KR101294474B1

KR101294474B1 - 고정화 효소를 이용한 유용 물질의 제조 방법

Info

Publication number: KR101294474B1
Application number: KR1020087008274A
Authority: KR
Inventors: 준 사이토; 요시타카 센다; 도시테루 고마츠
Original assignee: 카오카부시키가이샤
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2013-08-07
Also published as: CN101278046A; WO2007043552A1; EP1931776B1; EP1931776A1; CN101278046B; US20090298142A1; WO2007043552A9; US8377664B2; KR20080056191A

Abstract

본 발명은, 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 함유하는 액체 혼합물을 공급해, 2 액상이 동일한 평행 방향으로 유통하게 함으로써 유용 물질을 제조하는 방법에 있어서, 각 단면이 직경 100 ㎜이하의 원형 또는 대각선 100 ㎜이하의 다각형인 복수의 루멘이 고정층 반응기 내에 형성되도록 내장물 또는 배관을 갖춘 고정층 반응기를 이용하고, 루멘이 고정화 효소로 충전되어 이를 통해 액체 혼합물이 공급되는 방법을 제공한다.

고정화 효소로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 나타내는 반응 혼합물을 유통시켜 실시하는 반응에서, 반응액 전체의 흐름을 균일화함으로써, 효율적인 방식으로 유용 물질의 제조를 용이하게 한다.

Description

고정화 효소를 이용한 유용 물질의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING A USEFUL SUBSTANCE BY USE OF AN IMMOBILIZED ENZYME}

본 발명은, 고정화 효소로 충전된 고정층 원주형 반응기(fixed-bed columnar reator)(이하 간단히 고정층 반응기로 언급함)에서 실시되는 반응을 통한 유용 물질의 제조 방법에 관한 것이다.

고정화 효소는 종래, 고정층 반응기에서 액체를 통과시킴으로써, L－아스파르트산 생성, 에스테르 교환에 의한 오일 및 지방 생성, 젖당 가수분해, 오일 및 지방 가수분해에 관한 다양한 반응 또는 유사한 반응을 실시하는 데 이용되어 왔다.

이들 반응은 비교적 저열을 방출한다. 따라서, 반응은 통상 가장 단순한 반응기인 드럼형 반응기에서 실시된다.

오일 및 지방 가수분해의 경우와 같이, 효소가 고정화된 반응기를 2 종류 이상의 액체가 동시에 통과하는 경우, 반응 효율 향상을 위해, 액체를 반응기에 적용하기 전에 균일한 상태로 혼합하는 것이 바람직하다. 이 경우, 가수분해에 사용되는 유상 기질과 수상 기질은 본래 혼합 작용을 거쳐도 혼합되지 않기 때문에, 균일한 상을 얻기 위해 통상 유화액으로 제조된다. 한편, 유화액 입자는 담체 의 세공벽에 흡착된 효소 분자에 도달하기 어렵기 때문에, 몇 가지 기술에 따라, 액체 통과 속도를 반응 혼합물이 유화되지 않는 범위로 통제한다(특허 문헌 1 참조).

고정층 표면 위로 유상기질 및 수상기질을 통과시키기 위해, 두 가지 방법이 인식되어 있다; 즉, 대향류(counter flow) 방법(특허 문헌 1 및 2 참조) 및 평행류(parallel flow) 방법(특허 문헌 3 참조). 전자는 특수한 구조 및 작용 방법을 요하기 때문에, 통상 평행류 방법이 이용된다.

(특허 문헌 1) JP-A-S61－85195

(특허 문헌 2) JP-A-H01－98494

(특허 문헌 3) JP-A-2000-160188

본 발명은, 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 함유하는 액체 혼합물을 공급해, 2 액상이 동일한 평행 방향으로 유통하게 함으로써 유용 물질을 제조하는 방법에 있어서, 각 단면이 직경 100 ㎜이하의 원형 또는 대각선 100 ㎜이하의 다각형인 복수의 루멘(lumen)이 고정층 반응기 내에 형성되도록 내장물 또는 배관을 갖춘 고정층 반응기를 이용하고, 루멘이 고정화 효소로 충전되어 이를 통해 액체 혼합물이 공급되는 방법을 제공한다.

고정화 효소로 충전된 고정층 반응기를 통해 2 액상을 나타내는 액체 혼합물을 통과시켜 반응을 실시하는 방법에 있어서, 액체 혼합물을 미리 유화 과정을 거치지 않고 가하는 경우, 반응기의 직경이 커짐에 따라, 반응기 내의 반응 혼합물의 흐름이 불균일하게 되어, 효율적으로 반응이 진행되지 않는 부분이 생겨, 반응성이 저하되는 문제가 발생한다. 이 경우, 반응성을 높이기 위해서, 고정화 효소와 반응 혼합물이 접촉하는 동안 접촉 시간을 단순히 길게 하면, 생산성(유량)이 저하되는 또다른 문제가 생기기 쉽다.

따라서, 본 발명은 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기를 통해 2 액상을 나타내는 액체 혼합물을 통과시켜 반응을 실시하는 것을 포함하고, 유량을 감소시키지 않고 반응성을 높여 생산성을 향상시키는, 유용 물질의 효율적인 제조 방법을 제공한다.

본 발명자는, 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기를 통과하는 반응 혼합물의 흐름을 분석하여, 유로(flow channel)의 단면적이 더 작은 경우 반응 혼합물이 더 균일한 상태로 흘러, 반응성이 향상됨을 발견했다. 이 발견에 기초하여, 본 발명자는 고정화 효소로 충전된 단면적이 큰 고정층 반응기의 내부에, 단면이 비교적 작은 원형 또는 다각형인 루멘이 형성되도록 내장물 또는 배관을 갖추고, 그 단면적이 작은 각각의 루멘 내에서 효소 반응을 실시하면, 높은 반응성을 유지한 채로 생산성을 향상시킬 수 있음을 발견했다.

본 발명에 의하면, 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 나타내는 액체 혼합물을 공급해 실시되는 반응에 있어서, 반응기 내의 반응 혼합물 전체의 흐름을 균일화할 수 있고, 이로써 반응성 및 생산성이 향상된다. 특히, 오일 및 지방의 가수분해에 있어서, 효소 활성을 유효하게 이용할 수 있고, 이로써 지방산을 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 고정화 효소로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 나타내는 액체 혼합물을 공급한다. 본원에서 사용된 고정층 반응기(이하 "효소탑"으로도 언급함)란, 반응 혼합물이 효소 고정화에 사용되는 담체 세공 및 담체간 공극을 유통하도록 가해지는, 고정화 효소로 충전된 원주형 또는 유사 구조를 포함하는 반응기이다. 용어 "2 액상"은, 혼합작용을 거친 2 가지 상이한 액체가 단일상을 보이지 않는 상태를 말하며, 상기 용어는 상-분리 상태 및 균일하지만 유화된 상태를 포함한다.

본 발명의 바람직한 형태에 의하면, 오일 및 지방을 분해할 수 있는 효소를 담체에 흡착시킴으로써 본 발명의 고정화 효소를 제조하고, 효소가 흡착된 담체를 반응기에 배치한다. 유상 기질 및 수상 기질로 구성된 2 상 액체 혼합물을 반응기에 첨가함으로써 오일 및 지방 가수분해를 실시하고, 유용 물질로서 지방산을 제조한다.

본 발명에 있어서, 2 액상은 동일 방향으로 평행으로 흐른다. 이 경우, 2 액상을 미리 유화 상태로 혼합할 수 있거나, 상-분리 상태로 반응기에 공급할 수 있다. 대안적으로, 공급시, 2 액상을 예정된 시간마다 교대로 할 수 있다. 효소탑에 대한 각 기질의 공급은, 반응기 상부에서 하부로 하방으로 또는 반대, 즉 상방으로 실시될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 고정화 효소는, 담체에 효소를 흡착 등에 의해 결합해서 제조된다. 담체의 예는, 셀라이트(celite), 규조토, 카올리나이트, 실리카 겔, 분자체(molecular sieve), 다공질 유리, 활성탄, 탄산 칼슘 및 세라믹과 같은 무기 담체; 그리고 세라믹 분말, 폴리비닐 알코올, 폴리프로필렌, 키토산, 이온교환 수지, 소수성 흡착 수지, 킬레이트 수지 및 합성 흡착 수지와 같은 유기 중합체를 포함한다. 이 중에서, 물 보유 용량이 높다는 점에서, 이온교환 수지가 특히 바람직하다. 이온교환 수지 중에서도, 표면적이 크고 효소의 흡착량을 증가시키기 때문에, 다공질 이온교환 수지가 바람직하다.

담체로서 사용되는 수지의 입자 크기은 100 내지 1000 ㎛가 바람직하고, 250 내지 750 ㎛가 더 바람직하다. 수지의 세공 크기는 10 내지 150 nm가 바람직하고, 10 내지 100 nm가 더 바람직하다. 수지의 재료로서, 페놀-포름알데히드, 폴리스티렌, 아크릴아미드 및 디비닐벤젠을 사용할 수 있다. 이 중에서, 향상된 효소 흡착성을 달성할 수 있기 때문에, 페놀-포름알데히드 수지(예를 들어, Rohm and Hass 사 제품 "Duolite A－568")가 특히 바람직하다.

본 발명의 고정화 효소의 효소에 관한 특별한 한정은 없다. 고 생산성 증가의 관점에서, 오일 및 지방 분해용 리파아제를 사용하는 것이 바람직하다. 사용되는 리파아제는, 동물 또는 식물 유래일 수 있고, 시판되는 미생물 유래 리파아제일 수도 있다. 미생물 유래 리파아제의 예는, 리조푸스(Rizopus) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 무코르(Mucor) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 지오트리쿰(Geotrichum) 속, 페니실리움(Penicillium) 속 및 칸디다(Candida) 속 등의 미생물에서 유래한 것을 포함한다.

효소 고정화를 실시하는 온도는 효소의 특성에 의해 결정될 수 있다. 효소 고정화는 효소가 비활성화되지 않는 온도; 즉, 0 내지 60℃, 특히 5 내지 40℃에서 실시되는 것이 바람직하다. 효소 고정화에 사용되는 효소 용액의 pH는, 효소 변성을 초래하지 않는 범위 내에 해당될 수 있고, 고정화 온도 결정과 유사하게, 효소의 특성에 의해 결정될 수 있다. pH3 내지 9 범위가 바람직하다. 효소 용액의 pH를 상기 범위 내로 유지하기 위해 완충액을 사용하며, 그 예는 아세트산 완충액, 인산 완충액 및 트리스 염산 완충액을 포함한다. 효소 용액의 효소 농도는, 효소의 포화 용해도 이하이나, 고정화 효율 향상을 위해 충분히 높은 것이 바람직하다. 또한, 효소 용액은 필요에 따라 불용성 물질을 원심분리로 제거해 수득한 상청액이거나, 한외 여과(ultrafiltration)로 정제된 용액일 수 있다. 사용되는 효소의 양은 효소 활성에 의존하며, 담체의 양에 대해 바람직하게는 5 내지 1,000 중량%, 더욱 바람직하게는 10 내지 500 중량%이다.

효소 고정화를 실시하는 경우, 효소를 아무 처리 없이 담체에 흡착시킬 수 있다. 높은 효소 활성을 나타낼 수 있는 흡착 상태를 얻기 위해, 효소 흡착 전에 담체를 지용성 지방산 또는 그 유도체로 처리하는 것이 바람직하다. 담체를 지용성 지방산 또는 그 유도체와 접촉시키는 경우, 이들을 물 또는 유기 용매에 직접 첨가할 수 있다. 대안적으로, 분산성을 향상시키기 위해, 지용성 지방산 또는 그 유도체를 미리 유기 용매에 분산 및 용해시키고, 그 혼합물을 물에 분산된 담체에 첨가할 수 있다. 유기 용매의 예는, 클로로포름, 헥산 및 에탄올을 포함한다. 지용성 지방산 또는 그 유도체의 사용량은, 담체의 양에 대해 바람직하게는 1 내지 500 중량%, 더욱 바람직하게는 10 내지 200 중량%이다. 접촉 온도는 바람직하게는 0 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 60℃이다. 접촉 시간은 약 5분 내지 약 5시간이 바람직하다. 상기 처리 후, 여과를 통해 담체를 회수한다. 추가로, 회수한 담체를 건조할 수 있다. 건조 온도는 실온 내지 100℃가 바람직하고, 감압하에 건조를 실시할 수 있다.

담체의 전처리에 사용되는 지용성 지방산의 예는, C 4 내지 C 24, 바람직하게는 C 8 내지 C 18의 포화 또는 불포화 지방산(직쇄 또는 분지쇄)을 포함한다. 이들 지방산은 히드록실기를 가질 수 있다. 구체적인 예는, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 올레산, 리놀레산, α-리놀레산, 리시놀레산 및 이소스테아르산을 포함한다. 상기 지용성 지방산의 유도체는, 이들 지용성 지방산과 1가 알콜, 다가 알코올 또는 당류로부터 제조된 에스테르; 인지질; 및 이들 에스테르에 에틸렌 옥시드를 첨가해 수득된 화합물을 포함한다. 구체적인 예는, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 이들 에스테르에 에틸렌 옥시드를 첨가해 제조한 화합물, 폴리글리세린 에스테르, 소르비탄 에스테르 및 자당 에스테르를 포함한다. 이들 지용성 지방산 및 그 유도체는, 효소를 담체에 유효하게 고정화할 수 있기 때문에, 상온에서 액체 형태인 것이 바람직하다. 지용성 지방산 또는 그 유도체는 2종 이상을 병용할 수 있다. 상기 지용성 지방산 또는 그 유도체에 더하여, 유채 및 대두로부터 유래된 지방산과 같은 천연 유래의 지방산을 사용할 수 있다.

고정화 효소의 가수분해 활성은 바람직하게는 20 U/g 이상, 더욱 바람직하게는 100 내지 10,000 U/g, 더욱더 바람직하게는 500 내지 5,000 U/g이다. 여기서 효소 1 U는, 100：25(중량비)의 오일 및 지방 및 물 액체 혼합물을 교반 및 혼합하면서 40℃에서 30분간 가수분해를 시킬 때, 1분에 1 ㎛ol의 유리 지방산을 생성하는 효소의 가수분해능을 나타낸다.

오일 및 지방의 단위 그람 당 고정화 효소의 가수분해 활성[U/g－oil]은 일정한 가수분해율에 도달할 때까지 필요한 시간에 대해 실질적으로 반비례의 관계에 있다. 고정화 효소의 충전층(효소탑)을 이용해 가수분해를 실시하는 경우, 공급 조건(예를 들면, 액체 유속 및 온도)에 따라 가수분해율이 다르다. 그럼에도 불구하고, 고정화 효소의 명목 활성(발현 활성)[U/g]은 가수분해에 필요한 시간(충전층 내의 체류 시간), 충전층 내에 존재하는 오일 및 지방의 중량[g－oil] 및 고정화 효소의 충전 중량[g]에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 사용하는 유상 기질은 주로 오일 및 지방이다. 오일 및 지방의 예로서, 트리아실글리세롤 외에도, 디아실글리세롤, 모노아실글리세롤, 지방산류 및 가수분해로 생성되는 지방산을 들 수 있다. 유상 기질의 예는, 평지유, 대두유, 해바라기유, 팜유 및 아마인유와 같은 식물유; 우지, 돈지 및 어유와 같은 동물유; 및 이들 오일의 배합인 오일 및 지방을 포함한다. 사용되는 상기 오일 및 지방은 탈취 오일 및 지방 또는 미탈취 오일 및 지방일 수 있다. 오일 및 지방 또는 그의 일부로서 탈취유를 사용하는 경우, 유리하게도 개시물질로서 작용하는 오일 및 지방에서 유래하는 식물성 스테롤, 식물성 스테롤 지방산 에스테르 및 토코페롤을 잔존시키면서, 트랜스 불포화 지방산 및 공액(conjugated) 불포화 지방산의 생성을 감소시킬 수 있다. 유상 기질은 상기 오일 및 지방과 함께 지방산과 같은 유용성 성분을 함유할 수 있다. 용어 "지방산류"란, 가수분해로 생성되는 지방산 및 그 지방산과 상기 글리세리드 하나 이상의 혼합물을 말한다.

본 발명에서 사용되는 수상기질은 물이다. 그 기질은 가수분해로 얻어지는 글리세린과 같은 그 밖의 수용성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 고정층 반응기(효소탑)의 형상은, 효소탑이 사용된 펌프로 가해진 압력을 견딜 수 있는 한, 한정되지 않는다. 효소탑을 자켓으로 둘러싸서 탑내에 유통하는 반응액의 온도를 효소 반응에 적절한 온도로 조정하는 것이 바람직하다. 효소탑 내부 온도는, 고정화 효소의 활성을 유효하게 이용하기 위해서, 바람직하게는 0 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 40℃로 조정한다. 효소탑은 원하는 가수분해율을 얻는데 필요한 길이를 가질 수 있다. 그 길이는, 반응기의 압력 손실 감소 및 반응성 향상의 관점에서, 바람직하게는 0.01 내지 10 m, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5 m의 범위이다.

본 발명에 있어서, 단면이 직경 100 ㎜이하의 원형 또는 대각선 길이 100 ㎜이하의 다각형인 복수의 루멘이 형성되도록 효소탑 내에 내장물 또는 배관을 배치하고; 그 루멘을 고정화 효소로 충전하고; 그 루멘 내에 상기 액체 혼합물을 공급해 반응을 실시한다. 각 루멘이 상기와 같은 작은 단면적을 가지므로, 한 유로의 단면적이 작아진다. 따라서, 2 상 반응액이 유로를 균일하게 유통할 수 있다. 이 때, 효소탑 내벽과 루멘을 갖는 내장물 또는 배관 사이에 간극이 있는 경우, 반응액의 흐름을 균일하게 한다는 관점에서, 이 간극을 고정화 효소로 충전하는 것이 바람직하다. 효소탑 내에 상기 단면적을 갖는 복수의 루멘을 갖는 구조를 형성할 수 있는 한, 내장물 또는 배관은 한정되지 않는다. 내장물의 예는, 공동 원주형 구조물(도 1), 공동 사각 기둥 구조물(도 2) 및 판상(칸막이) 구조물(도 3)을 포함한다. 구체적으로, 예를 들어 하기와 같은 복수의 루멘을 갖는 구조를 형성한다: 효소탑 내에 배관을 배치함으로써 다관 구조를 형성하거나; 효소탑 내에 상하 방향으로 칸막이(예를 들면, 평판 및 골판)를 배치하거나; 각각 원형 또는 사각형의 단면으로 구성된 내장물을 배치한다. 내장물을 사용하는 경우, 내장물의 배치 효율 향상의 관점에서, 각 구성물의 단면은 정삼각형, 정사각형 또는 정육각형이 바람직하다. 예를 들어, 내장물은 사각 파이프들의 묶음일 수 있다.

배관 또는 내장물에 의해 형성되는, 상기 구조의 각 루멘(각 유로)의 직경 또는 대각선 길이는 100 ㎜ 이하여야 하고, 반응성 향상의 관점에서, 바람직하게는 75 ㎜ 이하, 더욱 바람직하게는 50 ㎜ 이하, 더욱더 바람직하게는 35 ㎜ 이하이다.

효소탑 내에 내장물 또는 배관을 배치하여 형성된 고정화 효소를 루멘에 충전하고, 그 루멘 내에 2 상의 액체 혼합물(반응 혼합물)을 공급한다(도 4 참조).

이로써, 2 상의 액체 혼합물(반응 혼합물)이 효소탑을 균일하게 유통할 수 있다.

반응기 내에 고정화 효소를 충전할 때, 효소탑 내벽과 내장물(또는 배관) 사이에 간극이 있고, 그 간극이 지나치게 좁으면, 고정화 효소의 배치는 어려워진다. 이 간극이 불충분하게 충전되면, 효소탑이 전체로서 불균일하게 충전된다. 이 경우, 벌크 밀도가 저하될 수 있다. 또한, 반응액이 덜 균일하게 유통하여 반응 효율이 저하될 수 있다. 따라서, 효소탑 내벽과 내장물(또는 배관) 사이의 간극을 일정한 거리 이상으로 유지하는 것이 바람직하다. 충전물의 종류와 입자 크기, 및 내장물 또는 배관의 크기에 따라 달라도, 고정화 효소의 균일한 충전을 확보하기 위해서, 효소탑 내벽과 내장물(또는 배관) 사이의 간극의 가장 좁은 부분이 1 ㎜ 이상인 것이 바람직하고, 5 ㎜이상인 것이 더욱 바람직하다. 반응액의 흐름을 균일하게 하기 위해, 그 간격의 상한이 내장물 또는 배관인 각 루멘 단면의 직경 또는 대각선 길이 이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 70 ㎜ 이하, 더욱더 바람직하게는 50 ㎜ 이하이다.

효소탑 내의 내장물 또는 배관의 길이는, 반응액 전체가 탑을 균일하게 유통할 수 있도록 하기 위해, 충전된 고정화 효소의 높이 이상인 것이 바람직하다. 또한, 길이가 높이의 50% 이상 또는 높이의 75%; 즉, 그 길이가 높이 미만인 특정 범위인 경우, 상기와 동일한 효과가 달성될 수 있다.

내장물 또는 배관은 그 전체 길이에 걸쳐 연결부가 없는 일체화된 것일 수 있다. 충전된 고정화 효소의 쉬운 교체와 같은 향상된 작업성의 관점에서, 내장물 또는 배관이 상하 방향으로 분할되어 다단 구조(multi-stage structure)를 형성하는 것이 바람직하다. 단의 수는 효소탑의 전체 길이에 의존하며, 바람직하게는 2 내지 30, 더욱 바람직하게는 2 내지 10이다. 내장물 또는 배관의 각 단은, 예를 들어 내장물 또는 배관의 쉬운 장전의 관점에서, 횡방향으로 몇 개의 부분으로 분할될 수 있다.

반응액의 통액 선속도는 바람직하게는 1 내지 400 ㎜/분, 더욱 바람직하게는 5 내지 200 ㎜/분 범위이다. 본원에서 사용된 용어 "통액 선속도(㎜/분)"란, 1분 당 공급되는 반응액의 양(㎜³/분)(또는 공급 속도(10^-3 ㎖/분))을 충전층의 단면적(㎜²)으로 나눈 몫으로 표현되는 값을 의미한다. 통액 선속도 증가의 결과로서 충전탑 내압력이 증가함에 따라, 통액이 곤란해져, 충전탑은 높은 내압성일 필요가 있다. 또한, 탑의 내압력 증가로 인해 고정화 효소가 파쇄될 수 있다. 따라서, 통액 선속도는 400 ㎜/분 이하로 조정되는 것이 바람직하고, 생산성 향상의 관점에서 1 ㎜/분 이상으로 조정된다. 고정화 효소의 발현 활성은 통액 선속도에 따라 다르다. 따라서, 최적의 통액 선속도를 선정하고, 속도를 포함한 반응 조건을 적용하는 경우, 고정화 효소가 의도된 생산성 및 제조 비용에 알맞게 반응할 수 있다.

가수분해 반응의 평형 상태 회피, 고정화 효소의 보다 유효한 활성 획득 및 생산성 증가의 관점에서, 효소탑 내의 반응 혼합물의 체류 시간은 바람직하게는 30초 내지 60분의 범위이고, 더욱 바람직하게는 1분 내지 40분이다. 본원에서 사용된 용어 "체류 시간(분)"이란, 충전층의 두께(㎜)에 공극률을 곱한 값을 통액 선속도(㎜/분)로 나눈 값을 의미한다.

본 발명에 있어서, 반응성, 생산성 및 기타 인자를 고려해서, 효소탑을 유통하는 반응액을 최종 생성물로서 사용할 수 있다. 또는, 수득된 반응액을 유상 생성물과 수상 생성물로 분리할 수 있고, 이어서 이렇게 수득된 유상 생성물에 새로운 물을 첨가한다. 이어서, 상기와 유사한 방법으로 재차 동일한 효소탑에 혼합물을 공급 및 유통시킬 수 있다. 원하는 반응율을 얻을 때까지 과정을 반복할 수 있다. 대안적으로, 수득된 반응액을 유상 생성물과 수상 생성물로 분리할 수 있고, 이어서 이렇게 수득된 유상 생성물에 새로운 물을 첨가한다. 이어서, 상기와 유사한 방법으로 재차 또다른 효소탑에 혼합물을 공급 및 유통시킴으로써, 반응을 연속적으로 실시할 수 있다. 원하는 반응율을 얻을 때까지 과정을 반복할 수 있다. 대안적으로, 복수의 효소탑을 이용해, 각 탑에서 수득된 반응액을 유상 생성물과 수상 생성물로 분리한다. 이어서, 수득된 유상 생성물 및 수득된 수상 생성물을 각각 다음의 효소탑 및 전자의 효소탑에 공급한다. 그래서, 더 높은 가수분해율을 갖는 유상 생성물을 신선한 수상 생성물과 반응시킬 수 있다(즉, 의사향류법(quasi-counterflow method)). 일반적으로 자연 침강형, 원심분리형 등의 장치가 사용되지만, 유상 수상 분리법은 특별히 한정되지 않는다.

도 1 은 공동(hollow) 원주형 구조로 구성된 내장물을 갖춘 효소탑의 단면을 나타낸다.

도 2 는 공동 사각 기둥 구조로 구성된 내장물을 갖춘 효소탑의 단면을 나타낸다.

도 3 은 판상(칸막이) 구조로 구성된 내장물을 갖춘 효소탑의 단면을 나타낸다.

도 4 는 효소탑을 통한 반응 혼합물의 흐름을 나타내는 개념도이다.

하기 실시예는 본 발명의 구현예를 추가로 기술하고 설명한다. 실시예는 오직 설명을 위한 것이며, 본 발명의 제한으로 해석되어서는 안된다.

〔고정화 리파아제의 제조〕

"Duolite A－568"(Diamond Shamrock Corporation 사제, 입자 크기 분포 100 내지 1,000 ㎛) 1 중량부를 1/10N NaOH 용액 10 중량부 내에서 1시간 동안 교반했다. 여과 후, 담체를 탈이온수 10 중량부로 세정하고, 이렇게 세정된 담체의 pH를 500 mM 황산 완충액(pH 7) 10 중량부로 평형화했다. 이어서, 담체의 pH를 50 mM 아세트산 완충액(pH 7) 10 중량부로 2시간씩 2회 평형화했다. 그 뒤, 여과를 실시해 담체를 회수하고, 담체를 에탄올 5 중량부로 30분 동안 에탄올 치환시켰다. 여과 후, 리시놀산을 1 중량부 함유한 에탄올 5 중량부를 첨가하고, 30분 동안 담체에 리시놀산을 흡착시켰다. 여과를 실시해 담체를 회수한 후, 50 mM 아세트산 완충액(pH 7) 5 중량부로 30분씩 4회 세정해, 에탄올을 제거했다. 이후, 여과를 실시해 담체를 회수했다. 이어서, 시판되는 리파아제("Lipase AY Amano", Amano Enzyme Inc. 사제) 1 중량부를 50 mM 아세트산 완충액(pH 7) 9 중량부에 용해시켜 제조한 효소액과 담체를 5시간 동안 접촉시켜, 효소 고정화를 실시했다. 고정화 효소를 여과로 회수하고, 50 mM 아세트산 완충액(pH 7) 10 중량부로 세정하여, 고정화되지 않은 효소와 단백질을 제거했다. 그 후, 실제로 가수분해할 대두유 4 중량부를 첨가하고, 이렇게 수득된 혼합물을 12시간 동안 교반했다. 상기 과정은 모두 20℃에서 실시했다. 이후, 여과를 실시해 오일로부터 고정화 효소를 분리했다. 이렇게 수득된 고정화 리파아제는 2,700 U/g(건 조 중량)의 가수분해 활성(발현 활성)을 가졌다. 고정화 효소의 중량 기준 평균 입자 크기은 451 ㎛였다.

＜실시예 1＞

사각 파이프 40개를 묶어서 내장물을 제조했다. 각 파이프는 24 ㎜×24 ㎜의 정방형 단면을 가졌다(벽두께: 1.5 ㎜, 높이: 300 ㎜). 5개의 내장물을 자켓을 갖춘 스테인레스 탑(내경: 200 ㎜, 높이: 1,600 ㎜) 내에 쌓았다(내장물 합계 높이: 1,500 ㎜). 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 10.5 kg)를 탑 내에 충전하고(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜), 자켓을 이용하여 탑의 온도를 35℃로 유지했다. 평지유 및 증류수의 혼합물(중량비 10：6)을 탑 상부에 30 kg/시간으로 공급함으로써 가수분해를 실시했다. 표 1은 그 결과를 나타낸다. 표 1에 나타난 각 가수분해율은 분석을 통해 얻은 산가를 비누화 값으로 나눠서 산출했다. 그 중에서, 산가는 "American Oil Chemists. Society Official Method Ca 5a－40"에 기재된 방법에 의해 측정하고, 비누화 값은 "American Oil Chemists. Society Official Method Cd 3a-94"에 기재된 방법에 의해 측정했다.

＜실시예 2＞

사각 파이프 16개를 묶어서 내장물을 제조했다. 각 파이프는 35 ㎜×35 ㎜의 정방형 단면을 가졌다(벽두께: 1.5 ㎜, 높이: 300 ㎜). 5개의 내장물을 자켓을 갖춘 스테인리스 탑(내경: 200 ㎜, 높이: 1,600 ㎜) 내에 쌓았다(내장물 합계 높이: 1,500 ㎜). 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 11.4 kg)를 탑 내에 충전했다(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜). 실시예 1과 유사한 방법으로 가수분해를 위한 다른 과정들을 실시했다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.

＜실시예 3＞

사각 파이프 7개를 묶어서 내장물을 제조했다. 각 파이프는 52 ㎜×52 ㎜의 정방형 단면을 가졌다(벽두께: 1.5 ㎜, 높이: 300 ㎜). 5개의 내장물을 자켓을 갖춘 스테인리스 탑(내경: 200 ㎜, 높이: 1,600 ㎜) 내에 쌓았다(내장물 합계 높이: 1,500 ㎜). 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 11.9 kg)를 탑 내에 충전했다(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜). 실시예 1과 유사한 방법으로 가수분해를 위한 다른 과정들을 실시했다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.

＜실시예 4＞

사각 파이프 4개를 묶어서 내장물을 제조했다. 각 파이프는 70 ㎜×70 ㎜의 정방형 단면을 가졌다(벽두께: 1.5 ㎜, 높이: 300 ㎜). 5개의 내장물을 자켓을 갖춘 스테인리스 탑(내경: 200 ㎜, 높이: 1,600 ㎜) 내에 쌓았다(내장물 합계 높이: 1,500 ㎜). 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 12.1 kg)를 탑 내에 충전했다(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜). 실시예 1과 유사한 방법으로 가수분해를 위한 다른 과정들을 실시했다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.

＜실시예 5＞

사각 파이프 16개를 묶어서 내장물을 제조했다. 각 파이프는 37 ㎜×37 ㎜의 정방형 단면을 가졌다(벽두께: 1.5 ㎜, 높이: 300 ㎜). 5개의 내장물을 자켓을 갖춘 스테인리스 탑(내경: 200 ㎜, 높이: 1,600 ㎜) 내에 쌓았다(내장물 합계 높이: 1,500 ㎜). 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 10.7 kg)를 탑 내에 충전했다(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜). 실시예 1과 유사한 방법으로 가수분해를 위한 다른 과정들을 실시했다. 내장물과 탑 내벽 사이의 간극은, 가장 좁은 부분에서 측정했을 때, 0.35 ㎜였다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.

＜비교예 1＞

스테인리스 탑 내에 사각 파이프를 배치하지 않고, 상기 제조된 고정화 리파아제(건조 중량: 12.7 kg)를 탑 내에 충전(고정화 리파아제의 충전 높이: 1,500 ㎜)한 것을 제외하고는, 실시예 1의 과정을 반복하여 가수분해를 실시했다. 표 1은 그 결과를 나타낸다.

표 1에서 분명하듯이, 내장물을 이용해 형성한, 일정한 단면적의 복수의 루멘을 갖는 고정층 반응기 내로 평지유 및 증류수를 공급하는 경우, 가수분해율이 향상되고 고정화 효소의 (명목)활성이 유효하게 발현된다. 고정층형 반응기 내벽과 내장물 사이에 좁은 간극이 있는 경우, 고정화 효소 충전후 측정한 공극률이 약간 높아, 가수분해율 저하의 경향이 있다. 그러나, 그 좁은 간극의 거리를 1 ㎜ 이상으로 함으로써 이런 경향이 해소됨이 밝혀졌다.

Claims

고정화 리파아제로 충전된 고정층 반응기에 2 액상을 함유하는 액체 혼합물을 공급해, 2 액상이 동일한 평행 방향으로 유통하게 함으로써 지방산을 제조하는 방법에 있어서, 상기 2 액상은 오일 또는 지방을 함유하는 유상 기질 및 수상 기질로 구성된 2 상 액체 혼합물이고, 각 단면이 직경 100 ㎜이하의 원형 또는 대각선 100 ㎜이하의 다각형인 복수의 루멘이 고정층 반응기 내에 형성되도록 내장물 또는 배관을 갖춘 고정층 반응기를 이용하고, 루멘이 고정화 리파아제로 충전되어 이를 통해 액체 혼합물이 공급되는 방법.
제 1 항에 있어서, 유상 기질이 식물유, 동물유 또는 이들의 배합 오일 또는 지방인 방법.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 내장물 또는 배관이 상하 방향으로 복수의 소단위로 분할되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 내장물 또는 배관이 횡방향으로 복수의 소단위로 분할되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 내장물 또는 배관과 효소탑 내벽 사이의 간극의 가장 좁은 부분이 1 ㎜이상인 방법.