KR101316702B1 - 곤충의 표지 유전자를 이용한, 곤충의 맥주 유입 시기 계산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식품 등에 동물, 곤충 등이 유입되어 죽은 채로 발견된 경우에 있어서, 상기 동물, 곤충 등이 유입된 날을 계산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 정확성이 높으며, 유입일로부터 오랜 기간이 흐른 후에도 계산이 가능한 이점이 있다.

Description

곤충의 표지 유전자를 이용한, 곤충의 맥주 유입 시기 계산 방법{CALCULATION METHOD OF BEER―CONTAMINATING INSECTS′ INFLOW TIME USING MARKER GENE FROM THE INSECTS}
본 발명은 식품 등에 동물이 유입된 경우에 상기 동물의 유입 시기를 계산하는 방법에 대한 것이다.
식품의 제조, 유통 및 판매와 관련하여, 식품 내 유입된 이물은 식품의 안전성을 위협할 뿐 아니라, 기업의 품질 신뢰도에 위해를 미치는 중요한 요소이다. 식품공전에서는 식품 이물의 종류를 동물성, 식물성, 광물성 이물로 분류하고 있으며, 식품위생법(HACCP)에서는 생물적, 화학적, 물리적 위해 요소로 분류하고 있다. 최근 주로 발생하여 신고되는 식품 내 이물로는 머리카락, 탄화물 및 금속류 등의 물리적 위해 요소와 작은 동물의 사체 및 곤충류의 생물학적 위해 요소가 있다. 특히 생물학적 위해 요소는 소비자의 혐오감을 불러일으킬 수 있으며 나아가 기업의 이미지 하락을 가져온다.
한편, 식품은 생산 공장, 지점, 도매업소, 대형 또는 소형 판매점, 식당 등의 여러 단계를 거쳐 최종 소비자에게 도달하게 되는바, 생물학적 위해 요소가 이 중 어느 단계에서 유입되었는지를 확인하는 것이 재발 방지 및 책임 소재 규명 등에 있어 중요하다. 그러나 생물학적 위해 요소의 유입 시기를 측정하는 종래 방법은 상기 곤충 등이 제품과 어떠한 상태로 혼입 등이 되어 있는지 물리적으로 판단하거나, 사멸한 곤충의 genomic DNA(gDNA)의 남아 있는 양을 정성적으로 분석하였는바, 그 유입 시기 측정의 정확도가 낮은 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 곤충, 작은 동물 등 동물의 유입 시기를 정확히 측정하는 방법을 연구하던 중 정량적 실시간 PCR 및 이로부터 수득한 결과값을 이용하면, 동물의 유입 시기를 정확히 계산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 특정 환경 조건 하 죽은 상태로 존재하였던 동물에 있어서, 상기 조건에서 동물의 사멸일로부터 경과한 기간을 계산하여, 동물의 사멸 시기를 계산하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 환경 조건 하 죽은 상태로 존재하였던 동물의 사체에서 genomic DNA(gDNA)를 추출하고, 정량적 실시간 PCR을 이용하여, 상기 동물의 사멸 후 경과 시간에 따라 분해되고 남을 유전자의 양을 구하여, 동물의 사멸 후 경과시간을 역으로 계산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 동물의 사멸일을 정성적으로 추정하였던 종래의 방법에 비하여, 정량적인 수식을 도출함으로써, 동물의 사멸일 계산의 정확도를 현저히 높인 효과가 있다.
도 1a은 정량적 실시간 PCR을 수행한 결과 수득한 증폭 곡선을 나타내며, 도 1b는 melting curve를 나타낸다.
도 2는 집파리의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 3은 집파리의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 4는 꿀벌의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 5은 꿀벌의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 6는 초파리의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 7은 초파리의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 8는 화랑곡나방의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 9은 화랑곡나방의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 10은 독일바퀴의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 11은 독일바퀴의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(상온 조건).
도 12은 집파리의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(저온 조건).
도 13은 집파리의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(저온 조건).
도 14은 집파리의 정량적 실시간 PCR 증폭곡선(a) 및 melting curve(b)를 나타낸다(고온 조건).
도 15은 집파리의 정량적 실시간 PCR 결과 수득한, 시간에 따른 Ct 값(a) 및 Ct ratio(b)를 나타낸다(고온 조건).
본 발명은,
1) 대조군의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 대조군의 표지 유전자의 Ct 값인 Ctc를 구하는 단계;
2) 표준시료의 사멸일로부터 특정 시간이 경과한 후, 표준시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 표준시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cts를 구하되, 상기 사멸일로부터의 경과 시간을 달리하여, 경과 시간에 따른 Cts들을 구하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 구한 Ctc 및 상기 단계 2)에서 구한 Cts를 이용하여 Ct ratio (1)을 계산하는 단계;및
4) 상기 단계 3)에서 계산한 Ct ratio(1)을 이용하여 표준곡선을 구하는 단계를 포함하며, 상기 대조군 및 표준시료는 동종인, 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
1) 대조군의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 대조군의 표지 유전자의 Ct 값인 Ctc를 구하는 단계;
2) 표준시료의 사멸일로부터 특정 시간이 경과한 후, 표준시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 표준시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cts를 구하되, 상기 사멸일로부터의 경과 시간을 달리하여, 경과 시간에 따른 Cts들을 구하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 구한 Ctc 및 상기 단계 2)에서 구한 Cts를 이용하여 Ct ratio (1)을 계산하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 계산한 Ct ratio(1)을 이용하여 표준곡선을 구하는 단계;
5) 분석시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 분석시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cta를 구하는 단계;
6) 상기 단계 1)에서 구하거나, 또는 상기 단계 5)의 수행 시에 상기 단계 1)을 재수행하여 구한 대조군의 Ctc 및 상기 단계 5)에서 구한 분석시료의 Cta를 이용하여 Ct ratio (2)를 계산하는 단계;및
7) 상기 단계 6)에서 계산한 Ct ratio (2)를 상기 단계 4)에서 구한 표준곡선에 적용하여 분석시료의 사멸일로부터의 경과일을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 분석시료, 대조군 및 표준시료는 동종인, 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
1) 대조군의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 대조군의 표지 유전자의 Ct 값인 Ctc를 구하는 단계;
2) 표준시료의 사멸일로부터 특정 시간이 경과한 후, 표준시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 표준시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cts를 구하되, 상기 사멸일로부터의 경과 시간을 달리하여, 경과 시간에 따른 Cts들을 구하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 구한 Ctc 및 상기 단계 2)에서 구한 Cts를 이용하여 Ct ratio (1)을 계산하는 단계;및
4) 상기 단계 3)에서 계산한 Ct ratio(1)을 이용하여 표준곡선을 구하는 단계를 포함하며, 상기 대조군 및 표준시료는 동종인 동물인, 식품 내 동물의 유입 시기를 계산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
1) 대조군의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 대조군의 표지 유전자의 Ct 값인 Ctc를 구하는 단계;
2) 표준시료의 사멸일로부터 특정 시간이 경과한 후, 표준시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 표준시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cts를 구하되, 상기 사멸일로부터의 경과 시간을 달리하여, 경과 시간에 따른 Cts들을 구하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 구한 Ctc 및 상기 단계 2)에서 구한 Cts를 이용하여 Ct ratio (1)을 계산하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 계산한 Ct ratio(1)을 이용하여 표준곡선을 구하는 단계;
5) 분석시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 분석시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cta를 구하는 단계;
6) 상기 단계 1)에서 구하거나, 또는 상기 단계 5)의 수행 시에 상기 단계 1)을 재수행하여 구한 대조군의 Ctc 및 상기 단계 5)에서 구한 분석시료의 Cta를 이용하여 Ct ratio (2)를 계산하는 단계;및
7) 상기 단계 6)에서 계산한 Ct ratio (2)를 상기 단계 4)에서 구한 표준곡선에 적용하여 분석시료의 사멸일로부터의 경과일을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 분석시료, 대조군 및 표준시료는 동종인, 식품 내 동물의 유입 시기를 계산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 대조군, 표준시료 및 분석시료는 동종인 동물의 핵산, 즉 gDNA이다. 상기 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 절지류, 곤충 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 쥐 등 작은 크기의 포유류, 참새 등 작은 크기의 조류, 해충, 곤충 등이며, 더욱 더 바람직하게는 해충 및 곤충이다. 상기 곤충은 바퀴, 나방, 나비, 벌, 모기, 매미, 잠자리 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 해충은 쥐며느리 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 대조군은 동물의 사후에 곧 추출한 핵산이며, 바람직하게는 사후 2일 이내 추출하고, 더욱 바람직하게는 사후 1일 이내에 추출하며, 더더욱 바람직하게는 본 발명의 대조군은 동물의 사망 직후에 추출한 핵산이다.
본 발명의 분석시료는 사멸 후 경과일을 분석하려는 대상이 되는 동물의 핵산이다. 한편, 상기 분석시료를 추출한 동물이 죽은 채로 발견된 환경과 동일하거나 유사한 환경을 설정하고, 상기 환경에 대조군과 동종인 동물을 인위적으로 유입하여 사멸시키고 일정 시간이 경과한 후 이로부터 핵산을 추출한 것이 표준시료가 된다. 상기 표준시료는 상기 분석시료가 존재한 조건(환경)과 동일하거나 당업계에서 이와 실질적으로 동일한 조건, 또는 유사하다고 간주할 수 있는 조건 하에 동물이 존재하도록 실험조건을 설정하는 것이 바람직하다.
예컨대, 본 발명의 분석시료는 식품에 유입된 채 발견된 곤충으로부터 추출한 핵산이 될 수 있다. 이 경우 상기 "환경"은 식품(상기 식품의 보관 온도, 습도 등 식품 외부의 환경도 포함한다)이 되며, 상기 곤충이 발견된 식품과 동일(이와 도일하거나 유사한 것으로 간주할 수 있는 식품을 포함한다)한 식품에 곤충을 인위적으로 유입시키고 사멸시킨 후, 일정 시간이 경과한 후에 이로부터 핵산을 경과 시간 별로 추출한 것이 표준시료가 된다. 한편, 대조군은 곤충을 식품에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후에 핵산을 추출한 것이다. 이 때, 대조군, 표준시료, 분석시료는 모두 동종인 곤충의 핵산이다. 본 발명은 동물이 식품에 유입되어 죽은 채로 발견된 경우에, 상기 동물이 상기 식품에 유입되어 언제 사멸하였는지 그 사멸일을 확인하고, 상기 사멸일을 식품에의 유입일로 간주함으로써, 동물의 식품 유입일을 계산하는데 이용될 수 있다.
예를 들어 소비자가 구입한 맥주에서 집파리(분석시료)가 죽은 채 발견되었다면, 본 발명을 하기와 같이 실시할 수 있다. 1) 집파리(표준시료)를 맥주에 유입시켜 사멸시킨 후 사멸 후 경과 시간에 따라 핵산을 추출하여, 정량적 실시간 PCR을 수행하여 얻은 시간(일자)별 Cts; 및 2) 집파리를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 맥주 유입 없이 죽은 직후 집파리의 핵산을 추출(대조군)하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여 얻은 Ctc를 이용하여, Ct ratio (1)를 구하고, 상기 Ct ratio (1)을 변수로 갖는 집파리의 사후 경과일의 계산식을 도출한다.
한편, 상기 분석시료의 핵산에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여 Cta를 구하고, 상기 Cta 및 상기 대조군의 Ctc를 이용하여, Ct ratio (2)를 구하고, 이를 상기 집파리의 사후 경과일의 계산식에 대입한다(즉, 상기 계산식에 Ct ratio (1) 대신 Ct ratio (2)를 대입하는 것이다).
이렇게 구하여진 집파리의 사후 경과일(Y)을 상기 실험을 수행한 실험일(D)에서 뺀 날이 집파리(분석시료)가 맥주에 유입된 날(Z)로 추정된다.
본 발명의 단계 6)에 있어서, 대조군의 Ct값인 Ctc는 본 발명의 단계 1)에서 구한 Ctc값을 사용할 수 있으며, 또는 분석시료의 Ct값을 구하는 단계 5)의 수행시, 본 발명의 단계 1)을 재수행하여, 대조군의 Ct값을 다시 구하여 단계 6)의 Ctc로 사용할 수도 있다. 분석시료의 수집 및 정량적 실시간 PCR의 수행일에 별도로 동물(곤충)을 희생시켜서 Ctc값을 구하여 Ct ratio (2)를 얻는 것이, PCR 기기의 조건 등 분석시료와 동일한 조건하에 수행된 대조군의 PCR 결과를 얻을 수 있어 좀더 정확한 Ct ratio(2)를 얻을 수 있어서 바람직하나, 반드시 그러해야 하는 것은 아니다.
상기 식품은 일반적인 식품이며, 특별한 제한은 없다. 예컨대 본 발명의 식품은 시판되는 식품일 수도 있고, 판매를 목적으로 하지 않는 식품일 수도 있다. 또한 본 발명의 식품은 고형 식품, 액상 식품, 젤 형태의 식품 등이 될 수 있으며, 식품의 형태에는 제한이 없다.
예컨대 본 발명의 식품은 주류일 수 있으며, 상기 주류는 주정, 발효주, 증류주 등이 될 수 있다. 예컨대, 상기 주류는 탁주, 약주, 청주, 맥주, 과실주, 소주(증류식 및 희석식 모두 포함), 위스키, 브랜디, 일반 증류주, 리큐르 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 맥주이나, 본 발명은 주류의 종류에 상관없이 모두 적용 가능하다는 것은 본 발명의 원리상 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 "동물의 사멸일로부터의 경과일"은 식품 내 유입되어 죽은 채 발견된 동물에 있어서, "식품 내 유입된 날로부터의 경과일"을 의미한다.
본 발명의 "동물의 사멸일로부터의 경과일(Y)"를 이용하여 동물유입 예상일(Z)을 계산할 수 있다. 즉, 동물유입 예상일(Z)은 본 발명을 실시한 실험일(D)로부터 동물의 사멸일로부터의 경과일(Y)을 뺀 값이다.
동물의 유입 예상일(Z) = 본 발명을 실시한 실험일(D) - 동물의 사멸일로부터의 경과일(Y)
본 발명은 판매용 식품 등에 있어서, 식품에 곤충 등이 유입되어 죽은 상태로 발견된 경우에 있어서, 곤충이 유입된 시점을 계산(추정)함으로써, 식품의 제조 및 생산 공정, 유통 과정, 판매 이후 등 식품의 제조 및 유통, 판매에 이르는 일련의 과정 중 어느 과정에서 곤충이 유입되었는지 역으로 추적할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명은 연구, 조사, 수사 등의 목적으로 특정 환경 조건 하에서 죽은 상태로 발견된 동물(곤충, 포유류 등 포함)에 있어서, 상기 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는데 이용될 수도 있다.
본 발명의 Ct ratio (1)은 대조군의 Ctc 값과 표준시료의 Cts 값을 변수로 갖는 함수식이며, 종래 정량적 실시간 PCR, 실시간 PCR과 관련하여 당업계에서 널리 사용되고 있는 Ct ratio를 사용하면 되고, 특별한 제한은 없다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 Ct ratio (1)은 하기의 식 1로 나타낸다.
<식 1>
Ct ratio(1) = (Cts-Ctc)/Ctc
Ctc: 대조군의 Ct값
Cts: 표준시료의 Ct값
본 발명의 Ct ratio (2)는 대조군의 Ctc 값과 분석시료의 Cta 값을 변수로 갖는 함수식이며, 종래 정량적 실시간 PCR, 실시간 PCR과 관련하여 당업계에서 널리 사용되고 있는 Ct ratio를 사용하면 되고, 특별한 제한은 없다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 Ct ratio (2)는 하기의 식 2로 나타낸다.
<식 2>
Ct ratio(2) = (Cta-Ctc)/Ctc
Ctc: 대조군의 Ct값
Cta: 분석시료의 Ct값
본 발명의 표지 유전자는 특별한 제한은 없다. 그러나 표지 유전자가 곤충 사후에 오래 남아 있을수록, 오랜 시간이 경과한 것도 측정이 가능한바, 본 발명의 표지 유전자는 동물 내 유전자 함량이 높은 것이 바람직하다. 이러한 관점에서 본 발명의 표지 유전자는 ribosomal RNA이며, 더욱 바람직하게는 곤충의 5S rRNA, 18S rRNA이고, 더더욱 바람직하게는 곤충의 18S rRNA이다.
본 발명에서 단계 4)의 표준곡선이란, 사멸일로부터의 경과 기간을 알고 있는 표준시료로부터 Ct ratio(1)를 측정하고, 이 값을 회귀분석(regression analysis)하여 얻은 사멸일로부터 경과 기간에 따른 Ct ratio(1)의 선형의 관련성을 나타내는 함수식을 의미하며, 실시간 PCR과 함께 사용되는 일반적인 프로그램을 이용하여 얻을 수 있다. 예컨대 상기 프로그램은 엑셀, Sigmaplot 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자가 본 발명을 실시하기 위하여 프로그램을 적절히 선택할 수 있다는 것은 자명하다.
바람직하게는 본 발명의 상기 단계 4)의 표준곡선은 Ct ratio(1)을 변수로 갖는 함수식으로 나타낸다. 또한 본 발명의 단계 7)은 상기 단계 4)의 표준곡선의 함수식에 Ct ratio (1) 대신 Ct ratio (2)를 입력하여 수행된다.
본 발명의 genomic DNA(gDNA) 추출 공정 중 분쇄 및 조직 균일화 공정은 beads(1.0mm Zirconium oxide beads)를 이용하는 조직파쇄기를 사용하고 곤충 크기에 따라 TL(Tissue Lysis) Buffer양을 다르게 사용하며 TL Buffer 사용은 homogenizing 전후에 하며 상등액 추출전 원심분리기로 spin down을 하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 상기 공정을 수행할 수 있다.
당업자는 식품에 곤충이 유입되어 죽은 것이 발견된 경우, 상기 곤충으로부터 gDNA를 수득하여, 이를 분석시료로 하여 Ct ratio (2)를 구하고, 이를 본 발명의 본 발명의 단계 4)에서 얻은 표준곡선에 적용하여 상기 분석시료인 곤충의 사멸일로부터 경과한 시간, 즉 상기 분석시료인 곤충이 상기 식품에 유입된 시간을 계산할 수 있다.
예컨대, 당업자는, 판매한 식품 등에 곤충(성충 및 유충 모두 포함)이 유입되었다고 클레임이 들어온 경우에 있어서, 본 발명을 실시하여 곤충 사후 경과일을 구하고, 상기 클레임이 들어온 제품의 제조 일자, 소비자의 제품 개봉일, 상기 제품의 수거일, 본 발명의 실시일 등의 기초 자료를 수집하여, 이를 상기 제품의 제조일, 도매상 및 소매상 등으로의 유통 스케쥴 등에 대입하여, 생산, 유통, 섭취 등의 단계 중 어느 단계에서 곤충이 유입되었는지를 확인할 수 있다.
본 발명을 실시하여, 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는데 있어서, 본 발명은 동물의 사체에 정량적 실시간 PCR로 검출할 만큼만 genomic DNA(gDNA)가 남아있으면 되기 때문에, 동물의 사멸일로부터 상당히 오랜 시간이 경과한 경우라도, 본 발명을 실시하여, 경과일을 계산하는 것이 가능하다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
곤충에서의 genomic DNA 의 추출
하기 실험예 1 내지 7에 있어서, 곤충들의 사체로부터 gDNA의 추출은 사체의 분쇄 및 조직 균일화 공정; 및 추출 공정을 통하여 수행되었으며, 그 자세한 방법은 하기와 같다.
먼저, 분쇄 및 조직 균일화 공정은 곤충사체가 담겨있는 1.5ml 튜브에 beads(1.0mm Zirconium oxide beads)양이 0.2ml를 넘지 않도록 넣은 후 TL(Tissue Lysis) Buffer를 하기 표 1과 같이 곤충 크기에 따라 1차로 넣어 주었다. 이후 조직파쇄기(Bullet Blender-24, NEXT ADVANCE사)를 이용하여 homogenizing을 1분 30초간 수행하였다. 그리고 완료한 샘플에 2차로 TL Buffer를 넣은 후 원심분리기로 spin down 후 상등액을 1.5ml 튜브에 취하였다. 한편, 추출 공정은 gDNA 추출 키트(바이오니아사)를 이용하여, 그 프로토콜 순서에 따라 진행하였다.
Figure 112011029528507-pat00001
프라이머의 제조
표지 유전자로는 18S rRNA를 선정하였으며, 이를 이용하여 프라이머를 제작하였다. 즉, 마크로젠 Oligo 서비스에 의뢰하여, 정량적 실시간 PCR을 위한 프라이머(프라이머의 서열: 서열번호 1 및 서열번호 2)를 제작하였으며, 프라이머 정제법은 MOPC 법을 사용하였다(Tm: 64.7 ℃).
<프라이머 정보>
18S_rt_f : GGC GAT YAG ATA CCG CCC TAG TT 23 mer(s)(서열번호 1)
18S_rt_r : CTT TGC AAC CAT ACT YCC CCC GG 23 mer(s)(서열번호 2)
정량적 실시간 PCR 조건
실험예 1 내지 7에서 수행한 정량적 실시간 PCR을 위한 샘플은 gDNA(Template DNA) 2ul, 증류수 4ul, 18S primer(f+r) 4ul, Hot Start PCR 2X master mix(Finnzyme 사) 10ul를 포함하는 총 20 ㎕를 한 튜브에 넣어 제조하였다.
한편 정량적 실시간 PCR의 처리 조건은 95℃ 15분을 처리하여 효소를 활성화 시킨 후 95 ℃ 20초, 62 ℃ 20초, 72 ℃ 20초를 1 cycle로 하여 45 cycles을 반복 수행하였다. 그리고 이때 수득한 증폭 곡선(도 1a)을 통하여 Ct 값(역치 사이클값)을 구하고 이후 melting curve 분석을 하여(도 1b) 표지 유전자인 18S rRNA 유전자가 제대로 증폭되었는지 확인하여, 본 실험을 진행하였다.
대조군으로는 각 실험예에서 실시한 곤충과 동종인 곤충을 맥주에 유입시키지 않고 희생(예컨대 실험예 1의 경우, 대조군인 곤충이 집파리이며, 실험예 2의 경우 대조군인 곤충은 꿀벌이다)시키고, 사멸 직후 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였으며, 대조군 역시 표지 유전자로는 18S rDNA를 사용하였다.
Ct ratio 의 계산
1. Ct ratio (1)은 하기의 식 1로 계산하였다.
<식 1>
Ct ratio(1) = (Cts-Ctc)/Ctc
Ctc: 대조군의 Ct값
Cts: 표준시료의 Ct값
2. Ct ratio (2)는 하기의 식 2로 계산하였다.
<식 2>
Ct ratio(2) = (Cta-Ctc)/Ctc
Ctc: 대조군의 Ct값
Cta: 분석시료의 Ct값
<실험예 1> 맥주 유입 집파리의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 집파리(House fly, Musca domestica)를 한 마리씩 집어넣은 후 25℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총부피는 50 ㎕로 정량화 하였으며, 이후 실험에 사용하기 위해 -20 ℃에 보관 하였다.
정량적 실시간 PCR 증폭곡선(도 2a) 및 melting curve(도 2b) 분석을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 확인할 수 있었으며, 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 2, 도 3a) 및 Ct ratio (1)(표 3, 도 3b)을 구하였다. 상기 Cts 값은 0 일차의 값이 평균 13.42의 값을 보였으며 날짜가 증가함에 따라 함께 증가하는 추세를 보였다. 이는 보관된 일수가 증가함에 따라 유전자의 양도 분해 되어 감소함을 보여주는 것이다. 상기 Ct ratio (1)은 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군인, 사멸 직후 수득한 집파리의 Ct값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 집파리의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 집파리를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
<식 1>
Ct ratio(1) = (Cts-Ctc)/Ctc
Ctc: 대조군의 Ct값
Cts: 표준시료의 Ct값
Figure 112011029528507-pat00002
집파리의 Ct값(상온조건)
Figure 112011029528507-pat00003
집파리의 Ct ratio(1) 값(상온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1)값 모두 시간 경과에 따른 유전자의 감소를 보여주고 있다(Ct값과 Ct ratio값이 클수록 유전자는 감소함.) Ct ratio (1)값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 상관도 R2은 0.985였으며 곤충 사후 경과일의 추정식은 Y=5.25X2+59.8X-13.7로 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충 사후 경과일).
통계처리결과 집단간 평균비교의 결과 각 집단간 유의 확률이 있으나 그 값은 낮으며 이는 각 반복별 평균이 95% 신뢰수준의 범위에서 중첩되는 구간이 있다는 것을 나타내지만 유의 확률이 낮으므로 향후 곤충의 유입시기 진단에 있어 더욱 정확한 데이터를 보여준다고 할 수 있다(유의수준=0.05). 표 4는 집파리 Duncan 사후검정 통계분석 결과(상온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00004
집파리 Duncan 사후검정 통계분석 결과(상온조건)
<실험예 2> 맥주 유입 꿀벌의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 꿀벌(Honey bee, Apis mellifera)을 한 마리씩 집어넣은 후 25℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총부피는 50ul로 정량화 하였으며, 이후 실험에 사용하기 위해 -20℃에 보관 하였다.
PCR 증폭곡선(도 4(a)) 및 melting curve분석(도 4(b))을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 확인할 수 있었으며, 시간에 따른 Ct값(Cts)(표 5, 도 5a) 및 Ct ratio (1) (표 6, 도 5b)을 구하였다(표 2). Ct값은 날짜가 증가함에 따라 함께 증가하는 추세를 보였으며 이는 보관된 일수의 증가에 따라 유전자의 양도 분해 되어 감소함을 알 수 있다. 상기 Ct ratio (1)는 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc는 대조군인 사멸 직후 수득한 꿀벌의 Ct값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 꿀벌의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 꿀벌을 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00005
꿀벌의 Ct값(상온조건)
Figure 112011029528507-pat00006
꿀벌의 Ct ratio (1)값(상온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1) 값 모두 시간 경과에 따른 유전자가 감소하는 경향을 보여주고 있다. Ct ratio (1) 값 및 Sigmaplot을 이용하여 회귀모델(regression model)을 적용하였을 때 상관도 R2은 0.97이었으며 곤충사후 경과일 추정식은 Y=1.69e5 .96X로 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일). 상기 추정식을 바탕으로 곤충 유입시기를 진단할 수 있었다. 표 7은 꿀벌의 Duncan 사후검정 통계분석 결과(상온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00007
꿀벌 Duncan 사후검정 통계분석 결과
실험예 3> 맥주 유입 초파리의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 초파리(Fruit fly, Drosophila melanogaster)를 한 마리씩 집어넣은 후 25℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총부피는 50ul로 정량화 하였으며, 이후 실험에 사용하기 위해 -20℃에 보관 하였다.
PCR 증폭곡선(도 6a) 및 melting curve분석(도 6b)을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 8, 도 7a) 및 Ct ratio (1) (표 9, 도 7b)을 구하였다. Ct 값 측정 결과 유전자의 분해 양상은 유입직후 3일까지 급격하게 분해 되는 양상을 보였으며 또한 동일날짜 샘플 간 변이가 큰 것으로 나타났다. 또한 상기 Ct ratio (1)은 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군인 사멸 직후 수득한 초파리의 Ct 값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 초파리의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 초파리를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00008
초파리의 Ct값(상온조건)
Figure 112011029528507-pat00009
초파리의 Ct ratio(1)값(상온조건)
상기의 Ct값(표19)과 Ct ratio (1)값(표20) 모두 10일까지 시간 경과에 따른 유전자가 감소하는 경향을 보여주고 있다. Ct ratio (1) 값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 상관도 R2은 0.927였으며, Ct ratio값을 적용한 곤충사후 경과일 추정식은 Y=290.15X2-214.25X+42.37로 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일). 표 10은 초파리의 Duncan사후검정 통계분석 결과(상온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00010
초파리 Duncan 사후검정 통계분석 결과
<실험예 4> 맥주 유입 화랑곡나방의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 화랑곡나방(Indian meal moth, Plodia interpunctella)을 한 마리씩 집어넣은 후 25℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총부피는 50ul로 정량화 하였으며, 이후 실험에 사용하기 위해 -20℃에 보관 하였다.
PCR 증폭곡선(도 8a) 및 melting curve분석(도 8b)을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 확인할 수 있었으며, 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 11, 도 9a) 및 Ct ratio (1) (표 12, 도 9b)을 구하였다. 상기 Ct ratio (1)은 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군인 사멸 직후 수득한 화랑곡나방의 Ct값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 화랑곡나방의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 화랑곡나방을 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00011
화랑곡나방의 Ct값(상온조건)
Figure 112011029528507-pat00012
화랑곡나방의 Ct ratio(1)값(상온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1)값에서 알 수 있듯이 맥주 유입 후 3일 까지 많은 양의 유전자가 분해 되며 이후 유전자는 서서히 분해 됨을 알 수 있다. Ct ratio (1) 값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 상관도 R2은 0.7995였으며, 곤충사후 경과일 추정식은 Y=1.05e3 .05X로 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일). 표 13은 화랑곡나방의 Duncan사후검정 통계분석 결과(상온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00013
화랑곡나방의 Duncan 사후검정 통계분석 결과
<실험예 5> 맥주 유입 독일바퀴의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 독일바퀴(Cockroach, Blattella germanica)를 한 마리씩 집어넣은 후 25℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총부피는 50ul로 정량화 하였으며, 이후 실험에 사용하기 위해 -20℃에 보관 하였다.
PCR 증폭곡선(도 10a) 및 melting curve분석(도 10b)을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 확인할 수 있었으며, 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 14, 도 11a) 및 Ct ratio (1) (표 15, 도 11b)을 구하였다. 상기 Ct ratio (1)은 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군인 사멸 직후 수득한 독일바퀴의 Ct값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 독일바퀴의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 독일바퀴를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00014
독일바퀴의 Ct값(상온조건)
Figure 112011029528507-pat00015
독일바퀴의 Ct ratio (1)값(상온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1) 값에서 알 수 있듯이 3일차와 7일차까지 많은 양의 유전자가 분해 되었으며 7일 이후 45일 까지 유전자 분해가 서서히 이루어짐을 알 수 있다. 이 후 60일 차에서 거의 대부분의 유전자가 분해 되었음을 보여준다. Ct ratio값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 곤충사후 경과일 추정식은 Y=61.2/(1+exp(-(X-0.4)/0.06))로 도출되었으며(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일), 상관도 R2은 0.7995이었다. 상기 추정식을 바탕으로 곤충 유입시기를 진단할 수 있었다. 표 16은 독일바퀴의 Duncan사후검정 통계분석 결과(상온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00016
독일바퀴의 Duncan 사후검정 통계분석 결과
<실험예 6> 맥주 보관 온도에 따른 곤충의 유입시기 진단
실험예 6 에서는 곤충이 유입된 맥주를 서로 다른 온도 조건에서 보관 후, 보관 온도에 따른 유입시기 진단을 실시하였다.
<6-1> 맥주 유입 집파리의 저온보관(4℃) 조건에서의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 집파리(House fly, Musca domestica)를 한 마리씩 집어넣은 후 4 ℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일 10일, 14일, 21일 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총 부피는 50ul로 정량화 하였다.
실시간 PCR 증폭곡선(도 12a) 및 melting curve(도 12b) 분석을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 17, 도 13a) 및 Ct ratio (1) (표 18, 도 13b)을 구하였다. 상기 Ct 값은 날짜가 증가함에 따라 함께 증가하는 추세를 보였는데, 보관된 일수가 증가함에 따라 유전자의 양도 분해 되어 감소함을 보여주는 것이다. 상기 Ct ratio (1)은 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군의 사멸 직후 수득한 집파리의 Ct 값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 집파리의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct 값이다. 상기 대조군은 집파리를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00017
집파리의 Ct값(저온조건)
Figure 112011029528507-pat00018
집파리의 Ct ratio (1) 값(저온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1) 값 모두 시간 경과에 따른 유전자의 감소를 보여주고 있다. Ct ratio (1) 값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 상관도 R2은 0.789이었으며 Ct ratio (1) 값을 적용한 곤충사후 경과일 추정식은 Y=exp(3.4×(X+0.4))로 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일). 이 추정식을 바탕으로 저온에서 유입된 곤충의 유입시기를 진단할 수 있다. 표 19는 집파리의 Duncan사후검정 통계분석 결과(저온조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00019
집파리 Duncan 사후검정 통계분석 결과(저온조건)
<6-2> 맥주 유입 집파리의 고온보관(37℃) 조건에서의 유입시기 진단
병맥주(500ml)에 각각 집파리(House fly, Musca domestica)를 한 마리씩 집어넣은 후 37 ℃에 보관하였다(4회 반복 실험). 이후 공시된 날짜(0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 30일)에 곤충을 수거하여 1.5ml 튜브에 개별적으로 넣은 후 -80℃에서 보관하였다. 수거된 곤충들은 30일차가 끝난 다음 일괄적으로 gDNA를 추출하였고 추출된 gDNA의 총 부피는 50ul로 정량화 하였다.
실시간 PCR 증폭곡선(도 14a) 및 melting curve(표14b) 분석을 통해 PCR이 문제없이 수행되었음을 확인할 수 있었으며, 시간에 따른 Ct 값(Cts)(표 20, 도 15a) 및 Ct ratio (1) (표 21, 도 15b)을 구하였다. Ct 값이 3일 이후 상온조건 보다 조금 더 큰 값이 확인되었으며 이는 고온에서 gDNA가 평균적으로 더 많이 분해됨을 보여주는 것이다. 상기 Ct ratio (1)은 상기 식 1에 따라 구하였다. 이때, Ctc은 대조군인 사멸 직후 수득한 집파리의 Ct값이며, Cts는 표준시료인 맥주 유입 집파리의 맥주 내 보관 시간에 따른 Ct값이다. 상기 대조군은 집파리를 맥주에 유입시키지 않고 희생시킨 후, 희생 직후 이를 수거하고 이로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다.
Figure 112011029528507-pat00020
집파리의 Ct값(고온조건)
Figure 112011029528507-pat00021
집파리의 Ct ratio (1) 값(고온조건)
상기의 Ct값과 Ct ratio (1) 값 모두 시간 경과에 따른 유전자의 감소를 보여주고 있다. Ct ratio (1) 값을 Sigmaplot을 이용하여 회귀모형(regression model)을 적용한 결과, 상관도 R2은 0.9682의 값을 얻을 수 있었으며 Ct ratio (1) 값을 적용한 곤충사후 경과일 추정식은 Y=45.4X-12.4의 1차식이 도출되었다(X=Ct ratio, Y=곤충사후 경과일). 이 추정식을 바탕으로 곤충 유입시기를 진단할 수 있다. 표 22는 집파리의 Duncan사후검정 통계분석 결과(고온 조건)를 나타낸다.
Figure 112011029528507-pat00022
집파리 Duncan 사후검정 통계분석 결과(고온조건)
<실험예 7> 곤충 유입일의 계산
<7-1> 맥주에 유입된 집파리의 사후 경과일 계산
상온 보관된 병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 집파리(분석시료)를 수집하고, 이를 이용하여 상기 집파리의 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 집파리를 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 13.42이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 집파리의 Ct값(Cta)은 22.32 였는바, 집파리의 Ct ratio (2)는 0.66이었다.
한편, 상기 실험예 1의 집파리 상온 표준식에서 도출된 Y=5.25X2+59.8X-13.7 (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 분석시료인 집파리는 맥주에 유입된 후 약 28.3일(곤충 사후 경과일)이 경과한 것으로 나타났다.
<7-2> 맥주에 유입된 꿀벌의 사후 경과일 계산
상온 보관된 병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 꿀벌(분석시료)을 수집하고, 이를 이용하여 상기 꿀벌의 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 꿀벌을 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 16.67이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 집파리의 Ct값(Cta)은 21.55였는바, 꿀벌의 Ct ratio (2)는 0.29이었다.
따라서, 상기 실험예 2의 꿀벌 상온 표준식에서 도출된 Y=1.69e5 .96X (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 분석시료인 꿀벌은 맥주에 유입된 후 약 9.7일(곤충 사후 경과일)이 경과한 것으로 나타났다.
<7-3> 맥주 유입 초파리의 사후 경과일 계산
상온 보관된 병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 초파리(분석시료)를 수집하고, 이를 이용하여 상기 초파리의 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 초파리를 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 16.87이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 초파리의 Ct값(Cta)은 25.46였는바, 초파리의 Ct ratio (2)는 0.51이었다. 따라서, 실험예 3의 초파리 표준식에서 도출된 Y=290.15X2-214.25X+42.37 (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 분석시료인 초파리는 맥주에 유입된 후 약 8.5일이 경과한 것(곤충 사후 경과일)으로 나타났다.
<7-4> 맥주에 유입된 화랑곡나방의 사후 경과일 계산
상온 보관된 병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 화랑곡나방(분석시료)를 수집하고, 이를 이용하여 상기 화랑곡나방의 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 화랑곡나방을 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 12.55이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 화랑곡나방의 Ct값(Cta)은 22.00였는바, 화랑곡나방의 Ct ratio (2)는 0.75이었다. 따라서, 실험예 4의 화랑곡나방 표준식에서 도출된 Y=1.05e3 .05x (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 분석시료인 화랑곡나비는 맥주에 유입되어 사멸한 후 약 10.4일이 경과한 것(곤충 사후 경과일)으로 나타났다.
<7-5> 맥주에 유입된 독일바퀴의 사후 경과일 계산
상온 보관된 병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 독일바퀴(분석시료)를 수집하고, 이를 이용하여 상기 독일바퀴의 맥주 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 독일바퀴를 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 14.43이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 독일바퀴의 Ct값(Cta)은 20.29였는바, 독일바퀴의 Ct ratio (2)는 0.41이었다. 따라서, 실험예 5의 독일바퀴 표준식에서 도출된 Y=61.2/(1+exp(-(x-0.4)/0.06)) (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 분석시료인 독일바퀴는 맥주에 유입되어 사멸한 후 약 32.1일이 경과한 것(곤충 사후 경과일)으로 나타났다.
<7-6> 저온 보관 맥주에 유입된 집파리의 사후 경과일 계산
병맥주(500ml)에서, 상기 병맥주에 유입된 집파리(분석시료)를 수집하고, 이를 이용하여 상기 집파리의 유입일을 계산하였다. 이때, 상기 병맥주는 저온 보관된 것으로 가정하고, 저온 보관 시 집파리의 유입일을 계산하였다. 분석시료의 수집일과 동일자에 집파리를 맥주 유입 없이 희생시켜 대조군으로 하고, 그 Ct값을 측정하였다. 그 결과, 대조군의 Ct 값(Ctc)는 13.42이었다. 한편, 분석시료인 맥주에 보관된 집파리의 Ct값(Cta)은 22.32였는바, 집파리의 Ct ratio (2)는 0.66이었다. 상기 실험예 6의 <6-1>의 집파리 저온 표준식에서 도출된 Y = exp(3.4×(X+0.4)) (X = Ct ratio, Y = 곤충 사후 경과일)에 상기 Ct ratio (2)를 대입한 결과, 상기 맥주가 저온에서 보관된 경우라면, 분석시료인 집파리는 맥주에 유입되어 사멸한 후 약 37.1일이 경과한 것(곤충 사후 경과일)으로 나타났다.
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Claims (10)

1) 대조군의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 대조군의 표지 유전자의 Ct 값인 Ctc를 구하는 단계;
2) 표준시료의 사멸일로부터 특정 시간이 경과한 후, 표준시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여, 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 표준시료의 표지 유전자의 Ct 값을 구하되, 상기 사멸일로부터의 경과 시간을 달리하여, 경과 시간에 따른 표준시료의 표지 유전자의 Ct값인 Cts들을 구하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 구한 Ctc 및 상기 단계 2)에서 구한 Cts를 이용하여 하기 식 1의 Ct ratio (1)을 계산하는 단계;및

<식 1>
Ct ratio(1) = (Cts-Ctc)/Ctc

4) 상기 단계 3)에서 계산한 Ct ratio(1)을 이용하여 표준곡선을 구하는 단계를 포함하며, 상기 대조군 및 표준시료는 동종인, 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법.
제 1항에 있어서,
5) 분석시료의 표지 유전자에 대하여 정량적 실시간 PCR을 수행하여 상기 정량적 실시간 PCR 결과로부터 분석시료의 표지 유전자의 Ct 값인 Cta를 구하는 단계;
6) 상기 단계 1)에서 구 하거나, 또는 상기 단계 5)의 수행 시에 상기 단계 1)을 재수행하여 구한 대조군의 Ctc 및 상기 단계 5)에서 구한 분석시료의 Cta를 이용하여 하기 식 2의 Ct ratio (2)를 계산하는 단계;및

<식 2>
Ct ratio(2) = (Cta-Ctc)/Ctc

7) 상기 단계 6)에서 계산한 Ct ratio (2)를 상기 단계 4)에서 구한 표준곡선에 적용하여 분석시료의 사멸일로부터의 경과일을 확인하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 분석시료는 대조군 및 표준시료와 동종인, 동물의 사멸일로부터의 경과일을 계산하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 동물은 곤충인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 단계 4)의 표준곡선은 Ct ratio(1)을 변수로 갖는 함수식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 단계 4)의 표준곡선은 Ct ratio(1)을 변수로 갖는 함수식으로 표현되고,
상기 단계 7)은 상기 단계 4)의 표준곡선의 함수식에 Ct ratio (1) 대신 Ct ratio (2)를 입력하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 표준시료 또는 분석시료는 식품에 유입된 곤충인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 대조군은 사멸 후 1일 이내인 동물인 것을 특징으로 하는 방법.

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