JP5989121B2 - 水溶液中での疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを使用した酵素的エステル交換 - Google Patents

Description

バイオ燃料、食品および海面活性剤の産業での使用用の脂肪酸アルキルエステルの生成のための酵素法が開示される。このプロセスでは、脂肪酸源およびアルコールまたはアルコール供与体は、疎水性樹脂上に固定化された酵素の存在下、アルカリ性水性緩衝液または水の存在下で、反応させる。開示されるプロセスは、または連続撹拌タンク反応器もしくは充填層反応器を連続で用いるバッチ式でまたは連続的でのいずれかで行われることができる。

酵素の固定化は、全酵素法において酵素の費用分担を減少させること；生成物から酵素の回収を容易すること；および該プロセスの連続操作を可能にすることを基本的に目標とする夥しい数の技法によって説明されてきた。

固定化技法は、通常、以下によって分類される：
１．シリカ高分子および不溶性高分子などの固体担体への酵素の物理的吸着。
２．イオン交換樹脂への吸着。
３．エポキシ化無機担体または高分子担体などの固体担体材料との酵素の共有結合。
４．成長する高分子内での酵素の封入。
５．膜反応器または半透性ゲル内での酵素の封入。
６．架橋酵素結晶（ＣＬＥＣ）または架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）。

上述のすべての酵素固定化プロセスは、以下のステップで構成されている：
１．ｐＨ、温度、緩衝塩の種類およびイオン強度に関して適切な緩衝液系で酵素を溶解するステップ。
２．酵素溶液に固体担体を加えて、酵素分子が該固体担体上に固定化されるまで暫く混合するステップ。
３．固定化した酵素を含む固体担体を濾過するステップ。
４．固体担体を適切な緩衝液で洗浄して、結合が弱い酵素分子を除去し、次いで該固体担体を乾燥させるステップ。

大部分はリパーゼである界面酵素は、上述した技法の後に固定化されてきた。これらの技法は、低い合成活性および／または短い作用半減期を有する固定化酵素調製物を提供した。固定化リパーゼおよび他の界面酵素の合成活性と安定性を増加させる試みにおいて、様々な活性化法が適用されてきた。これらの方法は以下を含む：
１．脂肪酸またはポリエチレングリコールなどの疎水性残基に酵素の表面官能基を結合すること。
２．酵素の表面を、ポリオール脂肪酸エステルなどの界面活性物質で被覆すること。
３．エタノールまたはイソプロパノールなどの親水性溶媒で前処理されている疎水性担体（典型的にはポリプロピレン）と酵素を接触させること。

酵素逆変換を工業量で行うために、固定化界面酵素の安定化および対費用効果に関して、上述の方法のいずれも、満足な結果をもたらさなかった。また、上述した方法によって固定化される場合、固定化方法によって課せられるいくつかの制約のため、または反応媒体中にいくつかの酵素抑制物質が存在するために、その合成活性のかなりの部分を失う、もしくはその活性の完全な性能を示さないことが報告されている。

リパーゼおよびホスホリパーゼの別の主要な弱点は、親水性基質、特に短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（Ｃが４以下のもの）に対するそれらの耐性が低いことである。多くの研究調査では、短鎖アルコール類および短鎖脂肪酸（それぞれメタノールおよび酢酸など）がこれらの酵素の四次構造から重要な水分子が分離することに関与しており、それらの触媒活性の変性およびその結果、触媒活性の消失を引き起こすことが観察されている。この弱点のために、基質としてオイルトリグリセリドおよびメタノールを用いる、脂肪酸メチルエステル「バイオディーゼル」の商業量の生産のためにリパーゼの使用が妨げられてきた。

遊離アルコールによる脂肪酸源のエステル交換／エステル化のために固定化リパーゼを用いるさらなる弱点は、生体触媒上に形成されたグリセロールおよび水の副産物が蓄積され、したがって基質が固定化酵素の活性部位に自由に接近するのを妨げていることである。かかる生体触媒は通常、同じバッチの生体触媒が使用される場合、数サイクル後にその触媒性能を失う。

本発明者らは、多くの生成サイクルにわたり良好な安定性を示し、活性を持続する特別な固定化酵素調製物を開発した。かかる酵素調製物の例は、とりわけ、国際公開第ＷＯ２００８／０８４４７０号、同第ＷＯ２００８／１３９４５５号、および同第ＷＯ２００９／０６９１１６号に開示されている。

触媒反応が行われる条件は、固定化酵素調製物の安定性および効率に悪影響を与えることもある。触媒反応条件下で安定性および活性を保持する酵素調製物を有することは重要である。

本発明のこれらおよび他の目的は、説明が進むにつれて明らかになる。

一実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源をアルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールでのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を含む。

この実施形態のすべての態様では、前述の水性アルカリ性緩衝液は、弱アルカリ性水性緩衝液であってもよい。前述の水性アルカリ性緩衝液は、脂肪酸源の最高９９重量％まで、例えば、最高９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％および１％までの量で反応混合物に含まれてもよい。あるいは、前述の水性アルカリ性緩衝液は、脂肪酸源の１重量％超、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超および最高９９％までの量で反応混合物に含まれていてもよい。該水性緩衝液は、７から約１１、例えば、７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０および７〜１１のいずれか１つのｐＨ値であってよい。本発明のプロセスでは、該緩衝液を含む補充した弱アルカリ性試薬のｐＫａは、脂肪酸源中に存在する遊離酸類のｐＫａよりも高いまたは等しくてもよい。

別の実施形態では、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、固定化リパーゼ調製物の存在下で脂肪酸源とアルコールとを反応させることを含む、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスに関し、固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、および反応媒体が水を含有する。水は、３〜１１のｐＨ値を有する、種々の溶解塩を含有する蒸留水または水の形状である。この実施形態のすべての態様では、反応媒体は、脂肪酸源の最高９９重量％まで、例えば、最高９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％および１％までの量で水または水溶液を含んでもよい。あるいは、水または水溶液は、脂肪酸源の１重量％超、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超および最高９９％までの量で反応混合物に含まれてもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、アルコールは短鎖アルコール、例えば、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルアルコール、より具体的にはＣ_１−Ｃ_４アルキルアルコール、特にメタノールまたはエタノールであってもよい。前述のアルコールがメタノールである場合、結果として生じる脂肪酸エステルは、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である。また、アルコールは、中鎖脂肪アルコール（Ｃ_６−Ｃ_１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ_１２−Ｃ_２２）であってもよい。アルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルもしくは炭酸ジエチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼは、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリド、部分グリセリド、ワックスエステルおよびリン脂質のエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステル、ならびにそれぞれ副産物としてグリセロールおよび長鎖脂肪アルコールおよびグリセロリン脂質をもたらすことができる。

アルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の使用に関する本発明のすべての実施形態および態様では、反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液またはアルカリ性溶液の量は、脂肪酸源の０．００１重量％超である。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の少なくとも１つのリパーゼは、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンのいずれか１つに由来するリパーゼであってもよい。リパーゼ調製物は、同じ疎水性担体上でそれぞれ別々に固定化されうる、または共固定化されてもよい。前述のリパーゼは、同時に、または連続的に遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルおよび副産物として水をもたらすことができ、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステルおよび副産物としてグリセロールをもたらすことができ、ならびに／あるいはリン脂質のエステル交換を触媒して脂肪酸アルキルエステルと副産物としてリゾリン脂質およびグリセロリン脂質をもたらすことができる。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の担体は、疎水性脂肪族高分子をベースにした担体および疎水性芳香族高分子をベースにした担体のうちのいずれか１つでありうる。前述の疎水性高分子担体は、線状または分岐状の有機鎖から構成されてもよい。前述の担体は、マクロ網状有機高分子鎖またはコポリマー鎖を含むこともある。前述の担体は多孔質、または非多孔質の無機担体であってもよく、これらは疎水性であってもよく、または疎水性有機材料で被覆されている。前述の有機材料は、線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖であってもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、前述の水性アルカリ性緩衝液は、無機アルカリ塩または有機塩基の溶液でありうる。前述のアルカリ性緩衝液は、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩、脂肪酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの任意の混合物のいずれか１つの溶液であってもよい。特定の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムおよび炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムから選択される弱塩基の溶液であってもよい。本発明のプロセスについての一部の実施形態では、前述のアルカリ性緩衝液は、前述の脂肪酸源の予備混合の段階で、または直接的に反応媒体に加えられてもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、アルカリ性緩衝液が使用される場合、エステル交換／エステル化反応媒体中の前述のアルカリ性緩衝液の含有量は、油供給原料の０．００１重量％超、例えば油供給原料の１〜３０重量％、１〜２０重量％、１〜１０重量％、１〜５重量％または１〜２重量％の量、あるいは油供給原料の５重量％超、例えば油供給原料の６重量％、７重量％、８重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％および５０重量％の量でありうる。

本発明の一部の実施形態では、脂肪酸源は、まずアルカリ性緩衝液と、または水もしくは水溶液と混合されてもよく、次いでこの混合物を前述の固定化リパーゼ調製物で処理してもよく、続いて前述のアルコールを加えることで、前述の脂肪酸源が脂肪酸エステルに変わるまで適切な条件下で反応が進行することが可能になる。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つであってもよい。前述の脂肪酸源は、リン脂質、ワックスエステルおよびステロールエステルなどの他の微量な脂肪酸誘導体の非存在下または存在下で、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリド、任意の割合でのそれらの混合物を含んでもよい。脂肪酸源は、未精製、精製、漂白、脱臭したものまたはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、反応は、１０℃と１００℃との間、具体的には、２５℃と３０℃との間の温度で行われうる。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の脂肪酸源は、予備反応調整容器中で、前述のアルコールもしくはアルコール供与体と、および水もしくは緩衝液と予備混合させて、エマルジョンを形成し、次いで前述の固定化リパーゼ調製物とともにエステル交換／エステル化反応容器に供給されてもよい。

本発明のすべての実施形態および態様では、前述の固定化リパーゼを、バッチ方式でまたは連続方式で作動する充填層反応器で使用してもよい。

本発明の別の態様によれば、脂肪酸アルキルエステルを形成するために、脂肪酸のアルコールとのエステル交換／エステル化のためのシステムが提供され、該システムは脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含む反応媒体を固定化リパーゼ調製物の存在下で反応させるように構成された反応容器を含み、該固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、該反応媒体が水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを含む。

該システムは、任意の所望の組み合わせまたは順列で、以下の特徴の１つまたは複数を含みうる：
Ａ．前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は固定化リパーゼ調製物を含むことができる。
Ｂ．Ａの特徴に加えてまたはその代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、反応容器は脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを含むことができる。
Ｃ．ＡもしくはＢの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、前述の脂肪酸アルキルエステルの生成のための前述のシステムの少なくとも作動中に、前述の反応媒体は混合物を含み、前述のシステムは前述の反応容器と選択的流体連通している予備反応容器をさらに含み、前述の予備反応容器は前述の混合物を形成するために少なくとも脂肪酸と、アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つとを予備混合するように、および前述の混合物を前述の反応容器に選択的に送るように構成されている。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の予備反応容器と選択的流体連通し、かつ脂肪酸を前述の予備反応容器に選択的に送るように構成された脂肪酸源と、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の予備反応容器と選択的流体連通し、かつアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つを前述の予備反応容器に選択的に送るように構成されたアルコール源とを随意にさらに含むことができる。該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の予備反応容器と選択的流体連通し、かつ前述の混合物に含まれるべく水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つを前述の予備反応容器に選択的に送るように構成された緩衝液源を随意にさらに含む。
Ｄ．ＡからＣの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、脂肪酸および／またはアルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つおよび／または水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つからの１つまたは複数を連続方式または別々のバッチでのいずれかでそれぞれ前述の予備反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｅ．ＡからＤの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該予備反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の混合物を連続方式および／または別々のバッチで前述の反応容器に選択的に送るように構成されることができる。
Ｆ．ＡからＥの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、少なくとも１つの脂肪酸と；アルコールおよびアルコール供与体のうちの少なくとも１つと；水性アルカリ性緩衝液および水のうちの少なくとも１つとを前述の反応容器に選択的かつ直接的に送るように構成されることができる。
Ｇ．ＡからＦの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述の反応容器中の反応媒体を選択温度範囲内に維持するように構成された温度調節装置を含むことができる。
Ｈ．ＡからＧの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、固定化リパーゼ調製物を前述の反応容器内に保持するように構成された保持装置をさらに随意に含むことができる。
Ｉ．ＡからＨの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の反応容器と選択的流体連通している生成物分離容器をさらに随意に含むことができ、前述のシステムが反応産物を含む反応混合物を前述の反応容器から前述の生成物分離容器に選択的に送るように構成され、および前述の生成物分離容器がそこに送られた反応混合物から脂肪酸アルカルエステルの生成物を選択的に分離するように構成されている。例えば、生成物分離容器は、遠心分離機および重力分離装置のうちの１つでありうる。
Ｊ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該反応容器は、前述のシステムの少なくとも前述の作動中に、前述の反応混合物を前述の生成物分離容器に連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｋ．ＡからＩの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に送るように構成される。例えば、該システムは、前述の生成物分離容器からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を連続方式でおよび／または別々のバッチで選択的に送るように構成される。
Ｌ．ＡからＫの特徴に加えてまたはそれらの代わりに、該システムは、前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を増加させるように構成される。この特徴を有するシステムの一構成では、該システムは、続いて前述の生成物分離容器に送られた反応混合物からの脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物をさらに増加させるために、脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成される。この特徴を有するシステムの別の構成では、該システムは、補助反応器のモジュールに脂肪酸アルキルエステルの前述の生成物を選択的に別のルートで送るように構成され、前述の補助反応器のモジュールが補助反応容器と補助生成物分離容器とを含み、脂肪酸アルキルエステルの前述のさらに増加した生成物は、続いて前述の補助生成物分離容器を介して選択的に送られる。

本発明を理解し、および本発明をどのようにして実際に行えうるかを調べるために、ここで添付の図面を参照して、非限定的な例だけの目的で、実施形態を説明する：

疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００（Ａｍｂ．ＸＡＤ１６００）上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ Ｄ５６８（Ｄｕｏ Ｄ５６８）上に固定化されたリパーゼ・サーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ）、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ７０（ＳＢ ＳＰ７０）上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ（Ｓｉｌ．）上に固定化されたリパーゼ・シュードモナスエスピー（ＰＳ）のエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの転換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、水を含まずに、および異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、異なるレベルの水で６時間反応させた後の、大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウムを異なるレベルで４時間エステル化／エステル交換を行った後の、ＦＦＡおよび大豆油の混合物のバイオディーゼルと、グリセロールおよび水の副産物とへの変換を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル；ＤＷ−蒸留水 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２％の存在下で４時間反応させた後の、大豆油加水分解産物のバイオディーゼルおよび水へのエステル化を示すグラフである。生体触媒は、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーに由来するリパーゼであった。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム１重量％の存在下で６時間反応させた後の、魚油のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼ（それぞれＴＬ Ｌｉｐ．、ＰＳ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル 複数のバッチ実験において同じバッチの生体触媒を用いて、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム２重量％の存在下で６時間反応させた後の、獣脂のエタノールとのエステル交換を示すグラフである。生体触媒は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス、シュードモナスエスピー由来のリパーゼ（ＰＳ Ｌｉｐ．；ＴＬ Ｌｉｐ．）であった。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｃ．−サイクル 疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカとともに、疎水性で多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピーまたはサーモマイセスラヌギノサスを用いて、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含む、４時間後に得られたエステル交換／エステル化の反応媒体の処置を示すグラフである。略語：Ａｃ．Ｖａｌ．−酸価；Ｃｙｃ．−サイクル 疎水性樹脂としてのジビニルベンゼン／ポリスチレン（ＤＶＢ−ＰＳ）上、親水性樹脂としての弱アニオン交換親水性樹脂（Ｒｅｓ．）上および顆粒状多孔質シリカ（Ｓｉｌ）上に固定化されたアルカリジェネスエスピー（ＡＬ）由来のリパーゼのエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル 疎水性樹脂としてのジビニルベンゼン／ポリスチレン（ＤＶＢ−ＰＳ）上、親水性樹脂としての弱アニオン交換親水性樹脂（Ｒｅｓ．）上および顆粒状多孔質シリカ（Ｓｉｌ）上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ）のエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル 疎水性樹脂としてのジビニルベンゼン／ポリスチレン（ＤＶＢ−ＰＳ）上、親水性樹脂としての弱アニオン交換親水性樹脂（Ｒｅｓ．）上および顆粒状多孔質シリカ（Ｓｉｌ）上に固定化されたシュードモナスエスピー（ＰＳ）リパーゼのエステル交換活性を示すグラフである。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液の異なる濃度で、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後の大豆油の脂肪酸メチルエステルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ｓｏｌ．−溶液 ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液の異なる濃度で、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたシュードモナスエスピー（ＳＰ））を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ｓｏｌ．−溶液 反応混合物中蒸留水の異なる濃度で、複数バッチでの実験において、同じバッチの（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ｗａｔ．−水 ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液の異なる濃度で、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後のオレイン酸のバイオディーゼルおよび水への変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ｓｏｌ．−溶液 ８重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液の存在下での、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後のオレイン酸および大豆油の異なる混合物のバイオディーゼル、グリセロールおよび水への変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ｏｌ．Ａｃ．−オレイン酸 ８重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液の存在下での、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後のリン脂質を含有する粗製油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；ＲＳＢＯ−精製大豆油；ＣＳＢＯ−粗製大豆油；ＲＳＢＯ−精製大豆油；ＰＬ−リン脂質；Ｏ．−油； ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液について異なるｐＨ値での、複数バッチでの実験において、同じバッチの（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。反応媒体中の緩衝液濃度は油の８重量％であった。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル ０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液について異なるｐＨ値での、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換を示すグラフである。反応媒体中の緩衝液濃度は油の８重量％であった。１：３の油とメタノールとの間のモルベース比で、メタノールを反応混合物に１ステップで添加した。略語：Ｃｏｎｖ．−変換；Ｃｙｓ．−サイクル；Ａｃｅｔ．−酢酸塩 本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第１の実施形態を示す概略図である。 本発明の一態様によって脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムの第２の実施形態を示す概略図である。

酵素で触媒される工業プロセス、特に固定化リパーゼの存在下で、脂肪酸源のアルコールとのエステル交換／エステル化を行うプロセスについての改善を求めて、本発明者らは、固定化リパーゼの安定性が多数の生成サイクルにわたり維持される特定の条件を開発した。

本発明の一実施形態では、本発明は、脂肪酸のアルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステルおよびエチルエステル（バイオディーゼル）などの脂肪酸の短鎖アルキルエステルを無溶媒のアルカリ性微水系で調製するプロセスに関する。特定の実施形態では、アルカリ性微水系は、弱アルカリ性微水系である。前述のプロセスは、脂肪酸源を供給し、前述のアルカリ性もしくは弱アルカリ性の条件下で、固定化リパーゼ調製物の存在下で、脂肪酸源を遊離アルコールまたはアルコール供与体と反応させることを含む。理論に束縛されることなく、アルカリ性緩衝液による脂肪酸源の前処理は、酵素に阻害効果を及ぼすこともある酸の中和をもたらすであろう。最高１００％までの変換までの反応を完了するために必要とされるアルコールの量を段階的にまたは１つのバッチで添加してもよい。さらに、該アルコールは、短鎖アルコール、例えばメタノールまたはエタノールであってもよい。他のアルコール供与体を加水分解酵素の存在下で脂肪酸源との反応で用いてもよく、これにより前述の脂肪酸源が脂肪酸アルキルエステル、具体的には、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）または脂肪酸エチルエステルに変換されるまで、適切な条件下で該反応が進行することが可能になり、ここで前述の加水分解酵素調製物が適切なマクロ網状の多孔質疎水性高分子をベースにした担体上に別々にまたは一緒に固定化された１つまたは複数のリパーゼを含む。

さらなる実施形態では、脂肪酸源とアルコールまたはアルコール供与体との間のエステル交換／エステル化反応は、反応混合物に水を添加することで、水性微小環境で行われる。特定の実施形態では、水は、（脂肪酸源に基づいて）０．０００１重量％より高い量で添加されてもよい。ここで用いられる水とは、純水または蒸留水、および「水溶液」（水性溶液とも呼ばれる）も意味し、水溶液とは、水道水、海水もしくはいずれの他の天然水源もしくは貯水池からの水、脱塩水、化学的にもしくは酵素的に精製または処理された水、およびいずれの他の水性溶液、例えば、溶解塩溶液であってもよいがこれらに限定されるものではない。反応系または水溶液のｐＨ値は変化することがあり、例えば、約３〜１１、例えば４〜１０、５〜１０、５〜９、６〜１０、６〜９、または７〜９でありうる。

本発明のプロセスは、形成されるグリセロールおよびいずれの過剰な水を反応混合物から連続的に除去しながら、行われることも可能である。前述の脂肪酸源に含まれる遊離脂肪酸の脂肪酸アシル基の、脂肪酸アルキル、具体的にはメチルエステルへの変換は、反応の間、種々の時点でモニターされることができる。反応媒体は、反応の間、任意の所望の時点で適切な手法より除去されてもよく、それによって反応が停止され、形成された脂肪酸メチルエステルと、随意に、形成されたグリセロールとが該反応媒体から単離される。前述の脂肪酸源に含まれる脂肪酸アシル基または遊離脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換が少なくとも７０％、例えば少なくとも８５％、または少なくとも９０％に達したときに、該反応は明確に停止されてもよい。

該反応系は、同時係属中の国際公開第ＷＯ２００９／０６９１１６号に記述されているものと同じようでありうる。例えば、生成システは、反応器内に生体触媒を保持するが、しかし反応媒体が反応器を通って浸透することを可能する焼結ガラスまたはステンレス鋼フィルタの底部を有する撹拌タンク反応器を用いてもよい。かかる反応器の構成は、副産物、具体的にはグリセロールおよび水を考慮に入れている。副産物は、固定化酵素から、シンク、反応器の底部へと自己脱離し、フィルタを通って染み出る。形成され、脱離したグリセロールおよび過剰な水分も反応媒体から連続的に除去される結果、合成に向かって反応の変化がもたらされ、それによって９８％を超える変換が達成される。この反応器で用いられる生体触媒は、本明細書に記述するように、それらの位置特異性ならびにそれらの起源を考慮すると、単一種または複数種のリパーゼから構成されてもよい。代替の、底部フィルタを有する２つの連続した撹拌タンク反応器を用いてもよい。沈殿タンクまたは遠心分離機をこれら２つの反応器の間に用いてもよい。第１の反応器は、単一種または複数種のリパーゼから構成される固定化生体触媒を含んでもよい。両反応器の間の沈殿タンクまたは遠心分離機の役割は、形成されるグリセロールおよび過剰な水を反応媒体から除去することであり、それによって原料の対応する脂肪酸アルキルエステルへの変換が増加し、第２の反応器において適切な反応時間で９８％を超えることになる。一部の特定の反応系およびその方法は、後述する。

用語「反応混合物」、「反応系」および「反応媒体」とは、本明細書では同意語として使われることもある。

本発明の実施形態におけるように、アルカリ性緩衝液または水溶液の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを用いることで、安定性の高い酵素を確保し、かつ水および形成されるグリセロール副産物などの親水性物質が生体触媒上に蓄積されないようにする。アルカリ性または弱アルカリ性緩衝液を用いる本発明のプロセスのすべての態様および実施形態では、０．００１％超のアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液、例えば、それだけに限らないが、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、０．０１〜５０％、０．０５〜５０％、０．１〜５０％、１〜５０％、１〜４５％、１〜４０％、１〜３５％、１〜３０％、１〜２５％、１〜２０％、１〜１５％、１〜１０％、１〜８％、例えばそれだけに限らないが、０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１%、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％。４．５％、５％、６％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％または７０％などのアルカリ性または弱アルカリ性緩衝液を用いてもよい。アルカリ性または弱アルカリ性緩衝液の濃度は最高９９重量％までであってもよい。本発明のすべての態様および実施形態では、水または水溶液を用いる場合、該水または水溶液は、それだけに限らないが、０．０００１％超、例えば０．０００１〜５０％、０．００１〜５０％、０．１〜５０％、０．０００１〜３０％、０．００１〜３０％、０．１〜３０％、０．０００１〜２０％、０．００１〜２０％、０．１〜２０％、例えばそれだけに限らないが、０．００１〜５、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．５〜５％、例えば０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または７０％超の濃度で用いる。反応混合物中の水または水溶液濃度は、最高９９重量％までであってもよい。上述のように、アルカリ性溶液を用いる場合、該溶液は、脂肪酸源中に典型的に存在するまたは副反応のために生成される酸を中和することが可能である。これらの副産物を持続的かつ積極的に除去することで、プロセスの効率がさらに上昇しうる。単離したグリセロールを、工業的に使用してもよい。

本発明のプロセスで用いられる脂肪酸源は、大豆油、カノーラ油、藻類油、菜種油、オリーブ油、ヒマシ油、パーム油、ひまわり油、落花生油、綿実油、ジャトロファ油、粗トウモロコシ油、魚油、動物性油脂、廃食油、ブラウングリース、非食油植物源に由来するオイルトリグリセリド、これらの油またはそれらの少なくとも２つの任意の混合物（任意の所望の割合で）に由来する部分グリセリドおよび遊離脂肪酸のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

脂肪酸源として粗製油を使用する例を図１９に示す。ここでは、粗製大豆油を使用した。この図はまた、脂肪酸源として種々の濃度でリン脂質を含有する油の使用を示している。遊離脂肪酸と油の混合物の使用を例として図１８で説明する。ここでは、オレイン酸と種々の濃度の油の混合物、およびオレイン酸自体（１００％）の混合物が脂肪酸源として作用した。

本発明のすべてのプロセスでは、反応によって形成される脂肪酸短鎖アルキルエステルは、具体的には、脂肪酸メチル、エチル、イソプロピルまたはブチルエステル（バイオディーゼル）である。他の中鎖脂肪アルコール（Ｃ_６−Ｃ_１０）および長鎖脂肪アルコール（Ｃ_１２−Ｃ_２２）も本発明の生成プロセスで用いてもよい。これらの長鎖アルコールは、具体的にワックスの製造、例えば化粧品に適していることがある。

リパーゼは、サーモマイセスラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ムコールミーハイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉｅ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスエスピー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ペニシリウムロックフォルティ（Ｐａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンに由来するリパーゼであってもよいが、これらに限定されるものではない。

複数のリパーゼは、適切な担体、具体的には疎水性脂肪族高分子をベースした担体または疎水性芳香族高分子の担体上に一緒に固定化されることもある。前述のリパーゼの各々は、適切な担体上に固定化されてもよく、前述のリパーゼがその上に固定化される担体は、同一であるか、または異なっている。使用されるリパーゼは、それらの基質に対して位置特異的であるか、またはランダムであってもよい。複数のリパーゼが用いられる場合、リパーゼは、同一または異なる疎水性担体上に固定化されてもよい。同一の担体上に共固定化されるリパーゼは、それらの基質に対して同一もしくは異なる基質選択性または位置特異性を示すことができる。

複数のリパーゼは位置特異的（または部位特異的）であってもよく、各々は単独で、または同一もしくは異なる部位特異性のリパーゼとの組み合わせで用いられてもよい。ｓｎー１位、ｓｎ−２位またはｓｎ−３位と呼ぶとき、これらは種々のグリセリドのグリセロール骨格の位置である。このように、本発明のプロセスで用いられるリパーゼは、ランダムリパーゼのそれよりも高いｓｎ−２位に対する選択性（すなわち、アルコールもしくはアルコール供与体と、ｓｎ−２位の脂肪酸アシル基との間の反応を触媒することを好む）を有することもあるが、ランダムリパーゼは、グリセロール骨格上の３つのすべての位置で脂肪酸アシル基に対して同じエステル交換活性を示す。一部のリパーゼは、ｓｎ−２位で、特に、基質、生成物などによって決定される特定の条件下で、位置活性を独自に示す。本発明のプロセスで用いられる他のリパーゼは、ｓｎ−１、３位特異的である。それらのリパーゼは単独で、またはランダムリパーゼ、具体的には部分グリセリドに親和性を有するリパーゼとともに、およびｓｎ−２位に対して高親和性を有する第３のリパーゼと随意に用いられてもよい。

担体は、具体的には、多孔質およびマクロ網状疎水性担体であり、有機または無機担体であってもよい。担体の例としては、これらに限定されないが疎水化シリカまたは、およびアルミナをベースした担体などの多孔質無機担体、ならびにこれらに限定されないが高分子担体または高分子をベースにした担体などの疎水性有機担体がある。担体は、エポキシ基もしくは、およびアルデヒド基から選択される活性官能基、またはイオン基を随意に含んでもよい。

本発明のプロセスで用いられる不溶性担体は、具体的には、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（両方とも、ジビニルベンゼンから、またはジビニルベンゼンとポリスチレンとの混合物から調製された多孔質のミクロ網状樹脂で構成されている）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ ７ＨＰ（ミクロ網状脂肪族アクリル高分子で構成されている）などの多孔質で網状の疎水性脂肪族高分子もしくは芳香族高分子をベースにした担体、および多孔質ポリプロピレン（Ａｃｃｕｒｅｌ（登録商標））などの多孔質脂肪族高分子である。

担体は、ジビニルベンゼン、またはジビニルベンゼンとスチレンとの混合物で構成された網状疎水性高分子、および脂肪族アクリル高分子、またはポリプロピレンなどのポリアルケンで構成された網状疎水性脂肪族高分子であってもよい。特定の担体は、孔径が２５〜１０００Åの範囲内、より具体的には８０〜２００Åの範囲内の多孔質母材である。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水性シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。また、担体は、粉末状もしくは顆粒状の多孔質疎水化シリカまたは他の無機酸化物であってもよい。特定の実施形態では、担体樹脂の表面積は、１００ｍ^２／ｇよりも高い。

脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化を触媒したリパーゼに補充されることになるアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の量は、通常、他の反応条件、出発材料、生体触媒等にしたがって調節される。この量は、本明細書に列挙および例証するように、変えることができる。このアルカリ性溶液は、例えば、アルカリ性の無機塩基もしくは塩から、または有機塩基から調製される。無機塩基および塩類は、例えば、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩である。有機塩基は、例えば、第一級、第二級または第三級のアミンであってもよい。これらのアルカリ性薬剤の混合物も、考えられる。本発明によるプロセスでは、固定化酵素の微環境のｐＨは、アルカリ度または弱アルカリ度で維持される。図４および５に示すように、蒸留水を反応系に添加すると、疎水性担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼの性能が向上する。図１６に示すように、水を大量でさえ添加することができ、例えば、３０重量％の含水量で、生体触媒（固定化酵素）の安定性は保護され、同じバッチの生体触媒は、５０サイクルもの後に６０％変換活性を示した。用いる塩基の種類に応じてｐＨ値が異なる種々のアルカリ性緩衝液を添加すると、例えば図２および３、ならびに図１４、１５および１７にも示すように、疎水性担体（樹脂）上に固定化され、安定したリパーゼがもたらされた。これらの図は、高濃度のアルカリ性水溶液は、生体触媒の活性を害さず、例えば、５０反応サイクル超もの後に、反応系中３０重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液で、同じバッチの生体触媒を用いて約６０％の変換率を有したことを示している。いかなる理論にも拘束されないが、酵素は好ましくは最初にグリセリド型のエステル結合を加水分解し、連続的に補充されたアルコールにより形成された遊離脂肪酸をエステル化することができるので、高濃度の水が必要とされる。添加された水はまた、好ましい酵素触媒配置を維持するために必須の水分子の抽出を抑制することができるだろう。炭酸緩衝液および重炭酸緩衝液は、疎水性担体上に固定化されたリパーゼの安定性を増加させる際に効果的な弱塩基の例である。他の適切な塩基を本明細書に記述する。本明細書で用いた弱アルカリ性溶液は、通常、７〜約１１、例えば７〜８．５、７〜９、７〜９．５、７〜１０または７〜１１のｐＨ値を有する溶液である。通常、用いられるアルカリ性または弱アルカリ性水溶液の量は、反応で用いられる油の量に基づいて重量パーセント（重量％）で表される。

多孔質疎水性の高分子をベースにした担体（樹脂）上に固定化されたリパーゼをアルカリ性溶液または弱アルカリ性溶液の存在下で、ならびに本明細書に定義する水または水溶液の存在下で、上に列挙し、具体的に例証もした量で用いると、脂肪酸源とアルコールとの間のエステル交換／エステル化反応において生体触媒の安定した活性がもたらされる。これは、以下の実施例で示す。

脂肪酸源は、トリグリセリド、部分グリセリド、遊離脂肪酸、リン脂質、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミド、または前述の少なくとも２つの源で構成される混合物のうちの少なくとも１つである。

脂肪酸アルキルエステルの生成は、エステル交換またはエステル化を同時にまたは順次行うことによって実行される。かかる反応系下で、生体触媒活性は、複数回の使用で何ら著しい活性消失もなく維持され、かつ生体触媒上にグリセロールおよび水の副産物または他の親水性化合物も蓄積されない。

本発明は。多数の生成サイクルにわたり高い活性および安定性を保持する特定の固定化界面酵素を使用するプロセスを提供する。具体的には、エステル交換／エステル化反応において、リパーゼおよびホスホリパーゼ調製物が使用される。これらの反応物は、食料品、化粧品およびバイオ燃料（「バイオディーゼル」）の生成で使用されることが可能である。特に興味深いのは、これらの酵素が、「バイオディーゼル」としての用途用の脂肪酸短鎖アルキルエステルの合成のために使用されることが可能なことである。

本発明は、メタノール、エタノールおよびグリセロールなどの短鎖アルコール、ならびに酢酸などの短鎖脂肪酸に対する耐用が高い、安定の固定化界面酵素を用いた。また、これらの酵素調製物を使用すると、親水性物質、特にグリセロールおよび水が固定化生体触媒上に蓄積されるのを防止する。

本発明の一実施形態では、適切な反応時間、典型的には５時間未満で、ほぼ完全な変換で所望の産物、すなわち脂肪酸アルキルエステルを得るために、疎水性担体（樹脂）上に固定化された１つまたは複数のリパーゼをアルカリ性もしくは弱アルカリ性の水溶液の存在下で用いることによる、脂肪酸源とアルコールとの同時または順次のエステル交換／エステル化反応を行うプロセスが提供される。弱アルカリ性溶液、例えば、０．００１Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍの重炭酸ナトリウムは、反応で用いられる油の量の約４重量％または約５重量％または５重量％超、例えば、６重量％、８重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量、２５重量％、３０重量％、４０重量％または５０重量％の量で反応系中に存在してもよい。

以下の実施例で示すように、リパーゼの固定化のための疎水性樹脂担体を、エステル交換／エステル化の反応媒体中本明細書に列挙および例証する濃度の種々のレベルおよび範囲および部分範囲でアルカリ性または弱アルカリ性の緩衝液の使用と組み合わせて用いることで、リパーゼの作用寿命をのばすこともできる。以下の実施例でさらに示すように、ｐＨ値に関係なく、反応混合物の含水量は増加させてもよい。このように別の実施形態では、例えば、本明細書に列挙および例証する濃度の種々のレベルおよび範囲および部分範囲で水を添加することによって反応系の含水量を増加させることで、生体触媒の安定性が増加する。アルカリ性溶液（図２、３、１４、１５、１７）を、または水（図４、５、１６）を添加することで、多数の反応サイクルにわたり酵素の活性および安定性が維持される結果となることをこの結果が示している。

本発明のプロセスで使用されるアルコールまたはアルコール供与体は、短鎖アルキルアルコール、具体的にはＣ_１−Ｃ_６アルキルアルコール、より具体的にはＣ_１−Ｃ_４アルキルアルコールであってもよく、特にメタノールもしくはエタノールもしくはアルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジメチルなどの炭酸ジアルキルであってもよい。例えば、炭酸ジアルキルなどのアルコール供与体は、反応系のアルカリ度または弱アルカリ度の源として役立つことも可能である。

本発明の別の態様によると、脂肪酸アルキルエステルの生成のためのシステムが提供される。図２２を参照して、概して参照番号１００と称される、かかるシステムの第１の実施形態は、反応容器１２０、予備反応調整容器１４０、および生成物分離容器１６０を含む。

予備反応調整容器１４０は、供給原料と緩衝液（および／または水）を受け取り、それらから適切なエマルジョンを形成し、次いで調製したエマルジョンＰＥ（本明細書では乳化原料ともよぶ）を反応容器１２０に送るように構成される。特に、かかる供給原料は、脂肪酸源１８２からの脂肪酸ＦＡ（例えば廃食油）と、アルコール源１８４からのアルコールＡＬ（例えばメタノール）と、緩衝液／水源１８６からの緩衝液（および／または水）ＢＵとを含んでもよく、予備反応調整容器１４０と、それぞれ容器注入口１７２、１７４、１７６および適切な弁（図示せず）を介して流体連通しているそれぞれ適切な供給ライン１５２、１５４、１５６を介して供給される。

予備反応調整容器１４０は、内容積Ｖ１を規定し、容器注入口１７２、１７４、１７６を介してそこに供給される供給原料および緩衝液／水を含む反応混合物が、電動源（図示せず）によって駆動される適切な撹拌装置１４２を用いて一緒に混合され、エマルジョンＰＥが形成される。予備反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ１を所望の定常温度に維持することが可能となる。例えば、作動流体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１４９にポンプで通し、ポート（図示せず）から出る。この実施形態の代替変形では、予備反応調整容器１４０は、外部ジャケット１４９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメントの系、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含んでもよい。

反応容器１２０は、予備反応調整容器１４０から調製されたエマルジョンＰＥを受け取り、その中の供給原料を適切な生体触媒ＢＣの存在下で反応させて、反応産物ＲＰを生成し、次いで反応産物ＲＰを反応混合物から生成物分離容器１６０に送るように構成される。送出ライン１４８は、予備反応調整容器１４０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつ予備反応調整容器１４０で調製された調製エマルジョンＰＥが所望通り反応容器１２０に送られるのを可能にする。

反応容器１２０は、内容積Ｖ２を規定し、その中に反応容器注入口１２２を介して供給された反応混合物中の調製されたエマルジョンを反応させ、次いで反応混合物を適切な電動源（図示せず）によって駆動される撹拌装置１２４で撹拌して、反応産物ＲＰを形成する。生体触媒ＢＣは適切な酵素を含んでもよく、かつ固定化酵素ビーズの形状で提供される。該ビーズは無効になるまで、または十分な効果がなくなり、除去されて新しい生体触媒ＢＣと交換されることになるまで反応容器１２０に残存する。例えば、生体触媒ＢＣは、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスに由来するリパーゼを含んでもよい。

反応容器１２０は、外部ジャケット１２９の形状で温度調節装置を含み、それを通って適切な作動流体が循環して、内容積Ｖ２を所望の定常温度で維持することが可能になる。例えば、作動液体は、油もしくは水であってもよく、別の容器（図示せず）で加熱または冷却されて、適切な注入口を介して外部ジャケット１２９にポンプで通し、ポート１２３から出る。この実施形態の代替変形では、温度調節装置は、外部ジャケット１２９の代わりにまたはそれに追加して、加熱エレメントおよび／または冷却エレメント、例えば電動加熱エレメントおよび／または冷却エレメントを含む。

反応容器１２０の下方部分は送出口１２７を含み、および反応容器１２０から除去される前に、反応混合物、特に反応産物ＲＰを濾過し、次いで生体触媒ＢＣを反応産物ＲＰとともに除去されることから防ぐように構成された適切な保持装置が、フィルタ１２５の形状で送出口１２７の上流に具備される。

生成物分離容器１６０は、反応産物ＲＰから所望の生成物Ｐ（脂肪酸アルキルエステル）を取り出し、過剰な水およびグリセロールＧを含む副産物を分離するように構成される。送出ライン１４７は、生成物分離容器１６０と、反応容器１２０との間に適切な弁（図示せず）を介して選択的流体連通をもたらし、かつ反応産物ＲＰが所望通り反応容器１２０から生成物分離容器１６０に送られるのを可能にする。この実施形態では、生成物分離容器１６０は、前述の分離を行うための遠心分離機または重力分離装置を含み、かつ生成物Ｐをアウトプットするための第１の送出口１６２と、過剰な水およびグリセロールＧを収集するための第２の送出口１６４とを含む。生成物Ｐはタップ１６３を介して収集されてもよい。

このように、本システムは、連続生成方式で操作されることが可能であり、該方式では調製されたエマルジョンＰＥは、反応容器１２０に送られ、次いで所望の生成物Ｐはタップ１６３を介して連続方式で収集される。エマルジョンＰＥは調製されて、連続方式で反応容器１２０に送られ、反応産物ＲＰが送出口１２７から取り出されるのと同じ速度でその中の反応物の量を補給することができる。あるいは、エマルジョンＰＥは調製されて、反応容器１２０にバッチで送られ、送出口１２７を介して反応産物ＲＰが連続的に取り出された後に、反応容器１２０内の反応物のレベルが特定の最低レベルまで低下したときはいつでも不連続の間隔で反応混合物中の反応物の量を補給することができるもちろん、システム１００が連続的よりはむしろバッチで所望の生成物Ｐをもたらすように操作することも可能である。

あるいは、システム１００は、歩留り改善方式で操作されることも可能であり、生成物Ｐは、タップ１６３を介して即時収集される代わりに、ライン１６５、容器注入口１２１および弁１６６を含む、随意に別ルートに切り替えるシステムを介して反応容器１２０に別のルートで送られ、弁１６６が選択的に操作されて、タップ１６３から生成物Ｐの方向を転換させることも可能である。別のルートから反応容器１２０に送られる場合、歩留りの高い生成物Ｐを生成するために、生成物Ｐは、アルコール源１８４から、別のアルコール源（図示せず）から、または予備反応調整容器１４０を介してアルコ−ル源１８４から別のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬと反応容器内でさらに反応させてもよい。生成物Ｐは、生成物分離容器１６０を用いて、副産物から再度分離されることも可能である。アルコールが反応調整容器１４０を介して供給される場合、反応調整容器は、まず調製されたエマルジョンＰＥが空の状態であり、次いで適切な弁で脂肪酸Ｆを止めて、随意に緩衝液／水がそれぞれの源１８２および１８６から供給される。適切なポンプまたは重力送り装置および制御可能な弁は、それぞれのライン１５２、１５４、１５６、１４８、１４７、１６５を介してそれぞれの原料を選択的に運ぶために具備されることも可能であり、および適切な制御装置（図示せず）が該システムの操作をモニターして制御する。

第１の実施形態の少なくとも一部の代替変形では、予備反応調整容器１４０は、反応容器１２０との一体型であってもよい。例えば、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、ライン１４８に対応する開口装置を有する壁によって分離されてもよい。あるいは、それぞれの内容積Ｖ１およびＶ２は、隣接していてもよいが、内容積Ｖ１は、生体触媒ＢＣから十分に間隔を空けることで、生体触媒ＢＣに達する前にエマルジョンＰＥが形成されるのに十分な時間をもたらすことが可能である。

第１の実施形態の代替変形では、脂肪酸ＦＡ、アルコールＡＬ、および緩衝液／水ＢＵのうちの１、２またはすべては、予備反応調整容器１４０を迂回して、反応容器１２０に直接供給されてもよい。例えば、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、および緩衝液／水源１８６のうちの１または複数は、予備反応調整容器１４０を迂回して、適切な供給ライン（図示せず）を介して反応容器１２０と直接、選択的流体連結されてもよい。

第１の実施形態、またはその代替変形によって、システム１００のすべての構成部品は、温度、圧力、ｐＨなどを含むそれぞれの条件で各構成部品がそれぞれの機能を果たすことを可能にするためなど、当技術分野で知られている適切な形状であり、かつ適切な原料から作られていると理解される。

図２３を参照して、参照番号２００と称される該システムの第２の実施形態は、図２２で同様の番号が付いたすべての部品を含み、必要な変更を加えて一部の相違とともに、その代替変形を含む第１の実施形態のエレメントおよび特徴のすべてを含む。例えば、システム２００も以下を含む：第１の実施形態で開示され、必要な変更を加えた、反応容器１２０、予備反応調整容器１４０、生成物分離容器１６０、脂肪酸源１８２、アルコール源１８４、緩衝液／水源１８６、供給ライン１５２、１５４、１５６、容器注入口１７２、１７４、１７６、撹拌装置１４２、外部ジャケット１４９、送出ライン１４８、容器注入口１２２、撹拌装置１２４、生体触媒ＢＣ外部ジャケット１２９、注入および排出ポート１２３、送出口１２７、フィルタ１２５、送出ライン１４７、第１の送出口１６２、第２の送出口１６４。

しかしながら、第２の実施形態では、第１の実施形態のライン１６５、タップ１６３および弁１６６は除外されており、代わりに補助反応モジュール３００が、生成物分離容器１６０の第１の送出口１６２に作動可能なように接続されている。

補助反応モジュール３００は、補助反応容器２２０および補助生成物分離容器２６０を含み、この実施形態では、必要な変更を加えた反応容器１２０および生成物分離容器１６０にそれぞれ実質的に類似している。作動中、生成物分離容器１６０からの所望の生成物Ｐは、ライン２６６、弁２６７および容器注入口２２１を介して補助反応容器２２０に送られる。補助反応容器２２０に送られると、生成物Ｐはその中で、アルコール源１８４からまたは別のアルコール源（図示せず）からの別個のライン（図示せず）を介して供給されるアルコールＡＬとさらに反応して、さらに反応した生成物ＦＲＰを生成する。ライン２４９は、さらに反応した生成物ＦＲＰが補助生成物分離容器２６０に送られるのを可能し、次いで補助生成物分離容器は、より歩留りの高い生成物Ｐ’を副産物から分離するように作動する。

システム２００は、必要な変更を加えて、システム１００と同様のプロセスで操作されうる。

開示されかつ記述されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、プロセスのステップ、および原料に限定されるものではなく、かかるプロセスのステップおよび原料は、いくらか変わりうると理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されることから、本明細書で用いた専門用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられ、かつ限定することを意図しないことも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用した単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意すべきである。

文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および以下に続く特許請求の範囲全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、記述した整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されよう。

以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって用いられた技法の代表例である。これらの技法が本発明の実行のための好適な実施形態の好例であり、本開示を踏まえて、当業者は多数の修正が本発明の意図する範囲から逸脱することなく行われうることを認識するであろう。
（実施例）
（概要）

すべての実験を、ガラスフィルタが中心に位置する底部を有する３０ｍＬの容量のガラス管または１５０〜２５０μｍの多孔性の焼結ガラスフィルタの底部を有する５００ｍＬの容量の機械撹拌反応器のいずれかで実行した。典型的な反応媒体は、脂肪酸源、アルコール、通常は、遊離またはグリセロール骨格上に結合しているかにかかわらず脂肪酸に関して１：１のモルベース（遊離脂肪酸およびモノグリセリドの場合は１：１、ジグリセリドの場合は１：２、およびトリグイセリドの場合は１：３とアルコールが多め）でのメタノールまたはエタノールを含んでいた。脂肪酸源を異なる量のアルカリ性緩衝液（特定の実施形態では重炭酸ナトリウム）と予備混合した。疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼを添加する（１０〜１５重量％）ことで反応を開始し、反応媒体を３０℃で機械的に振盪させるかまたは撹拌させた。別段示さない限り、アルコール量は、各１時間空けて３段階で同量を添加した。反応変換の後に、異なる時間間隔で反応媒体から試料を採取して、脂肪酸成分を分析した。バイオディーゼルへの変換を、以下のように算出した：１００＊脂肪酸アルキルエステルのピーク面積／すべてのピーク面積の合計

リパーゼ固定化：特定の微生物に由来するリパーゼを特定のｐＨ値（例えば７．５）の０．１Ｍの緩衝液に可溶化する標準手順に従ってリパーゼを固定化した。有機または無機高分子樹脂を該リパーゼ溶液に導入した。混合物を室温で８時間振盪した。樹脂上でのタンパク質酵素沈殿を増加させるために、冷アセトンを随意に混合物に添加した。該混合物を濾過して、酵素ビーズを乾燥させて含水量を５％未満まで減少させた。

疎水性高分子樹脂をベースにしたポリスチレン・ジビニルベンゼン、パラフィンまたはそれらの任意の組み合わせを含む種々の樹脂を用いて、樹脂の疎水性特徴を得た。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ，ＵＳＡ）およびＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）を含む典型的な疎水性樹脂を用いた。Ｄｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８（Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓ）および多孔質シリカゲルを含む典型的な親水性樹脂を用いた。リパーゼは樹脂上に別々に固定化してもよく、または異なるリパーゼを同一の樹脂上に共固定化する。
（実施例１）

疎水性樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に、および親水性樹脂としてＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８上に固定化したサーモマイセスラヌギノサスに由来するリパーゼ、ならびに疎水性樹脂としてＳｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に、および親水性樹脂として多孔質シリカ上に固定化したシュードモナスエスピーに由来するリパーゼのエステル交換活性。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含む精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。１０重量％リパーゼ調製物を含む反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１に示す。

図１に示した結果は、異なる樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピー由来の両リパーゼが、１重量％の重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの酵素を用いた最初の５サイクルの間、高いエステル交換活性を示したことを表している。５回目のバッチの後、同じバッチの酵素を用いると、親水性樹脂、すなわちＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８および多孔質シリカ上に固定化された両リパーゼのビーズの周りにゲル様沈着物が形成されたために、システムからの反応媒体の濾過は困難になったことが観察された。親水性樹脂上に固定化された両リパーゼのエステル交換活性は、さらなる連続的なバッチで急激に減少し、次いで両リパーゼは、１０回目のサイクルの後、不活性になった。対照的に、疎水性樹脂、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ７０上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼは７０サイクル後もその初期活性の８０％以上を保持したが、一方疎水性樹脂Ａｍｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼは、７０を超えるサイクル後、その初期活性の２０％以上を保持した。
（実施例２）

Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図２に示す。

Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオ燃料およびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図３に示す。

図２および３は、反応媒体中の炭酸ナトリウムの量が疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピー由来のリパーゼの作用寿命に主要な役割を有することを示している。アルカリ性溶液の非存在下で両固定化リパーゼは、数サイクル後にそれらの活性を急激に消失するが、一方、同固定化リパーゼは、反応系におけるベースとして重炭酸ナトリウム溶液の存在下で複数回使用にわたりそれらのエステル交換活性を維持することが図２および３から理解される。両固定化酵素の結果は、０〜４重量％の範囲で反応媒体中の重炭酸ナトリウム溶液の量が増加すると、同じバッチの固定化酵素の複数回使用での酵素活性の消失が減少する結果になることを示している。
（実施例３）

Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図４に示す。

Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図５に示す。

図４および５は、複数の実験において疎水性樹脂上に固定化された同じバッチのリパーゼ（サーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピー由来）を用いるエステル交換活性も、反応系での水の量によって影響されることを示す。連続サイクルで用いる場合、何もない（ゼロ）から４重量％まで水の量を増加させると、生体触媒の残留するエステル交換活性をより高く維持するという結果になったことがわかる。図２〜５に示した結果は、連続サイクルで用いる場合、エステル交換反応物中の重炭酸ナトリウム溶液などの弱塩基は、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼの活性を維持するために有利に働くことを明らかに示している。
（実施例４）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間のエステル化／エステル交換を行った後の、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）と大豆油との混合物のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を異なる量で含有する、遊離脂肪酸大豆の加水分解物（５０重量％）と、初期のＦＦＡ値７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの大豆油（５０重量％）との混合物。メタノール（４．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（２０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図６に示す。

図６は、異なる量の塩基性溶液が、大豆油加水分解物と大豆油トリグリセリドとを等量比率で含む反応混合物中に存在するＦＦＡの同時エステル化反応に主要な影響を及ぼすことを示す。エステル化／エステル交換反応系にアルカリ性溶液が何も添加されないと、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼはそのエステル化活性を消失するが、一方、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％および２重量％、該反応系に別々に添加すると、同じ生体触媒は連続サイクルにおいてその活性を維持したことがわかる。図６に示した結果は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液の１重量％および２重量％の存在下で、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いると、ＦＦＡ含有量が、７２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの初期値からそれぞれ平均８ｍｇ ＫＯＨ／１ｇおよび６ｍｇ ＫＯＨ／１ｇまで減少し、かつ２２回の連続サイクルでこの活性を維持したことを示している。
（実施例５）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて４時間の反応を行った後の、大豆油加水分解物のバイオディーゼルおよび水への変換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１重量％含有する、ＦＦＡ値１５０ｍｇ ＫＯＨ／１ｇの遊離脂肪酸大豆の加水分解物（２０ｇ）。メタノール（２ｍＬ）を１バッチで反応物に添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図７に示す。

図７は、疎水性樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼが遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸メチルエステルと水の副産物とを形成することもできることを示している。リパーゼ調製物は、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する媒体中で、同じバッチの生体触媒を用いて２５を超えるサイクルにわたりいずれの著しい活性消失も観察されることなく、そのエステル化／エステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例６）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、魚油のエタノールとのエステル交換。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を１％含有する精製魚油（２０ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々に用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図８に示す。

図８は、疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイミセスラヌギノサスおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、魚油トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。両生体触媒調製物は、１％重炭酸ナトリウム溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を用いて２０を超えるサイクルにわたり著しい活性消失もなく、それらのエステル交換活性を維持したことを結果が示している。
（実施例７）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間の反応を行った後の、獣脂のエタノールとのエステル交換。
反応条件：獣脂（４ｇ）の脂肪酸エチルエステルおよび１Ｍの炭酸カリウム溶液を１％含有する獣脂（１６ｇ）。エタノール（２．５ｍＬ）を等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ１６００上に固定化したサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピーに由来するリパーゼを別々にまたは等量比の組み合わせで用いた（１０重量％）。反応媒体を３７℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図９に示す。

図９は、疎水性樹脂上に別々にまたは組み合わせて固定化されたサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナススピー由来の両リパーゼが、獣脂トリグリセリドのエタノールとのエステル交換を触媒して、脂肪酸エチルエステルとグリセロール副産物とを形成することもできることを示している。反応媒体の供給原料は、該反応媒体の融点を下げるために、獣脂（８０％）と、獣脂に由来する脂肪酸エチルエステルとを含んでいた。図９に示した結果は、１Ｍの炭酸カリウムなどの弱アルカリ性溶液の存在下で、同じバッチの生体触媒を１００連続サイクルで用いたとき、すべての生体触媒がそれらの初期活性の８０％以上を保持したことを示している。
（実施例８）

疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたシュードモナススピー由来のリパーゼおよびサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いて４時間後に得た、７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有するエステル交換／エステル化反応媒体の、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（１０重量％）を用いる、疎水性多孔質の樹脂上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼおよびメタノール（ＦＦＡとメタノールとのモルベースで、それぞれ１：１０の比）での処理。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１０に示す。

図１０は、上述したサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼまたはシュードモナススピー由来のリパーゼのいずれかでの処理の後に得たエステル交換反応媒体が、典型的には３〜７ｍｇ ＫＯＨ／１ｇのＦＦＡ値を含有し、親水性または疎水性のいずれかの担体上に固定化されたカンジダアンタークティカＢ由来のリパーゼで処理されることができ、その結果ＦＦＡ値が２ｍｇ ＫＯＨ／１ｇ未満まで低下することを示している。固定化されたリパーゼは、１００サイクルを超えてその活性を維持することができる。
（実施例９）

疎水性樹脂としてのＤＶＢ−ＰＳ、および親水性イオン交換樹脂としてのＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｄ５６８、および親水性酵素吸着剤としての顆粒状多孔質シリカ上に固定化されたアルカリジェネスエスピー（ＡＬ）、シュードモナススピー（ＰＳ）およびサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ）由来のリパーゼのエステル交換／エステル化活性。
反応条件：２重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を、特に明記しない限り１ステップで、等量の３バッチで、各々１時間間隔で段階的に添加した。１０重量％のリパーゼ調製物を含有する反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１０〜１３に示す。

図１０〜１３に示す結果は、アルカリジェネスエスピー、シュードモナススピーおよびサーモマイセスラヌギノサスリパーゼを親水性樹脂上に固定化すると、最初の数サイクル中に高い変換が得られたが、同じバッチの生体触媒を使用した１０サイクル後には酵素活性が激減して低い変換に達したことを示している。同じバッチの酵素を使用すると、第５バッチ後、親水性樹脂、すなわち、弱イオン交換樹脂および多孔質シリカ上に固定化された両リパーゼのビーズの周りにゲル様沈着物が形成されたために、系からの反応媒体の濾過は困難になったことも観察された。

対照的に、ＤＶＢ−ＰＳ疎水性樹脂上に固定化されたアルカリジェネスエスピー、シュードモナススピーおよびサーモマイセスラヌギノサスリパーゼはすべて、５０サイクル後にその初期活性の８０％超を保持していた。図１０〜１３は、すべてのリパーゼが第１バッチで高い活性を示し、恐らくは樹脂上の任意の緩く結合した酵素が洗い流されるために、第２バッチ後にわずかに低下したことを示している。
（実施例１０）

Ａ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１４に示す。

Ｂ．複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたシュードモナスエスピー由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１５に示す。

図１４および１５は、反応媒体中の重炭酸ナトリウムの量が、疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスおよびシュードモナスエスピーリパーゼの作用寿命に主要な役割を果たすことを示している。弱アルカリ性溶液の非存在下では、両固定化リパーゼは数サイクル後にその活性を急激に喪失した一方で、同固定化リパーゼは反応系中の塩基としての重炭酸ナトリウムの存在下で複数使用にわたってそのエステル交換活性を維持したことが図４および５から分かる。両固定化酵素についての結果は、０〜３０重量％の範囲で反応媒体中の重炭酸ナトリウム溶液の量を増加させると、同じバッチの固定化酵素の複数使用において酵素のエステル交換活性が増加することを示している。重炭酸ナトリウム溶液の量を３０重量％超まで増加させると、酵素活性が低下した。理論に拘束されるものではないが、この低下は恐らく樹脂から酵素が洗い流されることが原因であるだろう。
（実施例１１）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後の大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：蒸留水を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１６に示す。

図１６は、反応媒体中の水の量もまた、疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスリパーゼの作用寿命に主要な役割を果たすことを示している。水の非存在下では、固定化リパーゼは数サイクル後にその活性を急激に喪失する一方で、同固定化リパーゼは反応系中水の存在下では複数使用にわたってそのエステル交換活性を維持することが図１６から分かる。固定化酵素についての結果は、０〜３０重量％の範囲で反応媒体中の水の量を増加させると、同じバッチの固定化酵素の複数使用において酵素のエステル交換活性が増加する一方で、水の量を３０重量％超まで増加させると、酵素活性が低下したことを示している。
（実施例１２）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後のオレイン酸のバイオディーゼルおよび水への変換。
反応条件：０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を異なる濃度で含有するオレイン酸（２０ｇ）。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１７に示す。

図１７は、反応媒体中の重炭酸ナトリウム溶液の濃度が、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスのエステル化活性の決定に主要な役割を果たすことを示している。反応系中水の非存在下では、疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼは、複数バッチの実験に使用すると、その活性を急激に喪失したことが図１７から分かる。０〜２０重量％の範囲で重炭酸ナトリウム溶液の濃度を増加させると、複数使用において生体触媒のエステル化活性が増加した。水相の量を３０重量％超まで増加させると、恐らく樹脂から酵素が洗い流されるために、複数使用において酵素活性が喪失した。
（実施例１３）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後のオレイン酸および大豆油トリグリセリドの混合物のバイオディーゼル、グリセロールおよび水への変換。
反応条件：オレイン酸を異なる濃度で含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）に８重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を補充した。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１８に示す。

図１８は、緩衝液の存在下で、疎水性で多孔質のリパーゼ樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスリパーゼが遊離脂肪酸およびグリセリドをエステル化およびエステル交換してバイオディーゼルと副産物のグリセロールおよび水を形成することができることを示している。この結果はまた、固定化リパーゼが５０サイクルにわたる同じバッチの生体触媒の複数使用において有意に活性を喪失することなくその触媒活性を維持することも示している。
（実施例１４）

複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒を用いて６時間反応を行った後のリン脂質を含有する粗製油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：リン脂質を異なる濃度で含有する粗製大豆油（２０ｇ）に８重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を補充した。メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図１９に示す。

図１９は、疎水性で多孔質のジビニルベンゼン・ポリスチレン樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスリパーゼのエステル交換活性を示している。分析結果は、以前の文献報告と対照的に、重炭酸ナトリウム溶液の存在下で疎水性樹脂上に固定化されたリパーゼがリン脂質を含むグリセリドをエステル交換してバイオディーゼルと、副産物のグリセロールおよびグリセロリン脂質をもたらすことができることを示している。また、この結果は、同じバッチの固定化酵素を複数使用で使用すると、リパーゼがそのエステル交換触媒活性を維持することを示している。
（実施例１５）

Ａ．０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液についての異なるｐＨ値での、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いた大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：異なるｐＨ値で８重量％の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液を含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。 メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図２０に示す。

Ｂ．０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液についての異なるｐＨ値での、複数バッチでの実験において、同じバッチの生体触媒（ＤＶＢ−ＰＳ担体上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス（ＴＬ））を用いた大豆油のバイオディーゼルおよびグリセロールへの変換。
反応条件：異なるｐＨ値で８重量％の０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を含有する精製、漂白した大豆油（２０ｇ）。 メタノール（２．５ｍＬ）を１ステップで添加した。疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサス由来のリパーゼを用いた（１０重量％）。反応媒体を３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。結果を図２１に示す。

図２０に示す結果は、５．５より上のｐＨ値において、生体触媒が同じバッチの酵素を使用した５０サイクル後にその初期エステル交換活性の６０％超を保持したことを示している。結果は、５．５のｐＨ値で酵素活性が線形低下し、酵素活性が初期酵素活性の２０％未満に達したことを明確に示している。

６．５より上のｐＨ値で酢酸緩衝液を使用した場合にも同様の傾向が観察され、ここでは酵素は５０回の反復使用後にその初期活性の５０％超を保持した（図２１）。図２１に示す結果はまた、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム溶液を使用すると、酵素活性は低かったが５０サイクルの反復使用後に一定に維持されたことを示している。
（実施例１６）

バイオディーゼル、水およびグリセロールを形成するために、図２２に図示したシステムの第１の実施形態を用いることによる、１０％ＦＦＡを含有する廃食油のメタノールでのエステル交換／エステル化。
反応条件：０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を２％含有する廃食油（１１００ｇ）およびメタノール（１４０ｇ）をまず、予備反応調整容器１４０で予備混合して、エマルジョンを形成し、次いでこれを約２リットルの内容積Ｖ２を有する反応容器１２０に導入した。反応容器１２０中で反応混合物を、疎水性で多孔質のポリスチレン・ジビニルベンゼンをベースにした樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスに由来するリパーゼ（油の３０重量％）と３０℃で６時間混合した。フィルタ１２５を介して反応混合物を濾過して、生成物分離容器１６０に送った。生成物分離容器１６０中の反応混合物からグリセロールおよび過剰な水を除去した。脂肪酸メチルエステルを含有する上相および非反応グリセリドを、別ルートライン１６５を介して反応容器１２０に再導入し、次いでメタノール（１１０ｇ）を反応容器１２０中の反応媒体に添加してから、反応容器１２０での撹拌を再び始めた。２時間後のメチルエステルへの変換は、９８％であった。廃食油（８３重量％）、メタノール（１５％）および０．１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（２％）を含有する乳化反応媒体（調製したエマルジョン）をおよそ３０ｍＬ／分の流量で反応容器１２０に連続的に送った。マクロ多孔質の疎水性樹脂上に固定化されたサーモマイセスラヌギノサスリパーゼに由来する同じバッチの生体触媒を用いると、脂肪酸メチルエステルへの変換は、著しい活性消失もなく、３カ月以上維持された。

Claims (24)

1. 下記から選択されるプロセス：
   （Ａ）脂肪酸源をアルコールでエステル交換／エステル化して脂肪酸アルキルエステルを形成するプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で、脂肪酸源とアルコールまたはアルコール供与体とを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性の多孔質担体上に固定化された少なくとも１つのリパーゼを含み、反応媒体が水性アルカリ性緩衝液を脂肪酸源の５重量％超および最高３０重量％の量で含む、プロセス、及び
   （Ｂ）脂肪酸源をアルコールでエステル交換／エステル化して脂肪酸アルキルエステルを形成するプロセスであって、固定化リパーゼ調製物の存在下で、脂肪酸源とアルコールとを反応させることを含み、前記固定化リパーゼ調製物が疎水性多孔質の担体上に固定化されたリパーゼを含み、および該脂肪酸源又は反応媒体に水が脂肪酸源の５重量％超および最高３０重量％の量で加えられている、プロセス。
2. プロセス（Ａ）であり、前記水性アルカリ性緩衝液が７から１１までのｐＨ値を有する、請求項１に記載のプロセス。
3. プロセス（Ａ）であり、前記水性アルカリ性緩衝液が脂肪酸源の５％、６％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％超および最高３０重量％までの量で含まれる、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
4. プロセス（Ｂ）であり、前記水が３〜１１のｐＨ値の溶解塩の水溶液の形態である、請求項１に記載のプロセス。
5. プロセス（Ｂ）であり、前記水または溶解塩の水溶液が脂肪酸源の５％、６％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％超および最高３０重量％までの量で加えられている、請求項１または４に記載のプロセス。
6. 前記アルコールが短鎖アルコールであり、または前記アルコール供与体は、モノアルキルエステル、または炭酸ジアルキルであって、反応媒体中のアルカリ性試薬の源としても役立つ、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
7. 前記短鎖アルコールがＣ _１ −Ｃ _６ アルキルアルコールである、請求項６に記載のプロセス。
8. 前記短鎖アルコールがＣ _１ −Ｃ _４ アルキルアルコールである、請求項６または７に記載のプロセス。
9. 前記アルコールがメタノールもしくはエタノールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
10. 前記モノアルキルエステルが酢酸エチルであり、前記炭酸ジアルキルが炭酸ジメチルである、請求項６に記載のプロセス。
11. 前記少なくとも１つのリパーゼが、リゾームコールミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、ムコールジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウムカメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）、アルカリジェネスエスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アクロモバクターエスピー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ブルクホルデリアエスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、サーモマイセスラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、カンジダアンタークティカＢ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダアンタークティカＡ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ）、パパイヤ種子およびパンクレアチンのいずれか１つに由来するリパーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
12. 前記少なくとも１つの固定化リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、また、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を触媒して、脂肪酸アルキルエステルと副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
13. 前記リパーゼ調製物が、疎水性担体上に各々別々に固定化されうる、または同じ疎水性担体上に共固定化されうる少なくとも２つのリパーゼを含み、前記少なくとも２つのリパーゼが同一のまたは異なる位置特異性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
14. 前記リパーゼが、遊離脂肪酸のエステル化を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物として水とをもたらすことができ、また、トリグリセリドおよび部分グリセリドのエステル交換を同時にもしくは連続的に触媒して、脂肪酸アルキルエステルと、副産物としてグリセロールとをもたらすことができる、請求項１３に記載のプロセス。
15. 前記担体が、疎水性脂肪族高分子をベースとした担体および疎水性芳香族高分子をベースとした担体のいずれか１つである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
16. 前記疎水性高分子担体が線状または分岐状の有機鎖から構成される、請求項１５に記載のプロセス。
17. 前記担体がマクロ網状有機高分子またはコポリマー鎖を含む、請求項１５または１６に記載のプロセス。
18. 前記担体が、疎水性でありうるまたは疎水性の有機材料で被覆されている、多孔質もしくは非多孔質の無機担体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
19. 前記有機材料が線状、分岐状、または官能基を有する疎水性有機鎖である、請求項１８に記載のプロセス。
20. 前記水性アルカリ性緩衝液が無機アルカリ塩または有機塩基の溶液である、請求項１〜３および６〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
21. 前記アルカリ性緩衝液が、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、脂肪酸カルボン酸塩およびクエン酸塩、第一級、第二級および第三級のアミン、ならびにそれらの混合物のいずれかの溶液である、請求項２０に記載のプロセス。
22. 前記脂肪酸源が、植物油、動物性脂肪、藻油、魚油、廃油およびそれらの任意の混合物のいずれか１つである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
23. 前記アルコールがメタノールであり、結果としてもたらされる前記脂肪酸エステルが脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ−Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
24. 前記アルコールが中鎖脂肪アルコール（Ｃ_６−Ｃ_１０）または長鎖脂肪アルコール（Ｃ_１２−Ｃ_２２）である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。