KR101717828B1 - 수용액 존재 하에 소수성 수지 상에 고정된 리파아제를 사용하는 효소 에스테르교환 방법 - Google Patents

수용액 존재 하에 소수성 수지 상에 고정된 리파아제를 사용하는 효소 에스테르교환 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 생물연료, 식품, 및 세정제 산업에서 사용하기 위한 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 효소 배치식 또는 연속 방법과, 그 시스템에 관한 것이다. 상기 방법은, 알칼리성 또는 약알칼리성 수성 완충액의 존재 하에, 또는 물 또는 수용액의 존재 하에, 지방산 공급원과 알코올 또는 알코올 공여자와 혼합된 소수성 수지 상에 고정된 효소를 이용한다. 지방산 알킬 에스테르를 위한 제조 방법은 에스테르교환 또는 에스테르화에 의해 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 생물촉매 활성은 다중 사용에서 큰 활성 손실 없이 유지되고, 또한 생물촉매 상에서 글리세롤과 물 부생성물 또는 기타 친수성 화합물의 축적을 방지한다.

Description

수용액 존재 하에 소수성 수지 상에 고정된 리파아제를 사용하는 효소 에스테르교환 방법{ENZYMATIC TRANSESTERIFICATION WITH LIPASES IMMOBILIZED ON HYDROPHOBIC RESINS IN WATER SOLUTIONS}
본 발명의 기술 분야
생물연료, 식품과 세정제 산업에서 사용하기 위한 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 효소적 방법이 개시된다. 이러한 방법에서 지방산 공급원과 알코올 또는 알코올 공여자는 알칼리성 수성 완충액 또는 물의 존재 하에, 소수성 수지 상에 고정된 효소의 존재 하에 반응된다. 개시된 방법은 연속 교반-탱크(continuous stirred-tank) 또는 충전층 컬럼 반응기(packed-bed column reactor)를 이용하여 배치(batch) 또는 연속적으로 가동될 수 있다.
본 발명의 배경 기술
효소의 고정화(immobilization)는 기본적으로, 전체 효소적 방법에서 효소의 원가 부담(cost contribution)을 감소시키고; 생성물로부터 효소의 회수를 용이하게 하고; 그리고 이러한 방법의 연속 가동(continuous operation)을 가능하게 하는 것을 목적으로 하는 매우 다양한 기술에 의해 설명되었다.
고정화 기술은 일반적으로, 하기와 같이 분류된다:
1. 고형 지지체, 예를 들어, 실리카와 불용성 중합체에 효소의 물리적 흡수.
2. 이온-교환 수지 상에 흡착.
3. 고형 지지체 물질, 예를 들어, 에폭시화(epoxidation)된 무기 또는 중합성 지지체에 효소의 공유 결합.
4. 성장하는 중합체 내에 효소의 포획.
5. 막 반응기 또는 반-침투성 겔 내에 효소의 가둠.
6. 가교-연결 효소 결정(CLECS) 또는 집합체(CLEAS).
앞서 언급된 모든 효소 고정화 절차는 하기 단계로 구성된다:
1. pH, 온도, 완충액 염의 유형 및 이온 강도에 대하여 적절한 완충액 시스템에서 효소를 용해시키는 단계.
2. 고형 지지체를 효소 용액 내로 첨가하고, 그리고 효소 분자가 고형 지지체 상에 고정될 때까지 일정 시간 동안 혼합하는 단계.
3. 고정된 효소를 함유하는 고형 지지체를 여과하는 단계.
4. 느슨하게 결합된 효소 분자를 제거하기 위하여 적절한 완충액으로 지지체를 세척하고, 이후 고형 지지체를 건조시키는 단계.
계면 효소(interfacial enzyme), 주로 리파아제(lipase)는 전술한 기술에 따라서 고정된다. 이들은 낮은 합성 활성 및/또는 짧은 작용 반감기 시간을 갖는 고정된 효소 제조물을 제공하였다. 고정된 리파아제 및 기타 계면 효소의 합성 활성과 안정성을 증가시키는 시도에서, 상이한 활성화 방법이 적용되었다. 이들 방법에는 하기가 포함된다:
1. 소수성 잔기, 예를 들어, 지방산 또는 폴리에틸렌 글리콜로 효소의 표면 작용기(surface functional group)에 결합.
2. 계면활성제, 예를 들어, 폴리올 지방산 에스테르로 효소의 표면을 코팅.
3. 친수성 용매, 예를 들어, 에탄올 또는 이소-프로판올로 전처리된 소수성 지지체, 전형적으로 폴리프로필렌으로 효소와 접촉.
앞서 언급된 방법 중에서 어느 것도 산업적 양으로 효소적 역전환(enzymatic reverse conversion)을 달성하기 위한 고정된 계면 효소의 안정화와 비용-효과(cost-effectiveness)에 대하여 만족스러운 결과를 산출하지 못하였다. 또한, 대부분의 효소는 전술한 절차에 따라 고정될 때, 그들의 합성 활성 중에서 상당 부분을 상실하거나, 또는 고정화 절차에 의해 강제되는 일정한 제약으로 인하여, 또는 반응 매체 내에 일정한 효소 저해물질의 존재 때문에 그들의 완전한 활성 능력(activity performance)을 발휘하지 못하는 것으로 보고되었다.
리파아제와 포스포리파아제의 다른 주요한 단점은 친수성 기질, 특히 짧은-사슬 알코올과 짧은-사슬 지방산(C4 미만)에 대한 그들의 낮은 내성(tolerance)이다. 많은 연구에서, 짧은-사슬 알코올과 짧은-사슬 지방산, 예를 들어, 메탄올과 아세트산은 각각, 이들 효소의 4차 구조로부터 필수적인 물 분자를 이탈시키는데 주도적인 역할을 하고, 그들의 변성(denaturation) 및 결과적으로, 그들의 촉매 활성의 상실을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 단점은 오일 트리글리세리드와 메탄올을 기질로서 이용한, 상업적인 양의 지방산 메틸 에스테르 "바이오디젤(biodiesel)"의 생산을 위한 리파아제의 적용을 방해하였다.
유리 알코올로 지방산 공급원의 에스테르교환/에스테르화를 위한 고정된 리파아제를 이용하는 추가 단점은 생물촉매(biocatalyst) 상에 형성된 글리세롤과 물 부생성물의 축적, 및 결과적으로, 고정된 효소의 활성 부위에 기질의 자유로운 접근의 불가능이다. 이러한 생물촉매는 일반적으로, 생물촉매의 동일한 배치(batch)가 이용될 때 소수의 사이클 이후 그들의 촉매 능력을 상실한다.
본 발명자들은 많은 생산 사이클 동안 우수한 안정성, 지속적인 활성을 보이는 특별한 고정된 효소 제조물을 개발하였다. 이러한 효소 제조물의 실례는 특히, WO/2008/084470, WO/2008/139455 및 WO2009/069116에서 기술된다.
촉매 반응이 수행되는 조건은 고정된 효소 제조물의 안정성과 효율에 부정적인 영향을 줄지도 모른다. 이들 반응 조건 하에 안정성과 활성을 보전하는 효소 제조물을 확보하는 것이 중요하다.
본 발명의 이들 목적 및 다른 목적은 설명이 진전됨에 따라 명백해질 것이다.
본 발명의 요약
일 실시예에서, 본 발명은, 지방산 알킬 에스테르를 형성하기 위해, 알코올로 지방산 공급원의 에스테르교환(transesterification)/에스테르화(esterification)를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 고정된 리파아제 제조물의 존재 하에 지방산 공급원과 알코올 또는 알코올 공여자를 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서, 고정된 리파아제 제조물은 소수성 다공성 지지체 상에 고정된 적어도 하나의 리파아제를 포함하고, 반응 매체는 수성 알칼리성 완충 용액을 함유한다.
이 실시예의 모든 양상에서, 상기 수성 알칼리성 완충 용액은 약한 수성 알칼리성 완충 용액일 수 있다. 상기 수성 알칼리성 완충 용액은 반응 혼합물에서 지방산 공급원의 99 중량% 이하, 예를 들어, 90 중량% 이하, 80 중량% 이하, 70 중량% 이하, 60 중량% 이하, 50 중량% 이하, 40 중량% 이하, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 12 중량% 이하, 10 중량% 이하, 8 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 및 1 중량% 이하의 양으로 함유될 수 있다. 대안적으로, 상기 수성 알칼리성 완충 용액은 반응 혼합물에서 지방산 공급원의 1 중량% 초과, 2 중량% 초과, 3 중량% 초과, 4 중량% 초과, 5 중량% 초과, 6 중량% 초과, 8 중량% 초과, 10 중량% 초과, 12 중량% 초과, 15 중량% 초과, 20 중량% 초과, 25 중량% 초과, 30 중량% 초과, 40 중량% 초과, 50 중량% 초과, 60 중량% 초과, 70 중량% 초과, 80 중량% 초과, 90 중량% 초과, 및 99 중량% 이하의 양으로 함유될 수 있다. 수성 완충 용액은 7 내지 약 11, 예를 들어, 7-8.5, 7-9, 7-9.5, 7-10, 및 7-11 중에서 임의의 한 가지 pH를 가질 수 있다. 본 발명의 방법에서, 완충 용액을 포함하는 보충된 약알칼리성 시약의 pKa는, 지방산 공급원에 존재하는 유리 산의 pKa 이상일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은, 지방산 알킬 에스테르를 형성하기 위해, 알코올로 지방산 공급원의 에스테르교환(transesterification)/에스테르화(esterification)를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 고정된 리파아제 제조물의 존재 하에 지방산 공급원과 알코올을 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서, 고정된 리파아제 제조물은 소수성 다공성 지지체 상에 고정된 적어도 하나의 리파아제를 포함하고, 반응 매체는 물을 함유한다. 물은 3 내지 11의 pH를 갖는, 증류수 또는 용해된 여러 염을 함유하는 물의 형태이다. 이 실시예의 모든 양상에서, 반응 매체는, 지방산 공급원의 99 중량% 이하, 예를 들어, 90 중량% 이하, 80 중량% 이하, 70 중량% 이하, 60 중량% 이하, 50 중량% 이하, 40 중량% 이하, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 12 중량% 이하, 10 중량% 이하, 8 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 및 1 중량% 이하의 양으로 물 또는 수용액(water solution)을 함유할 수 있다. 대안적으로, 물 또는 수용액은 반응 혼합물에서 지방산 공급원의 1 중량% 초과, 2 중량% 초과, 3 중량% 초과, 4 중량% 초과, 5 중량% 초과, 6 중량% 초과, 8 중량% 초과, 10 중량% 초과, 12 중량% 초과, 15 중량% 초과, 20 중량% 초과, 25 중량% 초과, 30 중량% 초과, 40 중량% 초과, 50 중량% 초과, 60 중량% 초과, 70 중량% 초과, 80 중량% 초과, 90 중량% 초과, 및 99 중량% 이하의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 알코올은 짧은-사슬 알코올, 예를 들어, C1-C6 알킬 알코올, 더욱 구체적으로 C1-C4 알킬 알코올, 특히 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 상기 알코올이 메탄올인 경우, 상기 결과의 지방산 에스테르는 지방산 메틸 에스테르(FAME - 바이오디젤)이다. 알코올은 또한, 중간-사슬 지방 알코올(C6-C10) 또는 긴-사슬 지방 알코올(C12-C22)일 수도 있다. 알코올 공여자는 모노-알킬 에스테르 또는 탄산 디-알킬, 예를 들어, 탄산 디-메틸 또는 탄산 디-에틸일 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 고정된 리파아제는 유리 지방산의 에스테르화를 촉진시켜 지방산 알킬 에스테르와 부생성물로서 물을 산출할 수 있고, 그리고 트리글리세리드, 부분 글리세리드, 왁스 에스테르(wax ester), 및 인지질(phospholipid)의 에스테르교환을 촉진시켜 지방산 알킬 에스테르와 글리세롤, 및 부생성물로서 장쇄 지방 알코올과 글리세로인지질(glycerophospholipid)을 각각 산출할 수 있다.
알칼리성 완충액 또는 알칼리성 용액의 사용에 관한 본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 반응 매체에서 상기 알칼리성 완충액 또는 용액의 양은 지방산 공급원의 0.001 중량%를 초과한다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 적어도 하나의 리파아제는, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp .), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 무코 자바니크스(Mucor javanicus), 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger), 페니실리움 카멤베르틸(Penicillium camembertii), 알칼리게네스 종(Alcaligenes sp.), 아크로모박테르 종(Acromobacter sp .), 버크홀데리아 종(Burkholderia sp.), 써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus), 크로모박테리움 비스코슘(Chromobacterium viscosum), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) B, 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) A, 파파야 씨앗(papaya seed) 및 췌액소(pancreatin) 중에서 어느 하나로부터 유도된 리파아제일 수 있다. 리파아제 제조물(lipase preparation)은 적어도 2개의 리파아제를 포함할 수 있고, 이들은 각각 개별적으로 소수성 지지체 상에서 고정되거나 또는 동일한 소수성 지지체 상에 공동-고정될 수 있다. 상기 리파아제는 동시에 또는 연속적으로 유리 지방산의 에스테르화를 촉진시켜 지방산 알킬 에스테르와 부생성물로서 물을 산출할 수 있고, 그리고 트리글리세리드와 부분 글리세리드의 에스테르교환을 촉진시켜 지방산 알킬 에스테르와 부생성물로서 글리세롤을 산출하고/산출하거나 인지질의 에스테르교환을 촉진시켜 지방산 알킬 에스테르와 리소인지질(lysophospholipid) 및 부생성물로서 글리세로인지질을 산출할 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 지지체는 소수성 지방족 중합체계 지지체 및 소수성 방향족 중합체계 지지체 중에서 임의의 한 가지일 수 있다. 상기 소수성 중합체 지지체는 선형 또는 가지형 유기 사슬로 구성될 수 있다. 상기 지지체는 거대망상(macroreticular) 유기 중합체 또는 공중합체 사슬을 포함할 수 있다. 상기 지지체는 다공성 또는 비-다공성 무기 지지체일 수 있고, 이것은 소수성일 수 있거나, 또는 소수성 유기 물질로 코팅된다. 상기 유기 물질은 선형, 가지형, 또는 기능화된 소수성 유기 사슬일 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 알칼리성 완충 용액이 사용되는 경우, 상기 수성 알칼리성 완충 용액은 무기 알칼리성 염 또는 유기 염기의 용액일 수 있다. 상기 알칼리성 완충 용액은, 알칼리성 금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염, 인산염, 황산염, 아세트산염, 구연산염, 지방산 염, 일차, 이차, 및 삼차 아민, 및 이들의 임의의 혼합물 중 어느 하나의 용액일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 알칼리성 완충 용액은 나트륨 또는 칼륨 중탄산염과 탄산염에서 선택된 약염기(weak base)의 용액일 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 특정 실시예에서, 상기 알칼리성 완충 용액은 예비혼합 단계에서 상기 지방산 공급원에 첨가되거나, 또는 반응 매체에 직접 첨가될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 알칼리성 완충 용액이 사용되는 경우, 에스테르교환/에스테르화 반응 매체에서 상기 알칼리성 완충 용액의 함량은, 오일 공급원료(oil feedstock)의 0.001 중량%를 초과하는 양, 예를 들어, 오일 공급원료의 1-30 중량%, 1-20 중량%, 1-10 중량%, 1-5 중량%, 또는 1-2 중량%이거나, 또는 오일 공급원료의 5 중량%를 초과하는 양, 예를 들어, 오일 공급원료의 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 및 50 중량%를 초과하는 양일 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, 지방산 공급원은 먼저, 알칼리성 완충 용액과 또는 물 또는 물 용액과 혼합되고, 혼합물은 이후, 상기 고정된 리파아제 제조물로 처리되고, 그 이후에 상기 알코올이 첨가되고, 그리고 상기 지방산 공급원이 지방산 에스테르로 전환될 때까지 적절한 조건 하에 반응이 진행될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 지방산 공급원은, 식물성유(plant oil), 동물성 지방(animal fat), 조류유(algal oil), 어유(fish oil), 폐유(waste oil), 및 이들의 임의의 혼합물 중에서 임의의 한 가지일 수 있다. 상기 지방산 공급원은, 다른 미량 지방산 유도체, 예를 들어, 인지질, 왁스 에스테르, 및 스테롤 에스테르의 부재 또는 존재 하에, 유리 지방산, 모노-, 디- 또는 트리-글리세리드, 임의의 비율의 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 지방산 공급원은 정제되지 않거나, 정제되거나, 표백되거나, 탈취되거나 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 반응은 10℃ 내지 100℃, 구체적으로 25 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 지방산 공급원은 예비-반응 준비 용기 내에서 상기 알코올 또는 알코올 공여자 및 상기 물 또는 완충 용액과 예비혼합되어 에멀젼이 형성될 수 있고, 이것은 이후, 상기 고정된 리파아제 제조물과 함께 에스테르교환/에스테르화 반응 용기 내로 공급될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예와 양상에서, 상기 고정된 리파아제는 배치(batch) 또는 연속(continuous) 방식으로 가동되는 충전층 컬럼 반응기(packed bed column reactor)에서 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 따라서, 지방산 알킬 에스테르를 형성하기 위해, 알코올을 이용한 지방산의 에스테르교환/에스테르화를 위한 시스템이 제공되고, 상기 시스템은, 고정된 리파아제 제조물의 존재 하에 지방산을 포함하는 반응 매체 및 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나를 반응시키도록 구성된 반응 용기(reaction vessel)를 포함하고, 여기서, 고정된 리파아제 제조물은 소수성 다공성 지지체 상에 고정된 적어도 하나의 리파아제를 포함하고, 그리고 반응 매체는 수성 알칼리성 완충 용액과 물 중 적어도 하나를 함유한다.
상기 시스템은 임의의 바람직한 조합(combination) 또는 변경(permutation)에서, 하기 특징 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다:
A. 반응 용기는 적어도 상기 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 상기 시스템의 가동 동안, 고정된 리파아제 제조물을 포함할 수 있다.
B. 특징 A에 부가적으로 또는 대안으로, 반응 용기는 적어도 상기 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 상기 시스템의 가동 동안, 지방산 및 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
C. 특징 A 또는 B에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 반응 매체는 혼합물을 포함하고, 상기 시스템은 상기 반응 용기와 선택적으로 유체 소통(fluid communication)하는 예비-반응 용기를 더 포함하고, 상기 예비-반응 용기는 적어도 지방산 및 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나를 예비혼합하여 상기 혼합물을 형성하고, 그리고 적어도 상기 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 상기 시스템의 가동 동안 상기 혼합물을 상기 반응 용기에 선택적으로 전달하도록 구성된다. 이러한 시스템은 상기 예비-반응 용기와 선택적으로 유체 소통하고 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 지방산을 상기 예비-반응 용기로 선택적으로 전달하도록 구성된 지방산 공급원, 그리고 상기 예비-반응 용기와 선택적으로 유체 소통하고 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나를 상기 예비-반응 용기에 선택적으로 전달하도록 구성된 알코올 공급원을 임의적으로 더 포함할 수 있다. 상기 시스템은 상기 예비-반응 용기와 선택적으로 유체 소통하고 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 상기 혼합물에 포함되는 수성 알칼리성 완충 용액과 물 중 적어도 하나를 상기 예비-반응 용기에 선택적으로 전달하도록 구성된 완충액 공급원을 임의적으로 더 포함할 수 있다.
D. 특징 A 내지 C에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 각각 연속적인 방식으로 또는 개별 배치에서 하나 이상의 지방산 및/또는 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나 및/또는 수성 알칼리성 완충 용액과 물 중 적어도 하나를 상기 예비-반응 용기에 선택적으로 전달하도록 구성될 수 있다.
E. 특징 A 내지 D에 부가적으로 또는 대안으로, 예비-반응 용기는 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 연속적인 방식으로 및/또는 개별 배치에서 상기 혼합물을 상기 반응 용기에 선택적으로 전달하도록 구성될 수 있다.
F. 특징 A 내지 E에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 적어도 하나의 지방산; 알코올과 알코올 공여자 중 적어도 하나; 그리고 수성 알칼리성 완충 용액과 물 중 적어도 하나를 상기 반응 용기에 선택적으로 및 직접 전달하도록 구성될 수 있다.
G. 특징 A 내지 F에 부가적으로 또는 대안으로, 반응 용기는 상기 반응 용기 내에서 반응 매체를 선택된 온도 범위 내에 유지하도록 구성된 열 조절 시스템(thermal regulation system)을 포함할 수 있다.
H. 특징 A 내지 G에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 적어도 상기 시스템의 가동 동안 고정된 리파아제 제조물을 상기 반응 용기 내에 보전하도록 구성된 보전 배열(retaining arrangement)을 임의적으로 더 포함할 수 있다.
I. 특징 A 내지 H에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 상기 반응 용기와 선택적으로 유체 소통하는 생성물 분리 용기(product separation vessel)를 더 포함하고, 상기 시스템은 반응 생성물을 포함하는 반응 혼합물을 상기 반응 용기로부터 상기 생성물 분리 용기로 선택적으로 전달하도록 구성되고, 그리고 여기서 상기 생성물 분리 용기는 거기에 전달된 반응 혼합물로부터 지방산 알킬 에스테르의 산출물을 선택적으로 분리하도록 구성된다. 예를 들어, 생성물 분리 용기는 원심분리기와 중력 분리 시스템 중에서 한 가지일 수 있다.
J. 특징 A 내지 I에 부가적으로 또는 대안으로, 반응 용기는 적어도 상기 시스템의 상기 가동 동안 연속적인 방식으로 및/또는 개별 배치에서 상기 반응 혼합물을 상기 생성물 분리 용기에 선택적으로 전달하도록 구성된다.
K. 특징 I 내지 J에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 상기 생성물 분리 용기로부터 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 선택적으로 전달하도록 구성된다. 예를 들어, 상기 시스템은 연속적인 방식으로 및/또는 개별 배치에서 상기 생성물 분리 용기로부터 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 선택적으로 전달하도록 구성된다.
L. 특징 A 내지 K에 부가적으로 또는 대안으로, 상기 시스템은 상기 생성물 분리 용기에 전달된 반응 혼합물로부터 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 증가시키도록 구성된다. 이러한 특징을 갖는 시스템의 한 설정(configuration)에서, 상기 시스템은 상기 생성물 분리 용기에 차후에 전달된 반응 혼합물로부터 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 더욱 증가시키기 위하여 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 상기 반응 용기에 선택적으로 경로 변경(rerouting)하도록 구성된다. 이러한 특징을 갖는 시스템의 다른 설정에서, 상기 시스템은 지방산 알킬 에스테르의 상기 산출물을 보조 반응기 모듈로 선택적으로 경로 변경하도록 구성되고, 여기서 상기 보조 반응기 모듈은 보조 반응기 용기와 보조 생성물 분리 용기를 포함하고, 여기서 지방산 알킬 에스테르의 상기 더욱 증가된 산출물은 상기 보조 생성물 분리 용기를 통해 선택적으로 이후 전달된다.
본 발명은, 촉매 반응이 수행되는 반응 조건에서 안정성과 활성을 보전하는 효소 제조물을 제공하는 효과를 갖는다.
도면의 간단한 설명
본 발명을 이해하고 본 발명이 실제로 어떻게 수행되는 지를 살펴보기 위하여, 하기 첨부된 도면을 참고로 하여 단지 비제한적인 예로 실시예가 기술될 것이다:
도 1: 소수성 수지로서 Amberlite XAD 1600(Amb. XAD 1600) 및 친수성 수지로서 Duolite D568(Duo D568) 상에 고정된 리파아제 써모미세스 라누기노수스(TL), 그리고 소수성 수지로서 Sepabeads SP70(SB SP70) 및 친수성 수지로서 다공성 실리카(Sil.) 상에 고정된 리파아제 슈도모나스 종(Pseudomonas sp ., PS)의 에스테르교환 활성.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 2: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 서로 다른 수준의 중탄산 나트륨 용액에서 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 3: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 서로 다른 수준의 중탄산 나트륨 용액에서 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 4: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 물 없이 및 물의 서로 다른 수준에서 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; DW - 증류수
도 5: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 물의 서로 다른 수준에서 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; DW - 증류수
도 6: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 서로 다른 수준의 중탄산 나트륨 용액에서 4시간의 에스테르화/에스테르교환후 FFA와 대두유의 혼합물의 바이오디젤, 그리고 글리세롤과 물 부생성물로의 전환. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; DW - 증류수
도 7: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 2% 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 4시간의 반응 후 대두유 가수분해물의 바이오디젤과 물로의 에스테르화. 생물촉매는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Ac. Val. - 산가(acid value); Cyc. - 사이클
도 8: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 1 중량% 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 6시간 반응 후 에탄올로 어유의 에스테르교환. 생물촉매는 Amberlite XAD 1600 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL Lip.)와 슈도모나스 종(PS Lip.)으로부터 유도된 리파아제이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 9: 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 0.1M의 2 중량% 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 6시간 반응 후 에탄올로 우지(Tallow fat)의 에스테르교환. 생물촉매는 Amberlite XAD 1600 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginose), 슈도모나스 종 리파아제(PS Lip.; TL Lip.)이었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 10: 소수성 다공성 수지 상에 고정된 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)와, 소수성 다공성 수지 상에 고정된 슈도모나스 종 또는 써모미세스 라누기노수스를 사용하여 7 mg KOH/1g의 FFA 값을 함유하는 4시간 후 얻어진 에스테르교환/에스테르화 반응 매체의 처리.
약어: Ac. Val. - 산가; Cyc. - 사이클
도 11: 소수성 수지로서 디비닐벤젠/폴리스티렌(DVB-PS) 상에, 약 음이온 교환 친수성 수지(Res.) 상에, 그리고 친수성 수지로서 과립화된 다공성 실리카(Sil) 상에 고정된 알칼리게네스 종(AL)으로부터 유도된 리파아제의 에스테르교환 활성.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 12: 소수성 수지로서 디비닐벤젠/폴리스티렌(DVB-PS) 상에, 약 음이온 교환 친수성 수지(Res.) 상에, 그리고 친수성 수지로서 과립화된 다공성 실리카(Sil) 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL) 리파아제의 에스테르교환 활성.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 13: 소수성 수지로서 디비닐벤젠/폴리스티렌(DVB-PS) 상에, 약 음이온 교환 친수성 수지(Res.) 상에, 그리고 친수성 수지로서 과립화된 다공성 실리카(Sil) 상에 고정된 슈도모나스 종(PS) 리파아제의 에스테르교환 활성.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 14: 서로 다른 농도의 0.1M 중탄산 나트륨 용액에서, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 지방산 메틸 에스테르와 글리세롤로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰 기본비로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Sol. - 용액
도 15: 서로 다른 농도의 0.1M 중탄산 나트륨 용액에서, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 슈도모나스 종(SP)}를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰 기본비로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Sol. - 용액
도 16: 반응 혼합물에서 서로 다른 농도의 증류수에서, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰 기본비로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Wat. - 물
도 17: 서로 다른 농도의 0.1M 중탄산 나트륨 용액에서, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 올레산의 바이오디젤과 물로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰 기본비로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Sol. - 용액
도 18: 8 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 올레산과 대두유 트리글리세리드의 다른 혼합물의 바이오디젤, 글리세롤, 및 물로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰 기본비로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Ol. Ac.. - 올레산
도 19: 8 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에, 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 인지질을 함유하는 미정제 오일(crude oil)의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰비를 기초로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; RSBO - 정제한 대두유; CSBO - 미정제 대두유; RSBO - 정제한 대두유; PL - 인지질; O. - 오일
도 20: 0.1M 중탄산 나트륨 용액에 대해 서로 다른 pH 값에서 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 반응 매체에서 완충액 농도는 8 중량% 오일이었다. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰비를 기초로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클
도 21: 0.1M 아세트산 나트륨 용액에 대해 서로 다른 pH 값에서 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환. 반응 매체에서 완충액 농도는 8 중량% 오일이었다. 오일과 메탄올 사이에 1:3의 몰비를 기초로 일 단계에서 반응 혼합물에 메탄올이 첨가되었다.
약어: Conv. - 전환; Cyc. - 사이클; Acet. - 아세트산염
도 22: 본 발명의 일 양상에 따라 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 시스템의 제 1 실시예를 개략적으로 도시한 도면.
도 23: 본 발명의 일 양상에 따라 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 시스템의 제 2 실시예를 개략적으로 도시한 도면.
본 발명의 상세한 설명
효소적으로 촉매된 산업적 방법, 특히 고정된 리파아제(들)의 존재 하에 알코올로 지방산 공급원의 에스테르교환/에스테르화를 위한 방법의 향상을 위하여, 본 발명자들은 고정된 리파아제(들)의 안정성이 여러 차례의 생산 사이클 동안 보존되는 특정한 조건을 개발하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 용매-없는 알칼리성 미소수성 시스템에서 지방산의 알킬 에스테르, 구체적으로 지방산의 짧은-사슬 알킬 에스테르, 예를 들어, 지방산 메틸과 에틸 에스테르(바이오디젤)의 제조 방법에 관계한다. 특정 실시예에서, 알칼리성 미소수성 시스템은 약알칼리성 미소수성 시스템이다. 상기 방법은 지방산 공급원을 제공하는 단계, 그리고 상기 알칼리성 또는 약알칼리성 조건 하에 고정된 리파아제 제조물의 존재 하에 이를 유리 알코올 또는 알코올 공여자와 반응시키는 단계를 포함한다. 이론에 한정되지 않으면, 알칼리성 완충 용액으로 지방산 공급원의 전처리는 효소에 대한 저해 효과를 가질지도 모르는 산을 중화시킬 것이다. 100% 전환까지 반응을 완결하는데 요구되는 알코올의 양은 단계별로 또는 하나의 배치로 첨가될 수 있다. 더 나아가, 알코올은 짧은-사슬 알코올, 예를 들어, 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 다른 알코올 공여자는 가수분해효소(hydrolase)의 존재 하에 지방산 공급원과의 반응에서, 그리고 상기 지방산 공급원이 지방산 알킬 에스테르, 구체적으로, 지방산 메틸 에스테르(FAME) 또는 지방산 에틸 에스테르로 전환될 때까지 이러한 반응이 적절한 조건 하에 진행될 수 있도록 하는데 이용될 수 있고, 여기서 상기 가수분해효소 제조물은 적절한 거대망상 다공성 소수성 중합체계 지지체 상에 개별 또는 공동으로 고정된 하나 이상의 리파아제를 포함한다.
추가 실시예에서, 지방산 공급원과 알코올 또는 알코올 공여자 사이에 에스테르교환/에스테르화 반응은 반응 혼합물에 물의 첨가로, 수성 미소환경에서 수행된다. 특정 실시예에서, 물은 0.0001 중량%를 초과하는 양으로 (지방산 공급원을 기준으로) 첨가될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 물은 순수한 또는 증류수를 의미하고, 또한, 수돗물, 해수 또는 임의의 다른 천연 수자원 또는 저장소의 물, 탈염수, 화학적으로 또는 효소에 의해 정제되거나 처리된 물, 및 임의의 다른 수용액, 예를 들어, 용해된 염 용액일 수 있지만, 이에 제한되지 않는 "수용액(water solution)"{수용액(aqueous solution)으로도 불리는}을 의미한다. 반응 시스템 또는 수용액의 pH는 변할 수 있고, 예를 들어, 약 3-11, 예를 들어, 4-10, 5-10, 5-9, 6-10, 6-9, 또는 7-9일 수 있다.
본 발명의 방법은, 반응 혼합물로부터 형성된 글리세롤 및 임의의 과잉의 물을 연속적으로 제거하면서 수행될 수 있다. 상기 지방산 공급원에 포함되는 지방산 아실기 또는 유리 지방산의 지방산 알킬, 구체적으로 메틸 에스테르로의 전환은 반응 동안 다양한 시점에서 모니터링될 수 있다. 반응 매체는 반응 동안 임의의 원하는 시점에서 적절한 수단에 의해 제거되어 반응이 중단될 수 있고, 그리고 형성된 지방산 메틸 에스테르 및 임의적으로, 형성된 글리세롤은 반응 매체로부터 분리된다. 구체적으로, 반응은 상기 지방산 공급원에 포함되는 지방산 아실기 또는 유리 지방산의 지방산 메틸 에스테르로의 전환이 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 85%, 또는 적어도 90%에 도달할 때 중단될 수 있다.
반응 시스템은 공동-계류 중인 WO2009/069116에서 기술된 것과 유사할 수 있다. 예를 들어, 생산 시스템은 반응기 내에서 생물촉매를 보전하지만 반응 매체가 반응기 외부로 스며들 수 있도록 하는 바닥 소결 유리 또는 스테인리스강 필터가 구비된 교반 탱크 반응기를 이용할 수 있다. 이러한 반응기 형태(configuration)는 고정된 효소로부터 자가-탈착되는 부생성물, 구체적으로 글리세롤과 물이 반응기의 바닥으로 가라앉고, 그리고 필터를 통하여 스며들 수 있도록 한다. 결과적으로, 탈착된 형성된 글리세롤 및 과잉의 물이 반응 매체로부터 연속적으로 제거되고, 반응이 합성 쪽으로 변동되어 98%를 초과하는 전환이 도달된다. 이러한 반응기에 사용된 생물촉매는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 그들의 위치 특이성(positional specificity)과 원천(origin)을 고려하여, 단일 또는 복합-유형의 리파아제로 구성될 수 있다. 대안으로, 바닥 필터가 구비된 2개의 연속 교반 탱크 반응기가 이용될 수도 있다. 2개의 반응기 사이에 침전 탱크(settling tank) 또는 원심분리기(centrifuge)가 이용될 수 있다. 제 1 반응기는 단일 또는 복합-유형의 리파아제로 이루어진 고정된 생물촉매를 내포할 수 있다. 양쪽 반응기 사이에 침전 탱크 또는 원심분리기의 역할은 형성된 글리세롤 및 과잉의 물을 반응 매체로부터 제거하여, 적당한 반응 시간에서 제 2 반응기 내에 원료 물질(raw material)의 그들의 상응하는 지방산 알킬 에스테르로의 전환을 98% 초과까지 증가시키는 것이다. 일부 특정한 반응 시스템과 방법이 하기에 기술된다.
"반응 혼합물", "반응 시스템", 및 "반응 매체"라는 용어는, 본 명세서에서 동의어로서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법의 실시예에서와 같이 알칼리성 완충 용액 또는 물의 존재 하에 소수성 수지 상에 고정된 리파아제의 사용은, 상기 효소의 높은 안정성 및 생물촉매 상에 친수성 물질, 예를 들어, 물 및 형성된 글리세롤 부생성물의 축적 방지를 보장한다. 알칼리성 또는 약 알칼리성 완충액이 사용된 본 발명의 방법의 모든 양상과 실시예에서, 0.001%를 초과하는 알칼리성 또는 약알칼리성 완충 용액, 예를 들어, 0.01-5%, 0.05-5%, 0.1-5%, 0.5-5%, 0.01-50%, 0.05-50%, 0.1-50%, 0.5-50%, 1-50%, 1-45%, 1-40%, 1-35%, 1-30%, 1-25%, 1-20%, 1-15%, 1-10%, 1-8%이지만, 이에 제한되지 않는, 예를 들어, 0.001%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 또는 70%를 초과하지만, 이에 제한되지 않는 알칼리성 또는 약알칼리성 완충 용액이 사용될 수 있다. 알칼리성 또는 약알칼리성 완충 용액의 농도는 99 중량% 이하일 수 있다. 물 또는 수용액이 사용된 본 발명의 모든 양상과 실시예에서, 물 또는 수용액은 0.0001%를 초과하는, 예를 들어, 0.0001-50%, 0.001-50%, 0.1-50%, 0.0001-30%, 0.001-30%, 0.1-30%, 0.0001-20%, 0.001-20%, 0.1-20%이지만, 이에 제한되지 않는, 예를 들어, 0.001-5%, 0.01-5%, 0.05-5%, 0.1-5%, 0.5-5%이지만, 이에 제한되지 않는, 예를 들어, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 70%를 초과하지만, 이에 제한되지 않는 농도로 사용된다. 반응 혼합물에서 물 또는 수용액 농도는 99 중량% 이하일 수 있다. 언급된 바와 같이, 알칼리성 용액이 사용되면, 이것은 부반응으로 인해 생성되거나 지방산 공급원에 일반적으로 존재하는 산을 중화시킬 수 있다. 이러한 부생성물의 연속적인 능동 제거는 상기 방법의 효율을 더 증가시킬 수 있다. 분리된 글리세롤은 산업적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 지방산 공급원은 대두유(soybean oil), 카놀라유(canola oil), 조류유(algae oil), 유채유(rapeseed oil), 올리브유(olive oil), 피마자유(castor oil), 야자유(palm oil), 해바라기유(sunflower oil), 낙화생유(peanut oil), 면실유(cotton seed oil), 자트로파유(Jatropha oil), 원유 옥수수유(crude corn oil), 어유(fish oil), 동물-유도된 지방, 폐식용유(waste cooking oil), 갈색 그리스(brown grease), 불가식 식물 공급원으로부터 유도된 오일 트리글리세리드, 이들 오일로부터 유도된 부분 글리세리드와 유리 지방산, 또는 임의의 원하는 비율에서 이들 중에서 적어도 2가지의 혼합물 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
지방산 공급원으로 미정제 오일을 사용하기 위한 한 가지 예는, 미정제 대두유가 사용된 도 19에 제시된다. 이 도면은, 여러 농도에서, 지방산 공급원으로서 인지질을 함유하는 오일의 사용을 또한 도시한다. 오일과 유리 지방산의 혼합물의 사용이 예를 통해 도 18에 예시되고, 여러 농도에서 오일과 올레산의 혼합물, 및 또한 올레산 그 자체(100%) 혼합물은 지방산 공급원으로 작용한다.
본 발명의 모든 방법에서, 반응에 의해 형성된 지방산 짧은-사슬 알킬 에스테르는 구체적으로 지방산 메틸, 에틸, 이소-프로필 또는 부틸 에스테르(바이오디젤)이다. 다른 중간-사슬 지방 알코올(C6-C10)과 긴-사슬 지방 알코올(C12-C22) 역시 본 발명의 생산 방법에 이용될 수 있을지도 모른다. 이들 더욱 긴 알코올은 구체적으로, 예로써 미용 제품을 위한 왁스의 생산에 적합할 수 있다.
리파아제는 써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus), 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp .), 리조푸스 종(Rhizopus sp .), 무코 자바니크스(Mucor javanicus), 페니실리움 로크포르티(Penicillium roqueforti), 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger), 크로모박테리움 비스코슘(Chromobacterium viscosum), 아크로모박테르 종(Acromobacter sp .), 버크홀데리아 종(Burkholderia sp .), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) A, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) B, 칸디다 루고사(Candida rugosa), 알칼리게네스 종(Alcaligenes sp .), 페니실리움 카멤베르틸(Penicillium camembertii), 파파야 씨앗(papaya seed) 및 췌액소(pancreatin) 중에서 어느 하나로부터 유도된 리파아제일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
리파아제는 적절한 지지체, 구체적으로 소수성 지방족 중합체계 지지체 또는 소수성 방향족 중합성 지지체 상에 공동으로 고정될 수 있다. 상기 리파아제 각각은 적절한 지지체 상에 고정될 수 있고, 여기서 상기 리파아제가 고정되는 지지체는 동일하거나 상이할 수 있다. 이용되는 리파아제는 그들의 기질에 대하여 위치-특이적이거나, 또는 무작위일 수 있다. 하나 이상의 리파아제가 사용될 때, 리파아제는 동일한 또는 상이한 소수성 지지체 상에 고정될 수 있다. 동일한 지지체 상에 공동-고정된 리파아제는 그들의 기질에 대하여 동일한 또는 상이한 기질 선택성 또는 위치-특이성을 나타낼 수 있다.
리파아제는 위치-특이적(또는 부위-특이적)일 수 있고, 각각은 단독으로 또는 동일한 또는 상이한 부위 특이성의 리파아제와 공동으로 이용될 수 있다. 위치 sn-1, sn-2- 또는 sn-3을 지칭할 때, 이들은 다양한 글리세리드의 글리세롤 골격 상의 위치이다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용된 리파아제는, sn-2 위치로 향하여 무작위 리파아제의 선택성보다 높은 선택성, 즉, 알코올 또는 알코올 공여자 및 sn-2 위치의 지방 아실기 사이에 반응의 촉매에서 그들의 편애를 나타낼 수 있는 반면, 무작위 리파아제는 글리세롤 골격 상의 3개 위치 모두에서 지방 아실 기에 대한 동일한 에스테르교환 활성을 나타낸다. 일부 리파아제는 특히, 기질, 생성물 등에 의해 결정된 특정 조건 하에, sn-2 위치 상에서 위치 활성(positional activity)을 독특하게 나타낸다. 본 발명의 방법에 사용된 다른 리파아제는 sn-1,3 위치 특이적이다. 이들은 단독으로, 또는 무작위 리파아제, 구체적으로 부분 글리세리드에 친화성을 갖는 리파아제, 그리고 임의적으로, sn-2 위치에 높은 친화성을 갖는 제 3 리파아제와 함께 이용될 수 있다.
지지체는 구체적으로, 다공성 거대망상 소수성 지지체이고, 이것은 유기 또는 무기일 수 있다. 지지체의 실례는 예를 들어, 소수성화된 실리카- 및/또는 알루미나-기초된 지지체가 포함되지만 이에 제한되지 않는 다공성 무기 지지체, 그리고 예를 들어, 중합성 또는 중합체계 지지체가 포함되지만 이에 제한되지 않는 소수성 유기 지지체이다. 지지체는 임의적으로, 에폭시 및/또는 알데히드 기에서 선택되는 활성 작용기(active functional group), 또는 이온 기(ionic group)를 내포할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 불용성 지지체는 구체적으로, 다공성 망상 소수성 지방족 또는 방향족 중합체계 지지체, 예를 들어, 디비닐벤젠 또는 디비닐벤젠과 폴리스티렌의 혼합물로부터 제조된 다공성 미소망상 수지로 이루어진 AmberliteR XAD 1600과 SepabeadsR SP70, 미소망상 지방족 아크릴 중합체로 이루어진 AmberliteR XAD 7HP, 그리고 다공성 지방족 중합체, 예를 들어, 다공성 폴리프로필렌(AccurelR)이다.
지지체는, 디비닐벤젠, 또는 디비닐벤젠과 스티렌의 혼합물로 이루어진 망상 소수성 중합체, 그리고 지방족 아크릴 중합체 또는 폴리알켄, 예를 들어, 폴리프로필렌으로 이루어진 망상 소수성 지방족 중합체일 수 있다. 특정한 지지체는, 25-1000 Å, 그리고 더욱 구체적으로 80-200 Å 범위에서 구멍 크기의 다공성 매트릭스이다. 지지체는 또한, 분말성 또는 과립성 다공성 소수성 실리카 또는 기타 무기 산화물일 수 있다. 지지체는 또한, 분말성 또는 과립성 다공성 소수성화된 실리카 또는 기타 무기 산화물일 수 있다. 특정 실시예에서, 지지체 수지의 표면적(surface area)은 100m2/g보다 크다.
지방산 공급원과 알코올 사이의 리파아제 촉매 에스테르교환/에스테르화 반응에 보충될 알칼리성 또는 약알칼리성 수용액의 양은, 일반적으로, 다른 반응 조건, 출발 물질, 생물촉매 등에 따라 조절된다. 이러한 양은, 본 명세서에 기재되고 예시된 바와 같이 변할 수 있다. 이러한 알칼리성 용액은, 예를 들어, 무기 알칼리성 염기 또는 염으로부터 또는 유기 염기로부터 제조된다. 무기 염기와 염은 예를 들어, 알칼리성 금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염, 인산염, 황산염, 아세트산염, 구연산염이다. 유기 염기는, 예를 들어, 일차, 이차 또는 삼차 아민일 수 있다. 이들 알칼리성 작용제의 혼합물 역시 예기된다. 본 발명에 따른 방법에서, 고정된 효소의 미소환경의 pH는 알칼리성 또는 약알칼리성 값으로 유지된다. 반응 시스템에 증류수를 첨가하는 것은, 도 4와 5에서 도시된 바와 같이, 소수성 지지체(수지) 상에 고정된 리파아제의 성능을 향상시킨다. 도 16에 예시된 바와 같이, 물이 다량까지도 첨가될 수 있는 반면, 생물촉매(고정 촉매)의 안정성은, 예를 들어, 30 중량%의 물 함량에서 유지되고, 동일 배치의 생물촉매는 50회 정도로 많은 사이클 후 60% 전환 활성을 나타내었다. 사용된 염기의 종류에 따라 서로 다른 pH 값을 갖는 여러 알칼리성 완충액의 첨가는, 예를 들어, 도 2와 3, 및 또한 도 14, 15, 및 17 (고 농도의 알칼리성 수용액은, 50회를 초과할 정도로 많은 반응 사이클 후, 반응 시스템에서 30 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액에서는, 동일 배치의 생물촉매에 의해, 예를 들어, 약 60%의 전환율을 갖는 생물촉매의 활성을 손상시키지 않았음을 보여주는)에 도시된 바와 같이, 소수성 지지체(수지) 상에 고정된 리파아제의 안정화를 또한 일으켰다. 어떠한 이론에도 한정되지 않으면, 고 농도의 물이 필요한데, 이는, 효소가 바람직하게는 글리세리드 형태의 에스테르 결합을 먼저 가수분해하고, 이어서, 형성된 유리 지방산을 보충된 알코올로 에스테르화할 수 있기 때문이다. 첨가된 물은 또한 유리한 효소 촉매 구성을 유지하는데 필수적인 물 분자의 추출을 도한 억제할 수 있다. 탄산염과 중탄산염 완충액은 소수성 지지체 상에 고정된 리파아제의 안정성을 증가시키는데 효과적인 약염기의 예이다. 다른 적절한 염기가 본 명세서에서 기술되어 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 약알칼리성 용액은 일반적으로, 7 내지 약 11, 예를 들어, 7-8.5, 7-9, 7-9.5, 7-10 또는 7-11의 pH를 갖는 용액이다. 일반적으로, 이용된 알칼리성 또는 약알칼리성 수용액의 양은 반응에 이용된 오일의 양에 기초하여 중량 퍼센트(중량%)로 표시된다.
알칼리성 또는 약알칼리성 용액뿐만 아니라, 상기 기재되고 또한 구체적으로 예시된 양으로, 본 명세서에 한정된 바와 같은 물 또는 수용액의 존재시, 다공성 소수성 중합체계 지지체(수지) 상에 고정된 리파아제의 사용은, 지방산 공급원과 알코올 사이에 에스테르교환/에스테르화 반응에서 생물촉매의 활성을 안정화시킨다. 이것은 다음 예에 나타난다.
지방산 공급원은, 트리글리세리드, 부분 글리세리드, 유리 지방산, 인지질, 지방산의 에스테르와 아미드, 또는 적어도 2가지의 상기 공급원으로 이루어진 혼합물 중 적어도 하나이다.
지방산 알킬 에스테르의 생산은 에스테르교환 또는 에스테르화에 의해 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 이러한 반응 시스템 하에, 생물촉매 활성은 복합 용도에서 큰 활성 손실 없이 유지되고, 또한 생물촉매 상에서 글리세롤과 물 부생성물 또는 기타 친수성 화합물의 축적을 방지한다.
본 발명에서는 많은 생산 사이클 동안 높은 활성과 안정성을 보전하는 특정한 고정된 계면 효소를 이용하는 방법을 제시한다. 구체적으로, 리파아제와 포스포리파아제 제조물이 에스테르교환/에스테르화 반응에 이용된다. 이들 반응은 식료품, 화장품 및 생물연료("바이오디젤")의 생산에 이용될 수 있다. 특히 흥미롭게는, 이들 효소는 "바이오디젤"로서 이용을 위한 지방산 짧은-사슬 알킬 에스테르의 합성에 이용될 수 있다.
본 발명에서는 짧은-사슬 지방산, 예를 들어, 아세트산뿐만 아니라 짧은-사슬 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올과 글리세롤에 대하여 높은 내성의 안정한 고정된 계면 효소를 이용하였다. 이들 효소 제조물의 이용은 또한, 고정된 생물촉매 상에 친수성 물질, 특히 글리세롤과 물의 축적을 예방한다.
본 발명의 일 실시예에서, 적당한 반응 시간, 전형적으로 5시간 미만 동안 완전한 전환에 가깝게 원하는 생성물, 즉, 지방산 알킬 에스테르를 획득하기 위하여, 알칼리성 또는 약알칼리성 수용액의 존재 하에 소수성 지지체(수지) 상에 고정된 한 가지 또는 그 이상의 유형의 리파아제를 이용하여 알코올로 지방산 공급원의 동시적 또는 순차적 에스테르교환/에스테르화 반응을 위한 방법이 제공된다. 약알칼리성 용액, 예를 들어, 0.001M, 0.1M, 0.5M 또는 1M 중탄산 나트륨 용액은, 반응에 사용된 오일의 양의 약 4 중량% 또는 약 5 중량% 또는 5 중량% 초과의 양으로, 예를 들어, 6 중량%, 8 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 40 중량% 또는 50 중량%의 양으로 반응 시스템에 존재할 수 있다.
다음 예에 나타난 바와 같이, 리파아제의 작용 수명(operational life time)은, 에스테르교환/에스테르화 반응 매체에서, 본 명세서에 기재되고 예시된 여러 농도와 범위 및 농도의 하위 범위에서, 알칼리성 또는 약알칼리성 완충 용액의 사용과 함께 리파아제 고정화를 위해 소수성 수지 지지체를 사용하여 또한 연장될 수 있다. 다음 예에 추가로 나타난 바와 같이, 반응 혼합물의 물 함량은 pH 값에 관계없이 증가할 수 있다. 그래서, 다른 실시예에서, 생물촉매의 안정성은, 본 명세서에 기재되고 예시된 여러 농도와 범위 및 농도의 하위 범위에서, 물을 첨가하여 반응 시스템의 물 함량을 증가시키는 것으로 증가한다. 결과는, 알칼리성 용액(도 2, 3, 14, 15, 17) 또는 물(도 5, 16)의 첨가가 많은 반응 사이클 동안 효소 활성과 안정성을 유지시킴을 보여준다.
본 발명의 방법에 사용된 알코올 또는 알코올 공여자는 짧은-사슬 알킬 알코올, 구체적으로 C1-C6 알킬 알코올, 더욱 구체적으로 C1-C4 알킬 알코올, 그리고 특히 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 또는 알코올 공여자는 모노-알킬 에스테르 또는 디알킬 탄산염, 예를 들어, 디메틸 탄산염일 수 있다. 알코올 공여자, 예를 들어, 디알킬 탄산염은 또한, 반응 시스템의 알칼리성(alkalinity) 또는 약한 알칼리성에 대한 공급원으로 작용할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 따라, 지방산 알킬 에스테르의 제조를 위한 시스템이 제공된다. 도 22를 참조하면, 참조 번호 100으로 전반적으로 지정된 이러한 시스템의 제 1 실시예는, 반응기 용기(120), 예비-반응 준비 용기(140), 및 생성물 분리 용기(160)를 포함한다.
예비-반응 준비 용기(140)는 공급원료 물질과 완충액(및/또는 물)을 수용하고, 이들로부터 적절한 에멀젼을 형성하고, 그리고 제조된 에멀젼(PE)(또한, 유화된 공급원료로 지칭됨)을 반응기 용기(120)에 공급하도록 구성된다. 특히, 이러한 피드백 물질(feedback material)은 각각, 용기 유입구(172, 174, 176), 및 적절한 밸브(도시되지 않음)를 통해 상기 예비-반응 준비 용기(140)와 유체 소통하는 각각, 적절한 공급 라인(152, 154, 156)을 거쳐 제공된 지방산 공급원(182)으로부터 지방산(FA)(예를 들어, 폐식용유), 그리고 알코올 공급원(184)으로부터 알코올(AL)(예를 들어, 메탄올), 그리고 완충액/물 공급원(186)으로부터 완충액(및/또는 물)(BU)을 포함할 수 있다.
예비-반응 준비 용기(140)는 내부 부피(internal volume)(V1)를 한정하고, 여기서 용기 유입구(172, 174, 176)를 거쳐 그 내부에 제공된 공급원료 물질과 완충액/물을 포함하는 반응 혼합물은 동력 공급원(도시되지 않음)에 의해 구동된 적절한 교반 시스템(142)에 의해 서로 혼합되어 에멀젼(PE)을 형성한다. 예비-반응 준비 용기(140)는 외부 재킷(149)을 포함하고, 이를 통하여 적절한 작동 유체(work fluid)는 원하는 정상 상태 온도에서 부피(V1)가 유지되도록 순환될 수 있다. 예를 들어, 작동 유체는 오일 또는 물이고, 상이한 용기(도시되지 않음)에서 가열되거나 냉각되고, 그리고 적절한 유입구와 출구 포트(도시되지 않음)를 통해 재킷(149)을 통해 펌핑(pumping)될 수 있다. 이러한 실시예의 대안적 변형에서, 예비-반응 준비 용기(140)는 재킷(149) 대신에 또는 재킷(149)에 추가하여, 가열 및/또는 냉각 요소, 예를 들어, 전기 동력 가열 및/또는 냉각 요소의 시스템을 포함할 수 있다.
반응기 용기(120)는 예비-반응 준비 용기(140)로부터 제조된 에멀젼(PE)을 수용하고, 적절한 생물촉매(BC)의 존재 하에 그 내부에 공급원료 물질을 반응시켜 반응 생성물(RP)을 생산하고, 그리고 반응 혼합물로부터 반응 생성물(RP)을 생성물 분리 용기(160)에 공급하도록 구성된다. 배출구 라인(148)은 적절한 밸브(도시되지 않음)를 통해 예비-반응 준비 용기(140)와 반응기 용기(120) 사이에 선택적 유체 소통을 제공하고, 그리고 예비-반응 준비 용기(140)에 의해 제조된 에멀젼(PE)이 원하는 대로 반응기 용기(120)에 공급될 수 있도록 한다.
반응 용기(120)은 내부 부피(V2)를 한정하고, 여기서 용기 유입구(122)를 통해 그 내부에 제공된, 반응 혼합물 내에 제조된 에멀젼(PE)은 반응되고, 그리고 반응 혼합물은 동력 공급원(도시되지 않음)에 의해 구동된 적절한 교반 시스템(124)에 의해 교반되어 반응 생성물(RP)이 형성될 수 있다. 생물촉매(BC)는 적절한 효소를 포함할 수 있고, 그리고 무능화되거나 충분히 효과적이지 못할 때까지 반응기 용기(120) 내에 존속하는 고정된 효소 비드(enzyme bead)의 형태로 제공되고, 그 후에, 이들은 제거되고 새로운 생물촉매(BC)로 대체될 수 있다. 예를 들어, 생물촉매(BC)는 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제를 포함할 수 있다.
반응기 용기(120)는 외부 재킷(129)의 형태로 열 조절 시스템(thermal regulation system)을 포함하고, 이를 통하여 적절한 작동 유체는 원하는 정상 상태 온도에서 부피(V2)가 유지되도록 순환될 수 있다. 예를 들어, 작동 유체는 오일 또는 물이고, 상이한 용기(도시되지 않음)에서 가열되거나 냉각되고, 그리고 적절한 유입구와 출구 포트(123)를 거쳐 재킷(129)을 통해 펌핑(pumping)될 수 있다. 이러한 실시예의 대안적 변형에서, 열 조절 시스템은 재킷(129) 대신에 또는 재킷(129)에 추가하여, 가열 및/또는 냉각 요소, 예를 들어, 전기 동력 가열 및/또는 냉각 요소의 시스템을 포함한다.
반응기 용기(120)의 아래쪽 부분은 배출구(127)를 포함하고, 그리고 필터(125)의 형태에서 적절한 보전 배열은 반응기 용기(120)로부터 이전에 앞서 반응 혼합물, 특히 반응 생성물(RP)을 여과하고, 그리고 생물촉매(BC)가 반응 생성물(RP)과 함께 이전되는 것을 예방하도록 구성된 배출구(127)의 상류에 제공된다.
생성물 분리 용기(160)는 과잉의 물과 글리세롤(G)을 포함하는 생성물에 의한, 반응 생성물(RP)로부터 원하는 생성물(P)(지방산 알킬 에스테르)을 분리하도록 구성된다. 배출구 라인(147)은 적절한 밸브(도시되지 않음)를 통해 생성물 분리 용기(160)와 반응기 용기(120) 사이에 선택적 유체 소통을 제공하고, 그리고 반응 생성물(RP)이 원하는 대로 반응기 용기(120)로부터 생성물 분리 용기(160)에 공급될 수 있도록 한다. 이러한 실시예에서, 생성물 분리 용기(160)는 전술한 분리를 수행하기 위한 원심분리기 또는 중력 분리 시스템을 포함하고, 그리고 생성물(P)을 출력하기 위한 제 1 배출구(162), 그리고 과잉의 물과 글리세롤(G)을 수집하기 위한 제 2 배출구(164)를 포함한다. 생성물(P)은 탭(163)을 거쳐 수집될 수 있다.
본 발명의 시스템은 따라서, 연속 생산 방식으로 가동될 수 있고, 여기서 제조된 에멀젼(PE)은 반응기 용기(120) 내로 공급되고, 그리고 원하는 생성물(P)은 탭(163)을 거쳐 연속적인 방식으로 수집된다. 에멀젼(PE)은 반응 생성물(RP)이 배출구(127)로부터 이전되는 속도와 동일한 속도에서 그 내부에 반응물의 부피를 보충하기 위하여 연속적인 방식으로 제조되고 반응기 용기(120)로 전달될 수 있다. 대안으로, 에멀젼(PE)은 배출구(127)를 거쳐 반응 생성물(RP)의 연속 이전 이후에 반응기 용기(120)에서 반응물의 수준이 특정의 최소 수준으로 하락할 때마다 개별 간격에서 반응 혼합물 내에 반응물의 부피를 보충하기 위하여 배치로 제조되고 반응기 용기(120)로 전달될 수 있다. 당연히, 원하는 생성물(P)이 연속적보다는 배치로 제공되도록 시스템(100)을 가동시키는 것도 가능하다.
대안으로, 시스템(100)은 증강된 수율 방식으로 가동될 수 있는데, 여기서 생성물(P)은 탭(163)을 거쳐 즉시 수집되는 대신에, 라인(165), 용기 유입구(121), 및 밸브(166)를 포함하는 임의적 경로 변경 시스템을 거쳐 반응기 용기(120)로 경로 변경되고, 여기서 밸브(166)는 탭(163)으로부터 생성물(P)을 우회시키기 위하여 선택적으로 가동될 수 있다. 반응기 용기(120)로 경로 변경될 때, 생성물(P)은 공급원(184)으로부터, 상이한 알코올 공급원(도시되지 않음)으로부터, 또는 예비-반응 준비 용기(140)를 거쳐 공급원(184)으로부터 독립된 라인(도시되지 않음)을 거쳐 제공된 알코올(AL)과 그 내부에서 추가 반응되어 더욱 높은 수율의 생성물(P)이 산출될 수 있고, 상기 생성물은 생성물 분리 용기(160)를 이용하여 부생성물로부터 다시 한 번 분리될 수 있다. 알코올이 준비 용기(140)를 거쳐 제공될 때, 후자는 먼저, 제조된 에멀젼(PE)이 비워지고, 그리고 적절한 밸브가 각각의 공급원(182와 186)에 의해 제공되는 지방산(FA) 및 임의적으로, 완충액/물을 예방한다. 적절한 펌프 또는 중력 공급(gravity feed) 및 제어 가능 밸브는 각각의 라인(152, 154, 156, 148, 147, 165)을 통하여 각각의 물질을 선택적으로 운반하기 위하여 제공될 수 있고, 그리고 적절한 컨트롤러(도시되지 않음)는 시스템의 가동을 모니터링하고 제어한다.
제 1 실시예의 적어도 일부 대안적 변형에서, 예비-반응 준비 용기(140)는 반응기 용기(120)와 일체가 될 수 있다. 예를 들어, 각각의 내부 부피(V1과 V2)는 라인(148)에 상응하는 열린 배열(opening arrangement)을 갖는 벽에 의해 구분될 수 있다. 대안으로, 각각의 내부 부피(V1과 V2)는 인접할 수 있지만, 내부 부피(V1)은 에멀젼(PE)이 생물촉매(BC)에 도달하기 이전에 형성되도록 충분한 시간을 제공할 만큼 생물촉매(BC)로부터 충분히 이격된다.
제 1 실시예의 대안적 변형에서, 지방산(FA), 알코올(AL), 그리고 완충액/물(BU) 중에서 하나, 둘 또는 모두는 반응기 용기(120)에 직접적으로 제공되고 예비-반응 준비 용기(140)를 우회할 수도 있다. 예를 들어, 지방산 공급원(182), 알코올 공급원(184), 그리고 완충액/물 공급원(186) 중에서 하나 이상이 적절한 공급 라인(도시되지 않음)을 거쳐 직접적으로 반응기 용기(120)와 선택적으로 유체 소통하고 예비-반응 준비 용기(140)를 우회할 수 있다.
제 1 실시예, 또는 그 대안적인 변형에 따른 시스템(100)의 모든 성분은, 예를 들어, 각 성분이 온도, 압력, pH 등을 비롯한 각각의 조건에서 각각의 기능을 수행할 수 있도록 하기 위하여, 이 기술 분야에 알려진 바와 같이 적절한 형태를 갖고 적절한 물질로부터 만들어지는 것으로 간주된다.
도 23을 참조하면, 참조 번호 200으로 지정된 시스템의 제 2 실시예는, 필요한 변경을 가하여, 약간의 차이를 갖는, 도 22에서와 같이 유사한 모든 참조 번호의 구성요소를 포함하는, 그 대안 변형예를 포함한 제 1 실시예의 모든 요소와 특성을 포함한다. 예를 들어, 시스템(200)은, 또한, 필요한 변경을 가하여 제 1 실시예에 대해 기재된 바와 같이, 반응기 용기(120), 예비-반응 준비 용기(140), 생성물 분리 용기(160), 지방산 공급원(182), 알코올 공급원(184), 완충액/물 공급원(186), 공급 라인(152, 154, 156), 용기 유입구(172, 174, 176), 교반 시스템(142), 외부 재킷(149), 배출구 라인(148), 용기 유입구(122), 교반 시스템(124), 생물촉매(BC), 외부 재킷(129), 유입구와 출구 포트(123), 배출구(127), 필터(125), 배출구 라인(147), 제 1 배출구(162), 제 2 배출구(164)를 포함한다.
그러나, 제 2 실시예에서, 제 1 실시예의 라인(165), 탭(163) 및 밸브(166)는 제외되고, 그리고 그 대신에, 보조 반응기 모듈(300)이 생성물 분리 용기(160)의 제 1 배출구(162)에 작동 가능하게 연결된다.
보조 반응기 모듈(300)은, 보조 반응기 용기(220)와 보조 생성물 분리 용기(260)를 포함하고, 이들은 본 실시예에서, 필요한 변경을 가하여 각각 반응기 용기(120) 및 생성물 분리 용기(160)와 실질적으로 유사하다. 가동 동안, 생성물 분리 용기(160)로부터 원하는 생성물(P)은 라인(266), 밸브(267), 및 용기 유입구(221)를 거쳐 보조 반응기 용기(220)로 보내진다. 보조 반응기 용기(220)로 보내질 때, 생성물(P)은 공급원(184)으로부터 또는 상이한 알코올 공급원(도시되지 않음)으로부터 독립된 라인(도시되지 않음)을 거쳐 제공된 알코올(AL)과 그 내부에서 추가 반응되어 추가 반응된 생성물(FRP)이 생산될 수 있다. 라인(249)은 추가 반응된 생성물(FRP)이 보조 생성물 분리 용기(260)로 운반될 수 있도록 하고, 이것은 이후, 가동되어 부생성물로부터 더욱 높은 수율의 생성물(P')을 분리한다.
시스템(200)은 필요한 변경을 가하여 시스템(100)에서와 유사한 방식으로 가동될 수 있다.
개시되고 설명된 본 발명은 본 명세서에서 개시된 특정 실례, 방법 단계, 그리고 물질에 한정되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 이러한 방법 단계와 물질이 다소간 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에서 이용된 전문 용어는 특정 실시예를 설명하는 목적으로만 이용되고 한정을 의도하지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수의 지시 대상(referent)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전역에서, 단어 "포함한다", 그리고 변형, 예를 들어, "포함한다"와 "포함하는"은 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 규정된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 집단을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 집단을 배제하지 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
다음 예는 본 발명의 양상을 수행할 때 본 발명자에 의해 이용되는 기술을 대표한다. 이들 기술이 본 발명의 실시를 위한 바람직한 실시예의 전형이지만, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어, 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않으면서 다수의 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
예
일반
모든 실험은 중심 유리 필터(centered glass filter)가 바닥에 위치하는 30㎖ 부피의 유리 튜브에서, 또는 150-250㎛ 다공성의 소결 유리 필터가 바닥에 위치하는 500㎖ 부피의 기계적으로 교반된 반응기에서 수행되었다. 전형적인 반응 매체는 글리세롤 골격 상에 유리 또는 결합하는 것에 관계없이, 지방산에 대하여 1:1 몰 기준으로 지방산 공급원, 알코올, 통상적으로, 메탄올 또는 에탄올을 내포하였다(유리 지방산과 모노글리세리드의 경우에 1:1, 디글리세리드의 경우에 1:2, 그리고 트리글리세리드의 경우에 1:3, 알코올 우세). 지방산 공급원은 상이한 양의 알칼리성 완충액, 특정 실시예에서 중탄산 나트륨과 예비혼합되었다. 반응은 소수성 수지 상에 고정된 리파아제(10-15 중량%)의 첨가에 의해 시작되고, 그리고 반응 매체는 30℃에서 기계적으로 진탕되거나, 또는 교반되었다. 알코올 양은 상이하게 지시되지 않으면, 각각 1시간 간격을 두고 3 단계에서 동등하게 첨가되었다. 반응 전환은 상이한 시간 간격에서 반응 매체로부터 샘플을 채취하고 지방산 성분을 분석함으로써 추적되었다. 바이오디젤로의 전환은 지방산 알킬 에스테르의 100* 피크 면적(peak area)/모든 피크 면적의 합계로서 계산되었다.
리파아제 고정화: 리파아제는 표준 절차에 따라 고정되었고, 여기서 일정한 미생물로부터 유도된 리파아제는 일정한 pH 값, 예를 들어, 7.5에서 0.1M의 완충 용액에서 용해되었다. 유기 또는 무기 중합체 수지가 리파아제 용액 내로 도입되었다. 혼합물은 실온에서 8시간 동안 진탕되었다. 차가운 아세톤이 수지 상에서 단백질 효소 침전을 증가시키기 위하여 혼합물 내로 임의적으로 첨가되었다. 생성된 혼합물은 여과되고, 그리고 효소 비드는 물 함량을 5% 이하로 감소시키기 위하여 건조되었다.
소수성 특성의 수지를 획득하기 위하여 폴리스티렌/디비닐벤젠, 파라핀 또는 이들의 임의의 조합에 기초된 소수성 중합체 수지를 비롯한 상이한 수지가 이용되었다. 이용된 전형적인 소수성 수지에는 AmberliteR XAD 1600(Rohm & Haas, USA) 및 SepabeadsR SP70(Resindion, Italy)가 포함되었다. 이용된 전형적인 친수성 수지에는 DuoliteR D568(Rohm & Haas) 및 다공성 실리카 겔이 포함되었다. 리파아제가 수지 상에 개별 고정되거나, 또는 상이한 리파아제가 동일한 수지 상에 공동-고정된다.
예 1
소수성 수지로서 AmberliteR XAD 1600 및 친수성 수지로서 DuoliteR D568 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제, 그리고 소수성 수지로서 SepabeadsR SP70 및 친수성 수지로서 다공성 실리카 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제의 에스테르교환 활성.
반응 조건: 0.1M의 1 중량% 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 10 중량% 리파아제 제조물을 함유하는 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 1에 도시된다.
도 1에 제시된 결과는, 1 중량%의 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 다른 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 및 슈도모나스 종 리파아제 둘 모두 동일 배치의 효소를 사용하여 첫 5회 사이클 동안 높은 에스테르교환 활성을 나타내었음을 보여준다. 5번째 배치 후, 동일 배치의 효소가 이용될 때, 시스템으로부터 반응 매체의 여과는 친수성 수지, 즉, DuoliteR D568 및 다공성 실리카 상에 고정된 양쪽 리파아제의 비드 둘레에 겔-유사 침전물(gel-like deposit)의 형성으로 인해 어려워지는 것으로 관찰되었다. 친수성 수지 상에 고정된 양쪽 리파아제의 에스테르교환 활성은 추가 연속 배치에서 급격하게 감소하였고, 및 이들은 10번째 사이클 후 비활성화되었다. 대조적으로, 소수성 수지, SepabeadsR SP70 상에 고정된 슈도모나스 종 리파아제는 70회 사이클 후 초기 활성의 80% 이상을 유지한 반면, 소수성 수지, AmberliteR XAD1600 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 리파아제는 70회 이상의 사이클 후 초기 활성의 20% 이상을 보전하였다.
예 2
A. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 농도의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 2에 도시된다.
B. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 농도의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 3에 도시된다.
도 2와 3은, 반응 매체에서 탄산 나트륨의 양이 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 리파아제 및 슈도모나스 종 리파아제의 작용 수명에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 도 2와 3에서, 알칼리성 용액의 부재에서 양쪽 고정된 리파아제가 소수의 사이클 후 그들의 활성을 급격하게 상실하는 반면, 반응 시스템 내에 염기로서 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 동일한 고정된 리파아제가 복수 이용 동안 그들의 에스테르교환 활성을 유지한다는 것을 확인할 수 있다. 양쪽 고정된 효소에 대한 결과는 반응 매체에서 중탄산 나트륨 용액의 양을 0 ~ 4 중량% 범위에서 증가시키면 고정된 효소의 동일 배치의 복수 이용에서 효소 활성의 상실이 감소한다는 것을 증명한다.
예 3
A. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 상이한 농도의 증류수를 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 4에 도시된다.
B. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 상이한 농도의 증류수를 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 5에 도시된다.
도 4와 5는 복수 실험에서 소수성 수지 상에 고정된 동일 배치의 써모미세스 라누기노수스 리파아제와 슈도모나스 종 리파아제를 이용한 에스테르교환 활성이 또한, 반응 시스템 내에 물 함량에 의해 영향을 받는다는 것을 보여준다. 0(zero)에서 4 중량%로 물 함량을 증가시키면 연속 사이클에서 이용될 때 생물촉매의 더욱 높은 잔여 에스테르교환 활성이 유지된다는 것을 확인할 수 있다. 도 2 내지 5에 제시된 결과는, 에스테르교환 반응에서 약염기, 예를 들어, 중탄산 나트륨 용액을 이용하는 것이 연속 사이클에 이용될 때 소수성 수지 상에 고정된 리파아제의 활성을 유지하는데 유리하다는 것을 명백하게 증명한다.
예 4
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 4시간의 에스테르화/에스테르교환후 유리 지방산(FFA)과 대두유의 혼합물의 바이오디젤, 그리고 글리세롤과 물 부생성물로의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 양의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 최초 FFA 값 72 mg KOH/1g의 유리 지방산 콩 가수분해물(50 중량%)과 대두유(50 중량%)의 혼합물. 메탄올(4.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(20 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 6에 도시된다.
도 6은, 서로 다른 양의 염기 용액이 동등한 비율의 대두유 가수분해물과 대두유 트리글리세리드로 이루어진 반응 혼합물 내에 존재하는 FFA의 동시 에스테르화 반응에 중요한 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 에스테르화/에스테르교환 반응 시스템 내로 어떤 알칼리성 용액도 첨가되지 않을 때 소수성 수지 상에 고정된 슈도모나스 종 리파아제는 에스테르화 활성을 상실하는 반면, 0.1M의 1중량%와 2 중량% 중탄산 나트륨 용액이 반응 시스템 내로 개별 첨가될 때 동일한 생물촉매는 연속 사이클 동안 활성을 유지한다는 것을 확인할 수 있다. 도 6에 제시된 결과는, 소수성 수지 상에 고정된 슈도모나스 종 리파아제의 이용이 0.1M의 1 중량%와 2 중량% 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에, FFA 함량을 72 mg KOH/1g의 최초 값에서 각각 평균적으로 8과 6 mg KOH/1g으로 감소시키고, 그리고 22회 차후 사이클 동안 이러한 활성을 유지시킨다는 것을 증명한다.
예 5
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 4시간의 반응 후 대두유 가수분해물의 바이오디젤과 물로의 에스테르화.
반응 조건: 0.1M의 1 중량% 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 150 mg KOH/1g의 FFA 값의 유리 지방산 콩 가수분해물(20g). 메탄올(2㎖)이 하나의 배치로 반응 매체에 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 사용되었다(10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 7에 도시된다.
도 7은 소수성 수지 상에 고정된 슈도모나스 종 리파아제가 또한, 유리 지방산의 에스테르화를 촉진시켜 지방산 메틸 에스테르와 물 부생성물을 형성할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는 이러한 리파아제 제조물이 활성의 큰 손실의 관찰 없이, 동일 배치의 생물촉매를 사용한 25회 이상의 사이클 동안 0.1M의 1% 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 매체에서 에스테르화/에스테르교환 활성을 유지한다는 것을 증명한다.
예 6
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 에탄올로 어유의 에스테르교환.
반응 조건: 0.1M의 1% 중탄산 나트륨 용액을 포함하는 정제된 어유(20g). 에탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. AmberliteR XAD 1600 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스와 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 개별 사용되었다 (10 중량%). 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 8에 도시된다.
도 8은 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스와 슈도모나스 종으로부터 유도된 양쪽 리파아제가 또한, 에탄올로 어유 트리글리세리드의 에스테르교환을 촉진시켜 지방산 에틸 에스테르와 글리세롤 부생성물을 형성할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는 또한, 양쪽 생물촉매 제조물이 동일 배치의 생물촉매를 사용한 20회 이상의 사이클 동안 큰 활성 손실 없이, 1% 중탄산 나트륨 용액의 존재 하에 그들의 에스테르교환 활성을 유지한다는 것을 증명한다.
예 7
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 에탄올로 우지의 에스테르교환.
반응 조건: 우지의 지방산 에틸 에스테르(4g)를 함유하는 우지(16g) 및 1M의 1% 탄산 칼륨 용액. 에탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. AmberliteR XAD 1600 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스와 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제(10 중량%)가 개별 또는 동등한 비율에서 공동으로 이용되었다. 상기 반응 매체는 37℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 9에 도시된다.
도 9는, 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스와 슈도모나스 종으로부터 유도된 양쪽 리파아제가 또한, 에탄올로 우지 트리글리세리드의 에스테르교환을 개별 또는 공동으로 촉진시켜 지방산 에틸 에스테르와 글리세롤 부생성물을 형성할 수 있다는 것을 보여준다. 반응 매체의 공급원료는 반응 매체의 융점(melting point)을 낮추기 위하여 우지(80%) 및 우지로부터 유도된 지방산 에틸 에스테르로 구성되었다. 도 9에 제공된 결과는 동일 배치의 생물촉매가 100회 연속 사이클 동안 이용될 때, 모든 생물촉매가 약알칼리성 용액, 예를 들어, 1M의 탄산 칼륨의 존재 하에 그들의 초기 활성의 80% 이상을 보전한다는 것을 증명한다.
예 8
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매(10 중량%)를 이용하여, 소수성 다공성 수지와 메탄올(각각, FFA와 메탄올 사이에 몰 기초에서 1:10의 비율) 상에 고정된 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) B 리파아제로, 소수성 다공성 수지 상에 고정된 슈도모나스 종 리파아제 또는 써모미세스 라누기노수스 리파아제를 이용하여 7 mg KOH/1g의 FFA 값을 함유하는 4시간 후 얻어진 에스테르교환/에스테르화 반응 매체의 처리. 상기 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 10에 도시된다.
도 10은, 전형적으로 3-7 mg KOH/1g의 FFA 값을 함유하는 앞서 기술된 바와 같은 써모미세스 라누기노수스 리파아제 또는 슈도모나스 종 리파아제로 처리후 얻어진 에스테르교환 반응 매체가 친수성 또는 소수성 지지체 상에 고정된 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) B 리파아제로 처리될 수 있고, FFA 값을 2mg KOH/1g 이하까지 감소시킨다는 것을 보여준다. 고정된 리파아제는 100회 이상의 사이클 동안 활성을 유지할 수 있다.
예 9
소수성 수지로서 DVB-PS 상에, 친수성 이온 교환 수지로서 Duolite® D568 상에, 그리고 친수성 효소 흡착제로서 과립화 다공성 실리카 상에 고정된 알칼리게네스 종(AL), 슈도모나스 종(PS), 및 써모미세스 라누기노수스(TL)로부터 유도된 리파아제의 에스테르교환/에스테르화 활성.
반응 조건: 0.1M의 2 중량% 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)이 각각 1시간 간격을 두고 3개의 동등한 배치에서 단계별로 첨가되었다. 10 중량% 리파아제 제조물을 함유하는 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 10-13에 도시된다.
도 10-13에 제시된 결과는, 알칼리게네스 종, 슈도모나스 종, 및 써모미세스 라누기노수스 리파아제가 친수성 수지 상에 고정되면, 처음 몇 사이클 동안 높은 전환이 얻어졌지만, 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 10 사이클 후에는 효소 활성이 급격하게 떨어져 낮은 전환에 도달하였음을 보여준다. 또한, 5번째 배치 후, 동일 배치의 효소 사용시, 친수성 수지, 즉, 약 이온 교환 수지와 다공성 실리카 상에 고정된 양쪽 리파아제의 비드 둘레에 겔-유사 증착물(gel-like deposit)의 형성으로 인해 시스템으로부터 반응 매체의 여과가 어려워지는 것으로 관찰되었다.
이에 반해서, DVB-PS 소수성 수지 상에 고정된 알칼리게네스 종, 슈도모나스 종, 및 써모미세스 라누기노수스 리파아제 모두는 50 사이클 후 그 초기 활성의 80% 이상을 유지했다. 도 10-13은, 모든 리파아제가 제 1 배치에서 높은 활성을 나타내고 제 2 배치 후에는 가장 확실하게는 수지 상의 임의의 느슨하게 결합된 효소의 세척 때문에 약간 감소하였음을 보여준다.
예 10
A. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 농도의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 14에 도시된다.
B. 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 농도의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 슈도모나스 종으로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 15에 도시된다.
도 14와 15는, 반응 매체에서 중탄산 나트륨의 양이 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스와 슈도모나스 종 리파아제의 작용 수명에 중요 역할을 갖는 것을 보여준다. 도 4와 5에서는, 약알칼리성 용액의 부재시, 고정된 양쪽 리파아제가 수 회의 사이클 후 그 활성을 크게 상실한 반면, 동일한 고정 리파아제는 반응 시스템에서 염기로 중탄산 나트륨의 존재시 다수의 사용에도 그 에스테르교환 활성을 유지하였음을 볼 수 있다. 양쪽 고정 효소에 대한 결과는, 반응 매체에서 중탄산 나트륨 용액의 양을 0 ~ 30 중량%의 범위로 증가시키는 것이 동일 배치의 고정 효소의 다중 사용에서 효소 에스테르교환 활성을 증가시킴을 보여준다. 중탄산 나트륨 용액의 양을 30 중량%를 초과하여 증가시키는 것은 효소 활성의 감소를 가져왔다. 이론에 한정되지 않으면, 이러한 감소는 아마도 수지로부터 효소를 세척하는 것에 기인할 수 있다.
예 11
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 서로 다른 농도의 증류수를 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 16에 도시된다.
도 16은, 반응 매체에서 물의 양이 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 리파아제의 작용 수명에 또한 중요 역할을 갖는 것을 보여준다. 도 16에서는, 물의 부재시, 고정된 리파아제가 수 회의 사이클 후 그 활성을 크게 상실한 반면, 동일한 고정 리파아제는 반응 시스템에서 물의 존재시 다수의 사용에도 그 에스테르교환 활성을 유지하였음을 볼 수 있다. 고정 효소에 대한 결과는, 반응 매체에서 물의 양을 0 ~ 30 중량%의 범위로 증가시키는 것이 동일 배치의 고정 효소의 다중 사용에서 효소 에스테르교환 활성을 증가시키는 반면, 물의 양을 30 중량%를 초과하여 증가시키는 것은 효소 활성을 감소시킴을 보여준다.
예 12
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 올레산의 바이오디젤과 물의 전환.
반응 조건: 0.1M의 서로 다른 농도의 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 올레산(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 17에 도시된다.
도 17은, 반응 매체에서 중탄산 나트륨 용액의 농도가 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스의 에스테르화 활성을 결정하는데 중요 역할을 갖는 것을 보여준다. 도 17에서는, 반응 시스템에서 물의 부재시, 소수성 수지 상에 고정된 리파아제가 다중 배치 실험에 사용시 그 활성을 급격히 상실함을 볼 수 있다. 중탄산 나트륨 용액의 농도를 0 ~ 20 중량%의 범위로 증가시키는 것은 다중 사용에서 생물촉매의 에스테르화 활성을 증가시켰다. 수상(aqueous phase) 양을 30 중량% 이상으로 증가시키는 것은, 가장 가능하게는 수지로부터 효소의 세척 때문에, 다중 사용에서 효소 활성의 상실을 가져왔다.
예 13
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 올레산과 대두유 트리글리세리드의 혼합물의 바이오디젤, 글리세롤, 및 물로의 전환.
반응 조건: 서로 다른 농도의 올레산을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g)는 8 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액이 보충되었다. 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 18에 도시된다.
도 18은, 소수성 및 다공성인 리파아제 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스가 완충 용액 존재 하에 유리 지방산과 글리세리드를 에스테르화 및 에스테르교환 반응을 일으켜서 바이오디젤을 형성하고, 부생성물로 글리세롤과 물을 형성할 수 있음을 보여준다. 결과는, 고정된 리파아제가 50 사이클 동안 동일 배치의 생물촉매의 다중 사용에서 큰 활성 손실 없이 그 촉매 활성을 유지함을 또한 보여준다.
예 14
다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매를 사용하여 6시간 반응 후 인지질을 함유하는 미정제 오일의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 서로 다른 농도의 인지질을 함유하는 미정제 대두유(20g)는 8 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액이 보충되었다. 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 19에 도시된다.
도 19는, 소수성 및 다공성인 디비닐벤젠-폴리스티렌 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 리파아제의 에스테르교환 활성을 보여준다. 분석은, 이전 문헌 보고와 대비하여, 중탄산 나트륨 용액의 존재시 소수성 수지 상에 고정된 리파아제가 인지질을 포함한 글리세리드를 에스테르교환하여 바이오디젤을 산출하고, 부생성물로 글리세롤과 글리세로인지질을 산출할 수 있음을 보여준다. 또한, 결과는, 동일 배치의 고정 효소가 다중 사용에서 사용시, 리파아제가 에스테르교환 촉매 활성을 유지함을 보여준다.
예 15
A. 0.1M 중탄산 나트륨 용액에 대해 서로 다른 pH 값에서 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 서로 다른 pH 값에서 8 중량%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 20에 도시된다.
B. 0.1M 아세트산 나트륨 용액에 대해 서로 다른 pH 값에서 다중 배치 실험에서 동일 배치의 생물촉매{DVB-PS 지지체 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스(TL)}를 사용하여 대두유의 바이오디젤과 글리세롤로의 전환.
반응 조건: 서로 다른 pH 값에서 8 중량%의 0.1M 아세트산 나트륨 용액을 함유하는 정제되고 표백된 대두유(20g). 메탄올(2.5㎖)은 하나의 단계로 첨가되었다. 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제가 사용되었다 (10 중량%). 반응 매체는 30℃에서 300rpm으로 진탕되었다. 결과는 도 21에 도시된다.
도 20에 제시된 결과는, 5.5 이상의 pH 값에서, 생물촉매는, 동일 배치의 효소를 사용하여 50 사이클 후, 그 초기 에스테르교환 활성의 60% 이상을 유지했음을 보여준다. 결과는, 5.5의 pH 값에서 효소 활성의 선형 감소가 있었고, 효소 활성은 초기 효소 활성의 20% 아래로 도달했음을 분명하게 보여준다.
6.5 이상의 pH 값에서 완충액 아세테이트가 사용되면 유사한 경향이 관찰되었고, 이 경우, 효소는 50번 반복 사용 후 그 초기 활성의 50% 이상을 유지하였다 (도 21). 도 21에 제시된 결과는, pH 5.5의 아세트산 나트륨 용액이 사용되면, 효소 활성은 낮지만 50 사이클의 반복 사용 후에도 일정하게 유지되었음을 또한 보여준다.
예 16
도 22에 예시된 시스템의 제 1 실시예를 사용하여 바이오디젤, 물, 및 글리세롤을 형성하기 위한, 메탄올을 이용한 10% FFA 함유 폐식용유의 에스테르교환/에스테르화.
반응 조건: 2%의 0.1M 중탄산 나트륨 용액을 함유하는 폐식용유(1100g)와 메탄올(140g)은 먼저 예비-반응 준비 용기(140)에서 예비혼합되어 에멀젼이 형성되고, 이것은 이후, 약 2 리터의 내부 부피(V2)를 갖는 반응기 용기(120)에 도입되었다. 반응 혼합물은 반응기 용기(120) 내에서 30℃에서 6시간 동안, 소수성 및 다공성인 폴리스티렌-디비닐벤젠계 수지(30 중량%의 오일) 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스로부터 유도된 리파아제와 혼합되었다. 반응 혼합물은 필터(125)를 통하여 여과되고 생성물 분리 용기(160)에 공급되었다. 글리세롤 및 과잉의 물은 생성물 분리 용기(160) 내에서 반응 혼합물로부터 제거되었다. 지방산 메틸 에스테르 및 반응되지 않은 글리세리드를 함유하는 위쪽 상(phase)은 경로 변경 라인(165)을 통해 반응기 용기(120)로 재-도입되고, 그리고 반응기 용기(120) 내에 반응 매체에 메탄올(110g)의 첨가 후 반응기 용기(120)에서 교반이 재개되었다. 2시간 후 메틸 에스테르로의 전환은 98%이었다. 폐식용유(83 중량%), 메탄올(15%), 및 0.1M의 중탄산 나트륨 용액(2%)을 함유하는 유화된 반응 매체(제조된 에멀젼)는 약 30㎖/min의 유속(flow rate)에서 반응기 용기(120) 내로 연속적으로 공급되었다. 지방산 메틸 에스테르로의 전환은 거대다공성 소수성 수지 상에 고정된 써모미세스 라누기노수스 리파아제로부터 유도된 동일 배치의 생물촉매를 사용할 때, 큰 활성 손실 없이 3개월 이상 동안 유지되었다.

Claims (63)

  1. 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤 및/또는 물을 각각 형성하기 위해 지방산 공급원을 알코올로 에스테르교환(transesterification) 및/또는 에스테르화(esterification)하는 방법으로서, 상기 방법은
    고정된 리파아제 제조물(immobilized lipase preparation)의 존재 하에 상기 지방산 공급원과 알코올 또는 알코올 공여자를 반응시키는 단계를 포함하되,
    상기 고정된 리파아제 제조물은 소수성 다공성 지지체 상에 고정된 적어도 하나의 리파아제를 포함하고 반응 매체는 7 내지 11의 pH를 갖는 수성 알칼리성 완충 용액을 함유하며, 상기 수성 알칼리성 완충 용액은 상기 지방산 공급원의 5 중량% 보다 크고 99 중량%에 이르는 양으로 상기 반응 혼합물 내에 함유되며, 상기 에스테르교환 및/또는 에스테르화는 동시에 또는 순차적으로 수행되는, 방법.
  2. 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤 및/또는 물을 각각 형성하기 위해 지방산 공급원을 알코올로 에스테르교환 및/또는 에스테르화하는 방법으로서,
    고정된 리파아제 제조물의 존재 하에 상기 지방산 공급원과 알코올을 반응시키는 단계를 포함하되,
    상기 고정된 리파아제 제조물은 소수성 다공성 지지체 상에 고정된 적어도 하나의 리파아제를 포함하고 반응 매체는 상기 지방산 공급원의 5 중량% 보다 크고 99 중량%에 이르는 양으로 물을 함유하며, 상기 에스테르교환 및/또는 에스테르화는 동시에 또는 순차적으로 수행되는, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 물은 3 내지 11의 pH를 갖는 용해된 염들의 수용액의 형태인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 6 중량%보다 많은 양인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 8 중량%보다 많은 양인, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 10 중량%보다 많은 양인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 12 중량%보다 많은 양인, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 15 중량%보다 많은 양인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 20 중량%보다 많은 양인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 25 중량%보다 많은 양인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응 혼합물 내에 함유된 수성 알칼리성 완충 용액 또는 물 또는 물 용액은 지방산 공급원의 30 중량%보다 많은 양인, 방법.
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  18. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알코올은 C1-C6 알킬 알코올인, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알코올 공여자는 상기 반응 매체에서 약알칼리성 시약을 위한 공급원으로도 작용하는 모노-알킬 에스테르 또는 탄산 디-알킬인, 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 모노-알킬 에스테르가 메틸 아세테이트인, 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 탄산 디-알킬이 탄산 디-메틸인, 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 리파아제는 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 무코 자바니크스(Mucor javanicus), 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 아스페르질루스 니제르(Aspergillus niger), 페니실리움 카멤베르틸(Penicillium camembertii), 알칼리게네스 종(Alcaligenes sp.), 아크로모박테르 종(Acromobacter sp.), 버크홀데리아 종(Burkholderia sp.), 써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosa), 크로모박테리움 비스코슘(Chromobacterium viscosum), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) B, 칸디다 루고사(Candida rugosa), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) A, 파파야 씨앗(papaya seed) 및 췌액소(pancreatin) 중 임의의 하나로부터 유도된 리파아제인, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정된 리파아제는 지방산 알킬 에스테르 및 물을 산출하도록 유리 지방산의 상기 에스테르화를 촉진할 수 있으며, 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤을 산출하도록 트리글리세리드 및 부분 글리세리드의 상기 에스테르교환을 촉진할 수 있는, 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리파아제 제조물은 소수성 지지체 상에 각각 개별 고정될 수 있거나 또는 동일한 소수성 지지체 상에 공동-고정될 수 있는 적어도 2개의 리파아제를 포함하는, 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 리파아제는 동일한 또는 서로 다른 위치-특이성(regio-specificity)을 갖는, 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    상기 리파아제는 지방산 알킬 에스테르 및 물을 산출하도록 유리 지방산의 상기 에스테르화를 동시에 또는 연속적으로 촉진할 수 있으며, 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤을 산출하도록 트리글리세리드 및 부분 글리세리드의 상기 에스테르교환을 동시에 또는 연속적으로 촉진할 수 있는, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지지체는 소수성 지방족 중합체계 지지체와 소수성 방향족 중합체계 지지체 중 임의의 하나인, 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 소수성 중합체 지지체는 선형 또는 가지형 유기 사슬로 이루어진, 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 지지체는 거대망상(macroreticular) 유기 중합체 또는 공중합체 사슬을 포함하는, 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지지체는 소수성일 수 있거나 또는 소수성 유기 물질로 코팅된 다공성 또는 비-다공성 무기 지지체인, 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 유기 물질은 선형, 가지형, 또는 기능화된 소수성 유기 사슬인, 방법.
  32. 제 1 항에 있어서,
    상기 수성 알칼리성 완충 용액은 무기 알칼리성 염 또는 유기 염기의 용액인, 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 알칼리성 완충 용액은 알칼리성 금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염, 인산염, 황산염, 아세트산염, 지방산 카르복시산염, 구연산염, 일차, 이차, 및 삼차 아민과 이들의 임의의 혼합물 중 임의의 하나의 용액인, 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 알칼리성 완충 용액은 나트륨 또는 칼륨 중탄산염과 탄산염으로부터 선택된 약염기 용액인, 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 공급원은, 식물성유(plant oil), 동물성 지방(animal fat), 조류유(algal oil), 어유(fish oil), 폐유(waste oil) 및 이들의 임의의 혼합물 중 어느 하나인, 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 공급원은 다른 미량 지방산 유도체의 부재 또는 존재 하에, 유리 지방산, 모노-글리세리드, 디-글리세리드 또는 트리-글리세리드, 임의의 비율의 이들의 혼합물을 포함하는, 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 인지질 및 스테롤 에스테르로부터 선택되는, 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 지방산 공급원은 정제되지 않거나, 정제되거나, 표백되거나, 탈취되거나 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 제 18 항에 있어서,
    상기 C1-C6 알킬 알코올은 C1-C4 알킬 알코올인, 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 C1-C4 알킬 알코올은 메탄올 또는 에탄올인, 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올이고 결과적인 지방산 알킬 에스테르는 지방산 메틸 에스테르(FAME - 바이오디젤)인, 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알코올은 중간-사슬 지방 알코올(C6-C10) 또는 긴-사슬 지방 알코올(C12-C22)인, 방법.
  45. 삭제
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