KR20090105817A

KR20090105817A - 식물성 펩톤을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20090105817A
Application number: KR1020090022894A
Authority: KR
Inventors: 박덕훈; 이지현; 이종성
Original assignee: 바이오스펙트럼 주식회사
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-03-18
Publication date: 2009-10-07
Also published as: WO2009145419A9; EP2280064A4; KR20110059832A; KR101220239B1; KR101181911B1; US20110028404A1; WO2009145419A3; EP2280064A2; WO2009145419A2

Abstract

본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 조성물, 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 무혈청 줄기세포 배양용 조성물은 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있고, 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단할 수 있다. 또한, 본 발명의 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포증식 촉진능 및 활성화능을 가지므로 다양한 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.

줄기세포, 무혈청 배지, 식물성 펩톤, 피부상태개선, 주름개선, 항노화

Description

식물성 펩톤을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물{Composition for Promoting Stem Cell Proliferation Comprising Vegetable Peptone}

본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 배지, 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 및 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

생물의약품의 여러 생산기술 가운데 하나인 동물세포 산업화 기술은 유전자가 조작된 인간 및 동물세포를 대량으로 배양하여 고부가가치의 생물의약품을 생산하는 기술로 각광받고 있으며, 최근 유전자 치료(gene therapy) 및 세포 치료(cell therapy) 기법의 개발로 인해 산업화 기술로서의 중요성이 더욱 강조되고 있다. 일반적으로 동물세포 유래 의약품 생산 공정 개발은 생산 제품의 안전성 확보와 세포 생산성에 의한 높은 생산비의 절감 등에 역점을 두고 있다. 현재까지 사용되고 있 는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 하며 가장 널리 사용되는 혈청으로 Fetal Bovine Serum (FBS) 나 Fetal Calf Serum (FCS)이 있다. 이들 첨가 성분의 기능은 명확하진 않지만 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 성분이 배제된 경우에는 세포배양 자체가 거의 안 되는 필수 성분이다. 그러나 고가의 혈청은 배지가격을 상승시키고 또한 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 혈청은 동물 유래이기 때문에 배양과정 중에 세포들이 바이러스나 감염성 프리온 등에 오염될 가능성이 상존한다. 소혈청에 감염된 프리온은 사람에게 그대로 전이될 수 있으므로 동물세포 배양은 여러 가지 안전장치를 하고 있음에도 여전히 감염가능성은 존재한다고 해야 할 것이다. 통상 혈청 사용시 다음과 같은 문제점을 수반한다: i) 혈청의 조성 변이 때문에 세포에 대한 성장촉진 능력에 있어서 변이가 크다; ii) 인간에게 사용될 세포 생산물의 제조 시, 혈청이 감염물질에 의한 오염 잠재성을 가지고 있다; iii) 상업적으로 제조된 FBS나 FCS에서 박테리오파아지(bacteriophage)와 보바인 바이러스(bovine virus)가 검출된다; iv) 박테리아 오염 때문에 생긴 각종 독소(toxin)로 인해 세포배양 억제 물질도 함유된다; v) 여과(filteration) 전에는 오염으로 인한 세균성 독소(bacterial toxin)가 존재한다; vi) 세포배양에 있어 생물학적 오염원(mycoplasmas, bacteriophages, viruses)이 되기도 한다; vii) 감마-글로불린 분획에 배양액과 교차반응(cross reaction)하는 항체 및 세균이 분 비한 독소를 함유한다; viii) 열 불활성화(heat inactivation)은 면역글로불린의 세포독성(cytotoxin) 작용을 감소시키지만 불안정한 구성물질까지 파괴되어 열처리하지 않은 혈청보다 만족한 결과가 항상 나타나는 것은 아니다; ix) 혈청 단백질의 흡착/결합에 의한 세포표면의 변형이 유도된다; x) 세포생산물의 분리 시 방해의 원인이 된다; xi) 1차 배양시에 섬유아세포의 과도한 성장이 조장된다.

1950년대에 합성배지로 자연배지를 부분적으로 대치할 수 있다고 보고된 이후로 혈청 없이 세포배양을 하려는 시도를 하게 되었고, 현재는 특정목적을 위하여 일부의 경우에 혈청없이 세포배양을 하고 있다. 그러나, 이들 무혈청배지는 특정세포만 잘 자라게 하고 혈청 대신에 사용하는 단백질성 세포성장인자 등이 너무 고가인데다 혈청을 포함한 배지에서보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못하다고 보고되고 있다. 또한 무혈청배지는 줄기세포의 배양에는 적용이 불가능한 것으로 알려져 있다. 줄기세포를 상업적으로 이용한 분야에서 가장 중요한 분야가 세포치료제로써 인체에서 얻어진 줄기세포를 시험관에서 배양한 후 다시 환자에게 투입하는 방식의 치료기술이다. 이러한 분야에서는 반드시 줄기세포 배양과정을 거치게 되는데 가능한한 동물성배지나 혈청을 피하는 것이 중요하다. 질병 치료 목적으로 줄기세포 이식하는 경우 얻는 치료 이득을 고려할 때 이에 따르는 감염 위험은 감수될 수 있으나, 미용목적의 시술인 경우에는 줄기세포 등의 이식으로 얻어지는 이득보다 감염위험에 노출되는 위험이 더 크게 부각될 수 있다. 따라서 줄기세포 배양분야에서 동물성 혈청대체제를 찾는 일은 상업적으로 매우 의미있다.

한편, 피부에 존재하는 줄기세포는 피부의 건강과 직결된 전체적인 역할을 담당하고 있어 피부건강과 관련하여 가장 중요한 세포군이라 할 수 있다. 줄기세포들은 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 즉 피부의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열능력이 떨어지고 점차 비활성화됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질을 식물성 소재로부터 찾기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과 식물성 펩톤이 동물성 혈청을 대체 가능한 정도로 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배양용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청(serum free) 줄기세포배양용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 배지에 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식 을 촉진할 수 있는 물질을 식물성 소재로부터 찾기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과 식물성 펩톤이 동물성 혈청을 대체 가능한 정도로 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 식물성 펩톤을 포함하며 동물성 혈청을 포함하지 않는 무혈청 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

상기 식물성 펩톤은 줄기세포의 증식 촉진능이 매우 우수하므로 동물성 혈청이 포함되지 않은 무혈청 줄기세포 배지에서 동물성 혈청 대체제로 사용될 수 있다.

상기 무혈청 줄기세포 배양용 배지 조성물에 포함되는 식물성 펩톤의 함유량은 줄기세포의 증식을 촉진하는 적합한 양으로 선택하여 사용할 수 있고 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 0.1-10％(g/㎖)의 범위이며 가장 바람직하게는 0.5-2％(g/㎖)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에 감소된 양의 동물성 혈청이 추가로 포함된다.

본 발명의 조성물에는 혈청대체제로서 식물성 펩톤이 포함되어 있기 때문에 줄기세포 배지에 첨가되는 동물성 혈청의 통상적인 양 보다 감소된 양이 포함되어도 줄기세포 배양에 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 감소된 양은 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 통상적인 동물성 혈청의 양의 1/2 이하의 양이다.

본 명세서에서 용어 "식물성 펩톤"은 식물로부터 얻은 단백질의 분해 산물을 의미한다. 예를 들어 대두 펩톤(soy peptone)은 대두(soy)로부터 얻은 총단백질을 분해하여 얻은 산물을 의미한다. 상기 식물성 단백질의 분해는 바람직하게는 부분적 분해(partial digest)에 의해 행해진다. 상기 단백질의 분해는 바람직하게는 산처리, 염기처리, 효소처리, 고압처리, 열처리 또는 물리적 처리에 의한 분해를 통해 행해진다. 상기 물리적 처리는 예컨대 그라인딩(grinding)이다.

본 발명에서의 식물성 펩톤은 식물성 단백질의 부분적 분해 산물로서, 단분자인 아미노산 뿐만 아니라, 수개 내지 수십개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드와 온전한 단백질 분자가 모두 포함되어 있는 혼합물 형태이다.

본 발명의 식물성 펩톤이 얻어지는 식물의 원천은 특별히 한정되지 않으며, 줄기세포 증식을 촉진하는 능력을 갖는다면 어떠한 식물로부터 유래된 펩톤이라도 모두 포함된다.

바람직하게는 본 발명의 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤 (papaic soy peptone) 또는 루핀 펩톤(lupin peptone) 이며, 가장 바람직하게는 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤이다.

본 발명은 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

식물성 펩톤은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에 이를 인체에 적용하는 경우 피부에 존재하는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있다. 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄 기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 식물성 펩톤은 상기 조성물 전체에 대해 0.01-30 중량％로 함유된다. 식물성 펩톤의 함유량이 전체 조성물에 대해 0.01 중량％ 미만이면 피부 상태 개선 효과를 볼 수 없고, 30 중량％를 초과하여 포함되면 증가되는 함유량에 비해 증가된 개선 효과를 얻기 어려우며 제조 비용이 증가하는 단점이 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물에 유효성분으로 포함되는 식물성 펩톤은 본 발명의 상기에서 설명된 다른 발명인 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에서 설명된 것과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부주름의 개선, 피부노화의 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 효능, 피부 재생 효능을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름, 또는 건선이다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명이 기능성 식품 조성물의 형태로 제공되는 경우 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분인 식물성 펩톤 이외 에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 피부상태 개선 용도로 매우 유용하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부에 직접 적용되는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.

본 발명은 식물성 펩톤을 포함하며 동물성 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 후에, 배양된 줄기세포를 배양액으로부터 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

상기 배양하는 줄기세포는 특정의 줄기세포로 한정되지 않으며 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 성체줄기세포(adult stem cell)를 모두 포함하나, 바람직하게는 포유동물유래의 성체줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 성체줄기세포이며, 가장 바람직하게는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포(human cord blood-derived stem cells, CB-MSCs), 피부 유래 줄기세포, 또는 인간 지방유래 줄기세포(human aipose-derived stem cells, ADSCs) 이다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 스스로 세포분열할 수 있고 매 우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "성체줄기세포"는 배아발달단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 분화되지 않고 줄기세포로서, 세포분열에 의해 증식하여 사멸된 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)을 가지고 있다. 본 발명에서 줄기세포 배양 시에 성체줄기세포를 사용하면 줄기세포배양액을 인체에 적용하는 경우 안전성을 확보하고 부작용을 최소화할 수 있는 유리한 점이 있다.

본 발명의 식물성 펩톤 함유 무혈청 배지에 줄기세포를 배양한 후 줄기세포를 제거하는 방법은 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 줄기세포를 배양한 후 세포배양액을 회수하고, 회수된 배양액을 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과함으로써 줄기세포가 제거된 배양액을 얻을 수 있다. 마이크로 필터의 세공 크기(pore size)는 줄기세포를 제거할 수 있는 크기 내에서 적절하게 선택할 수 있고, 바람직하게는 0.1-10 μm 이다.

상기 무혈청 줄기세포 배양용 배지 조성물에 포함되는 식물성 펩톤의 함유량은 줄기세포의 증식을 촉진하는 데 적합한 양으로 선택하여 사용할 수 있고 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 배지 조성물에 대해 0.1-10％(g/㎖)의 범위이며 가장 바람직하게는 0.5-2％(g/㎖)이다.

상기 줄기세포를 배양한 후 이를 제거한 배양액에는 동물성 혈청으로부터 유 래될 수 있는 다양한 생물학적 오염물, 예를 들어 동물성 세균, 동물성 바이러스 뿐만 아니라 프리온(prion)이나 독소(toxin)와 같은 단백질 등이 포함되어 있지 않으므로 배양액을 인체에 적용하는 경우 상기 오염물에 의한 감염 또는 독성 문제를 원천적으로 해결할 수 있다.

본 발명의 줄기세포를 배양한 배양액에는 줄기세포로부터 분비되어 다양한 생리활성물질(예를 들어 줄기세포 증식 또는 활성화 촉진능을 갖는 사이토카인)이 함유되어 있으므로, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 인체에 적용하는 경우 인체에 존재하는 성체 줄기세포의 증식 촉진 또는 활성화를 통해 피부 상태를 개선하는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물이 활성화 또는 증식 촉진시키는 피부 존재 성체 줄기세포는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 줄기세포배양액은 피부상태 개선용 조성물 전체에 대해 0.01-30 중량％로 함유된다. 줄기세포배양액의 함유량이 전체 조성물에 대해 0.01 중량％ 미만이면 피부 상태 개선 효과를 볼 수 없고, 30 중량％를 초과하여 포함되면 증가되는 함유량에 비해 증가된 개선 효과를 얻기 어려우며 제조 비용이 증가하는 단점이 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물에 유효성분으로 포함되는 식물성 펩톤은 본 발명의 상기 설명한 다른 발명인 무혈청 줄기세포 배양용 조성물에서 설명된 것 과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부주름의 개선, 피부노화의 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 및 피부 재생 효능 등을 포함한다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명이 기능성 식품 조성물의 형태로 제공되는 경우 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 피부상태 개선 용도로 매우 유용하다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방 산 에스테르가 있다.

본 발명의 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 줄기세포 배양용 조성물은 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있고, 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 줄기세포를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포의 증식촉진능 및 활성화능을 가지므로, 염증성 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 및 피부 재생 효능 등의 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 식물성 펩톤 함유 무혈청배지에서 줄기세포의 세포생존능 측정

세포, 배지 및 배양방법

본 발명자들은 줄기세포배양용 혈청대체제를 찾기 위해 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하면서 배지에 식물성 물질을 첨가하여 양호한 줄기세포 성장이 이루어지는 물질들을 스크리닝하였다.

본 발명자들은 펩톤의 기원, 아미노산 함량 및 올리고펩티드 분자량 분포에 기초하여 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤(papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone)의 7가지의 펩톤을 선정하여 실험에 사용하였다.

줄기세포로는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포와 인간 지방유래 줄기세포를 사용하였다.

인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(Human cord blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)는 포천중문 의과대학교(한국, 경기도 성남)로부터 얻었다. 세포들은 저농도의 글루코오스를 포함하고, 15％ FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)에서 37℃ 온도조건에서 배양하였다. 배지는 세포들이 컨플루언시(confluency)에 도달할 때 까지 3일 마다 교체하였다. 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ADSCs)는 Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. 동결보존된 세포들을 37℃에서 녹인 후 곧 바로 MesenPRO RS^TM 배지(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 이어서, 세포들을 MesenPRO RS^TM 배지를 이용하여 증식시켰다.

대두 펩톤, 밀 펩톤, 잠두 펩톤, 감자 펩톤 및 완두콩 펩톤은 Fluka (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France)로부터 구입하였고, 파파익 대두 펩톤과 루핀 펩톤은 Solabia (Pantin 93698 Cedex, France)으로부터 구입하였다. 펩톤은 0.2μm 직경을 가진 멤브레인 필터를 통해 여과한 후, 1％ 펩톤의 무혈청 DMEM 배지를 제조하는데 사용하였다. 음성 대조군인 무혈청 조건 시험군에서는 세포 배양 배지를 무혈청 DMEM (Cat. 11885, Invitrogen)으로 교체하였다. 양성 대조군으로는 세포를 15％ FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

세포생존능(cell viability) 측정

세포생존능은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석을 통해 측정하였다. MTT 분석은 테트라졸륨환(tetrazolium ring)을 포함하는 기질(substrate)이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것에 기초한 분석방법이다. 청색 포르마잔의 수준을 분광학적으로 측정한 후 이를 세포밀도의 간접적인 지표로 사용하였다. 간략하게 설명하면, 세포들을 37℃에서 MTT (1 mg/㎖)에 3 시간 동안 노출시킨 후, 배지를 제거하고 세포들을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 완전 용해된 후 청색 포르마잔의 존재는 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 분광학적으로 측정하였다.

MTT 분석법을 사용하여 성체 줄기세포의 증식에 미치는 펩톤의 영향을 평가한 결과, 여러 가지 식물성 펩톤 중에서도 2 가지 펩톤인 완두콩 펩톤(pea peptone) 및 밀 펩톤(wheat peptone)이 성체줄기세포의 증식을 현저히 유도함을 확인하였다(도 1a). 완두콩 펩톤 및 밀 펩톤이 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)의 성장률을 각각 25％ 및 20％로 현저히 증가시켰고(도 1b의 패널 A), 이와 유사하게, 완두콩 펩톤 및 밀 펩톤은 지방 유래 줄기세포(ADSCs)의 세포 성장률도 각각 20％ 및 25％ 증가시켰다(도 1b의 패널 B).

세포증식(cell proliferation) 평가

완두콩 펩톤 및 밀 펩톤이 줄기세포 생존능에 대해 미치는 효과는 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포에(CB-MSCs)에 대한 세포증식 평가 실험으로 추가적으로 확인하였다.

세포 증식을 평가하는 방법은 DNA 합성동안에 ³H 티미딘(thymidine) 또는 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine, BrdU)과 같은 티미딘 유사체의 혼입을 측정하는 것에 기초하여 행하였다. Click-iT^TM EdU 유세포 분석 키트는 BrdU 분석법(Molecular Probes, Eugene, OR)을 대체하는 새로운 방법이다. 이 방법에서는 항체 기반 검출 대상이 활동적인 DNA 합성 동안에 DNA로 혼입되는 종전 뉴클레오시드 유사체인 BrdU 대신에 티미딘(thymidine)에 대한 뉴클레오시드 유사체인 Edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)으로 교체된 방법이다.

간략히 설명하면, 세포들을 EdU와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 동일한 세포군으로부터 얻은 세포들은 EdU로 처리하지 않았다. 인큐베이션 후에, 샘플들을 FACS Vantage flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 모든 분석들은 제조자의 지시 프로토콜에 따랐다.

중간엽줄기세포에(CB-MSCs)에 대한 세포증식 평가 실험 결과, 도 2에서 나타 낸 바와 같이, 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤으로 처리된 그룹의 중간값(median value)은 무혈청 그룹과 비교하여 오른쪽으로 이동되어 있다(중간값이 3.08의 값에서 7.23 및 7.30의 값으로 각각 이동하였다).

실험 결과의 시사

상기 결과들을 종합하면, 식물성 펩톤이 동물성 기원의 성분이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 배양되는 줄기세포의 증식에 효과적으로 기여할 수 있다는 것을 제시하였다.

실시예 2: 식물성 펩톤의 조성과 특성

본 발명에서 선발된 완두콩 펩톤과 밀 펩톤의 물리화학적인 특성을 조사하였다. 물리적 특성은 통상의 실험실에서 사용하는 방법에 준하여 실시하였으며 미생물실험 역시 통상의 방법에 따라 수행하였다. 아미노산 조성은 일반적으로 사용되는 아미노산 분석기를 사용하였다.

완두콩 펩톤(Pea peptone)

a. 물리적 특성(Physical properties)은 다음과 같았다: 외양(appearance)은 밝은 갈색 파우더이고, 안정성(stability)은 2％ 용액에서 안정적이었으며, 용해성(solubility)으로서 전체 용액의 5％ 이내에서 용해되었다.

b. 미생물학적 특징 (Microbiological controls)은 호기성/중온성 flora(total aerobic mesophilic flora) ≤≤ 5000 cfu/g 이었다.

c. 아미노산 함량(Amino acid distribution, mg/g)은 다음 표 1과 같았다.

[표 1]

밀 펩톤( Wheat peptone )

a. 물리적 특성은 다음과 같았다: 외양은 베이지 파우더이었고, 안정성은 2％ 용액에서 안정적이었으며, 용해성(solubility)으로서 전체 용액의 5％ 이내에서 용해되었다.

c. 아미노산 함량(Amino acid distribution, mg/g)은 다음 표 2와 같았다.

[표 2]

실시예 3: 식물성 펩톤 함유 무혈청배지에서 동물세포의 세포생존능 측정

본 실시예에서는 식물성 펩톤이 다른 동물세포들의 증식도 촉진할 수 있는 지를 알아 보기 위해, 인간각질세포인 HaCaT과 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast)인 NIH3T3 세포를 식물성 펩톤이 함유된 무혈청 배지에 배양하여 이들 세포생존능에 미치는 효과를 관찰하였다.

본 실시예의 실험은 다음과 같이 실시하였다. 5％ CO₂및37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 HaCaT와 NIH3T3 세포 3 x 10⁵을 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 각각 무혈청조건과, 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청조건으로 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하여 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다.

하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 정상군(혈청 포함)을 100％로 환산하였을 시, 무혈청조건(54％)에 비해 완두콩 펩톤 및 밀 펩톤이 각각 첨가된 조건에서 70％ 이상의 세포생존율 증가를 보여 밀펩톤 및 완두콩펩톤이 줄기세포뿐만 아니라 일반 세포의 세포증식을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[표 3]

실시예 4: 식물성 펩톤 함유 무혈청배지에서 줄기세포 배양시 성장촉진인자의 발현 프로파일 변화 조사

상기 실시예 1에서 완두콩 펩톤과 밀 펩톤이 성체 줄기세포의 증식을 촉진한다는 것을 실험을 통해 확인하였다. 추가적으로 식물성 펩톤이 줄기세포의 증식에 어떠한 메카니즘을 통해 영향을 미치는지 확인하였다.

성체줄기세포의 배양시 완두콩 펩톤 및 밀 펩톤 존재의 경우 식물성 펩톤에 반응하여 EGF, FGF-2, Flt-3 ligand, G-CSF, GM-CSF, TGF-β1, IL-3, IL-6, IL-8, TNF-α 및 VEGF 등의 사이토카인들의 발현 프로파일에 어떠한 변화가 유도되는지를 확인하였다.

5％ CO₂및37 ℃ 하에서 15％의 FBS와 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양한 성체줄기세포(인간 탯줄혈액유래 중간엽 줄기세포 또는 인간 지방유래 줄기세포) 3 X 10⁵개를 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 후, 무혈청조건 및 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤)이 첨가된 무혈청 조건으로 각각 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간 경과한 후, 사이토카인을 정량하기 위해, 펩톤을 첨가하여 줄기세포를 배양한 배양 상등액을 MILLIPLEXTM Human Cytokine Kit (Millipore, St. Charles, MO, USA)를 사용하여 제조자 지시 프로토콜에 따라 사이토카인 분석을 행하였다.

도 3a - 도 3d에 나타난 바와 같이, 식물성 펩톤 존재하에 성체줄기세포를 배양한 경우 사이토카인 VEGF, TGF-β1 및 IL-6의 생성량이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 3a 및 도 3b에 나타난 구체적 결과에서, 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSC)를 완두콩 펩톤으로 처리한 경우 VEGF는 생성량은 678 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 8.83 ± 1.689 배 증가하였고, TGF-β1의 생성량은 485 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 3.79 ± 0.195 배 증가하였으며, IL-6의 생성량은 332 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 2.55 ± 0.217 배 증가하였다. 한편, 밀 펩톤으로 처리한 경우는 VEGF는 생성량은 1019 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 13.27 ± 1.447 배 증가하였고, TGF-β1의 생성량은 387 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 3.02 ± 0.234 배 증가하였다. 그러나, 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포를 밀 펩 톤으로 처리한 경우 IL-6의 생성량에는 변화가 없었다.

도 3c 및 도 3d에 나타난 결과에서, 인간 지방유래 줄기세포를 완두콩 펩톤으로 처리한 경우 VEGF는 생성량은 122 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 6.70 ± 0.280배 증가하였고, TGF-β1의 생성량은 194 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 5.78 ± 0.445배 증가하였으며, IL-6의 생성량은 166 pg/㎖으로서 1.11 ± 0.080배 증가하였다. 또한, 인간 지방유래 줄기세포를 밀 펩톤으로 처리한 경우는 VEGF는 생성량은 172 pg/㎖으로서 비처리대조군에 비해 9.49 ± 0.896배 증가하였고, TGF-β1의 생성량은 170 pg/㎖으로서 비처리 대조군에 비해 5.07 ± 0.356배 증가하였고, IL-6의 생성량은 192 pg/㎖으로서 1.28 ± 0.324 배 증가하였다.

인간탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포 또는 인간 지방유래 줄기세포를 완두콩 펩톤 및 밀 펩톤으로 처리한 경우 VEGF, TGF-β 및 IL-6 이외의 다른 사이토카인들의 분비량 변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 식물성 펩톤에 의한 줄기세포 증식 촉진 효과는 VEGF, TGF-β 및 IL-6에 의해 매개되는 효과로 보여진다.

실시예 5: 식물성 펩톤 함유 무혈청 배지에서 섬유아세포의 세포생존능 측정

인간 정상 섬유아세포(human normal fibroblasts)를 이용하여 무혈청배지에 식물성 펩톤을 처리한 후 세포생존율에 미치는 효과를 관찰하였다. 본 실험은 5 ％ CO₂ 및 37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 인간 정상 섬유아세포 3 X 10⁵를6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청 을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 무혈청조건 및 펩톤이 첨가된 무혈청 조건(1-10％)으로 각각 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후에, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청 배지로 교체하여 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다. 도 4의 실험 결과에서 보여지는 바와 같이, 밀 펩톤과 완두콩 펩톤을 처리한 경우에 모든 처리 농도에서 FGF-1 (Fetal Growth Factor-1)으로 처리한 양성대조군에 비해 높은 세포증식촉진 효과를 나타내었다. 따라서, 식물성 펩톤이 섬유아세포에서도 세포 증식을 촉진함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 식물성 펩톤의 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진효과

섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진은 피부에 있어 주름을 방지하고 완화하는 주요 지표이다. 주름은 통상적으로 콜라겐의 생합성이 감소하고 만들어진 콜라겐이 분해되면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 진피층에 존재하는 섬유아세포의 콜라겐 합성이 촉진되면 주름억제는 물론 생성된 주름도 개선될 수 있다.

사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 X 10⁵ 세포/웰) 5％ 농도의 CO₂ 배양기에서 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 양성대조군으로서 레티노산(RA, Retinoic acid) 포함 배지, 실험군으로서 1, 3, 10％ 완두콩 펩톤, 또는 1, 3, 5％ 밀 펩톤 포함 배지, 음성대조군으로서 무혈청 배 지로 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit; MK101; Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균ㅁ 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 식물성 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤)은 양성대조군인 레티노산(RA, Retinoic Acid)을 사용한 경우와 대등한 정도로 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시켰다.

실시예 7: 식물성 펩톤의 콜라겐 분해효소에 대한 억제효과

콜라겐은 진피층을 구성하는 구조단백질로 그 양이 줄어들게 되면 주름이 생성된다. 반면에 만들어진 콜라겐이 잘 유지되면 주름발생이 억제될 수 있다. 따라서 콜라겐 분해효소의 활성을 억제하는 것은 항노화의 주요 생리학적인 지표이다.

사람의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (2 X 10⁵ 세포/웰), 5％ 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 농도별로 시료를 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포배지 를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제(collagenase)의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게나제에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게나제 활성을 유도하는 물질로 PMA(phorbol myristate acetate)를 처리하였다. 실험은 상업적으로 판매되는 키트에 제조자의 지시서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 타입 I 콜라게나제 분석 키트 (Type I collagenase assay kit, Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균 ± 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과에서 양성대조군으로 TNF(Tumor Necrosis Factor)-α을 사용하였다. 밀 펩톤과 완두콩 펩톤은 1％ 이상의 처리농도에서 콜라겐 분해효소에 대한 활성억제 효과를 나타내었다.

실시예 8: 식물성 펩톤 함유 줄기세포배양액을 이용한 피부줄기세포의 활성화 측정

식물성 펩톤이 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포 배양액을 피부줄기세포에 처리하여 피부줄기세포의 활성화 정도를 측정하였다.

본 실시예에서 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청 배지에서 배양한 줄기세포 배양액은 다음의 과정을 통해 얻었다. 5 ％ CO₂ 및37 ℃ 하에서 15％의 FBS와 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양한 인간 탯줄혈액유래 중간엽 줄기세포 3 X 10⁵개를 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1 회 세척한 후, 1％ 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤)이 첨가된 무혈청 DMEM 배지에서 20일 간 배양하였다. 이 배양액을 회수하여 0.2 μm 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과하여 세포를 제거하여 얻은 배양액을 사용하였다.

본 실시예에서 사용한 피부줄기세포는 대한피부연구학회지(2006;13(1):1-4)에 개재된 표피성체줄기세포 분리방법에 따라 분리하였다. 즉, 피부줄기세포(ESC)는 피부조직 또는 피부에서 수득한 세포들로부터 제4형 콜라겐에 부착성을 갖는 세포를 분리하여 얻었다. 이렇게 얻은 피부줄기세포를 3 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1 회 세척한 다음, 통상적인 양의 혈청이 포함된 배지인 정상군 조건(CM), 무혈청조건(SF), 1％ 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤)이 첨가된 무혈청조건(P/SF), 1％ 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤)이 첨가된 무혈청 배지에서 인간 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액(P/SF/MSC)의 실험군으로 나누어 배양하였다. 72 시간 배양한 후에, MTT 분석을 행하고, 세포배양액을 수집하여 CCK 분석법(Cell viability 측정방법)도 시행하였다.

도 7의 결과에서 보여지는 바와 같이, 정상군(CM)을 100 ％로 환산하였을 시, 무혈청조건이 처리된 실험군(SF)에 비해, 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청조건이 처리된 실험군(P/SF) 및 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청조건으로 배양한 줄기세포의 배양액을 처리한 실험군(P/SF/MSC)에서 유의성 있게 피부줄기세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 식물성 펩톤을 함유한 피부상태 개선용 외용조성물 제조

식물성 펩톤을 일반적으로 화장품이나 연고 같은 피부외용제제로 만들 경우에 이용하는 Oil in Water 타입의 에멀젼제형으로 시험제품을 만들었다. 각 시험제품의 조성은 표 4와 같았다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 다음 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 식물성 펩톤을 0.1％ 첨가하였다.

[표 4]

실시예 10: 식물성 펩톤 함유 배지에서 줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 함유하는 피부상태 개선용 외용조성물 제조

1％ 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤)이 첨가된 무혈청배지에서 줄기세포 (인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거 하여 얻은 배양액을 포함하는 크림의 조성은 표 4와 같다. 실시예 9에서와 같은 방법으로 크림 조성물을 제조하였다. 마지막 단계에서 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청 배지에서 배양한 줄기세포의 배양액 및 향을 첨가하여 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

실시예 11: 식물성 펩톤 또는 식물성 펩톤 함유 배지에서 배양된 줄기세포의 배양액을 포함하는 조성물의 여드름 개선 효과

1％ 식물성 펩톤을 함유한 배지에서 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액과 식물성 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤) 자체의 염증성 피부개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 줄기세포배양액 또는 밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤을 각각 0.1％ 함유한 크림을 여드름 피부 피검자의 얼굴 왼쪽에 도포하였다. 다른 쪽에는 세포배양액이 결여되어 있는 크림 또는 밀 펩톤/완두콩 펩톤이 포함되지 않은 크림을 대조군으로 각각 도포하였다. 1개월 동안 여드름의 개선정도를 면포의 개수로 확인하였다. 그 결과 줄기세포배양액이 포함된 크림과 밀 펩톤 및 완두콩 펩톤이 포함된 크림을 도포한 왼쪽 얼굴에서만 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.

여드름 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 여드름을 가진 환자(40명)를 대상으로 표 4의 크림 4종류(시험군 1, 2, 3, 4)와 비교제조예(대조군 1 및 2)의 크림을 각각 여드름 환자의 한쪽 얼굴에 1일/2회 1개월 동안 사용하게 한 후, 여드름 개선 효과를 측정하였다. 측정은 눈 밑 2센티 미터 아랫 쪽에 가상의 3제곱 센티미터의 사각형을 그리고 그 안에 들어가는 여드름의 개수를 세서 측정하였다. 시험결과는 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5]

상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 크림이 대조군 1과 2의 크림에 비해 여드름 개선 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 12: 식물성 펩톤 또는 식물성 펩톤 함유 배지에서 배양된 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물의 피부 염증 개선효과

1％ 식물성 펩톤을 함유한 배지에서 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs)를 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액과 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤)자체의 아토피나 건선 등과 같은 만성 염증성 피부 개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 세포배양액 또는 밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤을 각각 0.1％ 함유한 크림을 여드름 피부 피검자의 얼굴 왼쪽에 도포하였다. 다른 쪽에는 세포배 양액 또는 밀 펩톤/완두콩 펩톤이 전혀 포함되지 않은 크림을 대조군으로 각각 도포하였다. 1개월 동안 염증성 피부질환의 대표적인 아토피의 개선정도를 홍반의 진정 정도로 수치화 하여 확인하였다. 그 결과 줄기세포배양액이 포함된 크림과 밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤이 포함된 크림을 사용한 그룹에서만 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.

아토피 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 아토피를 가진 환자(각 시험당 60명)를 대상으로 표 4의 크림 4종류(시험군 1, 2, 3, 4)와 비교제조예(대조군 1 및 2)의 크림을 각각 1개월 동안 전신에 사용하게 한 후, 아토피 개선 효과를 측정하였다. 측정은 팔의 접히는 부위를 중심으로 6곳을 임의로 정해 미놀타의 CR-300 색차계를 사용하여 홍반이 진정된 정도를 측정하고 설문을 통하여 가려움 정도를 측정한 후 두 값을 보정하여 최종 피부개선 정도를 수치화 하였다.

판정기준은 전혀 변화가 없는 경우를 0, 개선정도를 1 내지 5로 정하여 상대적인 값을 비교하였다. 높은 값 일수록 홍반과 가려움이 개선된 경우이다. 악화된 경우는 -1에서 -5까지 표기하였다. 시험결과는 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6]

실시예 13: 식물성 펩톤 또는 식물성 펩톤 함유 배지에서 배양된 줄기세포 배양액 함유 피부개선용 외용조성물의 항노화 효과

인체에 있어 항노화 효과는 여러 가지 기준으로 판정할 수 있으나 피부에 나타나는 주름은 손쉽게 측정할 수 있는 지표이다. 식물성 펩톤 또는 식물성 펩톤이 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액의 피부주름 개선효과를 측정하였다. 표 4에서 제조한 크림을 사용하였다. 피부 주름개선 효과는 피부 탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부 탄력의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 20명(25 내지 35세)을 대상으로 표 4의 크림 4종류와 비교 제조예의 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일/2회 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 주름개선 효과를 측정하였으며, 판정기준은 피부 탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 7에 나타내었다.

[표 7]

상기 표 7에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 펩톤 함유 크림(시험군 1, 2, 3, 4)이 비교제조예(대조군 1 및 2)의 크림에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 즉, 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤) 함유 배지에서 배양한 줄기세포의 배양액과 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤) 자체만을 포함한 크림 모두 주름개선 효과가 있었다.

실시예 14: 경구투여에 의한 항노화 효과

노화는 모든 생물체에 시간과 함께 나타나는 현상으로 전조직과 기관에 나타난다. 피부는 동물의 경우 개체의 최외곽을 구성하는 가장 면적이 넓은 기관으로 피부에 나타나는 주름은 노화 정도를 가장 쉽게 판별할 수 있는 지표이다. 특히 자외선을 조사할 경우 인위적으로 노화과정을 촉진할 수 있기 때문에 동물시험에서 자외선을 쬔 후 시험물질을 경구나 경피로 투여하여 그 효과를 측정함으로써 그 물질이 실제 항노화 효과가 있는 지를 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물이 광노화 증상에 미치는 영향을 조사하고자 무모생쥐 (hairless mouse)를 동물모델로 선정하여 실험하였다. 6-7 주령의 암컷 무모생쥐(hairless mouse)(Skh: HR-1)를 그룹 당 8 마리씩 정상군, UV 대조군, UV/펩톤 투여군, UV/줄기세포 배양액 투여군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다. 정상군과 UV 대조군은 0.5 ㎖의 생리식염수를 경구투여하였고, UV/펩톤 투여군, UV/줄기세포 배양액 투여군은 고형분 기준으로 체중 Kg당 500mg의 식물성 펩톤(완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤) 또는 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포) 배양액을 0.5 ㎖ 식염수에 섞어 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.

투여기간은 총 5주로 주 5일 동일한 시간에 투여하였다. 경구투여 후 2주 부터 5주까지 UV대조군, UV/펩톤 투여군 및 UV/줄기세포 배양액 투여군에 주 3회 태양광과 유사하게 UV를 조사하였다. 이때 실험기간 중 총 UV 조사량이 600 mJ/cm²이 되도록 하였다. 항노화 효과의 주 현상으로 주름개선 효과의 객관적 판정을 위하여 부검 전 무모생쥐(hairless mouse)의 등쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였고 마찬가지로 5주 후에 각 샘플 처리군으로부터 피부주형을 채취하여 항노화 효과 즉 주름개선 효과를 비교하였다. 하기 표 8에서 보여지는 바와 같이, 주름개선정도를 나타내는 R1, R2, R3, R4, R5 모두, 펩톤 및 펩톤 포함 무혈청 배지를 이용한 줄기세포 배양액을 투여한 무모생쥐(hairless mouse)에서 투여하지 않은 UV/대조군에 비해 크게 감소한 것을 관찰하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 조성물이 피부주름을 개선하는 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 경구투여시, 펩톤 자체뿐만 아니라, 펩톤 포함 무혈청배지를 이용해 배양한 줄기세포 배양액도 모두 주름개선 효과가 나타나 항노화 효과가 있음을 확인할 수 있었다(표 8).

[표 8]

R1 value: Skin roughness, R2 value: Maximum roughness, R3 value: Average roughness, R4 value: Smoothness depth, R5 value: Arithmetic average roughness (International Journal of Cosmetic Science, 2005 Jun;27(3):155-60).

실시예 15: 식물성 펩톤 및 식물성 펩톤 함유 무혈청 배지에서 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 배양액의 백반증 개선효과

인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)를 식물성 펩톤이 포함된 배지에서 멜라닌세포로 분화시켜서 얻은 세포의 배양액과 식물성 펩톤(밀 펩톤 또는 완두콩 펩톤) 자체의 백반증 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다.

인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)를 멜라닌세포로 분화시켜서 얻은 세포 배양액은 다음의 방법으로 제조하였다. 정상적인 조건에서 배양한 줄기세포를 3 x 10⁵개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시켰다. 다음 날, 멜라닌세포 배양배지 M254 배지에 줄기세포인자 (Stem Cell Factor; SCF), 엔도셀린-3 (Endothelin-3; ET-3), 포스콜린 (Forskolin; FK)의 분화유도인자를 첨가한 후 30일 간 배양하였다. 30일 경과 후, 중간엽줄기세포의 세포의 모양이 멜라닌세포-유사(melanin cell-like) 모양으로 분화하였음을 확인하였고, Real-time PCR 방법을 통해 멜라닌세포 특이적 유전자인 MITF-M (Melanocyte-specific MITF isoform) 유전자 발현이 증가하였음을 확인하였다. 이 배양액을 회수하여 0.2 μm 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과하여 세포를 제거한 배양액을 사용하였다.

중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액 또는 밀펩톤 또는 완두콩펩톤을 각각 0.1％ 함유한 크림을 백반증 피검자의 한 손에 도포하였다. 다른 한 손에는 중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액을 포함하지 않는 크림 또는 밀펩톤/완두콩 펩톤이 포함되지 않은 크림을 도포하였다. 3개월 동안 전체적으로 색소가 재형성되는 정도를 2주 간격으로 관찰하였다. 그 결과 중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액이 포함된 크림과 밀펩톤 또는 완두콩 펩톤이 포함된 크림을 도포한 손에서 3 개월 경과 후 백반증의 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.

백반증 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 백반증을 가진 환자(40명)를 대상으로 표 4의 크림 4종류(시험군 1, 2, 3, 4)와 비교 제조예의 크림을 각각 백반증 환자의 한쪽 손에 1일/2회 6개월 동안 사용하게 한 후, 백반증 개선 효과를 측정하였다. 판정기준은 전혀 변화가 없는 경우를 0, 변화가 있는 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 9에 나타내었다.

[표 9]

상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 크림이 대조군 1과 2의 크림에 비해 백반증 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 16: 무모 생쥐의 경피에 존재하는 피부줄기세포에 대한 효능 평가

실시예 14에서와 같이, 총 5 주간 주 5일 동일한 시간에 밀 펩톤, 완두콩 펩톤, 밀 펩톤 함유 무혈청 배지를 이용한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액, 완두콩 펩톤 함유 무혈청배지를 이용한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액을 무모생쥐에 경구 투여한 후, 경피로부터 피부줄기세포를 분리하였다. 피부줄기세포의 분리방법은 앞서 설명된 공지된 방법에 따라 행하였다. 분리된 피부줄기세포를 3 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청이 포함된 배지에서 48 시간 배양한 후, CCK 분석법 (cell viability 측정방법)를 이용하여 세포활성을 측정하였다.

[표 10]

상기 표 10에 나타낸 바와 같이, UV/대조군에 비해 모두 줄기세포 증식 속도가 증가된 것을 관찰하였다. 이러한 결과는, 펩톤 또는 펩톤이 함유된 무혈청배지로 배양된 줄기세포배양액을 경구투여하였을 경우에도 성체줄기세포의 활성화에 효과가 있음을 의미한다.

실시예 17: 급성경구독성시험

밀 펩톤, 완두콩 펩톤, 밀 펩톤함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액 및 완두콩 펩톤함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액을 함유한 모든 실험군에서 경피나 경구로 투여하였을 경우에 줄기세포활성화 효과는 물론 항노화 효과가 나타났다. 따라서 이러한 소재들을 사용하여 건강식품으로 상업화가 가능하다. 식품으로 사용되기 위해 본 소재들은 줄기세포배양액만 제외하고 이미 허가 되어 있으나 혹시 있을 수 있는 부작용을 방지하기 위하여 동물을 이용하여 급성 경구독성 시험을 실시하였다. 밀 펩톤, 완두콩 펩톤, 밀 펩톤 함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포 배양액, 완두콩 펩톤 함유 무혈청 배지로 배양한 줄기세포 배양액 등이 식품에도 안전하게 적용될 수 있는가를 확인하기 위해 급성 경구독성시험을 실시하였다. 실험동물로서 5 내지 6 주령된 SPF SD계 랫트 20 마리를 사용하여 하기와 같은 조건에서 급성독성시험을 실시하였다.

ㆍ온도 및 습도조건: 온도 22 ± 2 ℃. 상대습도 50 ± 10 %

ㆍ명암 사이클: 형광등조명 (08시 점등, 20시 소등)

ㆍ조도: 200 내지 300 Lux

ㆍ자외선 처리된 음용수는 자유섭취 시킴

ㆍ시험물질을 멸균증류수에 희석하여 투여시료를 제조하여 대조구로서 멸균 증류수를 사용하여 동량 투입

투여 당일은 4 시간까지 매 시간마다 일반상태를 관찰하고, 투여 다음날부터 14일 까지는 매일 1 회씩 일반상태의 변화, 중독증상, 운동성, 외관, 자율신경 및 사망동물의 유무를 주의 깊게 관찰하고 여러 가지 병리 해부학적인 검증을 거쳐 독성 유무를 판단하였다. 밀펩톤, 완두콩펩톤, 밀펩톤 함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포 배양액, 완두콩 펩톤 무혈청배지로 배양한 줄기세포 배양액의 LD50이 각각 24500, 24300, 24400, 24600mg/kg B.W.이었으며, 독성은 없는 것으로 판단되었다.

실시예 18: 건강식품조성물 제조

실시예 17에서 아무런 독성이 나타나지 않았고 이전 실시예에서 항노화 효과가 나타났기 때문에 이들 소재를 이용하여 건강식품으로 개발하였다. 하기 표 11에 나타낸 바와 같이 건강식품의 조성물은 다음 각각의 제제예와 같은 조성으로 통상의 액제 제조방법으로 제조하였다. 최종 부피는 각 액제는 양이 100㎖ 이다. 본 제제 예는 액체뿐만 아니라 정제, 산제, 과립제 등으로 통상의 식품형태로 사용되는 여러 가지 제재의 제조방법으로 제조가 가능하다.

[표 11]

실시예 19: 에너지 상승효과

실시예 16에 사용된 밀 펩톤(시험군 1), 완두콩 펩톤(시험군 2), 밀 펩톤 함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액(시험군 3), 완두콩 함유 무혈청배지로 배양한 줄기세포(인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, CB-MSCs) 배양액(시험군 4)를 이용하여 무모 생쥐에서 에너지 상승효과를 관찰하였다. 총 4주간, 주 5일 동일한 시간에 상기 시험군의 조성물들을 무모 생쥐에 구강으로 삽입하고 5주 후 희생시켜 장기로부터 SP(splenocytes), PBMC(peripheral blood mononuclear cell), LN(lymph node)와 같은 면역세포들을 분리한 후 시험군이 ATP 합성에 미치는 영향을 대조군과 비교하여 관찰하였다. 각 각의 세포들을 PBS로 2번 세척한 후 용해물(lysate)를 얻은 다음, 0.6 M의 과염소산(perchloric acid)를 이용하여 단백질 제거시켜 원심분리한다. 단백질 침전물(Protein pellet)이 혼입되지 않게 상등액만을 얻어서 KOH로 중화한 다음, 칼륨-과염소산염(K-perchlorate)를 제거하기 위해서 가볍게 원심분리하였다. 그 결과 얻어진 상등액을 ATP 합성에 사용하였다. ATP는 글루코오스(glucose), 헥소키나아제(hexokinase), glucose-6-phosphate dehydrogenase가 있는 상태에서 NADP+의 환원에 의해 측정하였다. Oligomysin은 ATPase 활성에 대한 억제자로 사용하였다. 결과는 하기 표 12에서 나타낸 바와 같다.

[표 12]

상기 표 12의 결과에 의해 시험군 1, 2, 3, 4에서 면역세포들의 에너지 상승 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 실험결과를 요약하면, 줄기세포 배양시 식물성 펩톤의 사용하여 동물성 혈청의 사용을 줄이거나 대체할 수 있음을 확인하였다. 또한, 식물성 펩톤이 줄기세포 촉진제로서의 역할도 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 식물성 펩톤이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양한 후 얻어지는 배양액을 경피 또는 경구투여하는 경우 피부 상태를 개선할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a는 7가지 종류의 식물성 펩톤을 포함하는 무혈청배지에서 인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSC)의 생존능 측정 결과이다. CM: 15％ FBS 및 1％ 항생제를 포함하는 DMEM; SF: 무혈청 DMEM; MSC: 인간 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포이고 MSC(A)와 MSC(B)는 계대 횟수(Cell passage number)가 다른 세포이다; #1: 완두콩 펩톤(pea peptone), #2: 루핀 펩톤(Lupin peptone), #3: 감자 펩톤(potato peptone), #4: 대두 펩톤(soy peptone), #5: 파파익 대두 펩톤(papaic soy peptone), #6: 잠두 펩톤(broadbean peptone), #7: 밀 펩톤(wheat peptone). 펩톤의 농도는 5mg/㎖(0.5％).

도 1b는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs) 또는 인간 지방유래 줄기세포(ADSCs)의 생존능에 대한 펩톤의 영향을 측정한 결과이다. 성체줄기세포를 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤을 포함하는 조합 배양배지에서 3일간 성장시켰다. 무혈청조건은 세포 배지를 혈청이 포함되지 않은 DMEM으로 교체하였다. 양성대조군으로서는 대조군 배지(15％ FBS를 포함하는 DMEM)에서 배양하였다. 세포생존능은 MTT 분석법에 의해 결정하였다. 측정값들은 대조군을 100％로 하여 이에 대한 백분율로 표시하였다. 각 그룹에서의 측정값은 4개의 샘플(n=4)에 대해 얻은 평균값으로 나타내었다. 패널 A는 CB-MSC 세포의 측정결과이고, 패널 B는 ADSC 세포의 측정결과이다.

도 2는 CB-MSC 세포증식에 대한 펩톤의 영향을 측정한 결과이다. CB-MSC를 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤을 포함하는 조합 배양배지에서 3일간 성장시켰다. 세포증식은 Click-iTTM EdU 유세포분석을 통해 결정하였다. 샘플에 대한 분석은 FACS Vantage flow cytometer 상에서 수행하였다. 패널 A는 무혈청 조건, 패널 B는 완두콩 펩톤이 첨가된 무혈청조건, 패널 C는 밀 펩톤이 첨가된 무혈청 조건이다.

도 3a 및 도 3b는 식물성 펩톤으로 처리된 인간탯줄혈액유래 중간엽 줄기세포(CB-MSC)의 조절된 배지에서 사이토카인 프로파일을 측정한 결과이다. 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤을 포함하는 배지에서 인간탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포(CB-MSC)를 3일간 배양하였다. 사이토카인의 정량분석은 무혈청 조건에서 펩톤 존재 또는 부존재하에서 인간탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSC)를 배양한 후 그 상등액을 분석하여 수행하였다. 각 그룹은 4개의 샘플에 대한 결과를 평균한 값으로 나타내었다. * NM은 펩톤처리에 의한 < 30 pg/㎖의 사이토카인 생성량을 의미한다.

도 3c 및 도 3d는 식물성 펩톤으로 처리된 인간 지방 유래 줄기세포(ADSC)의 조절된 배지에서의 사이토카인 프로파일을 측정한 결과이다. 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤을 포함하는 배지에서 성체줄기세포를 3일간 배양하였다. 사이토카인의 정량분석은 무혈청 조건에서 펩톤 존재 또는 부존재하에서 인간 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 배양한 후 그 상등액을 분석하여 수행하였다. 각 그룹은 4개의 샘플에 대한 결과를 평균한 값으로 나타내었다. *NM은 펩톤처리에 의한 < 30 pg/㎖의 사이토카인 생성량을 의미한다.

도 4는 식물성 펩톤의 섬유아세포 증식 촉진 효과를 보여주는 결과이다. 완두콩 펩톤 또는 밀 펩톤을 포함하는 배지에서 섬유아세포를 3일간 배양하였다. 72 시간이 경과한 후에, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하여 3시간 인큐베이션한 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다. Con : 무혈청 조건, FGF-1: Fetal Growth Factor-1, Pea: 완두콩 펩톤, Wheat: 밀 펩톤

도 5는 식물성 펩톤의 섬유아세포 콜라겐 합성 촉진 효과를 보여주는 결과이다. 사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 X 10⁵ 세포/웰) 5％ 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 양성대조군으로서 레티노산(RA, Retinoic acid) 포함 배지, 실험군으로서 1％, 3％, 10％ 완두콩 펩톤, 또는 1％, 3％, 5％ 밀 펩톤 포함 배지, 음성대조군으로서 무혈청 배지로 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였고, 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 Takara의 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균ㅁ 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. Con : 무혈청 조건, RA: Retinoic Acid, Pea: 완두콩 펩톤, Wheat: 밀 펩톤.

도 6은 식물성 펩톤의 콜라겐 분해효소의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 사람의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (2 X 10⁵ 세포/웰) 5％ 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 농도별로 시료를 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양한 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제(collagenase)의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게나제에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게나제 활성을 유도하는 물질로 PMA(phorbol myristate acetate)를 처리하였다. 실험은 상업적으로 판매되는 키트에 제조자의 지시서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 타입 I 콜라게나제 어세이 키트 (Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균ㅁ 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. Con : 무혈청 조건, TNF-α: Tumor Necrosis Factor-α, Pea: 완두콩 펩톤, Wheat: 밀 펩톤.

도 7은 식물성 펩톤이 인체의 경피에 존재하는 피부줄기세포를 활성화시키는 실험결과를 보여준다. CM: 15％ FBS 및 1％ 항생제를 포함하는 DMEM; SF: 무혈청 DMEM; P/SF: 식물성 펩톤(완두콩 펩톤)이 첨가된 무혈청 DMEM; P/SF/MSC: 식물성 펩톤(완두콩 펩톤)이 첨가된 무혈청 DMEM에 인간 탯줄혈액유래 중간엽줄기세포를 배양한 배양액.

Claims

식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 무혈정(serum-free) 줄기세포 배양용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 고압처리, 열처리 또는 물리적 처리에 의해 분해시켜 얻은 산물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤(Papaic soy peptone) 또는 루핀 펩톤(lupin peptone)인 것을 특징으로 하는 조성물.
식물성 펩톤을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리 또는 고압처리에 의해 분해시킨 산물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤, 밀 펩톤, 잠두 펩톤, 감자 펩톤, 완두콩 펩톤, 파파익 대두 펩톤 또는 루핀 펩톤인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 또는 피부 재생인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름, 또는 건선인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 줄기세포의 증식 촉진 또는 활성화 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 줄기세포는 피부에 존재하는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 전체 조성물에 대해 0.01-30 중량％로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
식물성 펩톤을 포함하는 무혈정(serum free) 배지에 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 식물로부터 유래된 단백질을 산처리, 염기처리, 효소처리, 열처리, 고압처리 또는 물리적 처리에 의해 분해시킨 산물인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤, 밀 펩톤, 잠두 펩톤, 감자 펩톤, 완두콩 펩톤, 파파익 대두 펩톤 또는 루핀 펩톤인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 무혈청 배지에 포함되는 식물성 펩톤의 함유량은 0.1-10％(g/㎖)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포, 피부유래 줄기세포 또는 지방유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 피부상태 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 백반증의 개선, 상처 재생 또는 피부 재생인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름, 또는 건선인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 25 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 증식 촉진 또는 활성화 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 줄기세포는 피부에 존재하는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 줄기세포배양액은 피부상태 개선용 조성물 전체에 대해 0.01-30 중량％로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.