WO2008072381A1 - 固定化酵素を用いた有用物質の製造方法 - Google Patents

固定化酵素を用いた有用物質の製造方法 Download PDF

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WO2008072381A1
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immobilized enzyme
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Yoshitaka Senda
Jun Saito
Keigo Hanaki
Toshiteru Komatsu
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Kao Corporation
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a useful substance by a reaction using a fixed bed type reaction column packed with an immobilized enzyme.
  • Immobilized enzymes used for L-aspartic acid production, transesterified oil and fat production, lactose hydrolysis, fat and oil hydrolysis, etc. are conducted by passing a liquid through a fixed bed type reaction tower.
  • the reaction used is known. Since these reactions all have a relatively small calorific value, the simplest drum reactor is usually used.
  • reaction liquids are uniformly mixed from the viewpoint of improving reaction efficiency.
  • the liquid is preferably passed in the state.
  • the oil phase substrate and the aqueous phase substrate used for the hydrolysis do not usually become one phase even when mixed, so it is common to use emulsion.
  • emulsion particles are difficult to reach the enzyme adsorbed in the pores of the carrier, there is a technique in which the liquid flow rate is within a range where the reaction solution is not emulsified (see Patent Document 1).
  • Patent Documents 1 and 2 As a method of circulating an oil phase substrate and an aqueous phase substrate through a fixed bed, a method of flowing in a countercurrent (see Patent Documents 1 and 2) and a method of circulating in a parallel flow (Patent Document 3).
  • Patent Documents 1 and 2 As a method of circulating an oil phase substrate and an aqueous phase substrate through a fixed bed, a method of flowing in a countercurrent (see Patent Documents 1 and 2) and a method of circulating in a parallel flow (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 since the former requires a special mechanism and operation method, it is generally adopted to distribute in parallel flow.
  • Patent Document 1 JP-A-6 1-8 5 1 95
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 1-9 8 4 94
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2 00 0 _ 1 6 0 1 8 8
  • the present invention relates to a liquid that forms a two-liquid phase in a fixed bed type reaction tower packed with an immobilized enzyme.
  • a method for producing a useful substance in which a mixture is fed and reacted in the same direction in the same direction the packed thickness of the immobilized enzyme per stage of a fixed bed reactor having an equivalent circle diameter of 35 mm 0 or more
  • the present invention provides a method for producing a useful substance having a value of 10 to 20 O mm.
  • the present invention also provides a method for producing a useful substance in which a liquid mixture that forms a two-liquid phase is supplied to a fixed bed type reaction column packed with an immobilized enzyme, and the reaction is caused to flow in the same direction.
  • a packed part filled with an immobilized enzyme having a packed thickness of 10 to 20 O mm per stage of a fixed bed type reaction tower having an equivalent diameter of 35 mm 0 or more is an empty space having a thickness equal to or less than the packed thickness.
  • the present invention provides a method for producing a useful substance using a multistage fixed bed type reaction tower in which at least two stages are stacked with a part interposed therebetween.
  • the present invention also provides a fixed bed type reaction tower having an equivalent circle diameter of 35 mm 0 or more and a packed thickness of immobilized enzyme per stage of 10 to 20 O mm.
  • the present invention provides a method for producing a useful substance in which a reaction is performed by circulating a liquid mixture forming a two-liquid phase through a fixed bed type reaction tower packed with an immobilized enzyme.
  • the present invention relates to a method for producing a useful substance more efficiently by increasing reactivity and improving productivity.
  • the present invention in a method for producing a useful substance by supplying a liquid mixture that forms a two-liquid phase to a fixed bed type reaction column packed with an immobilized enzyme, the entire reaction liquid in the column is obtained.
  • the flow can be made uniform, and as a result, the reactivity and productivity can be improved.
  • the enzyme activity is effectively expressed, and fatty acids can be produced efficiently.
  • a liquid mixture (reaction solution) that forms a two-liquid phase is supplied to a fixed bed type reaction tower packed with an immobilized enzyme.
  • a fixed bed type reaction tower hereinafter also referred to as “enzyme tower” means that the immobilized enzyme is packed in a column or the like so that the reaction solution can be circulated through the space between the immobilized carriers and the pores of the immobilized carrier. This is what you made.
  • the fixed bed type reaction tower may be composed of a single fixed bed type reactor having a single packed portion packed with an immobilized enzyme, and the packed portion is sandwiched between two empty stages.
  • a multi-stage fixed bed type reaction tower laminated as described above may be used.
  • the two-liquid phase means a state in which two types of liquids do not become one phase even after mixing, and includes those in which they are phase-separated or even in an emulsified state.
  • an enzyme in which an oleolytic enzyme is adsorbed on an immobilization carrier is used as an immobilization enzyme, and an oil phase substrate and an aqueous phase substrate are used as two liquid phases in an enzyme tower packed with the enzyme. It is preferable that the fatty acid is produced as a useful substance by hydrolysis reaction of fats and oils by circulating the oil.
  • the two liquid phases are made to flow in the same direction.
  • the two liquid phases may be mixed in advance and supplied as an emulsified state, or may be supplied while being separated. Further, the two liquid phases may be alternately supplied at regular intervals.
  • Each substrate may be supplied to the enzyme tower in a downward flow from the tower top to the tower bottom or in an upward flow from the tower bottom to the tower top.
  • the immobilized enzyme used in the present invention is one in which an enzyme is supported on an immobilized carrier by adsorption or the like.
  • the immobilization carrier celite, diatomaceous earth, force orientate , Silica gel, molecular sieve, porous glass, activated carbon, calcium carbonate, ceramics and other inorganic carriers, ceramic powder, polyvinyl alcohol, polypropylene, chitosan, ion exchange resin, hydrophobic adsorption resin, chelate resin, synthesis
  • An organic polymer such as an adsorbent resin can be mentioned, and an ion exchange resin is particularly preferable because of its high water retention capability.
  • a porous surface is preferable because it has a large surface area and can increase the amount of adsorbed enzyme.
  • the particle diameter of the resin used as the immobilization carrier is preferably 100 to 1 O 2 O m, more preferably 250 to 750 m.
  • the pore diameter is preferably from 10 to 150 nm, and more preferably from 10 to 100 nm.
  • the material include phenol formaldehyde, polystyrene, acrylamide, divinylbenzene, and the like, particularly phenol formaldehyde resin (for example Duolite A-568 manufactured by Rohm and Hass). This is preferable from the viewpoint of improving the enzyme adsorption.
  • the enzyme used for the immobilized enzyme of the present invention is not particularly limited, but lipase as an enzyme for decomposing oils and fats is preferable from the viewpoint of a large productivity improvement effect.
  • lipase not only those derived from animals and plants but also commercially available lipases derived from microorganisms can be used.
  • Microbial lipases include: Rhizopus 1 i, Aspergi II us Mucor, Pseud omo nas I ⁇ , Geotrich um; I ⁇ , Penici II ium genus, Candida genus and so on.
  • the temperature at which the enzyme is immobilized can be determined depending on the properties of the enzyme, but it is preferably 0 to 60 ° C, particularly 5 to 40 ° C, where the enzyme is not deactivated.
  • the pH of the enzyme solution used for immobilization may be in a range where no denaturation of the enzyme occurs and can be determined by the enzyme characteristics as well as the temperature, but pH 3-9 is preferred.
  • a buffer solution is used. Examples of the buffer solution include an acetate buffer solution, a phosphate buffer solution, and a tris hydrochloride buffer solution.
  • Enzyme dissolution The enzyme concentration in the solution is preferably not more than the saturation solubility of the enzyme from the viewpoint of immobilization efficiency, and a sufficient concentration.
  • the enzyme solution a supernatant obtained by removing an insoluble part by centrifugation, if necessary, or a solution purified by ultrafiltration can be used.
  • the enzyme mass to be used varies depending on the enzyme activity, but is preferably 5 to 100 mass%, particularly preferably 10 to 500 mass%, based on the mass of the carrier.
  • the carrier and the enzyme may be directly adsorbed.
  • the carrier in order to obtain an adsorption state that exhibits high activity, the carrier is preliminarily fixed with a fat-soluble fatty acid or a derivative thereof before the enzyme adsorption. It is preferable to treat with.
  • these may be added directly to water or an organic solvent.
  • the fat-soluble fatty acid or derivative thereof is once dispersed in the organic solvent. After dissolution, it may be added to a carrier dispersed in water.
  • the organic solvent include black mouth form, hexane, ethanol and the like.
  • the mass of the fat-soluble fatty acid or derivative thereof used is preferably 1 to 500 mass%, particularly preferably 10 to 200 mass%, based on the mass of the carrier.
  • the contact temperature is preferably 0 to 100 ° C., particularly preferably 20 to 60 ° C., and the contact time is preferably about 5 minutes to 5 hours.
  • the carrier after this treatment is recovered by filtration, but may be dried.
  • the drying temperature is preferably room temperature to 100 ° C., and may be dried under reduced pressure.
  • the fat-soluble fatty acid is a saturated or unsaturated, linear or straight chain having 4 to 24 carbon atoms, preferably 8 to 18 carbon atoms.
  • examples include branched-chain fatty acids which may have a hydroxyl group. Specific examples include strong puric acid, lauric acid, myristic acid, oleic acid, linoleic acid, monolinolenic acid, ricinoleic acid, and isostearic acid.
  • the fat-soluble fatty acid derivatives include esters of these fat-soluble fatty acids with monohydric or polyhydric alcohols or saccharides, phospholipids, and those obtained by adding ethylene oxide to these esters. Specific examples include methyl esters, ethyl esters, monoglycerides, diglycerides, ethylene oxide adducts thereof, polyglycerin esters, sorbitan esters, and sucrose esters of the above fatty acids. These fat-soluble fatty acids and their derivatives It is preferable in the process of immobilizing the enzyme on the carrier that all conductors are liquid at room temperature. As these fat-soluble fatty acids or derivatives thereof, two or more of the above may be used in combination, and naturally derived fatty acids such as rapeseed fatty acid and soybean fatty acid may be used.
  • the hydrolytic activity of the immobilized enzyme is preferably 20 U / g or more, more preferably 10 00 to 1 O O O O U Z g, and particularly preferably in the range of 5 00 to 5 00 0 U / g.
  • the hydrolysis activity (U / g—o i I) of the immobilized enzyme given per unit mass of fats and oils and the time required to reach a certain hydrolysis rate are in an inversely proportional relationship.
  • the volume of the immobilized enzyme packed part is multiplied by the porosity of the packed part, the volume ratio of the fats and oils in the reaction solution, and the specific gravity of the fats and oils. Ask.
  • the oil phase substrate mainly refers to vegetable oils, animal oils, or oils and combinations thereof, but the oils and fats may contain diacyl glycerol, monoacyl glycerol, or fatty acids in addition to triacylglycerol. It may contain fatty acids obtained as a result of hydrolysis.
  • Specific examples of the oil phase substrate include vegetable oils such as rapeseed oil, soybean oil, castor oil, palm oil and flax oil, animal oils such as beef tallow, pork tallow and fish oil, etc., or a combination of these oils and fats. .
  • These fats and oils can use deodorized oil and non-deodorized fats and oils that have not been deodorized in advance. However, non-deodorized fats and oils are used for some or all of these fats and oils. It is preferable from the viewpoint that trans unsaturated fatty acids and conjugated unsaturated fatty acids can be reduced and plant sterols, plant sterol fatty acid esters and tocopherols derived from raw oils and fats can be left. In the oil phase substrate, oil-soluble components such as fatty acids may be mixed in addition to the fats and oils.
  • Fatty acids refer to fatty acids obtained as a result of hydrolysis, as well as those containing one or more of the above glycerides.
  • the other one of the liquid mixtures forming the two liquid phases used in the present invention is preferably an aqueous phase matrix.
  • the aqueous phase substrate is water, but other water-soluble components such as glycerin obtained as a result of hydrolysis may be mixed.
  • the reaction is carried out using an enzyme column having an equivalent circle diameter of 35 mm0 or more and a packed thickness of immobilized enzyme per stage of 10 to 20 Omm.
  • the equivalent circle diameter of the enzyme tower becomes larger than 35 mm 0, the flow of the reaction liquid becomes uneven and the reactivity tends to decrease.
  • the equivalent circle diameter of the enzyme column is preferably 35 to 10,000 mm 0, particularly 35 to 7, 50 Omm0, more preferably 35 to 5, O 2 O Omm0 in terms of reactivity and productivity.
  • the equivalent circle diameter means the diameter of the enzyme tower when it is circular, and when it is a polygon, it means the diameter of a circle having the same area as the projected area, where the projected area is A and the following equation (1) Is required.
  • the shape of the enzyme column used in the present invention may be any shape that can withstand the indentation pressure of the pump used. Moreover, it is preferable that a jacket is provided around the enzyme tower so that the reaction liquid flowing in the enzyme tower can be adjusted to a temperature suitable for the enzyme reaction.
  • the temperature in the enzyme tower is preferably 0 to 60 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, in order to extract the activity of the immobilized enzyme more effectively.
  • the length of the enzyme column may be as long as necessary to obtain the desired decomposition rate, but from the standpoints of reactivity, pressure loss in the column, etc., 0.1-1 Om, preferably 0.1-5m Preferably in the range Yes.
  • the immobilized enzyme is packed in the enzyme column so that the packing thickness per stage is 10 to 200 mm.
  • the packed thickness of the immobilized enzyme per stage in the enzyme tower is preferably a force of 10 to 20 Omm, more preferably 15 to 200 mm, especially 75 to 20 Omm from the viewpoint of reactivity.
  • the empty space provided between the packed sections filled with the immobilized enzyme is less than the packed thickness of the immobilized enzyme in terms of reactivity, production, etc.
  • the thickness is preferably 1 to 200 mm, particularly 5 to 200 mm, and more preferably 15 to 20 Omm.
  • the filling part is preferably laminated in 2 to 30 stages, particularly 3 to 20 stages with the empty part in between, from the viewpoint of reactivity, production and the like.
  • reaction liquid to the enzyme tower it may be carried out separately by piping directly connected to the enzyme tower, or may be supplied by a common pipe. From the above, it is preferable to carry out piping separately connected to the enzyme tower.
  • the flow rate of the reaction liquid in the enzyme column is preferably 1 to 40 Omm / min, more preferably 5 to 20 Omm / min.
  • the liquid passing linear velocity (mm / min), feed volume per minute (mm 3 / min) (or feed rate (1 0_ 3 m L / min) also referred to as) the filling layer cross-sectional area of (mm 2 The value expressed by the quotient divided by).
  • the liquid passage speed is 40 Omm / min or less.
  • the flow rate is 1 mm / min or more. Since the expression activity of the immobilized enzyme changes depending on the flow rate, the optimal flow rate can be selected to determine the reaction conditions. Can respond to production capacity and manufacturing costs.
  • the residence time of the reaction solution in the immobilized enzyme packing section in the enzyme tower is from the viewpoint of avoiding the equilibrium state of the hydrolysis reaction, more effectively extracting the activity of the immobilized enzyme, and improving productivity. Second to 60 minutes, more preferably 1 to 40 minutes.
  • the residence time (minutes) is expressed as a value obtained by multiplying the thickness (mm) of the packed bed by the porosity and dividing this by the liquid linear velocity (mm / minute).
  • the reaction solution that has passed through the enzyme tower may be used as a reaction-finished product as it is in view of reactivity, productivity, and the like, and the reaction solution is once separated into oil and water to separate the oil phase. Later, fresh water may be added and supplied again to the same enzyme tower in the same manner as described above, and may be passed repeatedly until the desired reaction rate is obtained.
  • the reaction solution may be once separated into oil and water, and after separating the oil phase, fresh water may be added and supplied to another enzyme tower again by the same method as described above to carry out a continuous reaction.
  • the oil phase is supplied to the next enzyme tower and the aqueous phase is supplied to the previous enzyme tower.
  • an oil-water separation method of the reaction liquid an oil-water separator such as a natural sedimentation type or a centrifugal separation type is generally used, but is not particularly limited.
  • Duolite A-568 (Rohm and Hass, particle size distribution 100- "! 000 m) 1 part by mass was stirred for 1 hour in 10 parts by mass of N / 10 NaOH solution. After washing with 10 parts by mass of ion-exchanged water, 50 OmM phosphate buffer (pH 7) was equilibrated with 10 parts by mass, and then 50 mM phosphate buffer (pH 7) pH was equilibrated twice for 2 hours at 10 parts by mass, followed by filtration to recover the carrier, and ethanol substitution with 5 parts by mass of ethanol for 30 minutes.
  • the immobilized enzyme was recovered and washed with 10 parts by mass of 5 OmM phosphate buffer (pH 7) to remove unimmobilized enzyme and protein. After that, 4 parts by mass of rapeseed oil to be actually decomposed was added and stirred for 12 hours. All the above operations were performed at 20 ° C. Then, it was filtered and separated from fats and oils to obtain an immobilized enzyme. As a result, an immobilized lipase having a hydrolysis activity (activity to be expressed) of 2700 U / g (dry mass) was obtained. The average particle size based on the mass of the immobilized enzyme was 3 1 1;
  • a stainless steel column with a jacket (inner diameter 1 Omm, height 1400 mm) is packed with 27.0 g (dry mass) of the immobilized lipase (packing height 1 20 Omm), and the jacket is heated to 35 ° C. Keep warm. From the top of the column, a mixture of rapeseed oil and distilled water at a mass ratio of 10: 6 was fed at a rate of 1.57 mL / min, and the hydrolysis reaction was carried out. The results are shown in Table 1.
  • a stainless steel column with a jacket (inner diameter 1 Omm, height 1 950 mm) was filled with 4.83 g of the above immobilized lipase on a dry basis (packing height 200 mm), and an empty space (height 1 50 mm).
  • the hydrolysis reaction was carried out in the same procedure as in Reference Example 1 except that 6 layers were stacked with mm) in between. The results are shown in Table 1.
  • the saponification value is Am e r i c a n
  • a stainless steel column with a jacket was the same as in Example 1 except that 0.17825 kg of the immobilized lipase was packed on a dry basis (packing height 150 mm).
  • the hydrolysis reaction was performed according to the procedure. Next, the reaction liquid that passed through the column was once separated into oil and water, and the oil phase was separated. Then, new water was added and mixed, and the mixture was supplied again to another column of the same shape. Went. The results are shown in Table 1.
  • a stainless steel column with a jacket (inner diameter: 76.4 mm, height: 250 mm) is packed with 0.2 1 kg of the above immobilized lipase on a dry basis (packing height: 17 mm), and the feed rate is 92 mL.
  • the hydrolysis reaction was performed in the same manner as in Example 1 except that the time was changed to / min. Next, the reaction solution that passed through the column was once separated into oil and water, and the oil phase was separated. Then, fresh water was added and mixed, and then supplied again to another power ram of the same shape. Reaction was performed. The results are shown in Table 1.
  • a packed bed (packed height: 1 50 mm) filled with 13.37 kg of the above immobilized lipase on a dry base in a jacketed stainless steel column (inner diameter: 600 mm, height: 2250 mm)
  • the hydrolysis reaction was carried out in the same procedure as in Example 1 except that the stacking was performed in 8 steps with a thickness of 1 50 mm in between, and the feeding speed was 5655 mL / min.
  • Table 2 The results are shown in Table 2.
  • Example 3 The procedure was the same as in Example 1, except that a jacketed stainless steel column (inner diameter: 70 mm, height: 3 O Omm) was filled with 0.35 kg of the immobilized lipase on a dry basis (packing height: 300 mm). Hydrolysis reaction was performed. Next, the reaction liquid that passed through the column was once separated into oil and water, and the oil phase was separated. Then, fresh water was added and mixed, and again supplied to another power ram of the same shape. Reaction was performed. The results are shown in Table 3.
  • Example 1 except that a stainless steel column with a jacket (inner diameter 7 Omm, height 1 300 mm) was packed with 1.2 kg of the immobilized lipase on a dry basis (packing height 1 1 7 7 mm).
  • the hydrolysis reaction was performed according to the procedure. The results are shown in Table 3.

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Abstract

　本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０～２００ｍｍである有用物質の製造方法に関する。 　固定化酵素を充填した固定床型反応塔へ２液相を形成する液体混合物を供給して行う有用物質の製造方法において、塔内の反応液全体の流れを均一化することができ、その結果、反応性と生産性を向上する事ができる。

Description

明 細 書
固定化酵素を用いた有用物質の製造方法
技術分野
[0001 ] 本発明は、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔を用いた反応による有用 物質の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 液体を固定床型反応塔に通液して行う反応として、 L—ァスパラギン酸生 成、 エステル交換油脂生成、 乳糖加水分解、 油脂類の加水分解等に利用され ている固定化酵素を用いた反応が知られている。 これらの反応は、 いずれも 発熱量が比較的小さい為、 通常、 最も単純なドラム型反応器が使用されてい る。
[0003] 固定化酵素を用いた反応のうち、 油脂類の加水分解のように 2種類以上の 液を反応塔に流通させる場合には、 反応効率向上の観点から、 反応液を均一 に混合した状態で通液することが好ましい。 この場合、 加水分解に用いる油 相基質と水相基質は、 本来混合しても一相にならないものであるため、 エマ ルシヨンとするのが一般的である。 一方で、 エマルシヨン粒子は担体の細孔 内に吸着した酵素に到達し難いため、 通液速度を、 反応液が乳化しない範囲 とした技術もある （特許文献 1参照） 。
[0004] また、 固定床に油相基質と水相基質を流通させる方法としては、 向流で流 通させる方法 （特許文献 1、 2参照） 、 及び並流で流通させる方法 （特許文 献 3参照） があるが、 前者は特殊な仕組みと運転方法が必要となるため、 一 般的には並流で流通させる方法が採られている。
特許文献 1 ：特開昭 6 1 - 8 5 1 9 5号公報
特許文献 2：特開平 1—9 8 4 9 4号公報
特許文献 3：特開 2 0 0 0 _ 1 6 0 1 8 8号公報
発明の開示
[0005] 本発明は、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に 2液相を形成する液体 混合物を供給し、 同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法にお いて、 円相当径が 3 5 m m 0以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定 化酵素の充填厚みが 1 0〜2 0 O m mである有用物質の製造方法を提供する ものである。
また、 本発明は、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に 2液相を形成す る液体混合物を供給し、 同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方 法において、 円相当径が 3 5 m m 0以上である固定床型反応塔の一段当たり の充填厚みが 1 0〜2 0 O m mである固定化酵素を充填した充填部を、 充填 厚み以下の厚みを有する空積部を間に挟んで、 少なくとも 2段以上積層した 多段式固定床型反応塔を用いる有用物質の製造方法を提供するものである。 また、 本発明は、 円相当径が 3 5 m m 0以上であり、 一段当たりの固定化 酵素の充填厚みが 1 0〜2 0 O m mである固定床型反応塔を提供するもので 発明の実施の形態
[0006] 前記固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、 2液相を形成する液体混合 物を流通させて反応を行う方法においては、 反応塔の径が大きくなるに従つ て、 塔内における反応液の流れが不均一となり、 効率的に反応が進まない部 分が生じ、 結果として反応性が低下するという問題があることを見出した。 この場合、 反応性を高めるために、 単に固定化酵素と反応液の接触時間を長 くしょうとすると、 生産性 （流量） が低下するという問題もある。
[0007] 従って、 本発明は、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、 2液相を形 成する液体混合物を流通させて反応を行う有用物質の製造方法において、 流 量を低下させずに反応性を高め、 生産性を向上させることにより、 より効率 的に有用物質を製造する方法に関する。
[0008] そこで本発明者は、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔における反応液 の流通の特徴を解析した結果、 固定床型反応塔の径が大きくなると、 油相と 水相の流動様相の違いにより、 一定の充填厚みを超えたところから塔内での 反応液の不均一化が生じ、 反応性が低下することを見出した。 そこで、 固定 床型反応塔の一段あたりの固定化酵素の充填厚みを規定し、 液液二相流を整 流することにより、 高い反応性を維持したまま、 生産性を向上させることが できることを見出した。
[0009] 本発明によれば、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔へ 2液相を形成す る液体混合物を供給して行う有用物質の製造方法において、 塔内の反応液全 体の流れを均一化することができ、 その結果、 反応性と生産性を向上する事 ができる。 特に、 油脂類の加水分解においては、 酵素活性を有効に発現させ 、 脂肪酸類を効率的に製造することができる。
[0010] 本発明においては、 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に 2液相を形成 する液体混合物 （反応液） を供給する。 固定床型反応塔 （以下 「酵素塔」 と もいう） とは、 固定化酵素をカラム等に充填し、 固定化担体間の空隙及び固 定化担体の細孔に反応液を流通させ得るようにしたものをいう。 固定床型反 応塔は、 固定化酵素を充填した充填部を 1段有する一つの固定床型反応器か ら構成されていてもよく、 該充填部を空積部を間に挟んで 2段以上積層した 多段式固定床型反応塔でもよい。
2液相とは、 2種類の液体が混合後にも 1相にならない状態をいい、 分相 しているものから、 均一であっても乳化状態となっているものも含む。
[001 1 ] 本発明の態様としては、 固定化酵素として油脂分解酵素を固定化担体に吸 着させたものを用い、 これを充填した酵素塔に、 2液相として油相基質と水 相基質を流通させることによる油脂類の加水分解反応により、 有用物質とし て脂肪酸類を製造する方法であることが好ましい。
[0012] 本発明においては、 2液相を同一方向に並流させる。 この場合、 2液相を 予め混合して乳化状態として供給しても良く、 分相したまま供給しても良い 。 また、 2液相を一定時間毎に交互に供給しても良い。 酵素塔への各基質の 供給は、 塔頂から塔底へ下方流で行っても、 塔底から塔頂へ上方流で行って も良い。
[0013] 本発明で用いる固定化酵素は、 固定化担体に酵素を吸着等により担持させ たものである。 固定化担体としては、 セライ ト、 ケイソゥ土、 力オリナイ ト 、 シリカゲル、 モレキュラーシ一ブス、 多孔質ガラス、 活性炭、 炭酸カルシ ゥム、 セラミックス等の無機担体、 セラミックスパウダー、 ポリビニルアル コール、 ポリプロピレン、 キトサン、 イオン交換樹脂、 疎水吸着樹脂、 キレ ート樹脂、 合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、 特に保水力が高 い点からイオン交換樹脂が好ましい。 また、 イオン交換樹脂の中でも、 大き な表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、 多孔 質であることが好ましい。
[0014] 固定化担体として用いる樹脂の粒子径は 1 00〜 1 O O O mが好ましく 、 更に 250〜750 mが好ましい。 細孔径は 1 0〜 1 50 n mが好まし <、 更に 1 0〜 1 00 n mが好ましい。 材質としては、 フエノールホルムァ ルデヒド系、 ポリスチレン系、 アクリルアミ ド系、 ジビニルベンゼン系等が 挙げられ、 特にフヱノールホルムアルデヒド系樹脂 （例えば、 Ro hm a n d H a s s社製 D u o l i t e A- 568) が酵素吸着性向上の点か ら好ましい。
[0015] 本発明の固定化酵素に使用する酵素は特に限定はされないが、 生産性の向 上効果が大きい点から、 油脂類分解用酵素としてのリパーゼが好ましい。 リ パーゼは、 動物由来、 植物由来のものはもとより、 微生物由来の市販リパー ゼを使用することもできる。 微生物由来リパーゼとしては、 リゾブス （R i z o p u s ) 1禹、 ァスへゾレキリレス (A s p e r g i I I u s) ムコ一ゾレ (M u c o r ) 、 ンュ一トモナス (P s e u d omo n a s) I禹、 ンォト リケム （G e o t r i c h um; I禹、 へニンリゥム (P e n i c i I I i u m) 属、 キャンディダ （C a n d i d a) 属等の起源のものが挙げられる。
[0016] 酵素の固定化を行う温度は、 酵素の特性によって決定することができるが 、 酵素の失活が起きない 0〜60°C、 特に 5〜40°Cが好ましい。 また固定 化時に使用する酵素溶液の p Hは、 酵素の変性が起きない範囲であればよく 、 温度同様酵素の特性によって決定することができるが、 p H 3〜9が好ま しい。 この p Hを維持するためには緩衝液を使用するが、 緩衝液としては、 酢酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。 上記酵素溶 液中の酵素濃度は、 固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、 かつ十分 な濃度であることが好ましい。 また酵素溶液は、 必要に応じて不溶部を遠心 分離で除去した上澄や、 限外濾過等によって精製したものを使用することも できる。 また用いる酵素質量はその酵素活性によっても異なるが、 担体質量 に対して 5〜 1 0 0 0質量％、 特に 1 0〜5 0 0質量％が好ましい。
[0017] 酵素を固定化する場合、 担体と酵素を直接吸着してもよいが、 高活性を発 現するような吸着状態にするため、 酵素吸着前に予め担体を脂溶性脂肪酸又 はその誘導体で処理することが好ましい。 脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担 体の接触法としては、 水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、 分 散性を良くするため、 有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、 溶解させた後、 水に分散させた担体に加えてもよい。 この有機溶剤としては 、 クロ口ホルム、 へキサン、 エタノール等が挙げられる。 脂溶性脂肪酸又は その誘導体の使用質量は、 担体質量に対して 1〜5 0 0質量％、 特に 1 0〜 2 0 0質量％が好ましい。 接触温度は 0〜 1 0 0 °C、 特に 2 0〜 6 0 °Cが好 ましく、 接触時間は 5分〜 5時間程度が好ましい。 この処理を終えた担体は 、 ろ過して回収するが、 乾燥してもよい。 乾燥温度は室温〜 1 0 0 °Cが好ま しく、 減圧乾燥を行ってもよい。
[0018] 予め担体を処理する脂溶性脂肪酸又はその誘導体のうち、 脂溶性脂肪酸と しては、 炭素数 4〜2 4、 好ましくは炭素数 8〜 1 8の飽和又は不飽和の、 直鎖又は分岐鎖の、 水酸基を有していてもよい脂肪酸が挙げられる。 具体的 には、 力プリン酸、 ラウリン酸、 ミリスチン酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 ひ一リノレン酸、 リシノール酸、 イソステアリン酸等が挙げられる。 また前 記脂溶性脂肪酸の誘導体としては、 これらの脂溶性脂肪酸と一価若しくは多 価アルコール又は糖類とのエステル、 リン脂質、 及びこれらのエステルにェ チレンォキサイ ドを付加したもの等が挙げられる。 具体的には、 上記脂肪酸 のメチルエステル、 ェチルエステル、 モノグリセライ ド、 ジグリセライ ド、 それらのエチレンオキサイ ド付加体、 ポリグリセリンエステル、 ソルビタン エステル、 ショ糖エステル等が挙げられる。 これら脂溶性脂肪酸及びその誘 導体はいずれも常温で液状であることが酵素を担体に固定化する工程上好ま しい。 これら脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、 上記 2種以上を併用し てもよく、 菜種脂肪酸、 大豆脂肪酸等の天然由来の脂肪酸を用いることもで さる。
[0019] 固定化酵素の加水分解活性は 2 0 U / g以上、 更に 1 0 0〜 1 O O O O U Z g、 特に 5 0 0〜5 0 0 0 U / gの範囲であることが好ましい。 ここで酵 素の 1 Uは、 4 0 °Cにおいて、 油脂類：水 = 1 0 0 ： 2 5 (質量比） の混合 液を攪拌混合しながら 3 0分間加水分解をさせたとき、 1分間に I の遊離脂肪酸を生成する酵素の分解能を示す。 油脂類の単位質量当りに付与 した固定化酵素の加水分解活性 （U / g— o i I ) と、 ある加水分解率に到 達するまでの所要時間は、 略反比例の関係にある。
[0020] 固定化酵素を充填した充填層 （酵素塔） を用いて加水分解を行う場合、 送 液条件 （通液速度、 温度等） により分解速度は異なるが、 酵素充填層出口に おける油脂の加水分解率、 加水分解所要時間 （充填層内の滞留時間） 、 充填 層内に存在する油脂類の質量 （g— o i I ) 及び固定化酵素の充填質量 （g ) から固定化酵素の見かけ活性 （発現活性） （U / g ) が求められる。 なお
、 充填層内に存在する油脂類の質量を求めるためには、 固定化酵素充填部の 容積に充填部の空隙率、 反応液中の油脂類の容量比及び油脂類の比重を乗ず ることにより求める。
[0021 ] 本発明に使用する 2液相を形成する液体混合物のうちの 1つは油相基質で あることが好ましい。 油相基質とは主に植物油、 動物油又はこれらを組み合 わせた油脂類をいうが、 油脂類とはトリアシルグリセロールの他、 ジァシル グリセロール、 モノァシルグリセロール、 又は脂肪酸類を含んでいても良く 、 加水分解の結果得られる脂肪酸を含んでいても良い。 油相基質の具体例と しては、 菜種油、 大豆油、 ヒマヮリ油、 パーム油及びアマ二油等の植物油、 牛脂、 豚脂及び魚油等の動物油等、 又はこれらの組み合わせの油脂類が挙げ られる。 これら油脂類は、 脱臭油の他、 予め脱臭されていない未脱臭油脂を 用いることができるが、 これら油脂類の一部又は全部に未脱臭油脂を使用す ることが、 トランス不飽和脂肪酸、 共役不飽和脂肪酸を低減し、 原料油脂由 来の植物ステロール、 植物ステロール脂肪酸エステル、 トコフエロールを残 存させることができる点から好ましい。 油相基質中には、 前記油脂類の他に 脂肪酸等の油溶性成分が混合されていても良い。 脂肪酸類とは、 加水分解の 結果得られる脂肪酸の他、 上記グリセリ ドの 1種以上を含むものも指す。
[0022] 本発明に使用する 2液相を形成する液体混合物のうちの他の 1つは水相基 質であることが好ましい。 水相基質は水であるが、 加水分解の結果得られる グリセリン等、 その他の水溶性成分が混合されていても良い。
[0023] 本発明においては、 円相当径が 35mm0以上であり、 一段当たりの固定 化酵素の充填厚みが 1 0〜20 Ommである酵素塔を用いて反応を行う。 酵 素塔の円相当径が 35 m m 0より大きくなるに従って、 反応液の流れが不均 -となり、 反応性が低下するという傾向となる。
酵素塔の円相当径は、 反応性、 生産性の点から 35〜 1 0, 000 mm 0 、 特に 35〜7, 50 Omm0、 更に 35〜5, O O Omm0とするのが好 ましい。
なお、 円相当径とは、 酵素塔が円形の場合はその直径を云い、 多角形の場 合はその投影面積と同じ面積を持つ円の直径を云い、 投影面積を Aとして次 式 （1 ) により求められる。
D = 2 (Α/7Γ) Λ 0. 5 ( 1 )
(D ： 円相当径 （mm) 、 A ： 多角形の投影面積 （mm2) )
[0024] 本発明において使用する酵素塔の形状は使用するポンプの押し込み圧に耐 えられるものであれば良い。 また、 酵素塔の周囲にジャケットを設け、 酵素 塔内に流通する反応液を酵素反応に適した温度に調整できるものであること が好ましい。
[0025] 酵素塔内の温度は、 固定化酵素の活性をより有効に引き出すために、 0〜 60°C、 更に 20〜40°Cとすることが好ましい。 酵素塔の長さは、 所望の 分解率を得るのに必要な長さとすれば良いが、 反応性、 塔内圧力損失等の点 から 0. 0 1〜 1 Om、 好ましくは 0. 1〜5mの範囲とすることが好まし い。
[0026] 本発明においては、 固定化酵素を、 一段当たりの充填厚みが 1 0〜200 mmとなるように酵素塔に充填する。 このように、 固定化酵素の充填厚みを 規定することにより、 反応液の流れが不均一になるのを防止でき、 反応液の 流れが整流化されるため、 酵素活性を有効に発現させ、 加水分解を効率的に 行うことができる。 酵素塔における一段当たりの固定化酵素の充填厚みは、 反応性の点から 1 0〜20 Ommである力 更に 1 5〜200mm、 特に 7 5〜20 Ommとするのが好ましい。
[0027] また、 多段式固定床型反応塔を用いる場合、 固定化酵素を充填した充填部 の間に設けられる空積部は、 反応性、 生産等の点から固定化酵素の充填厚み 以下の厚みを有することが好ましく、 1〜200mm、 特に 5〜200mm 、 更に 1 5〜20 Ommであることが好ましい。 この多段式固定床型反応塔 を用いることにより、 逐次混合しなくてもより高い反応性を維持できる。 充填部は、 反応性、 生産等の点から空積部を間に挟んで 2〜30段積層す ることが好ましく、 特に 3〜20段積層することが好ましい。
[0028] 酵素塔へ反応液を供給する方法としては、 それぞれ別々に酵素塔へ直結す る配管にて行ってもよく、 又は共有の配管にて供給を行っても良いが、 操作 性の点から、 別々に酵素塔へ直結する配管にて行うことが好ましい。
酵素塔内における反応液の通液線速度は、 好ましくは 1〜40 Omm/分 、 更に 5〜20 Omm/分であるのが好ましい。 この通液線速度 （mm/分 ) は、 1分間当りの送液量 （mm3/分） （又は送液速度 （1 0_3m L/分） ともいう） を充填層断面積 （mm2) で除した商で表わされる値をいう。 通液 線速度を上げることによる充填塔内圧力の増大に伴ない、 通液が困難となり 、 耐圧性の高い酵素充填塔が必要となる他に、 固定化酵素が塔内圧力増加に より破砕される場合が生じることもあるため、 通液線速度は 40 Omm/分 以下とすることが好ましい。 また、 生産性の点から通液線速度は 1 mm/分 以上とすることが好ましい。 固定化酵素の発現活性は、 通液線速度により変 化するため、 最適な通液線速度を選定して反応条件を決定することで、 所望 の生産能力、 製造コス卜に見合った反応を行うことができる。
[0029] 酵素塔内の固定化酵素充填部における反応液の滞留時間は、 加水分解反応 の平衡状態を回避し、 固定化酵素の活性をより有効に引き出し、 生産性を向 上させる点から 30秒〜 60分、 更に 1分〜 40分とすることが好ましい。 滞留時間 （分） とは、 充填層の厚み （mm) に空隙率を乗じ、 これを通液線 速度 （mm/分） で除した値で表わされる。
[0030] 本発明においては、 反応性、 生産性等の兼ね合いから、 酵素塔を通過した 反応液をそのまま反応終了物としても良く、 また、 反応液を一旦油水分離し 、 油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同様の方法で再度同一の酵素 塔へ供給し、 所望の反応率が得られるまで繰り返し通過させても良い。 また 、 反応液を一旦油水分離し、 油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同 様の方法で再度、 別の酵素塔へ供給して連続反応を行っても良い。 また、 複 数の酵素塔を用いて反応液の油水分離を行いながら、 油相を次の酵素塔へ、 水相を前の酵素塔へ供給する事により、 より分解率の高い油相を新鮮な水相 と反応させる擬似向流法で行っても良い。 反応液の油水分離法としては、 自 然沈降型、 遠心分離型等の油水分離器が一般に使用されるが、 特に限定され ない。
実施例
[0031] [固定化リパーゼの調整]
D u o l i t e A-568 (Ro hm a n d H a s s社製、 粒径分布 1 00〜 "！ 000 m) 1質量部を N / 1 0の N a O H溶液 1 0質量部中で 1時間攪拌した。 ろ過した後 1 0質量部のイオン交換水で洗浄し 50 OmM のリン酸緩衝液 （p H 7) 1 0質量部で p Hの平衡化を行った。 その後 50 mMのリン酸緩衝液 （ p H 7 ) 1 0質量部で 2時間づっ 2回 p Hの平衡化を 行った。 この後ろ過を行い担体を回収した後、 エタノール 5質量部でエタノ ール置換を 30分行った。 ろ過した後、 リシノール酸を 1質量部含むエタノ —ル 5質量部を加え 30分間、 リシノール酸を担体に吸着させた。 ろ過によ つて担体を回収した後、 5 OmMのリン酸緩衝液 （p H 7) 5質量部で 30 分づっ 4回洗浄し、 エタノールを除去し、 ろ過して担体を回収した。 その後 市販のリパーゼ （リパーゼ AY、 アマノ天野製薬 （株） ） 1質量部を 50m Mのリン酸緩衝液 （p H 7) 9質量部に溶解した酵素液と 5時間接触させ、 固定化を行った。 ろ過し、 固定化酵素を回収して 5 OmMのリン酸緩衝液 （ p H 7) 1 0質量部で洗浄を行うことにより、 固定化していない酵素やタン パクを除去した。 その後実際に分解を行う菜種油を 4質量部加え 1 2時間攪 拌した。 以上の操作はいずれも 20°Cで行った。 その後ろ過して油脂と分離 し、 固定化酵素とした。 その結果、 2700 U/g (乾燥質量） の加水分解 活性 （発現すべき活性） を示す固定化リパーゼが得られた。 固定化酵素の質 量基準の平均粒子径は 3 1 1 ； であった。
[0032] <参考例 1 >
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 1 Omm、 高さ 1 400mm ) に、 前記固定化リパーゼ 27. 0 g (乾燥質量） を充填し （充填高さ 1 2 0 Omm) 、 ジャケットにて 35°Cに保温した。 カラム上部より菜種油と蒸 留水を質量比 1 0 ： 6で混合した液を 1. 57m L/分で送液し、 加水分解 反応を行った。 その結果を表 1に示す。
[0033] <参考例 2>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 1 Omm、 高さ 1 950mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 4. 83 g充填した充填部 （充填 高さ 200mm) を、 空積部 （高さ 1 50 mm) を間に挟んで 6段積層した 以外は、 参考例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 1に 示す。
[0034] 表 1に示すとおり、 酵素塔の径が 1 0 mm 0程度の場合は、 固定化酵素の 充填高さがどの程度であろうとも、 固定化酵素の （見掛け） 活性が有効に発 現することが明らかとなった。
[0035] <実施例 1 >
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 50mm) に、 前記固定化リパーゼ 0. 1 6 k g (乾燥質量） を充填し （充填高さ 1 5 Omm) 、 ジャケットにて 35°Cに保温した。 カラム上部より菜種油と蒸留 水を質量比 1 0 : 6で混合した液を 77m L/分で送液し、 加水分解反応を 行った。 結果を表 1に示す。 なお、 表中の分解率は、 分析により求めた酸価 をケン化価で除することにより算出した。 酸価は、 Am e r i c a n O i I C h em i s t s. S o c i e t y O f f i c i a l M e t h o d
C a 5 a _40に記載の方法により、 またケン化価は Am e r i c a n
◦ ι I し h em i s t s. S o c i e t y O f f i c i a l M e t h o d C d 3 a _ 94に記載の方法により測定した。
[0036] <実施例 2>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 50mm) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 1 7825 k g充填した （充填 高さ 1 50 mm) 以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 次いで、 カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、 新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、 同様の手順で 計 4回加水分解反応を行った。 結果を表 1に示す。
[0037] <実施例 3>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 76. 4mm、 高さ 250m m) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 2 1 k g充填し （充填高さ 1 7 Omm) 、 送液速度を 92 m L /分にした以外は、 実施例 1 と同様の手 順で加水分解反応を行った。 次いで、 カラムから通過した反応液を一旦油水 分離して油相を分取した後、 新しい水を加えて混合し再度同一形状の別の力 ラムへ供給し、 同様の手順で計 8回加水分解反応を行った。 結果を表 1に示 す。
[0038] <実施例 4>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 050mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 1 78 k g充填した充填部 （ 充填高さ 1 50 mm) を、 空積部 （高さ 1 50 mm) を間に挟んで 4段積層 した以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 1に示す。
[0039] <実施例 5>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 6 O Omm、 高さ 1 50mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 1 3. 37 k g充填し （充填高さ 1 5 Omm) 、 送液速度を 5655 m L /分にした以外は、 実施例 1 と同様 の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 2に示す。
[0040] <実施例 6>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 6 O Omm、 高さ 1 050m m) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 1 3. 37 k g充填した充填部 (充填高さ 1 50 mm) を、 空積部 （高さ 1 50 mm) を間に挟んで 4段積 層し、 送液速度を 5655m L/分にした以外は、 実施例 1 と同様の手順で 加水分解反応を行った。 結果を表 2に示す。
[0041] <実施例 7 >
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 600mm、 高さ 2250m m) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 1 3. 37 k g充填した充填層 (充填高さ 1 50 mm) を、 空積部 （高さ 1 50 mm) を間に挟んで 8段積 層し、 送液速度を 5655m L/分にした以外は、 実施例 1 と同様の手順で 加水分解反応を行った。 結果を表 2に示す。
[0042] <実施例 8>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 1 25mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 085 k g充填した充填部 （ 充填高さ 75mm) を、 空積部 （高さ 75mm) を間に挟んで 8段積層した 以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 2に 示す。
[0043] <実施例 9>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 70mm、 高さ 645mm) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 1 725 k g充填した充填部 （ 充填高さ 1 50 mm) を、 空積部 （高さ 1 5 mm) を間に挟んで 4段積層し た以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 2
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), iswi^¾goom ΛmΛ 0mm7
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^52004 に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 36 k g充填 （充填高さ 300 mm) した以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結 果を表 3に示す。
[0047] <比較例 2>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 70mm、 高さ 3 O Omm) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 35 k g充填 （充填高さ 300 mm) した以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 次いで 、 カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、 新しい 水を加えて混合し再度同一形状の別の力ラムへ供給し、 同様の手順で計 2回 加水分解反応を行った。 結果を表 3に示す。
[0048] <比較例 3>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 650mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 0. 35 k g充填した充填部 （充 填高さ 3 O Omm) を、 空積部 （高さ 1 50 mm) を間に挟んで 4段積層し た以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 3 に示す。
[0049] <比較例 4>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 7 Omm、 高さ 1 300mm ) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 1. 2 k g充填 （充填高さ 1 1 7 7mm) した以外は、 実施例 1 と同様の手順で加水分解反応を行った。 その 結果を表 3に示す。
[0050] <比較例 5>
ジャケット付きのステンレス製カラム （内径 600mm、 高さ 1 500m m) に、 前記固定化リパーゼを乾燥ベースで 1 03. O k g充填し （充填高 さ 1 30 Omm) 、 送液速度を 5655 m L/分にした以外は、 実施例 1 と 同様の手順で加水分解反応を行った。 その結果を表 3に示す。
[0051] ほ 3]
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表 1〜表 3に示した結果から、 固定床型反応塔の一段あたりの固定化酵素 の充填厚みを規定することにより、 固定化酵素の （見掛け） 活性が有効に発 現することが明らかとなった。 また、 反応塔として充填部と空積部を交互に 有する多段式固定床型反応塔を用いることにより、 固定化酵素の （見掛け） 活性をより有効に発現させることができ、 油脂類の加水分解率が向上するこ とが明らかとなった。

Claims

請求の範囲
[1 ] 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に 2液相を形成する液体混合物を供 給し、 同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、 円相 当径が 3 5 m m 0以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充 填厚みが 1 0〜2 0 O m mである有用物質の製造方法。
[2] 固定化酵素を充填した固定床型反応塔に 2液相を形成する液体混合物を供 給し、 同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、 円相 当径が 3 5 m m 0以上である固定床型反応塔の一段当たりの充填厚みが 1 0 〜2 0 O m mである固定化酵素を充填した充填部を、 充填厚み以下の厚みを 有する空積部を間に挟んで、 少なくとも 2段以上積層した多段式固定床型反 応塔を用いる有用物質の製造方法。
[3] 前記液体混合物のうち一種が油相基質である請求項 1又は 2記載の有用物 質の製造方法。
[4] 前記液体混合物のうち一種が水相基質である請求項 1〜 3のいずれか 1項 記載の有用物質の製造方法。
[5] 前記反応が固定化リパーゼを用いた油脂類の加水分解反応である請求項 1
〜 4のいずれか 1項記載の有用物質の製造方法。
[6] 有用物質が脂肪酸類である請求項 1〜 5のいずれか 1項記載の有用物質の 製造方法。
[7] 円相当径が 3 5 m m 0以上であり、 一段当たりの固定化酵素の充填厚みが
1 0〜2 0 O m mである固定床型反応塔。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5242236B2 (ja) * 2008-05-08 2013-07-24 花王株式会社 脂肪酸類の製造方法
WO2013114178A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Arvind Mallinath Lali Enzymatic process for fat and oil hydrolysis

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6185195A (ja) 1984-10-02 1986-04-30 Agency Of Ind Science & Technol 脂質の連続加水分解法
JPH0198494A (ja) 1987-10-09 1989-04-17 Agency Of Ind Science & Technol バイオリアクター
JP2000160188A (ja) 1998-11-26 2000-06-13 Kao Corp 油脂の加水分解方法
JP2000297295A (ja) * 1999-04-14 2000-10-24 Kao Corp 油脂の加水分解方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5292649A (en) * 1983-03-29 1994-03-08 Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry Method for reaction of lipase upon fatty acid
US4629742A (en) * 1986-01-27 1986-12-16 Akzo America Inc. Hydrolysis of fats
DE19823332C2 (de) * 1998-05-26 2000-09-07 Unifar Kimya Sanayii Ve Ticare Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Betalactam-Antibiotika
US6258575B1 (en) * 1998-11-26 2001-07-10 Kao Corporation Hydrolyzing fats and oils using an immobilized enzyme column and substrate-feeding chamber that separates phases
JP3764855B2 (ja) * 2001-06-22 2006-04-12 花王株式会社 油脂類の加水分解方法
US8241875B2 (en) 2005-06-21 2012-08-14 Kao Corporation Method for producing fatty acids with an immobilized enzyme packed column
KR101294474B1 (ko) * 2005-10-05 2013-08-07 카오카부시키가이샤 고정화 효소를 이용한 유용 물질의 제조 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6185195A (ja) 1984-10-02 1986-04-30 Agency Of Ind Science & Technol 脂質の連続加水分解法
JPH0198494A (ja) 1987-10-09 1989-04-17 Agency Of Ind Science & Technol バイオリアクター
JP2000160188A (ja) 1998-11-26 2000-06-13 Kao Corp 油脂の加水分解方法
JP2000297295A (ja) * 1999-04-14 2000-10-24 Kao Corp 油脂の加水分解方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H-KITTIKUN A. ET AL.: "Continuous Production of Fatty Acids from Palm Olein by Immobilized Lipase in a Two-Phase System", J. AM. OIL. CHEM. SOC., vol. 77, no. 6, 2000, pages 599 - 603, XP008109277 *
See also references of EP2090661A4 *
WISDOM R.A. ET AL.: "Enzymatic Interesterification of Fats: Laboratory and Pilot-Scale Studies with Immobilized Lipase from Rhizopus arrhizus", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 29, no. 9, 1987, pages 1081 - 1085, XP009109242 *

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