JPS6185195A - 脂質の連続加水分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は固定化リパーゼカラムを用いて油脂、リン脂質
、高級脂肪酸エステル等を加水分解し、脂肪酸やモノグ
リセライド、ジグリセライド等の油状分解産物と、グリ
セリン、グリセロリン酸、アルコール等の水溶性分解産
物を採取する方法に関するものであり、油脂工業、医薬
品産業、食品工業等で利用できるものである。

（ロ）従来の技術 固定化リパーゼの反応装置としては、光架橋性ゲルに包
括固定化したリパーゼをカラムに充填し、予め水と油を
攪拌混合しておき、その混合物を充填塔に還流させる方
法がある（Ｙ、ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ。

Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ａｐｐｌ、　　Ｍｉｃｒｏｌ、　
　Ｂｉｏｔ、ｅｃｈｎｏｌ、、　　１７．　１０７（１
９８３））。またオクチルセファ０−スゲル等の両媒性
ゲルにリパーゼを固定化し液体脂肪酸と混ぜ液体脂肪酸
中の未分解のエステルを分解する方式も報告されている
（Ｔ、　Ｙａｍａｎｅ　ｅシミ１．　Ｊ、　Ｆｅｒ’ｍ
ｅｎｔ、。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、　６０．５１７（１９８２））。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 既に報告されている固定化リパーゼカラムを用いて脂質
を分解するには、水と脂質を予め混合させてエマルジョ
ン化することが必要不可欠であり、攪拌動力を要する他
、エマルジョン粒子がゲル型固定化担体中に拡散する移
動速度が著しく遅い固定化リパーゼの充分な活性度を発
揮させるためには、固定化カラムに何回も反応液を循環
させる必要があり半連続型を越えることができない（Ｙ
。

Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

口ｉｏｔ、ｅｃｈｎｏ１．．１７．１０７（１９８３）
）、また両親媒性含水ゲルを用いる場合、分解産物がゲ
ルの表面及びゲル内に蓄積するため、長期間の操り返し
使用は不可能であり、手数を要する再生操作を必要とす
る（Ｔ、　　Ｙａｍａｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、
　　Ｆｅｒｍｅｎｔ、、　　Ｔｃｈｎｏｌ、　　６０゜
５１７（１９８２））。

（ニ）問題点を解決するための手段 本発明者らは従来法の諸欠点を改良すべく鋭意研究を重
ねた結果、上端から下端に渡って連続的に基質及び反応
産物の出入口設置可能な塔型固定化リパーゼカラムを用
いて油脂等の分解を行えば水と基質を工°マルジョンと
して供給する必要もなく中上段より水溶液、中下段より
油状基質を連続的に供給でき、しかも上端より油状分解
産物、下端より水溶性分解産物を連続的に分別採取でき
ることを見い出した。

すなわち、本発明は、塔型固定化リパーゼカラムで脂質
を分解するにあたり、中上段より水溶液、中下段より油
状基質を連続的に供給し、上端より油状分解産物、下端
より水溶性分解産物を連続的に採取することを特徴とす
る脂質の連続加水分解法である。

本発明に用いる固定化リパーゼカラムとは上端から下端
にわたって連続的に基質及び反応産物の出入口設置可能
な塔型固定化リパーゼカラムである。通常は中上段、中
下段、上端及び下端に出入口のある垂直に立てた充填層
型カラムである。ここでいう中上段、中下段とは上端及
び下端の中間と上端との間を中上段といい、中間と下端
との間を中下段という。反応生産物が油層及び水層の二
層以上に分かれる場合その夫々の層に回収口を取るつけ
ることにより夫々の反応生産物の分別が可能となる。カ
ラム中には固定化リパーゼを充填するので、その固定化
リパーゼの至適温度に保持出来るような装置をつける必
要がある。通常は外套管を用い、外套管内に熱交換水を
流して一定温度に保持する。上端あるいは下端の出入口
の開口部には夫々油状生産物しか通さない疎水性の膜あ
るいは可溶性生産物しか通さない親水性の膜を通過する
ようにすることにより、油状分解生産物あるいは水溶性
分解産物の分別採取が的確になるとともに固定化酵素の
流出も防げる。

本発明における油状基質とはグリセリンと脂肪酸のエス
テルである油脂、リン脂質あるいはアルコールと高級脂
肪酸のエステル等である。水溶液とは水の他に必要なら
ば可溶性の添加物を溶かし産物とはグリセリン、グリセ
ロリン酸、アルコール等を含む水溶液である。本発明に
使用されるリパーゼとは上記油状基質を加水分解する酵
素ならばいずれのものでも使用できる。しかし牛脂等の
高融点の基質を分解する場合、その融点以上で働かせる
必要があり、高温反応性かつ耐熱性のシュウトモナス・
フルオレセンス・バイオタイプＩＮｃ１０２１（微工研
菌寄５４９５号）や、シュウトモナス・セパシア（微工
研菌寄イ≧号）等を用いることが望ましい。耐熱性リパ
ーゼは低融点の基質を分解する場合でもＰＨや反応液組
成の変化に対して比較的安定でありしかも反応槽を６０
℃付近の比較的高い温度に保てるため、生物素材を用い
るバイオリアクターで常に大きな問題となる微生物汚染
が防げ望しいリパーゼである。本発明で使用されるリパ
ーゼの固定化法としては担体結合法や包括法など酵素の
固定化法として数多く報告されている方法ならばいずれ
の方法でも採用しうる。本発明の基質はエマルジョンで
なく連続層として供給するので、エマルジョン粒子が担
体内に結合しているリパーゼ分子に到達する過程が改善
されているため、いずれの固定化法でも比較的高い生産
性が得られる。ポリカチオンに固定化したリパーゼを用
いると、リパーゼ分子周辺の微細環境が生産物阻害を取
り除くようになるともに、リパーゼが担体に多点結合し
て安定化するため望ましい固定化リパーゼが得られる。

（特許公告５９−２０３５７、特願昭５８−５３２８５
）。

本発明における固定化リパーゼカラムの運転方式は中上
段より水溶液、中下段より油状基質を連続的に供給し、
下端より水溶性分解産物、上端より油状分解産物を連続
的に回収する。水溶液の供給量と水溶性分解産物の回収
量はほぼ同じくらいに調節すれば良い。水溶性分解産物
であるアルコールやグリセリンが溶けても体積変化がす
くないからである。一方、油状生産物の回収速度は油状
基質の供給量に影響され、水の供給量にはあまり影響さ
れない、基質の供給速度や分解産物の回収速度を調節す
ることにより固定化カラム充填層中の油水分離層の位置
を変えることが可能である。反応が定常状態になれば１
分解産物の回収量や油水分離層の位置は一定になるが定
常状態になるまでは水溶液及び油状基質の供給速度とと
もに水溶性分解産物の回収速度を定量ポンプにより制御
すれば油状分解産物はおのずから固定化リパーゼカラム
上端より回収されるようになる。

（ホ）作用 本発明においては、油状基質及び水溶液を連続層として
供給する。油状基質及び水溶液をエマルジョンとして供
給すると、エマルジョン粒子が固定化担体内に拡散する
律速過程が存在するため加水分解速度が著しく低下する
。

本発明においては、油層と水層をあえて混ぜることなく
分離したままで反応するので夫々の反応槽内の滞留時間
を別々に設定できる。すなわち水層である水溶液の滞留
時間は、水溶液の供給量あるいは水溶性分解産物の回収
量及び反応槽の体積によって定まる。したがって水溶液
の滞留時間を油状基質の滞留時間より長くして水溶性分
解物の濃度を高めることも可能となる。

本発明においては油水分離層が垂直に立てた充填塔内に
存在する。油水分離層の位置は基質及び水溶液の供給量
及び油状分解産物等の回収量を適当に調節することによ
り移動可能であるが、反応が定常状態に達するとほぼ一
定の位置に留まる。

また油状基質に高級脂肪酸エステルであるワックス等が
含まれていると分解産物が二層以上になることがある。

その時は新しく出来た層にも回収口を設けて高級脂肪酸
等を分別回収できる特徴も有している。

本発明においては、油状基質及び水溶液が固定化リパー
ゼの存在する環境下で比重差により向流的に混合する過
程で加水分解が進行する。加水分解により生成された油
状分解産物及び水溶性分解産物は比重差により上端及び
下端より連続的に回収される。加水分解中に生成した分
解産物と基質である油脂やエステルの間に平衝が起きて
加水分解が停止するのを防ぐため、常に連続的に生成物
を取り出し新しい基質及び水溶液を仕込むのである。

（へ）実施例１ シュウトモナス・フルオレセンス・バイオタイ単位のリ
パーゼを０．ＩＭＮａＨＣＯ３溶液９０履２に溶かし、
Ｄｏｗｅｘ　ＭｗＡ・１（ダウ・ケミカル社製）８０ｇ
を懸濁させ、２時間室温で振とうした。次いでリパーゼ
が吸着した樹脂をＯ，１ＭＮａＨｃｏ　３、蒸留水及び
１／１５Ｍマツクイルベイン緩衝液ｐＨ５で洗浄した。

洗浄液には６３．０００単位のリパーゼが検出された。

すなわち３５．０００単位のリパーゼがＤｏｗｅｘ　Ｍ
ｗＡ−１に固定化されたことになる。この固定化リパー
ゼを１／１５Ｍマツクイルベイン緩衝液ｐＨ５，２００
ｍΩに懸濁し２５％のゲルタールアルデヒド溶液８ｍ意
を加えて１０°Ｃで１０分分間上うした後２０ｍ　ｎの
亜硫酸ナトリウムを加えて更にｌＯ分分間上うし、余分
のゲルタールアルデヒドを還元した。得られた固定化リ
パーゼを水洗し後の実験に供した。

リパーゼ活性の測定は通常オリーブオイルエマルジョン
を用いるＮｏｒｄらの変法（８農化３６巻８６０とり０
．２ｍｍの０．１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，０を加えて振と
うし、６０℃で６０分間反応させた。反応は８ＩＩＩＱ
のクロロホルム・メタノール（２：１）混液で停止し、
０．０５Ｎ水酸化ナトリウムを９５％のメタノールに溶
解した液で生じた脂肪酸を滴定した。

第１表 第１表から解るようにオリーブオイルエマルジョンを基
質とするＮａｒｄらの変法で固定化酵素活性を謂ると著
しく低い値を示すが、振どう法によると高くなる。振ど
う法ではエマルジョンにした基質を用いないのでエマル
ジョン粒子のリパーゼ分子に到達する律速過程が改善さ
れていることを示す。

実施例２ 恒温水を循環できるような外套管のついている水性の膜
（ジュラガード３５０１、ポリプラスチック社製）でお
おい、固定化リパーゼの流出及び可溶性分解物の流出を
防いだ。長い注射針を用い上端より１２ｃｍの中上段に
水溶液の供給口を設けた。下端には水溶性分解産物の回
収口を設けた。固定化リパーゼは下端よりｌ０ＣＩ１１
の所にあるグラスフィルターで保持した。同じく長い注
射針を用いた下端より９ＣＩ１１の中下段に油状基質の
供給口を設けた。

固定化リパーゼは水に懸濁して円筒管に充填した。水が
よく切れたら、中上段よりオリーブ油を６ｍ　Ｑ　／ｈ
ｒ中上段より水を４ｍ　Ｑ　／ｈｒで供給した。カラム
内に反応液が充満されるまでは、下端からの水溶性分解
産物の回収口は閉じておいた。外套管にカラム内に反応
液が充満されたら、オリーブ油の供給速度を０．６ｔｓ
　Ｑ　／ｈｒ、水の供給速度を０．４ｉａ１２／ｈｒと
し、水溶性の分解産物の回収速度を０．４ｍ　Ｑ　／ｈ
ｒとすると、油状分解産物は０．６１ｍ　Ｑ　／ｈｒの
速度で上端から回収された。

上記の条件で１１６時間運転後の油状分解産物を分画し
その分解率を求めると７１．７％であった。

１６５時間後の油状分解産物の分解率は６８．８％、２
８５時間後に６９．９％、３１５時間後に７２．５％、
６４５時間後に６９．３％となった。

油状分解産物の分解率はその酸化価とケン化価の比から
求めた。１６５時間後の油状分解産物の組成を薄層クロ
マトグラフィーで見ると、トリグリセライド及び脂肪酸
が主で若干のジグリセライド、モノグリセライドを含ん
でいた。

１６５時間後の水溶液分解産物には薄層クロマトグラフ
ィーで検出できる油状分解物はなかった。

過ヨウ素酸酸化法によるグリセリンの定量法（Ｄ、　Ｊ
、　Ｈａｎａｈａｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　２３１，８１３給するため、エマルジョ
ン状基質を供給する方法と比較して高い生産性をあげる
ことが出来た。すなわち１５単位の実施例１で示した固
定化リパーゼを用い予め８０ｇのオリーブ油と２０ｇの
水を攪拌しておき、この混合液を固定化リパーゼ゛カラ
ムに環流さす方法（Ｙ、　Ｋｉｍｕｒａ　ａｔ　ａｌ、
　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｌ。

Ｂｉｏｔ、ｅｃｈｎｏｌ、　１７，１０７　（１９８３
））だと、分解率３０％にするには９４時間要したが１
本発明によれば、１５単位の固定化リパーゼカラムを使
い分解率３０％にするにはオリーブ油を８ｍ　Ｑ　／ｈ
ｒ、水を２ｍ　Ｑ　／ｈｒで連続的に供給することが出
来９４時間には７５２ｇのオリーブ油が処理出来た。

本発明は基質をエマルジョンにする攪拌動力を来るため
、高濃度のグリセリン溶液の回収が可能となり、グリセ
リンを蒸留して回収する熱量も節減できる。

固定化リパーゼ及び分解物とも空気と接触することがす
くなく、しかも固定化リパーゼの安定化作用のある（村
上幸子他油化学３２巻第９号（１９８３））グリセリン
溶液中に維持して長時間の加水分解を行なわせることも
可能である。また加水分解により生成された分解産物は
連続的に分別回収されるため反応中平衝が起きて加水分
解が停止することを防げ、高品質のものが連続的に採取
出来る等固走化リパーゼを使った油脂分解法として好適
なものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 塔型固定化リパーゼカラムで脂質を分解するにあたり、
   中上段より水溶液、中下段より油状基質を連続的に供給
   し、上端より油状分解産物、下端より水溶性分解産物を
   連続的に採取することを特徴とする脂質の連続加水分解
   法。