조정하였다.
도 5는 도 2에 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 비를 도시하되, 이 발현 수준은 RT-PCR 비교 CT 방법으로 측정하였다. CT 방법의 결과는 표준 곡선 방법으로 얻은 결과와 유사하였다.
실시예 2: 추가의 연골세포주, 윤활세포주 및 섬유모세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현
연골세포 배양물과 윤활세포 배양물을 구별하기 위한 방법의 적합성을 확인하기 위하여 추가적인 세포 배양물에서 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 사용한 배양물을 표 3에 열거하였다.
세포 단리 및 배양 - 인간 연골세포 세포 배양물 C3, C4, C5, C6 및 C7을 단리하고 실시예 1에 기재한 바와 같이 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법을 사용하여 배양하였다. 인간 윤활세포 배양물 (윤활막 유래 세포 배양물, 윤활막 섬유모세포라고도 함)을 젠자임에서 단리하거나 셀 어플리케이션즈 인크.(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 구입하였다. 다양한 절차를 이용하여 세포주 S4, S6 및 S7을 젠자임에서 단리하였다. S4는 잘게 절단한 윤활막 조직을 37℃에서 3.5시간 동안 콜라게나제 용액 중에서 분해시킨 다음, 37℃에서 1시간 동안 트립신 용액 중에서 제2 분해시켜 단리하였다. 세포주 S6은 잘게 절단한 윤활막 조직을 37℃에서 2시간 동안 콜라게나제와 DNA 분해효소를 함유하는 용액 중에서 분해시켜 단리하였다. 세포주 S7은 잘게 절단한 윤활막에 대해 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법으로 단리하였다. 단리한 후, 윤활막 유래 세포를 EGHXX 배지를 갖는 조직 배양 플라스크에서 플레이팅하고, 실시예 1에 기재한 바와 같이 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법을 이용하여 배양하였다. 세포주 S3 및 S5는 동결보존된 제1 계대 세포로서 셀 어플리케이션즈 인크.사에서 구입하였다. 해동시킨 후, 세포주 S3 및 S5로부터의 세포를 EGHXX 배지를 갖는 조직 배양 플라스크에서 플레이팅하고, 실시예 1에 기재한 바와 같이 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법을 이용하여 배양하였다.
RNA 단리 및 cDNA 제조 - 연골세포 배양물 C3, C4, C5, C6, C7 및 윤활세포 배양물 S3, S4, S5, S6, S7에 대한 RNA 제조는 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다. 이들 샘플로부터의 RNA를 대용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크., 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 이용하여 제조자 설명서에 따라 cDNA로 역전사시켰다. 본 실시예에서는 실시예 1로부터의 PC cDNA를 이용하였다. cDNA는 분석할 때까지 -20℃ 또는 -8O℃에서 저장하였다.
유전자 발현 분석 - 실시예 1에 기재한 바와 같이 RT-PCR을 이용하여 유전자 발현을 분석하였다.
도 6은 다수의 추가적인 연골세포주 및 윤활세포주에서의 HAPLN1 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-PCR의 표준 곡선 방법을 이용하여 측정하였고 18S 리보좀 RNA로 표준화하였다.
도 7은 도 6에 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 MFAP5 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 RT-PCR의 표준 곡선 방법을 이용하여 측정하였고 18S 리보좀 RNA로 표준화하였다.
도 8은 도 6 및 7로부터의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 비를 보여준다. 일차 연골세포 (PC)에서의 비를 1로 조정하고; 이에 따라 다른 비들을 조정하였다.
도 9는 도 6에 나타낸 것과 동일한 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 발현 수준은 RT-PCR의 비교 CT 방법을 이용하여 측정하였고, 비는 2＾(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로 계산하였다.
추가적인 세포주에서의 RT-PCR의 결과는 실시예 1에서 얻은 결과와 일치하였다.
실시예 3: 맞춤형 프라이머 및 프로브를 이용한 연골세포, 윤활세포 및 섬유모세포에서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현
알려진 올리고뉴클레오티드 서열의 프라이머 및 프로브를 이용하여 다양한 연골세포, 윤활세포, 및 피부 섬유모세포 배양물을 시험하였다.
세포 단리 및 배양 - 본 실시예에서 사용한 세포주들을 아래의 표 4 및 5에 열거하였다. 인간 연골세포 배양물 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C26, C28, C30 및 C34를 단리하고 실시예 1에 기재한 바와 같이 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법을 이용하여 배양하였다. 인간 연골세포 배양물 C21, C22, C23, C24, C25, C27, C29, C31, C32 및 C33을 (프로테아제 방법을 이용하여) 단리하고, 실시예 1에 기재한 바와 같이 배양하였다. 인간 윤활세포 배양물 S1, S2, S3, S4, S5, S6 및 S7에 대한 세포 단리 및 배양 방법은 실시예 1 및 2에서 기재하였다. 윤활세포 배양물 S9는 37℃에서 2시간 동안 잘게 절단한 윤활막 조직을 콜라게나제 및 DNA 분해효소를 함유하는 용액 중에서 분해시켜 단리하였다. 윤활세포 배양물 S10은 잘게 절단한 윤활막 조직을 37℃에서 3.5시간 동안 콜라게나제 용액 중에서 분해시킨 다음, 37℃에서 1시간 동안 트립신 용액 중에서 제2 분해시켜 단리하였다. 윤활세포주 S11, S12, S13, S14, S15, S16, S17 및 S18은 동결보존된 제1 계대 세포로서 셀 어플리케이션즈 인크.사에서 구입하였다. 피부 섬유모세포주 F1, F2, F3, F4, F5, F6, F8, F9, F10 및 F11은 동결보존된 일차 배양 세포로서 셀 어플리케이션즈 인크.사에서 구입하였다. 모든 세포 배양물들은 실시예 1에 기재한 바와 같이 카티셀® 자가 연골세포 생산 방법을 이용하여 배양하였다.
RNA 단리 및 cDNA 제조 -- 연골세포주 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 윤활세포주 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, 및 피부 섬유모세포주 F1 및 F2로부터의 RNA 제조는 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. 연골세포주 C8, 윤활세포주 S9, S10, S11, S12, S13, S14, 피부 섬유모세포주 F3, F4, F5 및 F6, 및 표 5에 열거된 모든 세포주로부터의 RNA 제조를 위하여, RNeasy™ 미니 키트 (캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen)) RNA 단리 방법을 사용하였다. RNeasy™ 단리를 위하여, 100만개 이하의 세포를 함유한 세포 펠렛에 용해 용액 360 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 즉시 최고 속도로 30초 동안 와동시킨 다음 37℃에서 5분 동안 두었다. 인큐베이션 후, 샘플을 10초 동안 손으로 진탕시킨 데 이어, 추가 30초 동안 최고 속도로 와동시켰다. 각 튜브의 내용물을 수집하고, 용해물을 퀴아쉬레더(Qiashredder)™ 컬럼 (퀴아젠)을 통해 전개시켰다. 퀴아쉬레더에 적용시킨 용해물 300 ㎕ 및 50 ㎕를 동물 세포로부터의 RNA 단리에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy™ 절차에서 사용하였다. 컬럼을 물 30 ㎕로 이루어진 단일 용리에 의해 용리시켰다. 고용량 cDNA 역전사 키트 (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 인크.))를 제조자 설명서에 따라 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 생성된 cDNA를 분석 시까지 -20℃ 또는 -80℃에 보관하였다.
유전자 발현 분석 -- HAPLN1 및 MFAP5 mRNA의 영역에 특이적인 맞춤형 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 맞춤 프라이머 및 프로브에 대한 서열 정보를 표 6에 나타냈다. 약어: 6FAM = 6-카르복시플루오레세인, VIC™은 어플라이드 바이오시스템즈 인크.의 상표이며 형광체이고, MGBNFQ = 작은 홈 결합제 비-형광성 켄처. 프라이머는 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.) (캘리포니아주 칼즈배드 소재)으로부터 입수하였다. 프로브는 어플라이드 바이오시스템즈 인크.로부터 입수하였다. HAPLN1에 대하여, 정방향 프라이머의 표적은 진뱅크 등록 번호 NM_001884.2 하에 기탁된 HAPLN1 서열 (서열 2)의 뉴클레오티드 543 내지 570이고, 역방향 프라이머의 표적은 뉴클레오티드 603 내지 622이고, 프로브의 표적은 동일한 서열의 뉴클레오티드 584에서 601까지이다. MFAP5에 대하여, 정방향 프라이머의 표적은 진뱅크 등록 번호 NM_003480.2 하에 기탁된 MFAP5 서열 (서열 1)의 뉴클레오티드 301에서 322까지이고, 역방향 프라이머의 표적은 뉴클레오티드 353에서 372까지이고, 프로브의 표적은 동일한 서열의 뉴클레오티드 334에서 350까지이다. UNG 부재의 태크만™ 패스트 유니버설 PCR 마스터 믹스 (카탈로그 번호 4352042, 어플라이드 바이오시스템즈 인크.), 900 nM 프라이머, 250 nM 프로브, 및 샘플 cDNA 5 ng 이하를 태크만™ 패스트 유니버설 PCR 믹스 프로토콜에 따라 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 반응 부피는 13 ㎕였고, 디폴트 패스트 태크만™ 주기 및 이 구성에 대한 데이터 수집 프로그램을 사용하여 ABI 7500 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.) 상에서 증폭을 실시하였다. 모든 분석에 대해 0.1 단위의 역치를 사용하였다. 실시예 1에 기재된 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 발현 수준을 구하였다.
도 10A는 도 2 및 6에 나타낸 것과 동일한 세포주, 뿐만 아니라 표 4에 나타낸 추가 연골세포주, 윤활세포주 및 피부 섬유모세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 도 10B는 표 5로부터의 세포주에서의 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비를 도시한다. 맞춤형 프라이머 및 프로브를 사용하여 얻어진 결과는 실시예 1 및 2에 기재된 결과와 유사하였다.
실시예 4: 단층 및 콜라겐 스캐폴드에서의 연골세포, 윤활세포 및 섬유모세포 배양물 내 HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준의 비교
HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준을 단층 및 콜라겐 스캐폴드에서의 다양한 유형의 배양물에서 비교하였다.
세포 단리 및 배양 -- 연골세포 배양물 C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 및 C18을 실시예 1에 기재된 바와 같은 프로테아제 방법을 사용하여 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. 윤활세포 배양물 S7을 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 단리하여 배양하였다. 피부 섬유모세포 배양물 F2 및 F7을 셀 어플리케이션즈 인크.로부터 냉동보존된 일차 배양 세포로서 입수하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. 제2 계대 (배양물 S7에 대해서는 제3 계대) 배양이 완료되면, RNA 단리를 위하여 샘플을 취한 다음 ("0일" 또는 단층 샘플), 세포를 EGHXX 배지에 재현탁시켜 20 ㎠ MAIX™ 스캐폴드 (ACI-MAIX™ 콜라겐 막, CE, 독일 데-52134 헤르초겐라트 소재의 마트리첼 게엠베하(Matricel GmbH))에 접종하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 부착되도록 한 다음, 스캐폴드에 추가 EGHXX를 공급하고 4일 동안 배양하였다. 윤활세포 및 피부 섬유모세포를 함유한 스캐폴드 배양물도 동일한 방식으로 제조하였다. 스캐폴드 배양 4일 후, 8 mm 생검 펀치를 사용하여 배양물을 샘플링하고 ("4일" 또는 스캐폴드 샘플), RNA 단리를 수행하였다.
RNA 단리 및 cDNA 제조 -- RNeasy™ 미니 키트 (캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 RNA를 단리하였다. RNeasy™ 단리를 위하여, MACI® 이식물 샘플 (제조당 2개까지의 8 mm MACI® 이식물 펀치)에 용해 용액 360 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 즉시 최고 속도로 30초 동안 와동시킨 다음 37℃에서 5분 동안 두었다. 인큐베이션 후, 샘플을 10초 동안 손으로 진탕시켜 막을 펼친 데 이어, 추가 30초 동안 최고 속도로 와동시켰다. 각 튜브의 내용물을 수집하고, 용해물을 퀴아쉬레더 컬럼 (퀴아젠)을 통해 전개시켰다. 퀴아쉬레더에 적용시킨 용해물 350 ㎕를 동물 세포로부터의 RNA 단리에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy™ 절차에서 사용하였다. 컬럼을 물 30 ㎕로 이루어진 단일 용리에 의해 용리시켰다. 고용량 cDNA 역전사 키트 (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 인크.)를 제조자 설명서에 따라 사용하여 샘플 RNA로부터의 cDNA 제조를 수행하였다. cDNA를 -20℃ 또는 -80℃에 보관하였다.
표 7에 상기 실시예에서 사용되는 세포 배양물 및 형태를 열거하였다.
유전자 발현 분석 -- 앞서 실시예 1에 개략적으로 나타낸 방식으로 단층 및 MACI® 이식물 cDNA의 유전자 발현 분석을 수행하였다.
도 11은 단층 및 콜라겐-스캐폴드 배양에서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비 사이의 비교를 나타낸다. HAPLN1 및 MFAP5 발현 수준은 RT-PCR의 표준 곡선 방법에 의해 측정하였다. 발현 수준을 18S 리보솜 RNA로 표준화하였다. 일차 연골세포 (PC)의 단층 배양에서의 비를 1로 조정하고, 이에 따라 다른 비를 조정하였다.
도 12는 도 11에 나타낸 것과 동일한 세포주를 사용한 단층 및 콜라겐-스캐폴드 배양물에서의 HAPLN1 및 MFAP5에 대한 발현 수준 비 사이의 비교를 나타낸다. HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준은 RT-PCR의 비교 CT 방법에 의해 측정하였고, 비는 2^(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로서 계산하였다.
스캐폴드 배양에서 얻어진 결과는 단층 배양에서 얻어진 것과 유사하였다.
실시예 5: 계대 수의 함수로서의 HAPLN1 및 MFAP5의 발현
다양한 배양 수준에서의 HAPLN1 대 MFAP5의 비를 조사하였다.
세포 단리 및 배양 -- 연골세포 배양물 C19, C20, C31, C32 및 C33을 실시예 1에 기재된 바와 같은 프로테아제 방법을 사용하여 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. 윤활세포 배양물 S6 및 S7을 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 단리하여 배양하였다. 37℃에서 2시간 동안 콜라게나제 및 DNase를 함유한 용액 내에서 잘게 절단한 윤활막 조직을 분해시킴으로써 윤활세포 배양물 S8을 단리하였다. S8의 세포 배양을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 연골세포 배양물 C19, C20, C31, C32 및 C33에 대하여, 연골 유래 세포 (도 14A 및 14B에서 "0"으로 표시됨), 일차 배양 세포 (도 14A 및 14B에서 "1"로 표시됨), 제1 계대 세포 (도 14A 및 14B에서 "2"로 표시됨) 및 제2 계대 세포 (도 14A 및 14B에서 "3"으로 표시됨)의 샘플을 취하였다. 윤활세포 배양물 S7에 대하여, 일차 배양 (도 13에서 "1"로 표시됨), 제1 계대 (도 13에서 "2"로 표시됨), 제2 계대 (도 13에서 "3"으로 표시됨), 제3 계대 (도 13에서 "4"로 표시됨) 및 제4 계대 (도 13에서 "5"로 표시됨) 세포의 샘플을 취하였다. 윤활세포 배양물 S6 및 S8에 대하여, 제1 계대 (도 13에서 "2"로 표시됨), 제2 계대 (도 13에서 "3"으로 표시됨), 제3 계대 (도 13에서 "4"로 표시됨) 및 제4 계대 (도 13에서 "5"로 표시됨) 세포의 샘플을 취하였다.
RNA 단리 및 cDNA 제조 - RNeasy™ 미니 키트 (퀴아젠) 및 고용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.)를 사용하여 실시예 3에 기재한 바와 같이 RNA 및 cDNA를 제조하였다.
유전자 발현 분석 - 윤활세포 샘플의 유전자 발현 분석을 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다. 연골세포 샘플의 유전자 발현 분석을 실시예 3에 기재한 바와 같이 수행하였다.
도 13, 14A 및 14B은 계대 수의 함수로서 HAPLN1과 MFAP5의 발현 수준 비율의 변화를 도시한다. 발현 수준은 RT-PCR의 비교 CT 방법으로 측정하였다. HAPLN1 : MFAP5 비는 2＾(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로 계산하였다.
HAPLN1 대 MFAP5의 비는 모든 배양 수준에서 연골세포 샘플에 비해 윤활세포 샘플에서 일관되게 낮았다. HAPLN1 대 MFAP5의 비는 모든 배양 수준에서 윤활세포 샘플에 비해 연골세포 샘플에서 일관되게 높았다.
실시예 6: 혼합된 세포 배양물에서 HAPLN1 및 MFAP5의 발현
연골세포와 윤활세포의 혼합된 배양물에 유전자 발현 분석을 적용하여 혼합된 배양물에서 상기 방법의 민감성 수준을 평가하였다. 인간 연골세포 및 인간 윤활세포의 세포 배양물을 사용하여 하기 비율과 같은 두 유형의 세포의 혼합물을 제조하였다.
1) 0％ 연골세포 / 100％ 윤활세포;
2) 25％ 연골세포 / 75％ 윤활세포;
3) 50％ 연골세포 / 50％ 윤활세포;
4) 75％ 연골세포 / 25％ 윤활세포; 및
5) 100％ 연골세포 / 0％ 윤활세포.
세포 단리 및 배양 - 연골세포주 C5, C6 및 C8을 실시예 1 및 2에 기재한 바와 같이 단리하고 배양하였다. 윤활세포 배양물 S6, S7 및 S9를 실시예 1, 2 및 3에 기재한 바와 같이 단리하고 배양하였다. 혼합 실험 1을 위하여, 연골세포주 6 (C6) 및 윤활세포주 6 (S6)의 제2 계대 배양물을 사용하였다. 혼합 실험 2를 위하여, 연골세포주 8 (C8) 및 윤활세포주 7 (S7)의 제1 계대 배양물을 사용하였다. 혼합 실험 3을 위하여, 연골세포주 5 (C5) 및 윤활세포주 9 (S9)의 제1 계대 배양물을 사용하였다.
RNA 단리 및 cDNA 제조 - RNeasy™ 미니 키트 (퀴아젠) 및 고용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 인크.)를 사용하여 실시예 3에 기재한 바와 같이 RNA 및 cDNA를 제조하였다.
유전자 발현 분석 - 실시예 3에 기재한 바와 같이 유전자 발현 분석을 수행하였다.
발현 수준은 RT-PCR의 비교 CT 방법으로 측정하였다. HAPLN1:MFAP5 비율은 2＾(CT,MFAP5 - CT,HAPLN1)로 계산하였다. 혼합 실험의 결과는 도 15에 제공하였으며, 이는 혼합된 연골세포 및 윤활세포 집단으로 이루어진 샘플에서 HAPLN1 및 MFAP5의 발현 수준의 비를 나타낸다. 75％ 이하의 연골세포 및 25％ 이상의 윤활세포를 포함하는 배양물에서 HAPLN1:MFAP5 발현 수준 비는 약 1 이하였다. 더 높은 비는 시험한 샘플내의 더 높은 연골세포 비율에 상응한다. 세포 배양물의 혼합물을 식별할 수 있는 분석의 능력은 평균적으로 샘플이 67％ 이상의 연골세포와 나머지는 활막 섬유모세포로 이루어져 양수의 CT,MFAP5 - CT,HAPLN1이 나온다는 것을 나타내었다. 피부 섬유모세포와 같은 다른 유형의 세포에 의한 오염 역시 상기 분석으로 검출할 수 있다.
실시예 7: 분석 반응률과 마커의 분자 비 사이의 관계의 분석
HAPLN1 및 MFAP5의 합성 RNA 전사체를 이용하여 시험 샘플에서의 분석 반응률과 마커의 분자 비 사이의 관계를 측정하였다. 먼저, 표 8에 열거된 프라이머를 사용하여 일차 PCR (플래티넘 PCR 수퍼믹스, 인비트로젠 카탈로그 번호 11306-016)을 인간 cDNA에 수행하였다. HAPLN1에 대하여, 이러한 프라이머는 HAPLN1 유전자 (기탁 번호 NM_001884.2)의 위치 256에서 1171까지의 뉴클레오티드를 증폭시켰다. MFAP5에 대하여, 이러한 프라이머는 MFAP5 유전자 (기탁 번호 NMJ303480.2)의 위치 32에서 728까지의 뉴클레오티드를 증폭시켰다. 비교를 위해 100 개의 염기쌍 분자크기 래더 (100 bp PCR 분자 자(Molecular Ruler), 바이오래드(BioRad) 카탈로그 번호 170-8206)를 사용하고, 겔 염색을 위해 SYBR 그린 I (인비트로젠 카탈로그 번호 S-7563)를 사용하여 1.5％ 트리스-아세테이트 EDTA (TAE) 아가로스 겔 상에서 PCR 산물을 분석하였다. 생성된 일차 앰플리콘을 4％ 네이티브 트리스-보레이트 EDTA (TBE) 폴리아크릴아미드 (PAGE) 겔을 이용하여 겔 정제하고, 표 8에 열거된 프라이머를 이용한 이차 PCR의 주형으로 사용하였다. 이차 MFAP5 증폭을 위한 겔-정제한 일차 앰플리콘 주형을 200 μL의 이차 반응 당 0.56 ng으로 로딩했다. 이차 HAPLN1 증폭을 위한 겔-정제한 일차 앰플리콘 주형을 900 μL의 이차 반응 당 2.5 ng으로 로딩하였다. 이차 앰플리콘을 상기한 바와 같은 네이티브 TBE PAGE 겔로부터 정제하고, 암비온(Ambion) 메가스크립트(Megascript) T7 키트를 사용한 시험관 내 전사를 위한 주형으로 사용하였다. 20 μL 전사 반응물 당 1.3 μg 이하의 이차 앰플리콘 주형을 사용하였다. 생성된 전사체를 6％ TBE-우레아 (TBU) 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 겔 정제하고, 0.1 mM EDTA 중에 재현탁하고, 40 ng/μL RNA에 상응하는 1A26O 단위의 환산 인자를 이용하여 2회씩 리딩함으로써 분광광도법으로 정량화하였다. 겔 정제한 전사체를 6％ TBU 겔 상에서 분석하여 순도를 평가하였다. PAGE 분석으로 순도를 측정하고, 분광광도법으로 정량화한 후, μL당 전사 카피수를 표 9에 열거된 환산 인자를 이용하여 측정하였다. 이러한 환산 인자는 평균 염기 분자량을 343 달톤으로 가정한 것이다. 아보가드로 상수는 6.02×1023/몰로 간주하였다. 또한 첫번째로 전사되는 염기가 T7 프로모터로부터 +1 G이며 표적 서열이 후속되는 것이라고 가정하였다. 전사체를 효모 RNA 담체 완충액 (뉴클레아제-무함유 수 중 20 ng/μL 효모 RNA (암비온 카탈로그 번호 AM7120G)의 용액)에 103 내지 108 카피/μL 범위의 농도로 희석시켰다. 그 후, 13 μL PCR 반응물 당 2 μL의 cDNA를 사용하는 것을 제외하고는 본 출원의 실시예 3에 주어진 바와 같은 RT-PCR 절차를 사용하여 희석물을 시험하였다. 본 출원의 실시예 4에 기재된 바와 같은 비교 CT 방법을 사용하여 각 희석물의 HAPLN1:MFAP5 비를 계산하였다.
카피수 표준을 사용한 분석 반응률을 공지된 분자 비와 비교하였다. 이러한 결과를 표 10에 나타내었다. 분석 반응률과 측정된 분자 비 사이의 관계를 이용하여 다양한 분석 반응률에서의 정확한 분자 비를 계산하였다. 표 11에 기재한 이러한 결과는 측정한 비교 CT가 허용 경계가 1일 때 (예, HAPLN1:MFAP5 = 1), HAPLN1:MFAP5의 정확한 분자 비가 2.212임에 상응함을 나타낸다.
실시예 8: 연골세포 및 섬유모세포 마커의 절대 정량 분석
절대 정량 방법을 이용한 유전자 발현 분석을 수행하였다. 표 12는 본 실시예에 사용되는 세포 배양물을 열거한다. 상기 실시예에서 논의한 바와 같이 다양한 배양물을 단리하고, 배양하였다. 실시예 3에서 논의한 바와 같이 RNeasy 키트를 사용하여 세포 배양물로부터의 RNA를 단리하였다. 13 μL PCR 반응물 당 2μL의 cDNA를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3에 기재한 바와 같이 세포 배양물에 RT-PCR을 수행하였다. HAPLN1 및 MFAP5에 대한 시험관 내 전사된 RNA 표준물 (실시예 7에 기재된 바와 같이 제조함)을 희석시켜 최종 농도가 uL 당 5×102, 5×103 및 5×104개 카피인 cDNA를 수득하였다. 표준물로부터의 CT 결과를 y-축에 플로팅하고 반응 당 카피수 (103, 104 및 105)의 로그를 x-축에 플로팅하여 표준 곡선을 생성하였다. 선형 추세선을 데이터에 피팅시키고, 각 시험 샘플에 존재하는 HAPLN1 및 MFAP5 mRNA 카피의 양을 수학적으로 측정하였다. 이러한 정량화 방법은 예를 들어 [Real-Time PCR Systems: Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 7300/7500 Real-Time PCR Systems, Chemistry Guide, Applied Biosystems, 2005, Part No. 4348358 Rev. E]에 이미 기재되어 있다. 그 후 각 샘플의 HAPLN1:MFAP5 몰 비를 계산하였다. 도 16은 다양한 세포 배양물에서의 HAPLN1:MFAP5의 몰 비를 도시한다. 이러한 결과는 연골세포에서의 HAPLN1:MFAP5의 몰 비가 윤활세포 및 피부 섬유모세포에 비해 높다는 것을 나타낸다.
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SEQUENCE LISTING
<110> Genzyme Corporation
<120> METHOD OF EVALUATING CELLS AND CELL CULTURES
<130> 07680.0060-00304
<150> US 60/910,574
<151> 2007-04-06
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2900
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
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ctcattgttt cagcggaggc caaatctgaa gtcctttcca gggagtggct ctgttcatct 120
tattcgccag ccaaagtagg aacagcgtaa gaggagagag acacattcag cagccaaagg 180
actcggtgga aagagcagaa caccatagac aatatgtcgc tcttgggacc caaggtgctg 240
ctgtttcttg ctgcattcat catcacctct gactggatac ccctgggggt caatagtcaa 300
cgaggagacg atgtgactca agcgactcca gaaacattca cagaagatcc taatctggtg 360
aatgatcccg ctacagatga aacagttttg gctgttttgg ctgatattgc accttccaca 420
gatgacttgg cctccctcag tgaaaaaaat accactgcag agtgctggga tgagaaattt 480
acctgcacaa ggctctactc tgtgcatcgg ccggttaaac aatgcattca tcagttatgc 540
ttcaccagtt tacgacgtat gtacatcgtc aacaaggaga tctgctctcg tcttgtctgt 600
aaggaacacg aagctatgaa agatgagctt tgccgtcaga tggctggtct gccccctagg 660
agactccgtc gctccaatta cttccgactt cctccctgtg aaaatgtgga tttgcagaga 720
cccaatggtc tgtgatcatt gaaaaagagg aaagaagaaa aaatgtatgg gtgagaggaa 780
ggaggatctc cttcttctcc aaccattgac agctaaccct tagacagtat ttcttaaacc 840
aatccttttg caatgtccag cttttacccc tactctctac tttttcaccc aaactgataa 900
catttatctc attttctagc acttaaaata caaagtctat attattgcat aattttgctg 960
cttctcaata tcatagacac agtgaataga tgatgactat atggcttata tacaaacatt 1020
ctatgtacaa tttcaaggga gactaaactt taggctaata atctttacta ttgaatctgt 1080
ctgatataga tcttagggtt gaagaagcta tctttgtcta tttgggctaa ccatagaatt 1140
tcatttattt tcctcacaat attttcctag accaactccc catcattcac gtgttcctct 1200
ttactcttac tttaactatt ttgctggctt gcccgaaaat ttgcctggca agtcttcctt 1260
ataagacaca tcatggtaag ttttgtagtc ctgtaagatt ctgcaacaca gtcaagaatt 1320
atacaatcct actagcaata tataaggacc caaaatgtct tctgctaagc tcagaggctg 1380
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
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atattctatg gacccaagtc tatgctcagt tccacagaat gtcaggacca aataacttca 4140
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ccctgttgca tgtcatgtag attcaagctt ctgtaacata ggcagctgca ctgcgcgttc 4260
ctattattga agcaaaaagg gtgactgata cctaaaagcc ctttcttcct ctagtcgcca 4320
gctcatcaga aaaacatact ttgaaaagat gcttgagatt ttcctgctgc atcgcactct 4380
agtttggaag gatttacatc ttaggaaata acatgtatac tctagtaaat aagcgattta 4440
ggtgttccat tgaacagctt tgattaactt aatgccacca ttgatttcaa agtgaagaaa 4500
atgtaacaga agccagtgaa gcaatggaag ctggagtgtg actggaaaaa tactcagcaa 4560
acaaagttac caattccata cagagatgat ctggtgtctt cttttggaaa atggtattca 4620
aattctggaa tggaaatcta gccaccaaaa cgggttaatc aaaagacgtc cttttccgtt 4680
ttttttgctt ttattttcta aatcattttt aagggaatga aacaggaatg tcatcagaga 4740
ttttttagta caggcccaag agcctgtact ctaagaaaga aatttttgcc atgtatgaat 4800
tttcgaataa gtgactttgc aggcttttgc tagcccttgc tggtgggtct ggaaattaca 4860
tccagagtct gcagtccagg tcaccaagcc agcggcaccc gtcggcaacc ctgtgtttaa 4920
cggattgtgc cgtttactgt gacctgcaac ggggtggcat tcacttaggg tctgacttca 4980
cagctatgac aaaaccgaaa aagcaaaact gcgaggaagt gctaagatgt acgggtcttg 5040
gggatatctg ccttatatgt tatattcaag gaaattaacg aaacatcctg tgaaacatcg 5100
tttaaggaaa cgtttactag tccaaaggcc aaagctaatt tatttccact ttagaaaagt 5160
tagcacatgc ttttgaaaat ctgtgatttc attttattag gctaaaaggg taaataggct 5220
ttattacact gaagctgcat ctatatgtca ctgacataaa gttgaaaaaa taaatgcagg 5280
caaataacta gagacttctt ttaagggggt ttggctggtt tctctcactg aaatggccag 5340
tcgtgattaa agtgataaaa ccccatatct gttttggtat attgtacaca aacctacaaa 5400
aataaactga acttgcaata tttttgcaat aaaatctgtc gttaaaactg aggataaaat 5460
acctgctcaa ttttatttta ctaagtatat atttacattt cacccaggca ggccattttc 5520
ttttgtgatt ataagaaaga gtagttgttg attaaatttt cagactaaat ataggacagg 5580
tacaattttg gataaatagc agatttataa gaaccgcaat gaaaactgac ttgaaataat 5640
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taaagggtag ttgttttaca atgaagacta aaactgaaca agatgttgca tgcgcttagg 5880
ccataatttg gtagtgttgg cagttgttaa taaagcttgt caggatgtta agcatctcag 5940
gagaaatatt ggaaaattat atgtataaaa ccaaagtgct gtttttaaaa gcatcattta 6000
aaaaaaaatg acatgcctga acaacttttc cactttccac gtgcttccct cccacctttg 6060
gtttggcaac aggtatctcg tgcatgaagc tgacagctaa agaagatttt aaaaattgag 6120
ttaaagatga ctgtgtaaat gtccaagcac agagagcatg cacctgactt tctaaagttt 6180
gatgtgttct caagcctgac agaagcacaa ggaacagttt gatacacttt taaaaggttc 6240
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ttgcttttgt tgtaagcttt tgtagtacat gtttttacta ataattcttg ttctctagaa 6360
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acacttgcag tgtagcccag tttgaaatat ttatttggtt atcaactgcc catggaggag 6480
gctcttgatg atcccaggtc tcctcgacct ccatacacca cacaggcatt tgtaagcaca 6540
gtttccacaa gcaccttgta ggaatatgga taagattaga ccagcccctc tctgtccact 6600
gggtttattt cttgaagaag atgcagatct ggtttttcca atgtgccaca gtctttcctt 6660
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tctatagtaa tattttatta cacatgattg atatttttgt ggtagggaag tgggatgctc 7020
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tgaggctgga ttcactacac aagatgaact tcacttcata aattaattat accttagcga 7260
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atcaaaaaag tcaaggcatt gtatgttgct tctgtggtta ttattctgtg atgcttagac 7500
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tttacaaatg aaggggcttc acggaatgtt acaatgttac taatataatt tggcttttgt 7980
tatgcaaatt gttaacacca gctattaaaa tatattttag tagaaaaaaa aaaa 8034
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<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Primer sequence
<400> 27
ccattgggtc tctgcaaatc c 21
Claims (35)
- a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;b) 복수개의 세포에서 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하며, 상기 섬유모세포 마커는 그의 표준화된 발현 수준이 섬유모세포 또는 윤활세포에 비해 연골세포에서 보다 낮게 되는 단계; 및c) 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 1) 세포 배양물은 연골세포를 포함하거나, 또는 2) 섬유모세포 마커는 미세원섬유 관련 단백질 5 (MFAP5)인 것인, 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법.
- a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;b) 복수개의 세포에서 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하며, 상기 섬유모세포 마커는 그의 표준화된 발현 수준이 섬유모세포 또는 윤활세포에 비해 연골세포에서 보다 낮게 되는 단계; 및c) 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 미리측정된 역치 미만의 평균 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 포함한다는 것을 나타내는 것인, 세포 배양물의 조성을 평가하는 방 법.
- a) 세포 배양물로부터 복수개의 세포를 얻는 단계;b) 복수개의 세포에서 MFAP5의 평균 발현 수준을 측정하는 단계; 및c) MFAP5의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 미리측정된 역치 미만의 상기 MFAP5의 평균 발현 수준은 세포 배양물이 연골세포를 포함한다는 것을 나타내는 것인, 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법.
- 제1항에 있어서, 1) 세포 배양물이 연골세포를 포함하며, 2) 섬유모세포 마커가 MFAP5인 방법.
- 제1항에 있어서, 섬유모세포 마커가 그의 표준화된 발현 수준이 피부 섬유모세포 또는 윤활세포에서에 비해 계대배양된 연골세포에서 보다 낮게 되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 복수개의 세포에서 연골세포 마커의 평균 발현 수준을 측정하는 단계; 및 단계 c)에서 연골세포 마커의 평균 발현 수준, 및 연골세포 및 섬유모세포 마커의 평균 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제6항에 있어서, 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커가 연골세포에서의 이들의 발현 수준의 비 (섬유모세포 마커에 대한 연골세포 마커의 비)가 피부 섬유모세포 또는 윤활세포에서의 비와 동일하거나 또는 5배 더 크도록 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 연골세포 마커가 표 1에서 열거된 연골세포 마커로부터 선택되는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 연골세포 마커가 HAPLN1인 방법.
- 제6항에 있어서, 연골세포 마커가 HAPLN1이고, 섬유모세포 마커가 MFAP5인 방법.
- 제6항에 있어서, 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커의 발현 수준을 RNA 수준에서 측정하는 방법.
- 제11항에 있어서, 발현 수준을 PCR을 사용하여 측정하는 방법.
- 제12항에 있어서, 발현 수준을 비교 CT PCR 방법을 사용하여 측정하는 방법.
- 제6항에 있어서, 비교 CT PCR 방법을 사용하여 측정시 섬유모세포 마커에 대한 연골세포 마커의 발현 수준 비가 0.25 초과인 것은 세포 배양물이 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 비는 세포 배양물이 적어도 50％ 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 섬유모세포 마커에 대한 연골세포 마커의 몰 비가 0.55 초과인 것은 세포 배양물이 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 몰 비는 세포 배양물이 적어도 50％ 연골세포를 함유한다는 것을 나타내는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양물이 연골 생검으로부터 얻은 세포를 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 연골 생검을 슬관절로부터 취하는 방법.
- 제18항에 있어서, 세포 배양물의 평가에 이어서, 세포 배양물로부터의 세포를 필요한 환자에게 투여하는 방법.
- 제20항에 있어서, 배양물로부터의 세포를 자가 연골세포 이식을 위해 사용하는 방법.
- a) 세포에서 MFAP5의 발현 수준을 측정하는 단계; 및b) MFAP5의 발현 수준을 기준으로 세포의 표현형을 측정하는 단계를 포함하는, 세포의 표현형을 평가하는 방법.
- 제22항에 있어서, 세포에서 연골세포 마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 단계 b)에서 연골세포 마커 및 MFAP5의 발현 수준을 기준으로 세포의 표현형을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 연골세포 마커가 표 1에서 열거된 연골세포 마커로부터 선택되는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 연골세포 마커가 HAPLN1인 방법.
- 제23항에 있어서, 연골세포 마커가 HAPLN1이며, 섬유모세포 마커가 MFAP5인 방법.
- 제23항에 있어서, 섬유모세포 마커 및 연골세포 마커의 발현 수준을 RNA 수준에서 측정하는 방법.
- a) 포유동물로부터 연골 생검을 얻는 단계;b) 생검으로부터 세포를 단리하는 단계;c) 단계 b)에서 단리된 세포를 세포 배양물에서 배양하는 단계;d) 세포 배양물의 샘플을 얻는 단계;e) 샘플로부터의 하나 이상의 세포에서 MFAP5 및 HAPLN1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및f) MFAP5 및 HAPLN1의 발현 수준을 기준으로 배양물의 조성을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 배양물의 조성을 평가하는 방법.
- 제28항에 있어서, MFAP5 및 HAPLN1의 발현 수준을 RNA 수준에서 측정하는 방법.
- 제29항에 있어서, 발현 수준을 PCR을 사용하여 측정하는 방법.
- 제30항에 있어서, 발현 수준을 비교 CT PCR 방법을 사용하여 측정하는 방법.
- 제28항에 있어서, 비교 CT PCR 방법을 사용하여 측정시 MFAP5에 대한 HAPLN1의 발현 수준 비가 0.25 초과인 것은 세포 배양물이 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 비는 세포 배양물이 적어도 50％ 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, MFAP5에 대한 HAPLN1의 몰 비가 0.55 초과인 것은 세포 배양물이 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 몰 비는 세포 배양물이 적어도 50％ 연골세포를 함유함을 나타내는 것인 방법.
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