KR20090097869A

KR20090097869A - 고정화 효소를 사용한 유용 물질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20090097869A
Application number: KR1020097012038A
Authority: KR
Inventors: 요시타카 센다; 준 사이토; 게이고 하나키; 도시테루 고마츠
Original assignee: 카오카부시키가이샤
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2009-09-16
Also published as: EP2090661A4; US20100047883A1; JP4915732B2; EP2090661A1; WO2008072381A1; CN101558160A; CN101558160B; JP2008148596A; US8173403B2

Abstract

본 발명은 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하고, 동일 방향으로 병류시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상인 고정상형 반응탑의 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 유용 물질의 제조 방법에 관한 것이다.

고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하여 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 탑 내의 반응액 전체의 흐름을 균일화시킬 수 있고, 그 결과, 반응성과 생산성을 향상시킬 수 있다.

Description

고정화 효소를 사용한 유용 물질의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING USEFUL SUBSTANCE USING IMMOBILIZED ENZYME}

본 발명은 고정화 효소를 충전한 고정상 (床) 형 반응탑을 사용한 반응에 의한 유용 물질의 제조 방법에 관한 것이다.

액체를 고정상형 반응탑에 통액시켜 실시하는 반응으로서, L-아스파르트산 생성, 에스테르 교환 유지 생성, 유당 가수 분해, 유지류의 가수 분해 등에 이용되고 있는 고정화 효소를 사용한 반응이 알려져 있다. 이들 반응은 모두 발열량이 비교적 작기 때문에, 통상적으로 가장 단순한 드럼형 반응기가 사용되고 있다.

고정화 효소를 사용한 반응 중, 유지류의 가수 분해와 같이 2 종류 이상의 액을 반응탑에 유통시키는 경우에는, 반응 효율 향상의 관점에서, 반응액을 균일하게 혼합한 상태에서 통액시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 가수 분해에 사용되는 유상 기질과 수상 기질은 본래 혼합해도 1 상 이 되지 않는 것이기 때문에, 에멀션으로 하는 것이 일반적이다. 한편으로, 에멀션 입자는 담체의 세공 내에 흡착된 효소에 잘 도달하기 어렵기 때문에, 통액 속도를 반응액이 유화되지 않는 범위로 한 기술도 있다 (특허 문헌 1 참조).

또한, 고정상에 유상 기질과 수상 기질을 유통시키는 방법으로는, 향류로 유 통시키는 방법 (특허 문헌 1, 2 참조), 및 병류 (竝流) 로 유통시키는 방법 (특허 문헌 3 참조) 이 있는데, 전자는 특수한 구조와 운전 방법이 필요하기 때문에, 일반적으로는 병류로 유통시키는 방법이 채용되고 있다.

특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 소61-85195호

특허 문헌 2 : 일본 공개특허공보 평1-98494호

특허 문헌 3 : 일본 공개특허공보 2000-160188호

발명의 개시

본 발명은 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하고, 동일 방향으로 병류시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상인 고정상형 반응탑의 1 단 (段) 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 유용 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하고, 동일 방향으로 병류시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상인 고정상형 반응탑의 1 단 당 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 고정화 효소를 충전한 충전부를, 충전 두께 이하의 두께를 갖는 공적부 (空積部) 를 사이에 끼워, 적어도 2 단 이상 적층한 다단식 고정상형 반응탑을 사용하는 유용 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 원 상당 직경이 35㎜φ 이상이고, 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 고정상형 반응탑을 제공하는 것이다.

발명의 실시형태

상기 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에, 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 유통시켜 반응을 실시하는 방법에 있어서는, 반응탑의 직경이 커짐에 따라 탑 내에 있어서의 반응액의 흐름이 불균일해져 효율적으로 반응이 진행되지 않는 부분이 발생하고, 결과적으로 반응성이 저하된다는 문제가 있는 것을 알아냈다. 이 경우, 반응성을 높이기 위해 단순히 고정화 효소와 반응액의 접촉 시간을 길게 하려고 하면, 생산성 (유량) 이 저하된다는 문제도 있다.

따라서, 본 발명은 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에, 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 유통시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 유량을 저하시키지 않고 반응성을 높이고, 생산성을 향상시킴으로써, 보다 효율적으로 유용 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

그래서 본 발명자는 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 있어서의 반응액 유통의 특징을 해석한 결과, 고정상형 반응탑의 직경이 커지면, 유상과 수상의 유동 양상 차이에 의해, 일정한 충전 두께를 초과한 시점부터 탑 내에서의 반응액의 불균일화가 발생하여, 반응성이 저하되는 것을 알아냈다. 그래서, 고정상형 반응탑의 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께를 규정하여, 액액 2 상류를 정류함으로써, 높은 반응성을 유지한 채로 생산성을 향상시킬 수 있는 것을 알아냈다.

본 발명에 의하면, 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하여 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 탑 내의 반응액 전체의 흐름을 균일화시킬 수 있고, 그 결과, 반응성과 생산성을 향상시킬 수 있다. 특히, 유지류의 가수 분해에 있어서는 효소 활성을 유효하게 발현시켜, 지방산류를 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물 (반응액) 을 공급한다. 고정상형 반응탑 (이하 「효소탑」이라고도 한다) 이란, 고정화 효소를 칼럼 등에 충전하여, 고정화 담체 사이의 공극 및 고정화 담체의 세공에 반응액을 유통시킬 수 있도록 한 것을 말한다. 고정상형 반응탑은, 고정화 효소를 충전한 충전부를 1 단 갖는 1 개의 고정상형 반응기로 구성되어 있어도 되고, 그 충전부를 공적부를 사이에 끼워 2 단 이상 적층한 다단식 고정상형 반응탑이어도 된다.

2 액상이란 2 종류의 액체가 혼합 후에도 1 상이 되지 않는 상태를 말하며, 분상되어 있는 것에서부터, 균일하지만 유화 상태로 되어 있는 것도 포함된다.

본 발명의 양태로는, 고정화 효소로서 유지 분해 효소를 고정화 담체에 흡착시킨 것을 사용하고, 이것을 충전한 효소탑에 2 액상으로서 유상 기질과 수상 기질을 유통시키는 것에 의한 유지류의 가수 분해 반응에 의해, 유용 물질로서 지방산류를 제조하는 방법인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 2 액상을 동일 방향으로 병류시킨다. 이 경우, 2 액상을 미리 혼합하여 유화 상태로서 공급해도 되고, 분상된 채로 공급해도 된다. 또한, 2 액상을 일정 시간마다 교대로 공급해도 된다. 효소탑에 대한 각 기질의 공급은, 탑정에서 탑저로 하방류로 실시해도 되고, 탑저에서 탑정으로 상방류로 실시해도 된다.

본 발명에서 사용되는 고정화 효소는, 고정화 담체에 효소를 흡착 등에 의해 담지시킨 것이다. 고정화 담체로는, 셀라이트, 규조토, 카올리나이트, 실리카 겔, 몰레큘러시브, 다공질 유리, 활성탄, 탄산칼슘, 세라믹스 등의 무기 담체, 세라믹스 파우더, 폴리비닐알코올, 폴리프로필렌, 키토산, 이온 교환 수지, 소수 흡착 수지, 킬레이트 수지, 합성 흡착 수지 등의 유기 고분자 등을 들 수 있는데, 특히 보수력이 높은 점에서 이온 교환 수지가 바람직하다. 또한, 이온 교환 수지 중에서도 큰 표면적을 가짐으로써 효소의 흡착량을 높게 할 수 있다는 점에서, 다공질인 것이 바람직하다.

고정화 담체로서 사용되는 수지의 입자 직경은 100 ∼ 1000㎛ 가 바람직하고, 250 ∼ 750㎛ 가 더욱 바람직하다. 세공 직경은 10 ∼ 150㎚ 가 바람직하고, 10 ∼ 100㎚ 가 더욱 바람직하다. 재질로는, 페놀포름알데히드계, 폴리스티렌계, 아크릴아미드계, 디비닐벤젠계 등을 들 수 있으며, 특히 페놀포름알데히드계 수지 (예를 들어, Rohm and Haas 사 제조 Duolite A-568) 가 효소 흡착성 향상의 면에서 바람직하다.

본 발명의 고정화 효소에 사용되는 효소는 특별히 한정은 되지 않지만, 생산성의 향상 효과가 큰 점에서, 유지류 분해용 효소로서의 리파아제가 바람직하다. 리파아제는 동물 유래, 식물 유래의 것은 물론, 미생물 유래의 시판되는 리파아제를 사용할 수도 있다. 미생물 유래 리파아제로는, 리조푸스 (Rhizopus) 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 무코르 (Mucor) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 지오트리쿰 (Geotrichum) 속, 페니실륨 (Penicillium) 속, 칸디다 (Candida) 속 등이 기원인 것을 들 수 있다.

효소의 고정화를 실시하는 온도는 효소의 특성에 따라 결정할 수 있는데, 효소의 실활이 일어나지 않는 0 ∼ 60℃, 특히 5 ∼ 40℃ 가 바람직하다. 또한 고정화시에 사용되는 효소 용액의 pH 는, 효소의 변성이 일어나지 않는 범위이면 되고, 온도와 마찬가지로 효소의 특성에 따라 결정할 수 있는데, pH 3 ∼ 9 가 바람직하다. 이 pH 를 유지하기 위해서는 완충액을 사용하는데, 완충액으로는, 아세트산 완충액, 인산 완충액, 트리스염산 완충액 등을 들 수 있다. 상기 효소 용액 중의 효소 농도는, 고정화 효율의 면에서 효소의 포화 용해도 이하이고, 또한 충분한 농도인 것이 바람직하다. 또한 효소 용액은, 필요에 따라 불용부를 원심 분리에 의해 제거한 상청이나, 한외 여과 등에 의해 정제한 것을 사용할 수도 있다. 또한 사용되는 효소 질량은 그 효소 활성에 따라서도 상이한데, 담체 질량에 대하여 5 ∼ 1000 질량％, 특히 10 ∼ 500 질량％ 가 바람직하다.

효소를 고정화시키는 경우, 담체와 효소를 직접 흡착시켜도 되지만, 고활성을 발현시키는 흡착 상태로 하기 위해, 효소 흡착 전에 미리 담체를 지용성 지방산 또는 그 유도체로 처리하는 것이 바람직하다. 지용성 지방산 또는 그 유도체와 담체의 접촉법으로는, 물 또는 유기 용제 중에 이들을 직접 첨가해도 되지만, 분산성을 양호하게 하기 위해, 유기 용제에 지용성 지방산 또는 그 유도체를 일단 분산, 용해시킨 후, 물에 분산시킨 담체에 첨가해도 된다. 이 유기 용제로는, 클로로포름, 헥산, 에탄올 등을 들 수 있다. 지용성 지방산 또는 그 유도체의 사용 질량은, 담체 질량에 대하여 1 ∼ 500 질량％, 특히 10 ∼ 200 질량％ 가 바람직하다. 접촉 온도는 0 ∼ 100℃, 특히 20 ∼ 60℃ 가 바람직하고, 접촉 시간은 5 분 ∼ 5 시간 정도가 바람직하다. 이 처리를 종료한 담체는 여과하여 회수하는데, 건조시켜도 된다. 건조 온도는 실온 ∼ 100℃ 가 바람직하고, 감압 건조를 실시해도 된다.

미리 담체를 처리하는 지용성 지방산 또는 그 유도체 중, 지용성 지방산으로는, 탄소수 4 ∼ 24, 바람직하게는 탄소수 8 ∼ 18 의 포화 또는 불포화의, 직사슬 또는 분기 사슬의, 수산기를 갖고 있어도 되는 지방산을 들 수 있다. 구체적으로는, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 올레산, 리놀산,

-리놀렌산, 리시놀산, 이소스테아르산 등을 들 수 있다. 또한 상기 지용성 지방산의 유도체로는, 이들 지용성 지방산과 1 가 혹은 다가 알코올 또는 당류의 에스테르, 인지질, 및 이들 에스테르에 에틸렌옥사이드를 부가한 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 지방산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 그들의 에틸렌옥사이드 부가체, 폴리글리세린에스테르, 소르비탄에스테르, 자당에스테르 등을 들 수 있다. 이들 지용성 지방산 및 그 유도체는 모두 상온에서 액상인 것이 효소를 담체에 고정화시키는 공정상 바람직하다. 이들 지용성 지방산 또는 그 유도체로는, 상기 2 종 이상을 병용해도 되고, 채종 지방산, 대두 지방산 등의 천연 유래의 지방산을 사용할 수도 있다.

고정화 효소의 가수 분해 활성은 20U/g 이상, 100 ∼ 10000U/g 이 더욱 바람직하고, 500 ∼ 5000U/g 의 범위인 것이 특히 바람직하다. 여기서 효소의 1U 는, 40℃ 에 있어서, 유지류 : 물 = 100 : 25 (질량비) 의 혼합액을 교반 혼합하면서 30 분간 가수 분해를 시켰을 때, 1 분간 1μ㏖ 의 유리 (遊離) 지방산을 생성하는 효소의 분해능을 나타낸다. 유지류의 단위 질량당 부여한 고정화 효소의 가수 분해 활성 (U/g-oil) 과 어떠한 가수 분해율에 도달할 때까지의 소요 시간은, 대략 반비례의 관계에 있다.

고정화 효소를 충전한 충전층 (효소탑) 을 사용하여 가수 분해를 실시하는 경우, 송액 조건 (통액 속도, 온도 등) 에 따라 분해 속도는 상이한데, 효소 충전층 출구에 있어서의 유지의 가수 분해율, 가수 분해 소요 시간 (충전층 내의 체류 시간), 충전층 내에 존재하는 유지류의 질량 (g-oil) 및 고정화 효소의 충전 질량 (g) 으로부터 고정화 효소의 겉보기 활성 (발현 활성) (U/g) 이 구해진다. 또한, 충전층 내에 존재하는 유지류의 질량을 구하기 위해서는, 고정화 효소 충전부의 용적에 충전부의 공극률, 반응액 중의 유지류의 용량비 및 유지류의 비중을 곱함으로써 구한다.

본 발명에 사용되는 2 액상을 형성하는 액체 혼합물 중 1 개는 유상 기질인 것이 바람직하다. 유상 기질이란 주로 식물유, 동물유 또는 이들을 조합한 유지류를 말하는데, 유지류란 트리아실글리세롤 외에 디아실글리세롤, 모노아실글리세롤, 또는 지방산류를 포함하고 있어도 되고, 가수 분해의 결과 얻어지는 지방산을 포함하고 있어도 된다. 유상 기질의 구체예로는, 채종유, 대두유, 해바라기유, 팜유 및 아마인유 등의 식물유, 우지, 돈지 및 어유 등의 동물유 등, 또는 이들 조합의 유지류를 들 수 있다. 이들 유지류는 탈취유 외에 미리 탈취되어 있지 않은 미탈취 유지를 사용할 수 있는데, 이들 유지류의 일부 또는 전부에 미탈취 유지를 사용하는 것이, 트랜스 불포화 지방산, 공액 불포화 지방산을 저감시켜, 원료 유지 유래의 식물 스테롤, 식물 스테롤 지방산에스테르, 토코페롤을 잔존시킬 수 있는 점에서 바람직하다. 유상 기질 중에는, 상기 유지류 외에 지방산 등의 유용성 성분이 혼합되어 있어도 된다. 지방산류란, 가수 분해의 결과 얻어지는 지방산 외에, 상기 글리세리드의 1 종 이상을 포함하는 것도 가리킨다.

본 발명에 사용되는 2 액상을 형성하는 액체 혼합물 중 다른 1 개는 수상 기질인 것이 바람직하다. 수상 기질은 물인데, 가수 분해의 결과 얻어지는 글리세린 등, 그 밖의 수용성 성분이 혼합되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서는, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상이고, 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 효소탑을 사용하여 반응을 실시한다. 효소탑의 원 상당 직경이 35㎜φ 보다 커짐에 따라 반응액의 흐름이 불균일해져 반응성이 저하된다는 경향으로 된다.

효소탑의 원 상당 직경은, 반응성, 생산성의 면에서 35 ∼ 10,000㎜φ, 35 ∼ 7,500㎜φ 가 특히 바람직하고, 35 ∼ 5,000㎜φ 로 하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 원 상당 직경이란, 효소탑이 원형인 경우에는 그 직경을 말하고, 다각형인 경우에는 그 투영 면적과 동일한 면적을 갖는 원의 직경을 말하며, 투영 면적을 A 로 하여 하기 식 (1) 에 의해 구해진다.

D = 2 (A / π) ＾ 0.5 (1)

(D : 원 상당 직경 (㎜), A : 다각형의 투영 면적 (㎟))

본 발명에 있어서 사용되는 효소탑의 형상은 사용되는 펌프의 가압 압력에 견딜 수 있는 것이면 된다. 또한, 효소탑의 주위에 재킷을 설치하여, 효소탑 내에 유통되는 반응액을 효소 반응에 적합한 온도로 조정할 수 있는 것인 것이 바람직하다.

효소탑 내의 온도는, 고정화 효소의 활성을 보다 유효하게 끌어내기 위해, 0 ∼ 60℃, 20 ∼ 40℃ 로 하는 것이 더욱 바람직하다. 효소탑의 길이는 원하는 분해율을 얻는데 필요한 길이로 하면 되는데, 반응성, 탑 내 압력 손실 등의 면에서 0.01 ∼ 10m, 바람직하게는 0.1 ∼ 5m 의 범위로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 고정화 효소를 1 단 당 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 가 되도록 효소탑에 충전한다. 이와 같이, 고정화 효소의 충전 두께를 규정함으로써 반응액의 흐름이 불균일해지는 것을 방지할 수 있어, 반응액의 흐름이 정류화되기 때문에, 효소 활성을 유효하게 발현시켜 가수 분해를 효율적으로 실시할 수 있다. 효소탑에 있어서의 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께는, 반응성의 면에서 10 ∼ 200㎜ 인데, 15 ∼ 200㎜ 가 더욱 바람직하고, 75 ∼ 200㎜ 로 하는 것이 특히 바람직하다.

또한, 다단식 고정상형 반응탑을 사용하는 경우, 고정화 효소를 충전한 충전부 사이에 형성되는 공적부는, 반응성, 생산 등의 면에서 고정화 효소의 충전 두께 이하의 두께를 갖는 것이 바람직하고, 1 ∼ 200㎜, 특히 5 ∼ 200㎜ 가 바람직하고, 보다 15 ∼ 200㎜ 인 것이 바람직하다. 이 다단식 고정상형 반응탑을 사용함으로써, 축차 혼합하지 않아도 보다 높은 반응성을 유지할 수 있다.

충전부는 반응성, 생산 등의 면에서 공적부를 사이에 끼워 2 ∼ 30 단 적층하는 것이 바람직하고, 특히 3 ∼ 20 단 적층하는 것이 바람직하다.

효소탑에 반응액을 공급하는 방법으로는, 각각 따로따로 효소탑에 직결되는 배관에 의해 실시해도 되고, 또는 공유된 배관에 의해 공급을 실시해도 되는데, 조작성의 면에서 따로따로 효소탑에 직결되는 배관에 의해 실시하는 것이 바람직하다.

효소탑 내에 있어서의 반응액의 통액 선속도는, 바람직하게는 1 ∼ 400㎜/분, 5 ∼ 200㎜/분인 것이 더욱 바람직하다. 이 통액 선속도 (㎜/분) 는, 1 분간당 송액량 (㎣/분) (또는 송액 속도 (10^-3㎖/분) 라고도 한다) 을 충전층 단면적 (㎟) 으로 나눈 몫으로 나타내는 값을 말한다. 통액 선속도를 높이는 것에 의한 충전탑 내 압력의 증대에 수반하여, 통액이 곤란해져 내압성이 높은 효소 충전탑이 필요해지는 것 외에, 고정화 효소가 탑 내 압력 증가에 의해 파쇄되는 경우가 발생할 수도 있기 때문에, 통액 선속도는 400㎜/분 이하로 하는 것이 바람직하다. 또한, 생산성의 면에서 통액 선속도는 1㎜/분 이상으로 하는 것이 바람직하다. 고정화 효소의 발현 활성은 통액 선속도에 의해 변화되기 때문에, 최적의 통액 선속도를 선정하여 반응 조건을 결정함으로써 원하는 생산 능력, 제조 비용에 걸맞는 반응을 실시할 수 있다.

효소탑 내의 고정화 효소 충전부에 있어서의 반응액의 체류 시간은, 가수 분해 반응의 평형 상태를 회피하고, 고정화 효소의 활성을 보다 유효하게 끌어내어 생산성을 향상시키는 점에서 30 초 ∼ 60 분, 1 분 ∼ 40 분으로 하는 것이 더욱 바람직하다. 체류 시간 (분) 이란, 충전층의 두께 (㎜) 에 공극률을 곱하고, 이것을 통액 선속도 (㎜/분) 로 나눈 값으로 나타낸다.

본 발명에 있어서는, 반응성, 생산성 등의 균형에서, 효소탑을 통과한 반응액을 그대로 반응 종료물로 해도 되고, 또한 반응액을 일단 유수 분리하여 유상을 분취한 후에 새로운 물을 첨가하고 상기와 동일한 방법으로 다시 동일한 효소탑에 공급하여, 원하는 반응률이 얻어질 때까지 반복 통과시켜도 된다. 또한, 반응액을 일단 유수 분리하여 유상을 분취한 후에 새로운 물을 첨가하고 상기와 동일한 방법으로 다시 별도의 효소탑에 공급하여 연속 반응을 실시해도 된다. 또한, 복수의 효소탑을 사용하여 반응액의 유수 분리를 실시하면서, 유상을 다음의 효소탑에, 수상을 전의 효소탑에 공급함으로써, 보다 분해율이 높은 유상을 신선한 수상과 반응시키는 의사 향류법으로 실시해도 된다. 반응액의 유수 분리법으로는 자연 침강형, 원심 분리형 등의 유수 분리기가 일반적으로 사용되는데, 특별히 한정되지 않는다.

[고정화 리파아제의 조정]

DuoliteA-568 (Rohm and Haas 사 제조, 입경 분포 100 ∼ 1000㎛) 1 질량부를 N/10 의 NaOH 용액 10 질량부 중에서 1 시간 교반하였다. 여과한 후 10 질량부의 이온 교환수로 세정하고 500mM 의 인산 완충액 (pH 7) 10 질량부로 pH 의 평형화를 실시하였다. 그 후 50mM 의 인산 완충액 (pH 7) 10 질량부로 2 시간 씩 2 회 pH 의 평형화를 실시하였다. 그 후 여과를 실시하여 담체를 회수한 후, 에탄올 5 질량부로 에탄올 치환을 30 분 실시하였다. 여과한 후, 리시놀산을 1 질량부 함유하는 에탄올 5 질량부를 첨가하여 30 분간 리시놀산을 담체에 흡착시켰다. 여과에 의해 담체를 회수한 후, 50mM 의 인산 완충액 (pH 7) 5 질량부로 30 분씩 4 회 세정하여 에탄올을 제거하고, 여과하여 담체를 회수하였다. 그 후 시판되는 리파아제 (리파아제 AY, 아마노 제약 (주)) 1 질량부를 50mM 의 인산 완충액 (pH 7) 9 질량부에 용해시킨 효소액과 5 시간 접촉시켜, 고정화를 실시하였다. 여과하여 고정화 효소를 회수하고 50mM 의 인산 완충액 (pH 7) 10 질량부로 세정을 실시함으로써, 고정화되어 있지 않은 효소나 단백을 제거하였다. 그 후 실제로 분해를 실시할 채종유를 4 질량부 첨가하고 12 시간 교반하였다. 이상의 조작은 모두 20℃ 에서 실시하였다. 그 후 여과하여 유지와 분리하여, 고정화 효소로 하였다. 그 결과, 2700U/g (건조 질량) 의 가수 분해 활성 (발현시켜야 할 활성) 을 나타내는 고정화 리파아제가 얻어졌다. 고정화 효소의 질량 기준의 평균 입자 직경은 311㎛ 였다.

<참고예 1>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 10㎜, 높이 1400㎜) 에 상기 고정화 리파아제 27.0g (건조 질량) 을 충전하고 (충전 높이 1200㎜), 재킷에 의해 35℃ 로 보온하였다. 칼럼 상부로부터 채종유와 증류수를 질량비 10 : 6 으로 혼합한 액을 1.57㎖/분으로 송액하여, 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.

<참고예 2>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 10㎜, 높이 1950㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 4.83g 충전한 충전부 (충전 높이 200㎜) 를, 공적부 (높이 150㎜) 를 사이에 끼워 6 단 적층한 것 이외에는, 참고예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 에 나타내는 바와 같이, 효소탑의 직경이 10㎜φ 정도인 경우에는, 고정화 효소의 충전 높이가 어느 정도이든 간에 고정화 효소의 (겉보기) 활성이 유효하게 발현되는 것이 밝혀졌다.

<실시예 1>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 150㎜) 에 상기 고정화 리파아제 0.16㎏ (건조 질량) 을 충전하고 (충전 높이 150㎜), 재킷에 의해 35℃ 로 보온하였다. 칼럼 상부로부터 채종유와 증류수를 질량비 10 : 6 으로 혼합한 액을 77㎖/분으로 송액하여, 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다. 또한, 표 중의 분해율은 분석에 의해 구한 산가 (酸價) 를 비누화값으로 나눔으로써 산출하였다. 산가는, American Oil Chemists. Society Official Method Ca 5a-40 에 기재된 방법에 의해, 또한 비누화값은 American Oil Chemists. Society Official Method Cd 3a-94 에 기재된 방법에 의해 측정하였다.

<실시예 2>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 150㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.17825㎏ 충전한 (충전 높이 150㎜) 것 이외에는, 실시 예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 이어서, 칼럼으로부터 통과시킨 반응액을 일단 유수 분리하여 유상을 분취한 후, 새로운 물을 첨가하여 혼합하고 다시 동일 형상의 별도의 칼럼에 공급하여, 동일한 순서로 합계 4 회 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

<실시예 3>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 76.4㎜, 높이 250㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.21㎏ 충전하고 (충전 높이 170㎜), 송액 속도를 92㎖/분으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 이어서, 칼럼으로부터 통과시킨 반응액을 일단 유수 분리하여 유상을 분취한 후, 새로운 물을 첨가하여 혼합하고 다시 동일 형상의 별도의 칼럼에 공급하여, 동일한 순서로 합계 8 회 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

<실시예 4>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 1050㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.178㎏ 충전한 충전부 (충전 높이 150㎜) 를, 공적부 (높이 150㎜) 를 사이에 끼워 4 단 적층한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.

<실시예 5>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 600㎜, 높이 150㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 13.37㎏ 충전하고 (충전 높이 150㎜), 송액 속도를 5655 ㎖/분으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.

<실시예 6>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 600㎜, 높이 1050㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 13.37㎏ 충전한 충전부 (충전 높이 150㎜) 를, 공적부 (높이 150㎜) 를 사이에 끼워 4 단 적층하고, 송액 속도를 5655㎖/분으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.

<실시예 7>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 600㎜, 높이 2250㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 13.37㎏ 충전한 충전층 (충전 높이 150㎜) 을, 공적부 (높이 150㎜) 를 사이에 끼워 8 단 적층하고, 송액 속도를 5655㎖/분으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.

<실시예 8>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 1125㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.085㎏ 충전한 충전부 (충전 높이 75㎜) 를, 공적부 (높이 75㎜) 를 사이에 끼워 8 단 적층한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.

<실시예 9>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 645㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.1725㎏ 충전한 충전부 (충전 높이 150㎜) 를, 공적부 (높이 15㎜) 를 사이에 끼워 4 단 적층한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.

<비교예 1>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 300㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.36㎏ 충전 (충전 높이 300㎜) 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

<비교예 2>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 300㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.35㎏ 충전 (충전 높이 300㎜) 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 이어서, 칼럼으로부터 통과시킨 반응액을 일단 유수 분리하여 유상을 분취한 후, 새로운 물을 첨가하여 혼합하고 다시 동일 형상의 별도의 칼럼에 공급하여, 동일한 순서로 합계 2 회 가수 분해 반응을 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.

<비교예 3>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 1650㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 0.35㎏ 충전한 충전부 (충전 높이 300㎜) 를, 공적부 (높이 150㎜) 를 사이에 끼워 4 단 적층한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

<비교예 4>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 70㎜, 높이 1300㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 1.2㎏ 충전 (충전 높이 1177㎜) 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

<비교예 5>

재킷이 부착된 스테인리스제 칼럼 (내경 600㎜, 높이 1500㎜) 에 상기 고정화 리파아제를 건조 베이스로 103.0㎏ 충전하고 (충전 높이 1300㎜), 송액 속도를 5655㎖/분으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 순서로 가수 분해 반응을 실시하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

표 1 ∼ 표 3 에 나타낸 결과로부터, 고정상형 반응탑의 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께를 규정함으로써, 고정화 효소의 (겉보기) 활성이 유효하게 발현되는 것이 밝혀졌다. 또한, 반응탑으로서 충전부와 공적부를 교대로 갖는 다단식 고정상형 반응탑을 사용함으로써, 고정화 효소의 (겉보기) 활성을 보다 유효하게 발현시킬 수 있고, 유지류의 가수 분해율이 향상되는 것이 밝혀졌다.

Claims

고정화 효소를 충전한 고정상 (床) 형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하고, 동일 방향으로 병류시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상인 고정상형 반응탑의 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 유용 물질의 제조 방법.
고정화 효소를 충전한 고정상형 반응탑에 2 액상을 형성하는 액체 혼합물을 공급하고, 동일 방향으로 병류시켜 반응을 실시하는 유용 물질의 제조 방법에 있어서, 원 상당 직경이 35㎜φ 이상인 고정상형 반응탑의 1 단 당 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 고정화 효소를 충전한 충전부를, 충전 두께 이하의 두께를 갖는 공적부 (空積部) 를 사이에 끼워, 적어도 2 단 이상 적층한 다단식 고정상형 반응탑을 사용하는 유용 물질의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 액체 혼합물 중 1 종이 유상 기질인 유용 물질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 액체 혼합물 중 1 종이 수상 기질인 유용 물질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 반응이 고정화 리파아제를 사용한 유지류의 가수 분해 반응인 유용 물질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

유용 물질이 지방산류인 유용 물질의 제조 방법.
원 상당 직경이 35㎜φ 이상이고, 1 단 당 고정화 효소의 충전 두께가 10 ∼ 200㎜ 인 고정상형 반응탑.