CN101558162B - 使用固定化酶的有用物质的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种有用物质的制造方法，其是将形成2个液相的液体混合物提供给充填固定化酶的固定床型反应塔中并使之朝同一个方向并流而进行反应，其使用在固定床型反应塔的纵向上插入隔离板而形成有多个管状构造的固定床型反应塔，并将固定化酶充填于该管状构造内，并且将液体混合物提供给管状构造内，在多个管状构造中，一个管子的横截面是至少一部分没有闭塞的代表长度为100mm以下的圆形或多边形。即使使用大管径的反应塔也能使得塔内的所有反应液的流动均匀化，并且还能有效地表现酶活性。其结果能提高反应性和生产性。特别是在油脂类的水解中，能有效地表现酶活性并能高效地制造脂肪酸类。在去除充填于反应塔的固定化酶时的操作性也良好。

Description

使用固定化酶的有用物质的制造方法

技术领域

本发明是有关凭靠使用充填了固定化酶的固定床型反应塔的反应的有用物质的制造方法。 

背景技术

作为将液体流通于固定床型反应塔而进行的反应，众所周知是利用于L-天冬氨酸的生成、酯交换油脂的生成、乳糖水解以及油脂类的水解等的使用了固定化酶的反应。因为这些反应的发热量都比较小，所以通常是使用最为简单的圆筒形反应器。 

在使用固定化酶的反应中，在像油脂类的水解那样使2种类以上的溶液流通于反应器中的情况下，从提高反应效率的观点出发，优选使反应液以均匀地混合的状态流通。在此情况下，用于水解的油相基质和水相基质，因为本来就是即使混合也不会成为单相的物质，所以通常作为乳浊液。另一方面，乳浊液粒子难以到达吸附于载体细孔内的酶，所以也有把流通溶液的速度调整到反应液不进行乳化的范围内的技术(参照专利文献1)。 

另外，作为使油相基质和水相基质流通于固定床的方法，虽然有以逆流进行流通的方法(参照专利文献1、2)以及以并流进行流通的方法(参照专利文献3)，但是前者因为需要特殊的结构和运转方法，所以一般是采用以并流进行流通的方法。 

专利文献1：日本专利申请公开昭61-85195号公报 

专利文献2：日本专利申请公开平1-98494号公报 

专利文献3：日本专利申请公开2000-160188号公报 

发明内容

本发明提供了一种将形成2个液相的液体混合物提供给充填了固定化酶的固定床型反应塔并使之朝同一个方向并流而进行反应的有用 物质的制造方法，该方法使用在固定床型反应塔的纵向上插入隔离板而形成有多个管状构造的固定床型反应塔，并将固定化酶充填于该管状构造内，摈弃将所述液体混合物提供给该管状构造内，在上述多个管状构造中，一个管子的横截面是至少一部分没有闭塞的代表长度为100mm以下的圆形或者多边形。 

另外，本发明提供了一种将形成2个液相的液体混合物提供给管径为35mmφ以上的充填有固定化酶的固定床型反应塔中，并通过使之朝同一个方向并流来进行反应从而制造有用物质的方法，作为固定床型反应塔，该制造方法使用充填有固定化酶的固定床型反应塔，该固定床型反应塔的管径(mm)与固定化酶的平均粒径(mm)的比率即管径/平均粒径的比率为135(mm/mm)以下。 

附图说明

图1是表示装载凹凸形的隔离板的酶塔的横截面的图。 

图2是表示装载锯齿状的隔离板的酶塔的横截面的图。 

图3是表示以另外的板状隔离板隔开由装载凹形隔离板而构成的多边形内部的酶塔的横截面的图。 

图4是表示组合装载组合用带有狭缝的隔离板的酶塔的横截面的图。 

图4-(a)是表示组合用带有狭缝的隔离板的图。 

图5是表示酶塔中的反应液的流动的概念图。 

具体实施方式

在使形成2个液相的液体混合物流通于充填了所述固定化酶的固定床型反应塔中而进行反应的方法中，特别是在不使该液体混合物乳化而进行流通的情况下，随着反应塔的直径变大，塔内的反应液的流动会变得不均匀，并产生不能够效率性地使反应进行的部分，另外，酶的表现活性降低，作为其结果，发现存在反应性降低的问题。在此情况下，为了提高反应性而如果仅仅延长固定化酶与反应液的接触时间的话，会有生产性(流量)降低的问题。 

因此，本发明是有关在使形成2个液相的液体混合物流通于充填 了固定化酶的固定床型反应塔中而进行反应的有用物质的制造方法中，通过在不降低流量的前提下提高反应性、并提高生产性，从而更加效率性地制造有用物质的方法。 

因此，本发明人解析了在充填有固定化酶的固定床型反应塔中的反应液的流通特征，其结果发现，流通通道的截面积越小反应液的流动越均匀，从而提高了反应性。因此，在充填有固定化酶的大截面积的固定床型反应塔的内部，通过在固定床型反应塔的纵向上插入隔离板而形成多个管状构造，并在其小截面积的各自管状构造内实行酶反应，从而能够在维持高反应性的状态下提高生产性，在上述多个管状构造中，一个管子的横截面是至少一部分没有闭塞的代表长度为100mm以下的圆形或者多边形。 

另外，本发明人就有关在充填了固定化酶的固定床型反应塔中的酶的表现活性作了种种研究，其结果发现：在使用大管径反应塔的情况下，通过规定反应塔的管径与固定化酶粒径的比率，从而能够有效地表现酶的活性，并在维持高反应性不变的状态下能够使生产性提高。 

通常，在使用固定化酶的情况下，如果要使酶的表现活性提高，那么本行业者则为了增大固定化载体的比表面积而缩小载体的粒径。本手法虽然在固定床型反应塔的管径较小的情况下有效，但是在增大了管径的情况下，本发明人竟然完全意外地发现，对于载体粒径而言，如果不采取相反的手段就不能得到想要的效果。 

根据本发明，在将形成2个液相的液体混合物提供给充填了固定化酶的固定床型反应塔中而进行的反应中，即使使用大管径的反应塔也能够使塔内的全体反应液的流动均匀化，另外，还能够有效地表现酶的活性。其结果，能够提高反应性和生产性。特别是在油脂类的水解中，能够有效地体现酶的活性并能够效率性地制造脂肪酸类。再则，在去除充填于反应塔的固定化酶的时候的操作性也良好。 

在本发明中，把形成2个液相的液体混合物提供给充填有固定化酶的固定床型反应塔中。所谓的“固定床型反应塔”(以下称之为“酶塔”)是指，将固定化酶充填于塔柱等中，并以使反应液流通于固定化载体之间的空隙以及固定化载体的细孔中的形式进行制作的反应塔。所谓“2个液相”是指即使在2个种类的液体混合后也不会成为1个相的状态，同时也包括由分相的液体成为均匀的但呈乳化状态的液体。

作为本发明的形态，优选：固定化酶使用将油脂分解酶吸附于固定化载体上的固定化酶，并在充填有该固定化酶的反应塔中，使2个液相即油相基质和水相基质流通，从而使油脂类进行水解反应，由此制造作为有用物质的脂肪酸类的方法。 

在本发明中，使2个液相在同一个方向上并流。在此情况下，既可以预先混合2个液相并作为乳化状态来进行供给，又可以按分相了的原样来进行供给。另外，也可以每隔一定的时间交替地供给2个液相。给酶塔的各个基质的供给，既可以从塔顶往塔底以朝底部流动的方式来实行，也可以从塔底往塔顶以朝上部流动的方式来实行。 

在本发明中所使用的固定化酶是由吸附等使酶担载于固定化载体上。作为固定化载体可以列举钙铁石、硅藻土、高岭石、硅胶、分子筛、多孔质玻璃、活性碳、碳酸钙、陶瓷等的无机载体、陶瓷粉末、聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水性吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等的有机高分子等，但是，特别是从保水力高的观点考虑优选离子交换树脂。另外，在离子交换树脂中，从通过具有大表面积而能够提高酶的吸附量的观点出发，优选多孔质的离子交换树脂。 

作为固定化载体而使用的树脂的粒径优选为0.1～10mm，更为优选的是0.2～6mm，特别优选的是0.25～4mm，最为优选的是0.3～2mm。细孔径优选为10～150nm，更为优选的是10～100nm。作为材质可以列举酚醛类、聚苯乙烯类、丙烯酰胺类、二乙烯基苯类等，特别是从酶的吸附性的观点出发优选酚醛类树脂(例如，Rohm and Haas公司制的Duolite A-568)。 

对于使用于本发明的固定化酶的酶并没有特别的限定，但是从较大地提高生产性的效果出发，优选作为油脂类分解用酶的脂肪酶。脂肪酶可以使用来自于动物和来自于植物的脂肪酶，也可以使用来自于微生物的市售的脂肪酶。作为来自于微生物的市售的脂肪酶可以列举根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、假单胞菌属(Pseudomonas)、地丝菌属(Geotrichum)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)等的起源物质。 

实行酶的固定化的温度可以根据酶的特性来决定，但是优选为不发生酶失活的0～60℃，特别优选5～40℃。另外，对于在固定化时所使用的酶溶液的pH值而言，只要是在不发生酶变性的范围内即可，与温度的情况相同，可以根据酶的特性来决定，优选为pH3～9。为了维持这个pH值而使用缓冲液，作为缓冲液可以列举醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(TRIS-Hydrochloride)缓冲液等。从固定化效率的观点出发，上述酶溶液中的酶浓度优选在酶的饱和溶解度以下并且有充分的浓度。另外，根据必要，酶溶液可以使用以离心分离去除不溶解部分的上清液，或者也可以使用由超滤等进行精制的溶液。另外，所使用的酶质量根据其酶的活性而有所不同，相对于载体质量优选5～1000质量％，特别优选10～500质量％。 

对酶进行固定化的情况下，可以使载体和酶直接吸附，但是为了要做成表现高活性的吸附状态，优选在酶吸附之前以脂溶性脂肪酸或者其衍生物对载体进行预处理。作为脂溶性脂肪酸或者其衍生物与载体的接触方法，可以将它们直接投入到水或者有机溶剂中，但是为了使分散性良好，可以在暂时使脂溶性脂肪酸或者其衍生物分散以及溶解于有机溶剂之后、将其添加到分散于水中的载体上。作为该有机溶剂可以列举三氯甲烷、己烷以及乙醇等。脂溶性脂肪酸或者其衍生物的使用量相对于载体质量优选1～500质量％，特别优选10～200质量％。接触温度优选为0～100℃，特别优选为20～60℃。接触时间优选为5分钟～5小时。完成了该处理的载体可以通过过滤来加以回收，并可以对其进行干燥。干燥温度优选为室温～100℃，也可以进行减压干燥。 

在对载体实施预先处理的脂溶性脂肪酸或者其衍生物中，作为脂溶性脂肪酸可以列举碳原子数为4～24、优选为碳原子数8～18的饱和或者不饱和的直链或者支链的可以具有羟基的脂肪酸。具体可以列举癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、蓖麻醇酸以及异硬脂酸等。另外，作为上述脂溶性脂肪酸的衍生物，可以列举这些脂溶性脂肪酸与一元或者多元醇或者糖类的酯、磷脂、以及将环氧乙烷加成于这些酯的物质等。具体可以列举上述脂肪酸的甲酯、乙酯、单甘油酯、二甘油酯、这些酯的环氧乙烷加成物、聚甘油酯、山梨糖醇 酐酯以及蔗糖酯等。对于在将酶固定于载体上的工序上来说，优选这些脂溶性脂肪酸以及其衍生物在常温下均为液状。作为这些脂溶性脂肪酸或者其衍生物，既可以合并使用2种以上上述物质，也可以使用菜籽脂肪酸以及大豆脂肪酸等的来自于天然的脂肪酸。 

固定化酶的水解活性优选为20U/g以上，更为优选的是100～10000U/g，特别优选的是500～5000U/g的范围。在此，酶的1U表示：在40℃的温度条件下，在一边对油脂类∶水＝100∶25(质量比)的混合液实施搅拌混合一边使之水解30分钟的时候，在1分钟的时间内生成1μmol的游离脂肪酸的酶的分解能力。赋予每单位质量油脂类的固定化酶的水解活性(U/g-oil)、与到达某个水解率为止的所需时间，大致呈反比率的关系。 

在使用充填有固定化酶的充填层(酶塔)来实行水解的时候，虽然根据送液条件(流通液体速度、温度等)的不同而分解速度也会有所不同，但是从在酶充填层出口处的油脂的水解率、水解所需时间(充填层内的滞留时间)、存在于充填层内的油脂类的质量(g-oil)以及固定化酶的充填质量(g)，可以求得固定化酶的表观活性(表现活性)(U/g)。还有，为了求得存在于充填层内的油脂类的质量，通过将充填部的空隙率、反应液中的油脂类的容量比以及油脂类的比重乘以固定化酶充填部的容积来求得。 

本发明中的形成2个液相的液体混合物中的优选的1种为油相基质。所谓油相基质主要是指植物油、动物油或者组合这些油类的油脂类，所谓“油脂类”除了包含三酰基甘油(甘油三酯)之外还可以包含二酰基甘油(甘油二酯)、单酰基甘油(甘油单酯)、或者脂肪酸类，也可以包含由水解而得到的脂肪酸。作为油相基质的具体例子可以列举菜籽油、大豆油、葵花籽油、棕榈油以及亚麻籽油等的植物油；牛油、猪油以及鱼油等的动物油等；或者组合这些油的油脂类。作为这些油脂类，除了能够使用脱臭油之外，还可以使用预先没有脱臭的未脱臭油脂，但是从降低反式不饱和脂肪酸以及共轭不饱和脂肪酸的观点、以及从能够使来自于原料油脂的植物甾醇、植物甾醇脂肪酸酯以及生育酚(维生素E)残存的观点出发，优选这些油脂类的一部分或者全部中使用未脱臭油脂。在油相基质中除了上述油脂类之外也可以混 合脂肪酸等的油溶性成分。所谓脂肪酸类是指，除了包括由水解而能够得到的脂肪酸之外，还包含上述甘油酯的1种以上的物质。 

本发明中的形成2个液相的液体混合物中的优选的另1种为水相基质。水相基质是水，但是其中也可以混合由水解而得到的甘油等以及其他的水溶性成分。 

在本发明中所使用的固定床型反应塔(酶塔)，其形状只要能够承受得起所使用的泵的推入压力即可。另外，优选在酶塔的周围配设夹套从而能够将流通于酶塔内的反应液调整到适合于酶反应的温度。 

为了更有效地发挥出固定化酶的活性，酶塔内的温度优选为0～60℃，更为优选的是20～40℃。 

酶塔的长度只要能够达到对于得到希望的分解率所必要的长度即可，但是从反应性以及塔内压力损失等的观点出发，优选为0.01～10m的范围，更为优选的是0.1～5m的范围。 

在本发明中，在酶塔中，在酶塔的纵向上插入隔离板以形成多个管状构造，其中，一个管子的横截面是至少一部分没有闭塞的代表长度为100mm以下的圆形或者多边形，并将固定化酶充填于该管状构造内，并且将所述液体混合物提供给该管状构造内，以进行反应。通过在具有像这样的较小截面积的多个管状构造内进行反应，酶塔内的流通通道的截面积变小，并且能够使成为2个液相的反应液的流动均匀。另外，通过形成一个管子的横截面为至少一部分没有闭塞的管状构造，固定化酶充填部的容积率上升，反应性提高并且还能够谋求到成本的降低。再则，去除固定化酶的操作性也良好。还有，此时，在隔离板和酶塔内壁之间有间隙的情况下，在该间隙中也会充填固定化酶，这从使反应液均匀流动的角度出发是优选的。还有，在本发明中，所谓“代表长度”意味着，如果横截面为矩形那么就是指其对角线的长度，如果为圆形那么就是指其直径，如果为其他椭圆或者多角形那么就是指具有与这些形状的投影面积相同的面积的圆的直径。 

隔离板只要以能够在酶塔内形成具有所述截面积的多个管状构造的形式在纵向上进行插入即可。例如，可以列举将凹凸形的隔离板(平板、波纹板)装载于酶塔内部的方法(图1)、装载锯齿状的隔离板的方法(图2)、将装载凹形隔离板而构成的多边形内部用别的隔离板隔 开的方法(图3)、组合多枚组合用带有狭缝的隔离板[图4(a)]的方法(图4)等。另外，可以列举装载波浪形的隔离板的方法、将装载波浪形的隔离板而构成的圆形内部用别的隔离板隔开的方法、以及组合弯曲形状或者板状的多个隔离板从而以形成圆形或者多边形的形式进行装载的方法等。对于管子的横截面形状而言，从隔离板的装载效率的观点出发，在多边形的情况下优选为正三角形状、正方形状以及正六角形状，在圆形的情况下优选为圆形以及椭圆形。 

由隔离板形成的多个管状构造的一个管子(一个流通通道)的横截面的代表长度为100mm以下，但是从提高反应性的观点出发优选为75mm以下，更为优选的是50mm以下，特别优选的是35mm以下。 

从提高反应性的观点出发，在所述圆形或者多边形的横截面上的没有闭塞的部分的长度优选为0.1～10mm，更为优选的是0.5～8mm，特别优选的是1～6mm。还有，为了将隔离板和隔离板的间隔维持在一定，可以部分性地插入垫片(spacer)。另外，在所述组合用带有狭缝的隔离板的情况下，优选将狭缝的宽度设定为比隔离板的厚度宽0.2～20mm，更为优选宽1～16mm，特别优选宽2～12mm。 

将固定化酶充填于通过在酶塔中装载隔离板而形成的管状构造物中，并将2个液相的液体混合物(反应液)提供给该管状构造物内(参照图5)。 

通过搅拌使2个液相的液体混合物(反应液)的酶塔内的流动变得均匀。 

在充填固定化酶的时候，在所述隔离板和酶塔内壁之间有间隙，如果其间隙极其狭小，那么就难以充填固定化酶。如果向该间隙的充填不够充分的话，那么作为酶塔全体来说充填就会变得不均匀，从而会有产生体积密度下降的情况。在该情况下，反应液的流动会变得不均匀，有可能成为招致反应效率降低的原因。因此，优选将该隔离板和酶塔内壁的间隙调整到一定以上。虽然根据固定化酶等的充填物的种类和粒径、隔离板的尺寸而不同，但是优选将隔离板和酶塔内壁的间隙的最狭小部分做到1mm以上，进一步，从将固定化酶无间隙地均匀地进行充填这一观点出发，更优选将间隙的最狭小部分做到5mm以上。从使反应液均匀地流动的观点出发，该间隙的上限优选要做到一 个管子的截面的代表长度以下，更为优选的是70mm以下，特别优选的是要做到50mm以下。 

从使塔内的反应液全体的流动均匀化的观点出发，酶塔内的隔离板的长度优选在固定化酶的充填厚度以上，即使比充填厚度小，当在充填厚度的50％以上、进一步在75％以上的范围时，仍然能够获得同样的效果。 

另外，就隔离板而言，其全长上可以没有断开处，但是从更换充填了的固定化酶的容易程度等的操作性的观点出发，优选在上下方向上分割成多段。段数根据酶塔的全长而不同，优选分割为2～30段，更优选分割为2～10段。另外，进一步从向酶塔内的装填容易程度等观点出发，各段的隔离板可以分别在横向上分割成多个部分，又可以按每个区间被单元化。 

另外，在本发明中，在使用管径为35mmφ以上的酶塔来进行反应的时候，优选将所述管径(mm)相对于固定化酶平均粒径(mm)的比率(管径/平均粒径)调整到135(mm/mm)以下。当酶塔的管径不满35mmφ的时候，难以发生酶活性的降低且反应性也良好，但是，随着酶塔的直径变得比35mmφ大，从而会有酶的表现活性降低的倾向，其结果也就会有反应性降低的情况。在使用大管径酶塔的时候也是这样，通过规定酶塔的管径与固定化酶平均粒径的比率，能够按比率扩大，并且能够防止酶的活性降低，所以能够高效率地制造有用物质。 

从提高反应性的观点出发，管径/平均粒径优选为5～135(mm/mm)，更为优选的是15～130(mm/mm)，特别优选的是30～125(mm/mm)。还有，本发明中的担载酶的固定化酶的平均粒径是指，由激光散射衍射法粒度分布测定装置LS 13 320(Beckman Coulter株式会社制)测定的值。 

从固定化酶的充填容易程度等的操作性、反应性以及生产性的观点出发，酶塔的管径优选35～1000mmφ，更为优选的是35～800mmφ，特别优选的是40～600mmφ，最为优选的是50～300mmφ。 

作为将反应液提供给酶塔的方法，既可以由分别直接连接到酶塔的配管来实行、或者又可以用共有配管来实行供给，但是从避免水相和油相的乳化的观点以及操作性的观点出发，还是优选用分别直接连 接到酶塔的配管来实行。 

反应液的液体流通线速度优选为1～400mm/分钟，更为优选的是5～200mm/分钟。该液体流通线速度(mm/分钟)是指，以充填层截面积(mm²)除每1分钟的送液量(mm³/分钟)[或者，又可称为送液速度(10^-3mL/分钟)]的商来表示的值。伴随着由于提高液体流通线速度而引起的充填塔内压力的增大，从而使得液体流通变得困难，因此需要耐压性高的酶充填塔，并且，因为还存在固定化酶由于塔内压力的增加而发生破碎的情况，所以液体流通线速度优选为400mm/分钟以下。另外，从生产性的观点出发，液体流通线速度优选为1mm/分钟以上。固定化酶的表现活性根据液体流通的线速度而发生变化，所以，通过选定最合适的液体流通线速度来决定反应条件，从而就能够实行与所希望的生产能力以及制造成本相匹配的反应。 

从回避水解反应的平衡状态、更有效地发挥出固定化酶的活性以及提高生产性的观点出发，酶塔内的反应液的滞留时间优选为30秒钟～120分钟，更为优选的是1分钟～80分钟。所谓滞留时间(分钟)是，空隙率乘以充填层的厚度(mm)，并且该相乘结果除以液体流通线速度(mm/分钟)而得到的值。 

在本发明中，从兼顾反应性和生产性等的观点出发，可以把通过酶塔的反应液直接作为反应终了物质，另外，也可以首先对反应液进行油水分离、在分馏油相之后添加新水并以与上述相同的方法再一次提供给相同的酶塔、直至得到所希望的反应率为止重复通过酶塔。另外，也可以首先对反应液进行油水分离，在分馏油相之后添加新水并以与上述相同的方法再度提供给别的酶塔，从而实行连续反应。另外，也可以通过使用多个酶塔来一边进行反应液的油水分离一边将油相提供给下一个酶塔并将水相提供给前一个酶塔，从而以使更高分解率的油相与新鲜的水相进行反应的疑似逆流法实行反应。作为反应液的油水分离法，通常使用自然沉淀型以及离心分离型等的油水分离器，但并没有特别的限定。 

实施例 

[固定化酶的调制(1)] 

在N/10的NaOH溶液10质量份中将Duolite A-568(Rohm and Hass公司制，粒径分布100～1000μm)1质量份搅拌1小时。过滤后用10质量份的离子交换水进行清洗，并以500mM的醋酸缓冲液(pH7)10质量份进行pH的平衡化。之后，用50mM的醋酸缓冲液(pH7)10质量份每2个小时进行1次pH的平衡化共进行2次。此后，在回收没有实行过滤的载体之后，用乙醇5质量份进行30分钟的乙醇置换。过滤之后，添加含有1质量份的蓖麻醇酸的乙醇5质量份，从而用30分钟使蓖麻醇酸吸附于载体上。在由过滤回收载体之后，用50mM的醋酸缓冲液(pH7)5质量份每30分钟清洗1次共清洗4次，去除乙醇，过滤并回收载体。其后，与将市售的脂肪酶(脂肪酶AY，AMANO天野制药株式会社)1质量份溶解于50mM醋酸缓冲液(pH7)9质量份中的酶溶液相接触5小时，从而实行固定化。过滤回收固定化酶并通过用50mM醋酸缓冲液(pH7)10质量份实行清洗，从而去除没有被固定化的酶或者蛋白质。其后，添加实际上是实行分解的菜籽油4质量份并搅拌12小时。以上的操作全都在20℃的温度条件下进行。之后，过滤并与油脂相分离，从而制得固定化酶。其结果，获得了显示2700U/g(干燥质量)的水解活性(应该表现的活性)的固定化脂肪酶。固定化酶的质量标准的平均粒径为451μm。 

[固定化酶的调制(2)] 

在N/10的NaOH溶液10质量份中将Duolite A-568(Rohm and Hass公司制，粒径分布100～1000μm)1质量份搅拌1小时。过滤后用10质量份的离子交换水进行清洗，并以500mM的醋酸缓冲液(pH7)10质量份进行pH的平衡化。之后，用50mM的醋酸缓冲液(pH7)10质量份每2个小时进行1次pH的平衡化共进行2次。此后，在回收没有实行过滤的载体之后，用乙醇5质量份进行30分钟的乙醇置换。过滤之后，添加含有1质量份的蓖麻醇酸的乙醇5质量份，从而用30分钟使蓖麻醇酸吸附于载体上。在由过滤回收载体之后，用50mM的醋酸缓冲液(pH7)5质量份每30分钟清洗1次共清洗4次，去除乙醇，过滤并回收载体。其后，与将市售的脂肪酶(脂肪酶AY，AMANO天野制药株式会社)1质量份溶解于50mM醋酸缓冲液(pH7)9质量份 中的酶溶液相接触5小时，从而实行固定化。过滤回收固定化酶并通过用50mM醋酸缓冲液(pH7)10质量份实行清洗，从而去除没有被固定化的酶或者蛋白质。其后，添加实际上是实行分解的大豆油4质量份并搅拌12小时。以上的操作全都在20℃的温度条件下进行。之后，过滤并与油脂相分离，从而制得固定化酶(以下标记为固定化酶A)。进一步，使用粉碎Duolite A-568并将其分级的固定化载体、以及将Duolite A-568进行分级并去除了425μm以下的微粒子的固定化载体，以与上述相同的方法调制了固定化酶(分别作为固定化酶B、固定化酶C)。固定化酶A～C的水解活性(应该表现的活性)以及质量标准的平均粒径表示于表1中。 

[表1] 

	水解活性[U/g]	平均粒径(质量标准)[μm]
			固定化酶A	2400	500
固定化酶B	3030	300
			固定化酶C	2150	580

<实施例1> 

在以没有闭塞的部分的长度成为2mm的形式、在纵向上装填横截面的形状为11.4mm×11.4mm矩形(代表长度16mm)的锯齿状隔离板(相当于图2所表示的形式，厚度1mm，高度1300mm)的附有外套的不锈钢制塔柱(内径70mm，高度1500mm)中，充填1.3kg(干燥重量)由所述固定化酶的调制(1)方法所得到的固定化脂肪酶(充填高度1300mm)，并在外套上将温度保持在35℃。以4.3kg/Hr的送液速度从塔柱上部输送将菜籽油和蒸馏水以10∶6的重量比混合的溶液，并实行水解反应。其结果如表2所示。还有，表中的分解率是通过用皂化值除以根据分析而求得的酸值来计算的值。还有，酸值是由American Oil Chemists.Society Official Method Ca 5a-40中所记载的方法进行测定的，另外，皂化值是由American Oil Chemists.SocietyOfficial Method Cd 3a-94中所记载的方法进行测定的。 

<实施例2> 

在以横截面的形状为40mm×40mm的矩形(代表长度56mm)且没有闭塞的部分的长度成为1mm的形式、将组合用带有狭缝的隔离板(相当于图4所表示的形式，板厚2mm，高度300mm)组合装填而成的附有外套的不锈钢制塔柱(内径200mm，高度1500mm)中，在干燥状态下充填11.5kg(充填高度1500mm)由所述固定化酶的调制(1)方法所得到的固定化脂肪酶，并在外套上将温度保持在35℃。以30kg/Hr的送液速度从塔柱上部输送将菜籽油和蒸馏水以10∶6的重量比混合的溶液，并实行水解反应。其结果表示于表2中。 

<比较例1> 

在不锈钢制塔柱内不装填隔离板，并且在干燥状态下充填(内径70mm，充填高度1300mm)1.4kg由所述固定化酶的调制(1)方法所得到的固定化脂肪酶，除此之外，其余以与实施例1相同的程序实行水解反应。其结果表示于表2中。 

<比较例2> 

在不锈钢制塔柱内不装填隔离板，并且在干燥状态下充填(内径200mm，充填高度1500mm)12.7kg由所述固定化酶的调制(1)方法所得到的固定化脂肪酶，除此之外，其余以与实施例2相同的程序实行水解反应。其结果表示于表2中。 

[表2] 

	实施例1	实施例2	比较例1	比较例2
					横截面的代表长度(mm)	16	56	-	-
隔离板枚数	6	10枚×10段	-	-
					隔离板和反应塔内壁的最   小间隔(mm)	2	1	-	-
酶充填量(kg)	1.3	11.5	1.4	12.7
					酶充填空隙率	0.56	0.56	0.56	0.56
分解率(％)	86	89	78	77
					固定化酶的表观活性   (U/g)	710	830	377	354

[0071] 从表2所示结果可知，在固定床型反应塔内部，在固定床型反应塔的纵向上插入隔离板而形成有多个管状构造的状态下(其中，一个管子的横截面是至少一部分没有闭塞的代表长度为100mm以下的圆形或者多边形)，通过提供菜籽油以及蒸馏水来进行水解，从而提高分解率并且有效地表现固定化酶的(表观)活性。 

<实施例3> 

将固定化酶A350g(干燥质量)充填(充填高度1500mm)于附有外套的不锈钢制塔柱(内径35mm，高度1600mm)中，并在外套上将温度保持在35℃。以1.1kg/Hr的送液速度从塔柱上部输送将菜籽油和蒸馏水以10∶6的质量比混合的溶液，并实行水解反应。其结果如表3所示。 

<实施例4> 

在干燥状态下将865g的固定化酶A充填(充填高度1500mm)于附有外套的不锈钢制塔柱(内径55mm，高度1600mm)中，并在外套上将温度保持在35℃。以2.7kg/Hr的送液速度从塔柱上部输送将菜籽油和蒸馏水以10∶6的质量比混合的溶液，并实行水解反应。其结果如表3所示。 

<实施例5> 

除了将实施例3中的固定化酶A替换成固定化酶B之外，以与实施例3相同的方法实行水解反应。其结果如表3所示。 

<实施例6> 

在干燥状态下将1400g的固定化酶C充填(充填高度1500mm)于附有外套的不锈钢制塔柱(内径70mm，高度1600mm)中，并在外套上将温度保持在35℃。以4.3kg/Hr的送液速度从塔柱上部输送将菜籽油和蒸馏水以10∶6的质量比混合的溶液，并实行水解反应。其结果如表3所示。 

<比较例3> 

除了将实施例6中的固定化酶C替换成固定化酶A之外，以与实施例6相同的方法实行水解反应。其结果如表3所示。 

<比较例4> 

除了将实施例4中的固定化酶A替换成固定化酶B之外，以与实施例4相同的方法实行水解反应。其结果如表3所示。 

<比较例5> 

除了将实施例6中的固定化酶C替换成固定化酶B之外，以与实施例6相同的方法实行水解反应。其结果如表3所示。 

[表3] 

从表3所示的结果可知，即使是在使用管径为35mmφ以上的固定床型反应塔的情况下，通过在反应塔内以该管径相对于固定化酶平均粒径的比率(管径/平均粒径)成为135以下的形式充填固定化酶，从而提高分解率并且有效地表现固定化酶的(表观)活性。 

Claims (5)

1.一种有用物质的制造方法，其特征在于：

是将形成2个液相的液体混合物提供给充填了固定化脂肪酶的固定床型反应塔并使之朝同一个方向并流而进行反应的有用物质的制造方法，

所述液体混合物中的一种为油相基质、另一种为水相基质，所述油相基质含有油脂，所述水相基质含有水，

所述有用物质是脂肪酸类，

使用在固定床型反应塔的纵向上插入隔离板而形成有多个管状构造的固定床型反应塔，并将固定化脂肪酶充填于该管状构造内，并且将所述液体混合物提供给该管状构造内，在所述多个管状构造中，每个管子的横截面是代表长度为100mm以下且16mm以上的圆形或者多边形，

所述圆形或者多边形的横截面上具有没有闭塞的部分，该部分的长度为0.1～10mm，

所述代表长度意味着，如果横截面为矩形那么就是指其对角线的长度，如果为圆形那么就是指其直径，如果为其他椭圆或者多边形那么就是指具有与这些形状的投影面积相同的面积的圆的直径。

2.如权利要求1所记载的有用物质的制造方法，其特征在于：

在固定床型反应塔的纵向上插入的隔离板在上下方向上被分割成多段。

3.如权利要求1或者2所记载的有用物质的制造方法，其特征在于：

在固定床型反应塔的纵向上插入的隔离板在横向上被分割成多个部分。

4.如权利要求1或者2所记载的有用物质的制造方法，其特征在于：

在固定床型反应塔的纵向上插入的隔离板和固定床型反应塔内壁之间的间隙的最狭小部分为1mm以上且70mm以下。

5.如权利要求3所记载的有用物质的制造方法，其特征在于：

在固定床型反应塔的纵向上插入的隔离板和固定床型反应塔内壁之间的间隙的最狭小部分为1mm以上且70mm以下。

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