CN116287034A - 一种甘油二酯的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于轻工油脂领域，公开了一种甘油二酯的制备方法。本发明对固定化酶载体进行预处理，将游离的脂肪酶与甘油按一定比例混合，将固定化载体加入脂肪酶与甘油的混合溶液中，通过吸附的方法进行固定化，从而制备出既具有催化特性又可以作为反应底物的固定化酶，得到的固定化酶可用于填充床反应器连续化生产制备甘油二酯。相较于传统酶法催化甘油解反应制备甘油二酯，本发明得到的固定化酶不仅具有催化作用，而且固定化酶上吸附了足够的甘油可用作底物进行甘油解反应，提高了反应效率。不仅解决了游离酶难以回收和重复利用性差的问题，而且解决了生产中甘油粘度较大，很难进行连续化生产的问题。

Description

一种甘油二酯的制备方法
技术领域
本发明属于轻工油脂领域，特别涉及一种甘油二酯的制备方法。
背景技术
甘油二酯是一类甘油三酯中一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质。摄入后在人体内难以再合成中性脂肪，最终以CO2和H2O的形式释放，不会造成脂肪堆积，具有较高的营养价值。但是天然油脂中甘油二酯含量较少，当前制备甘油二酯的主要方法包括化学法和酶法，其中酶法催化具有反应条件温和、选择性强、环境友好、能耗低等优点，受到越来越多的关注。然而，在脂肪酶催化生成甘油二酯的过程中，由于游离酶无法重复利用，使得该工艺成本较高，且水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和连续化生产。因此，将游离的脂肪酶进行固定化可以提高酶的稳定性，提高酶的重复使用性。
酶法催化甘油解反应因为原料成本低，产品处理简单，环境污染小而适合用于制备甘油二酯。传统的酶法催化甘油解反应，因为反应体系中需要过量甘油，底物粘度大，常用搅拌式反应器催化反应，这种催化方法对酶的机械损伤较大，造成酶的重复使用效率低，且很难进行连续化生产，导致生产成本增加，因此这种方法的应用具有很大的局限性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种甘油二酯的制备方法。本发明对固定化酶载体进行预处理，将游离的脂肪酶与甘油按一定比例混合，将固定化载体加入脂肪酶与甘油的混合溶液中，通过吸附的方法进行固定化，从而制备出既具有催化特性又可以作为反应底物的固定化酶，得到的固定化酶可用于填充床反应器连续化生产制备甘油二酯。相较于传统酶法催化甘油解反应制备甘油二酯，本发明得到的固定化酶不仅具有催化作用，而且固定化酶上吸附了足够的甘油可用作底物进行甘油解反应，提高了反应效率。不仅解决了游离酶难以回收和重复利用性差的问题，而且解决了生产中甘油粘度较大，很难进行连续化生产的问题。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种甘油二酯的制备方法，包括以下步骤：
(1)甘油与游离脂肪酶的混合：将脂肪酶与甘油混合，使脂肪酶完全溶于甘油中，得到脂肪酶-甘油溶液；
(2)固定化酶的制备：向脂肪酶-甘油溶液中加入树脂载体，经吸附后过滤，然后室温下晾干即得既具有催化活性又可作为反应底物的固定化酶；
(3)将既具有催化活性又可作为反应底物的固定化酶置于填充床反应器的反应柱中，加热填充床后向反应柱中加入反应物，引发酶催化反应，收集从反应柱底部流出的粗样品，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，即得到以甘油二酯为主要成分的油脂。
步骤(1)所述脂肪酶与甘油的用量满足脂肪酶-甘油溶液中脂肪酶的体积分数为2.5-5％。
步骤(1)所述酶为可以催化甘油解反应的脂肪酶，优选为诺维信CALB酶。
为加强固化效果，步骤(2)中所述树脂载体在加入之前，优选通过以下步骤进行预处理，具体如下：称取树脂载体，用95％乙醇浸泡24h，过滤洗至无醇味后依次用5％盐酸和5％氢氧化钠浸泡3h，用水洗至中性，滤干备用。
步骤(2)所述树脂载体可以为大孔树脂、离子交换树脂、环氧树脂中的至少一种，优选为型号为LXTE-1000、LXTE-600、LXTE-603、LXTE-604、LX-1000EP和R103SX树脂中的至少一种，更优选为LXTE-1000大孔吸附树脂。
步骤(2)中脂肪酶-甘油溶液和树脂载体的用量满足：树脂始终浸没在脂肪酶-甘油溶液中；优选为每1g的树脂对应加入10-20mL的脂肪酶-甘油溶液。
步骤(2)所述吸附为在恒温摇床上吸附，温度为20～40℃，优选30℃，摇床转速为100～300r/min，优选150r/min，反应时间0.5～5h，优选2h；
步骤(3)中具体包括以下步骤：采用连续式填充床反应器反应，将所述的既具有催化活性又可作为反应底物的固定化酶置于带热套的填充床反应器的反应柱中，将反应物置于底物罐中，底物罐与反应柱之间通过恒流泵连接；利用热套对反应柱进行加热，待加热至反应温度时，开启与反应柱相连的恒流泵，调节反应流速，使反应物不断由反应柱顶部进入反应柱中，引发酶催化反应，开启恒流泵的同时反应柱底部为打开状态，流出速度与反应物进入反应柱流速一致；反应结束后，关闭恒流泵，停止加热，收集从反应柱底部流出的所有的粗样品，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，即得到以甘油二酯为主要成分的油脂。
步骤(3)中所述的反应物为甘油三酯，优选为大豆油或亚麻籽油。
步骤(3)中所述的固定化酶和反应物甘油三酯的用量满足：固定化酶质量为反应物甘油三酯质量的2％-6％，优选为4％。
步骤(3)中所述加热是指加热至60-100℃，优选为80℃；
步骤(3)中所述的反应流速为1.0-3.0mL/min。
步骤(3)中所述酶催化反应的时间为10-30min,优选为20min，以反应物甘油三酯进入反应柱顶部开始计时。
所得到的以甘油二酯为主要成分的油脂中，甘油二酯的含量能达到油脂总含量的60％以上。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明以LXTE-1000树脂作为脂肪酶固定化载体，通过吸附的方式将游离脂肪酶和甘油同时固定在了载体上，使得制备得到的固定化酶既具有催化活性，又可以作为催化甘油解反应的底物，增加了酶的催化稳定性，并且可以回收重复使用多次，降低了生产成本。
(2)制备得到的固定化酶可用于填充床反应器连续化生产甘油二酯，不仅解决了游离酶难以回收利用的问题，增加了固定化酶的可重复使用性，而且解决了两相反应难以进行连续化和生产的难题。
附图说明
图1为不同改性树脂载体比酶活及催化生成甘油二酯含量图。
图2为实施例1的甘油酯气相图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
实施例和对比例中的脂肪酶购置于诺维信公司。
酶活力检测：
溶液配制：(1)聚乙烯醇橄榄油乳化液:称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约800mL，在沸水浴中加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000mL。用干净的双层纱布过滤，滤液备用。取4％聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄榄油，用高速匀浆机处理6min(分两次处理，间隔5min，每次处理3min)，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，现用现配。
(2)磷酸缓冲液(100mM pH7.0)：配制1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠标准溶液，以磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为57.7：43.3的体积比混合，调节溶液pH为7.0。
(3)0.05mol/L氢氧化钠标准溶液：称取2g氢氧化钠，用少部分水溶解，定容至1L。
(4)1％酚酞溶液：称取1g酚酞，用95％乙醇溶解后继续用95％乙醇定容至100mL。
碱式滴定法测定脂肪酶活力：取2个50mL具塞三角瓶，于空白瓶(A)和样品瓶(B)中均分别称取4mL橄榄油乳化液与5mL磷酸缓冲液混合，再于A瓶中加入95％乙醇15mL，在40℃恒温水浴摇床中预热5min。然后于A、B两瓶中各加入1mL或1g用100mM pH7.0磷酸缓冲溶液稀释的待测酶液稀释液，在200r/min下反应15min后，B瓶中立即加入15mL 95％乙醇终止反应。反应结束后，加入2滴1％酚酞溶液，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至溶液由无色变为粉色，且30s内不褪色，根据消耗的NaOH的体积，计算出脂肪酶活力单位。每组实验重复三次。酶活定义：在一定反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol脂肪酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL(U/g)表示。酶活力根据以下公式计算：
Figure BDA0004093006310000051
其中：X为比酶活，U/mg；V1：实验组(B瓶)所消耗的氢氧化钠体积，mL；V0：对照组(A瓶)所消耗的氢氧化钠体积，mL；c：氢氧化钠浓度，mol/L；n：样品的稀释倍数；0.05：氢氧化钠标准体积分数换算系数。
固定化率(IE)测定：通过测定固定化前后磷酸盐缓冲溶液中游离酶的酶活力来估计固定化率。固定化效率(IE)计算如下：
Figure BDA0004093006310000052
其中，E0是初始脂肪酶活性(U/ml)，V0是酶溶液的初始体积(ml)，Ef是滤液中的脂肪酶活力(U/ml)，Vf是滤料体积(ml)。
气相测定甘油酯组分含量：取50mg甘油酯样品，用5.0mL正己烷将其完全溶解，将溶液通过滤膜过滤于样品瓶中。样品制备完毕后置于气相色谱(GC)检测。GC条件：DB-1ht毛细管柱(15m×0.25mm×0.1μm)，进样量1μL，分流比40：1；柱箱温度50℃，离子火焰检测器温度380℃；载气为N2，流量4.17mL/min。阶段性程序升温检测：初始温度50℃，保持1min，然后以50℃/min升至100℃，80℃/min升至220℃，30℃/min升至290℃，50℃/min升至330℃，保持2min，最后以50℃/min升至380℃并保持3min。采用面积归一化法分别对游离脂肪酸、单甘酯、甘油二酯和甘油三酯进行定量分析。
实施例1
(1)称取LXTE-1000树脂2g于烧杯中，用95％乙醇浸泡24h，过滤洗至无醇味后依次用质量分数5％盐酸和质量分数5％氢氧化钠浸泡3h，用去离子水洗至中性，滤干备用；
(2)于150mL锥形瓶中加入1mL Novezyme CALB脂肪酶溶液，再加入39mL甘油，混合均匀，使脂肪酶完全溶于甘油中，得到浓度为2.5％的脂肪酶溶液；
(3)取上述步骤(2)得到的脂肪酶溶液40mL于锥形瓶中，加入2g树脂载体，于30℃恒温摇床上150r/min下振荡2h，之后将其转移至烧杯中，过滤，于室温下晾干，测定其酶活力和固定化率；
(4)将85g上述方法制得的固定化酶置于带热套的玻璃反应柱中，得到酶填充床反应器，连接填充床反应柱与循环水管道，打开恒温水浴，设定温度为80℃；取大豆油甘油三酯(购买于益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司)置于底物罐中，将底物罐、填充柱和产物罐依次连接；待热套温度达到设定温度后，开启恒流泵，设置流速为1.0mL/min，使底物罐中的大豆油甘油三酯不断从反应柱顶部进入，从而引发甘油三酯与甘油在酶催化作用下的甘油解反应，开启恒流泵的同时反应柱底部为打开状态，流出速度与反应物进入反应柱流速一致。从反应物甘油三酯进入反应柱顶部开始计时，反应20min后，关闭恒流泵，停止循环水浴加热，收集产物罐中的甘油解粗产物，通过气相色谱法进行甘油酯质量分数检测。
经检测，固定化酶的比酶活为283.33U/g，固定化效率为95.22％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为5.17％，单甘酯质量分数为6.67％，甘油二酯质量分数为63.85％，甘油三酯质量分数为24.31％，甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为2.63，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，分子蒸馏后甘油酯气相结果如图2所示，对各组分进行面积归一化处理，得到游离脂肪酸(FFA)质量分数为0.17％，单甘酯(MAG)质量分数为0.37％，甘油二酯(DAG)质量分数为69.58％，甘油三酯(TAG)质量分数为29.88％，甘油二酯含量能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
实施例2
本实施例除以下技术特征外同实施例1：步骤(2)中Novezyme CALB脂肪酶添加量为2mL，甘油添加量为48mL，脂肪酶质量分数为4％。
经检测，固定化酶的比酶活为263.72U/g，固定化效率为93.21％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为4.21％，单甘酯质量分数为5.70％，甘油二酯质量分数为62.50％，甘油三酯质量分数为27.59％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为2.27，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.09％，单甘酯质量分数为0.31％，甘油二酯质量分数为67.38％，甘油三酯质量分数为32.22％，甘油二酯含量虽然没有实施例1含量高，但仍能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
实施例3
本实施例除以下技术特征外同实施例1：步骤(2)中Novezyme CALB脂肪酶添加量为2mL，甘油添加量为38mL，脂肪酶质量分数为5％。
经检测，固定化酶的比酶活为239.74U/g，固定化效率为90.02％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为3.49％，单甘酯质量分数为3.34％，甘油二酯质量分数为58.81％，甘油三酯质量分数为34.36％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为1.71，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.11％，单甘酯质量分数为0.20％，甘油二酯质量分数为62.02％，甘油三酯质量分数为37.67％，甘油二酯含量虽然没有实施例1含量高，但分蒸后仍能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
实施例4
本实施例除以下技术特征外同实施例1：步骤(4)恒流泵流速设置为2.0mL/min。
经检测，固定化酶的比酶活为283.33U/g，固定化效率为95.22％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为3.85％，单甘酯质量分数为2.50％，甘油二酯质量分数为58.91％，甘油三酯质量分数为34.74％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为1.70，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.02％，单甘酯质量分数为0.04％，甘油二酯质量分数为61.90％，甘油三酯质量分数为38.04％，甘油二酯含量能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
实施例5
本实施例除以下技术特征外同实施例1：步骤(4)恒流泵流速设置为3.0mL/min。
经检测，固定化酶的比酶活为283.33U/g，固定化效率为95.22％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为3.79％，单甘酯质量分数为3.51％，甘油二酯质量分数为58.94％，甘油三酯质量分数为33.76％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为1.75，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.08％，单甘酯质量分数为0.16％，甘油二酯质量分数为61.58％，甘油三酯质量分数为38.18％，甘油二酯含量能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
实施例6
本实施例除以下技术特征外同实施例1：步骤(1)中树脂未进行预处理。
经检测，固定化酶的比酶活为253.62U/g，固定化效率为92.23％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为5.21％，单甘酯质量分数为5.89％，甘油二酯质量分数为60.50％，甘油三酯质量分数为28.40％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为2.13，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.14％，单甘酯质量分数为0.27％，甘油二酯质量分数为66.05％，甘油三酯质量分数为33.54％，甘油二酯含量虽然没有实施例1含量高，但仍能达到油脂总含量的60％以上，能比较高效的制备甘油二酯。
对比例1
本对比例除以下技术特征外同实施例1：步骤(4)恒流泵流速设置为4.0mL/min。
经检测，固定化酶的比酶活为283.33U/g，固定化效率为95.22％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为5.85％，单甘酯质量分数为7.50％，甘油二酯质量分数为31.91％，甘油三酯质量分数为54.74％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为0.58，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.20％，单甘酯质量分数为0.41％，甘油二酯质量分数为35.83％，甘油三酯质量分数为63.56％，甘油二酯含量不能达到油脂总含量的60％以上，这是因为流速过快会导致大豆油甘油三酯与固定化酶接触不够均匀，产率较低。
对比例2
本对比例除以下技术特征外同实施1：步骤(1)中选用不同载体(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)LXTE-1000、LXTE-600、LXTE-603、LXTE-604、LX-1000EP(源叶生物科技有限公司)、R103SX(广州天瑞新材料科技公司)各2g，用95％乙醇浸泡，过滤洗至无醇味后依次用5％盐酸和5％氢氧化钠浸泡3h，用去离子水洗至中性，滤干备用；
各树脂固定化后结果见图1：六种树脂固定化后比酶活最高的为LXTE-1000。经检测，以LXTE-1000树脂为载体的固定化脂肪酶催化甘油解反应得到甘油二酯质量分数为63.85％，LXTE-600树脂催化结果为甘油二酯质量分数为24.32％，LXTE-603树脂催化结果为甘油二酯质量分数为21.85％、LXTE-604树脂催化结果为甘油二酯质量分数为29.82％、LX-1000EP树脂催化结果为甘油二酯质量分数为32.98％、R103SX树脂催化结果为甘油二酯质量分数为21.57％。
对比例3
(1)称取LXTE-1000(西安蓝晓科技有限公司)树脂2g，用95％乙醇浸泡，过滤洗至无醇味后依次用5％盐酸和5％氢氧化钠浸泡3h，用去离子水洗至中性，滤干备用；
(2)于150mL锥形瓶中加入2g树脂载体、50mM，pH7.0磷酸缓冲溶液39mL和1ml脂肪酶溶液，混合均匀，密封瓶口，置于30℃摇床上150r/min下振荡2h；吸附结束后，取出固定后的酶，用相同缓冲液清洗5次，每次30mL，收集载体；
(3)将85g上述方法制得的固定化酶置于带热套的玻璃反应柱中，得到酶填充床反应器，连接填充床反应柱与循环水管道，打开恒温水浴，设定温度为80℃；按摩尔比为1:10的含量取大豆油甘油三酯和甘油置于底物罐中，通过搅拌将其混合均匀，将底物罐、反应柱和产物罐依次连接；待热套温度达到设定温度后，开启恒流泵，设置流速为1.0mL/min，使底物罐中的大豆油甘油三酯和甘油不断从反应柱顶部进入，从而引发甘油三酯与甘油在酶催化作用下的甘油解反应，开启恒流泵的同时反应柱底部为打开状态，流出速度与反应物进入反应柱流速一致。从反应物甘油三酯和甘油进入反应柱顶部开始计时，反应20min后，关闭恒流泵，停止循环水浴加热，收集产物罐中的甘油解粗产物，取少量产物置于离心管中，在10000r/min的转速下离心10min，上层油层通过气相色谱法进行甘油酯质量分数检测。
经检测，固定化酶的比酶活为273.65U/g，固定化效率为94.32％。该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为4.85％，单甘酯质量分数为9.50％，甘油二酯质量分数为21.31％，甘油三酯质量分数为64.34％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为0.33，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.12％，单甘酯质量分数为0.39％，甘油二酯质量分数为23.88％，甘油三酯质量分数为75.61％，甘油二酯含量不能达到油脂总含量的60％以上，这是因为甘油与油互不相容，在填充床中会分离，导致产率降低。
对比例4
将85g Novezyme 435固定化酶置于带热套的玻璃反应柱中，得到酶填充床反应器，连接填充床反应柱与循环水管道，打开恒温水浴，设定温度为80℃；按摩尔比为1:10的含量取大豆油甘油三酯和甘油置于底物罐中，通过搅拌将其混合均匀，将底物罐、反应柱和产物罐依次连接；待热套温度达到设定温度后，开启恒流泵，设置流速为1.0mL/min，使底物罐中的大豆油甘油三酯和甘油不断从反应柱顶部进入，从而引发甘油三酯与甘油在酶催化作用下的甘油解反应，开启恒流泵的同时反应柱底部为打开状态，流出速度与反应物进入反应柱流速一致。从反应物甘油三酯和甘油进入反应柱顶部开始计时，反应20min后，关闭恒流泵，停止循环水浴加热，收集产物罐中的甘油解粗产物，取少量产物置于离心管中，在10000r/min的转速下离心10min，上层油层通过气相色谱法进行甘油酯质量分数检测。
经检测，该条件下填充床酶反应器催化大豆油甘油解反应得到游离脂肪酸质量分数为5.82％，单甘酯质量分数为9.96％，甘油二酯质量分数为25.77％，甘油三酯质量分数为58.45％。甘油二酯与甘油三酯的质量分数比值为0.44，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，得到游离脂肪酸质量分数为0.04％，单甘酯质量分数为0.29％，甘油二酯质量分数为29.59％，甘油三酯质量分数为70.08％，甘油二酯含量不能达到油脂总含量的60％以上，这是因为甘油与油互不相容，在填充床中会分离，导致产率降低。
本发明通过将甘油与脂肪酶混合进行固定化，能够得到稳定性更强，催化活性较高的固定化脂肪酶，且该固定化酶可以回收重复使用和补充甘油，解决了甘油解制备甘油二酯反应中酶不易回收，重复使用次数少的问题，显著提升了酶的稳定性，降低工业生产成本。同时，固定化酶上负载了甘油，可作为甘油解反应的底物，可用于填充床反应器长时间连续化制备甘油二酯，解决了甘油解反应因为两相不相容而使用的搅拌反应对固定化酶的机械损伤，减少了固定化酶的活力损失。同时发现适当的脂肪酶体积浓度和填充床反应时间，能够调节酶的催化效果，控制甘油解反应的进程，在适当的条件下，使甘油解反应处于平衡状态，得到最高含量的甘油二酯。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甘油二酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)甘油与游离脂肪酶的混合：将脂肪酶与甘油混合，使脂肪酶完全溶于甘油中，得到脂肪酶-甘油溶液；
(2)固定化酶的制备：向脂肪酶-甘油溶液中加入树脂载体，经吸附后过滤，然后室温下晾干得既具有催化活性又作为反应底物的固定化酶；
(3)将既具有催化活性又作为反应底物的固定化酶置于填充床反应器的反应柱中，加热填充床后向反应柱中加入反应物，引发酶催化反应，收集从反应柱底部流出的粗样品，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，即得到以甘油二酯为主要成分的油脂。
2.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(1)所述脂肪酶与甘油的用量满足脂肪酶-甘油溶液中脂肪酶的体积分数为2.5-5％；
步骤(1)所述脂肪酶为催化甘油解反应的脂肪酶，优选为诺维信CALB酶。
3.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述树脂载体在加入之前，通过以下步骤进行预处理：称取树脂载体，用95％乙醇浸泡24h，过滤洗至无醇味后依次用5％盐酸和5％氢氧化钠浸泡3h，用水洗至中性，滤干备用；
步骤(2)所述树脂载体为大孔树脂、离子交换树脂、环氧树脂中的至少一种；优选为型号为LXTE-1000、LXTE-600、LXTE-603、LXTE-604、LX-1000EP和R103SX树脂中的至少一种；更优选为LXTE-1000大孔吸附树脂。
4.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中脂肪酶-甘油溶液和树脂载体的用量满足：树脂始终浸没在脂肪酶-甘油溶液中；优选为每1g的树脂对应加入10-20mL的脂肪酶-甘油溶液。
5.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(2)所述吸附为在恒温摇床上吸附，温度为20～40℃，摇床转速为100～300r/min，反应时间0.5～5h。
6.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中具体包括以下步骤：采用连续式填充床反应器反应，将所述的既具有催化活性又可作为反应底物的固定化酶置于带热套的填充床反应器的反应柱中，将反应物置于底物罐中，底物罐与反应柱之间通过恒流泵连接；利用热套对反应柱进行加热，待加热至反应温度时，开启与反应柱相连的恒流泵，调节反应流速，使反应物不断由反应柱顶部进入反应柱中，引发酶催化反应，开启恒流泵的同时反应柱底部为打开状态，流出速度与反应物进入反应柱流速一致，反应结束后，关闭恒流泵，停止加热，收集从反应柱底部流出的所有的粗样品，后续通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸和单甘酯，即得到以甘油二酯为主要成分的油脂。
7.根据权利要求6所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的反应物为甘油三酯，优选为大豆油或亚麻籽油。
8.根据权利要求6所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的固定化酶和反应物甘油三酯的用量满足：固定化酶质量为反应物甘油三酯质量的2％-6％。
9.根据权利要求6所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述加热是指加热至60-100℃；
步骤(3)中所述的反应流速为1.0-3.0mL/min；
步骤(3)中所述酶催化反应的时间为10-30min，以反应物甘油三酯进入反应柱顶部开始计时。
10.根据权利要求1所述的甘油二酯的制备方法，其特征在于：
所得到的以甘油二酯为主要成分的油脂中，甘油二酯的含量能达到油脂总含量的60％以上。
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