CN101558160B - 使用固定化酶的有用物质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有用物质的制造方法，所述制造方法是将形成2个液相的液体混合物供给至充填有固定化酶的固定床型反应塔并使之在同一个方向上并流而进行反应，其中，圆当量直径为

Description

使用固定化酶的有用物质的制造方法
技术领域
本发明涉及通过使用充填有固定化酶的固定床型反应塔的反应的有用物质的制造方法。 
背景技术
作为将液体流通于固定床型反应塔而进行的反应，已知有使用被用于L-天冬氨酸的生成、酯交换油脂的生成、乳糖水解、油脂类的水解等的固定化酶的反应。这些反应由于发热量均比较小，所以通常用于最为简单的圆筒型反应器。 
在使用固定化酶的反应中，在像油脂类的水解那样使2个种类以上的液体在反应塔内流通的情况下，从提高反应效率的观点出发，优选在均匀地混合反应液的状态下流通液体。在此情况下，用于水解的油相基质和水相基质由于本来即使混合也不会成为单相，因此通常形成乳浊液。另一方面，由于乳浊液粒子难以到达吸附于载体细孔内的酶，因此也有将液体流通速度控制在反应液不乳化的范围内的技术(参照专利文献1)。 
另外，作为使油相基质和水相基质流通于固定床的方法，虽然有以逆流进行流通的方法(参照专利文献1、2)以及以并流进行流通的方法(参照专利文献3)，但是前者由于需要特殊的结构和运转方法，因此一般是采用以并流进行流通的方法。 
专利文献1：特开昭61-85195号公报 
专利文献2：特开平1-98494号公报 
专利文献3：特开2000-160188号公报 
发明内容
本发明提供了一种有用物质的制造方法，所述制造方法是将形成2个液相的液体混合物供给至充填有固定化酶的固定床型反应塔并使之在同一个方向上并流而进行反应，其中，圆当量直径(equivalent circular diameter)为 
Figure 907910DEST_PATH_G2007800462899D00021
以上的固定床型反应塔的每一段的固定化酶的充填厚度为10～200mm。 
另外，本发明提供了一种有用物质的制造方法，所述制造方法是将形成2个液相的液体混合物供给至充填有固定化酶的固定床型反应塔并使之在同一个方向上并流而进行反应，并使用多段式固定床型反应塔，所述多段式固定床型反应塔是将至少2段以上的充填部以在其间夹持空层叠部的方式进行层叠而成，其中，所述充填部是圆当量直径为 
Figure 762733DEST_PATH_G2007800462899D00022
以上的固定床型反应塔的每一段的充填厚度为10～200mm的充填有固定化酶的充填部，所述空层叠部具有充填厚度以下的厚度。 
另外，本发明提供了圆当量直径为 以上、每一段的固定化酶的充填厚度为10～200mm的固定床型反应塔。 
具体实施方式
在使形成2个液相的液体混合物流通于充填有所述固定化酶的固定床型反应塔而进行反应的方法中，发现存在以下问题：随着反应塔的直径变大，塔内的反应液的流动会变得不均匀并产生反应不能有效进行的部分，结果反应性降低。在此情况下，如果为了提高反应性而单独延长固定化酶与反应液的接触时间，仍然存在生产性(流量)降低的问题。 
因此，本发明涉及在将形成2个液相的液体混合物流通于充填有固定化酶的固定床型反应塔而进行反应的有用物质的制造方法中，通过不降低流量而提高反应性并提高生产性从而更有效地制造有用物质的方法。 
因此，本发明人研究充填有固定化酶的固定床型反应塔中的反应液的流通特征，结果发现：当固定床型反应塔的直径变大时，由于油相和水相的流动情况不同，因此由于超过一定的充填厚度，所以塔内的反应液就会产生不均匀，反应性下降。从而发现：通过规定固定床型反应塔的每一段的固定化酶的充填厚度并将液液二相流进行整流，就能够维持高反应性不变，而且能够提高生产性。 
根据本发明，在将形成2个液相的液体混合物供给至充填有固定化酶的固定床型反应塔的有用物质的制造方法中，能够将塔内的反应 液全体的流动均匀化，结果能够提高反应性和生产性。特别是在油脂类的水解中，能够有效地发挥酶的活性并且能够效率地制造脂肪酸类。 
在本发明中，将形成2个液相的液体混合物(反应液)供给至充填有固定化酶的固定床型反应塔。所谓的固定床型反应塔(以下称为“酶塔”)是指将固定化酶充填于塔柱等中，并使反应液流通于固定化载体之间的空隙以及固定化载体的细孔而成的反应塔。固定床型反应塔可以由具有1段充填有固定化酶的充填部的一个固定床型反应器构成，也可以是将2段以上的该充填部以在其间夹持空层叠部的方式进行层叠而成的多段式固定床型反应塔。 
所谓2个液相可以是即使混合2种液体后也不会成为1个相的状态，包括从分相而成的液相到即使是均匀的也成为乳化状态的液相。 
作为本发明的形态，优选通过油脂类的水解反应而制造作为有用物质的脂肪酸类的方法，其中，油脂类的水解反应是在作为固定化酶使用将油脂分解酶吸附于固定化载体的物质、并充填有该物质的酶塔中，使作为2个液相的油相基质和水相基质流通。 
在本发明中，使2个液相在同一个方向上并流。在此情况下，既可以将2个液相预先混合成为乳化状态而提供，又可以将2个液相分相而直接提供。另外，也可以每隔一定的时间交替地提供2个液相。将各个基质供给至酶塔既可以从塔顶往塔底以向下流动的方式来进行，又可以从塔底往塔顶以向上流动的方式来进行。 
在本发明中所使用的固定化酶是使酶通过吸附等而担载于固定化载体而成。作为固定化载体，可以列举硅藻土(celite)、硅藻土(diatomite)、高岭土、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性碳、碳酸钙、陶瓷等的无机载体，陶瓷粉末、聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等的有机高分子等，但从保水力高的观点出发，特别优选离子交换树脂。另外，在离子交换树脂中，从由于具有大表面积而能够提高酶的吸附量的观点出发，优选多孔质的。 
作为固定化载体而使用的树脂的粒径优选为100～1000μm，更为优选的是250～750μm。细孔径优选为10～150nm，更优选为10～100nm。作为材质，可以列举酚醛系、聚苯乙烯系、丙烯酰胺系、二乙烯基苯系等，从提高酶的吸附性的观点出发，特别优选酚醛系树脂(例如，Rohm and Haas公司制的Duolite A-568)。
本发明的固定化酶所使用的酶虽然并没有特别的限定，但是从提高生产性的效果好的观点出发，优选作为油脂类分解用酶的脂肪酶。脂肪酶固然可以使用来自于动物和来自于植物的脂肪酶，也能够使用来自于微生物的市售的脂肪酶。作为来自于微生物的脂肪酶，可以列举起源于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、地霉(Geotrichum)属、青霉(Penicillium)属、假丝酵母(Candida)属等的物质。 
进行酶的固定化的温度可以根据酶的特性来进行决定，但优选为酶不发生失活的0～60℃，特别优选5～40℃。另外，在固定化时所使用的酶溶液的pH只要在酶不发生变性的范围即可，与温度同样可以根据酶的特性来进行决定，但优选为pH3～9。为了维持该pH而使用缓冲液，作为缓冲液可以列举醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等。从固定化效率的观点出发，上述酶溶液中的酶浓度优选为在酶的饱和溶解度以下并且有充分的浓度。另外，酶溶液根据需要可以使用通过离心分离除去不溶部分而得到的上清液，或者也可以使用通过超滤等进行精制而成的溶液。另外，所使用的酶质量根据其酶的活性而有所不同，但相对于载体质量优选为5～1000质量％，特别优选为10～500质量％。 
对酶进行固定化的情况可以将载体和酶直接吸附，但为了成为表达高活性那样的吸附状态，优选在酶吸附之前用脂溶性脂肪酸或者其衍生物预先对载体进行处理。作为脂溶性脂肪酸或者其衍生物与载体的接触方法，可以将其直接加入到水或者有机溶剂中，但为了分散性良好，也可以使脂溶性脂肪酸或者其衍生物一旦分散、溶解于有机溶剂之后，再将其添加到被分散于水中的载体中。作为该有机溶剂，可以列举氯仿、己烷、乙醇等。脂溶性脂肪酸或者其衍生物的使用量相对于载体质量优选为1～500质量％，特别优选为10～200质量％。接触温度优选为0～100℃，特别优选为20～60℃。接触时间优选为5分钟～5小时左右。完成了该处理的载体可以过滤来回收，也可以对其进行干燥。干燥温度优选为室温～100℃，也可以进行减压干燥。 
在预先处理载体的脂溶性脂肪酸或者其衍生物中，作为脂溶性脂肪酸，可以列举碳原子数为4～24、碳原子数优选为8～18的饱和或者不饱和的直链或者支链的可以具有羟基的脂肪酸。具体而言，可以列举癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、蓖麻油酸以及异硬脂酸等。另外，作为所述脂溶性脂肪酸的衍生物，可以列举这些脂溶性脂肪酸与一元或者多元醇或者糖类的酯、磷脂以及在这些酯上加成环氧乙烷而成的物质等。具体而言，可以列举上述脂肪酸的甲酯、乙酯、甘油一酯、甘油二酯、这些酯的环氧乙烷加成物、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯等。这些脂溶性脂肪酸以及其衍生物在常温下均为液状，这对于将酶固定化于载体的工序而言是优选的。作为这些脂溶性脂肪酸或者其衍生物既可以合并使用2种以上上述物质又可以使用菜籽脂肪酸以及大豆脂肪酸等来自天然的脂肪酸。 
固定化酶的水解活性优选为20U/g以上，更优选100～10000U/g的范围，特别优选500～5000U/g的范围。在此，酶的1U表示在40℃下，一边搅拌混合油酯类∶水＝100∶25(质量比)的混合液一边使之水解30分钟时，在1分钟内生成1μmol的游离脂肪酸的酶的分解能。固定化酶赋予给每单位质量的油脂类的水解活性(U/g-油)和到达某个水解率所需的时间为大致反比例的关系。 
在使用充填有固定化酶的充填层(酶塔)并进行水解的时候，虽然根据送液条件(流通液体速度、温度等)而分解速度有所不同，但是从在酶充填层出口的油脂的水解率、水解所需时间(充填层内的滞留时间)、存在于充填层内的油脂类的质量(g-油)以及固定化酶的充填质量(g)可以求得固定化酶的表观活性(表达活性)(U/g)。还有，为了求得存在于充填层内的油脂类的质量，通过将固定化酶充填部的容积乘以充填部的空隙率、反应液中的油脂类的容量比以及油脂类的比重来求得。 
在本发明所使用的形成2个液相的液体混合物中的1个优选为油相基质。所谓油相基质虽然主要是指植物油、动物油、或者将其组合而成的油脂类，但是所谓油脂类除了包含三酰基甘油之外，还可以包含二酰基甘油以及单酰基甘油或者脂肪酸类，也可以包含作为水解结果所得的脂肪酸。作为油相基质的具体例子，可以列举菜籽油、大豆 油、葵花籽油、棕榈油以及亚麻子油等的植物油；牛油、猪油以及鱼油等的动物油等；或者将其组合而成的油脂类。这些油脂类除了使用脱臭油之外，可以使用没有预先脱臭的未脱臭油脂，但从降低反式不饱和脂肪酸以及共轭不饱和脂肪酸并使来自于原料油脂的植物甾醇、植物甾醇脂肪酸酯以及生育酚残存的观点出发，优选这些油脂类的部分或者全部使用未脱臭油脂。在油相基质中，除了所述油脂类之外，也可以混合脂肪酸等的油溶性成分。所谓脂肪酸类是指包括除了作为水解结果所得的脂肪酸之外，还包含1种以上的上述甘油酯的物质。 
本发明所使用的形成2个液相的液体混合物中的另外1个优选为水相基质。水相基质为水，但也可以混合作为水解结果所得的甘油等以及其他的水溶性成分。 
在本发明中是使用圆当量直径为 
Figure 937680DEST_PATH_G2007800462899D00061
以上且每一段的固定化酶的充填厚度为10～200mm的酶塔来进行反应的。随着酶塔的圆当量直径超过 
Figure 752052DEST_PATH_G2007800462899D00062
反应液的流动会变得不均匀，从而就会成为反应性降低的倾向。 
从反应性以及生产性的观点出发，酶塔的圆当量直径优选为35～ 
Figure 574514DEST_PATH_G2007800462899D00063
特别优选为35～ 
Figure 841548DEST_PATH_G2007800462899D00064
最优选为35～ 
Figure 227398DEST_PATH_G2007800462899D00065
还有，所谓圆当量直径，当酶塔为圆形的时候，指其直径，当酶塔为多角形的时候，指具有与其投影面积相同的面积的圆的直径，将投影面积作为A，由下面的式(1)来求得圆当量直径。 
D＝2(A/π)^0.5     (1) 
(D：圆当量直径(mm)，A：多角形的投影面积(mm2)) 
在本发明中所使用的酶塔的形状只要能够承受所使用的泵的推入压力即可。另外，优选在酶塔的周围配设夹套，从而能够将在酶塔内流通的反应液调整到适合于酶反应的温度。 
为了更有效地发挥出固定化酶的活性，酶塔内的温度优选为0～60℃，更优选为20～40℃。酶塔的长度只要能够达到对于得到所希望的分解率而言为必要的长度即可，但从反应性以及塔内压力损失等的观点出发，优选为0.01～10m的范围，更优选为0.1～5m的范围。 
在本发明中，以每一段的充填厚度为10～200mm的形式将固定化酶充填到酶塔内。如上所述，通过规定固定化酶的充填厚度，从而能 够防止反应液的流动变得不均匀，由于反应液的流动被整流，因此能够有效地表达酶的活性并能够高效率地进行水解。从反应性的观点出发，酶塔中的每一段的固定化酶的充填厚度优选为10～200mm，更优选为15～200mm，特别优选为75～200mm。 
另外，在使用多段式固定床型反应塔的情况下，从反应性、生产性等的观点出发，设置在充填有固定化酶的充填部之间的空层叠部优选具有固定化酶的充填厚度以下的厚度，优选为1～200mm，特别优选为5～200mm，最优选为15～200mm。通过使用该多段式固定床型反应塔，从而即使不进行逐次混合也能够维持更加高的反应性。 
从反应性以及生产性等的观点出发，充填部优选以其间夹持空层叠部的方式层叠2～30段，特别优选层叠3～20段。 
作为将反应液供给至酶塔的方法，可以用分别各自直接连接到酶塔的配管来进行，或者也可以用共有配管来进行供给，但从操作性的观点出发，优选用各自直接连接到酶塔的配管来进行。 
酶塔内的反应液的液体流通线速度优选为1～400mm/分钟，更优选为5～200mm/分钟。该液体流通线速度(mm/分钟)是指用充填层截面积(mm2)除每1分钟的送液量(mm3/分钟)[或称作送液速度(10-3mL/分钟)]得到的商所表示的值。除了伴随着由于提高液体流通线速度而造成充填塔内压力的增大，液体流通变得困难，而需要耐压性高的酶充填塔之外，由于还会产生固定化酶因塔内压力的增加而发生破碎的情况，因此液体流通线速度优选为400mm/分钟以下。另外，从生产性的观点出发，液体流通线速度优选为1mm/分钟以上。由于固定化酶的表达活性根据液体流通线速度而发生变化，因此通过选定最合适的液体流通线速度来决定反应条件，从而就能够进行与所希望的生产能力以及制造成本相匹配的反应。 
从避免水解反应的平衡状态并更有效地发挥出固定化酶的活性以及提高生产性的观点出发，酶塔内的固定化酶充填部中的反应液的滞留时间优选为30秒钟～60分钟，更优选为1分钟～40分钟。所谓滞留时间(分钟)是用充填层的厚度(mm)乘以空隙率，并将结果用液体流通线速度(mm/分钟)除而得到的值所表示的值。 
在本发明中，从兼顾反应性和生产性等的观点出发，可以将通过酶塔的反应液直接作为反应结束物，另外，也可以将反应液一旦进行油水分离并分馏油相之后，添加新的水并以与上述相同的方法再次供给相同的酶塔，并使之重复通过直至得到所希望的反应率。另外，也可以将反应液一旦进行油水分离并分馏油相之后，添加新的水并以与上述相同的方法再次供给至别的酶塔从而进行连续反应。另外，通过使用多个酶塔来一边进行反应液的油水分离，一边将油相供给至下一个酶塔并将水相供给至前一个酶塔，从而也可以以使分解率更高的油相与新鲜的水相进行反应的拟似反流法来进行。作为反应液的油水分离法，通常使用自然沉降型、离心分离型等的油水分离器，但并没有特别的限定。
实施例 
[固定化脂肪酶的调整] 
在10质量份N/10的NaOH溶液中将1质量份Duolite A-568(Rohmand Haas公司制，粒径分布为100～1000μm)搅拌1小时。过滤后用10质量份的离子交换水进行清洗并以10质量份500mM的磷酸缓冲液(pH7)进行pH的平衡。之后，用10质量份50mM的磷酸缓冲液(pH7)每2个小时进行2次pH的平衡。此后，进行过滤并回收载体，然后用5质量份乙醇进行30分钟的乙醇置换。过滤之后，用30分钟添加含有1质量份蓖麻油酸的5质量份乙醇，从而使蓖麻油酸吸附于载体。在由过滤回收载体之后，用5质量份50mM的磷酸缓冲液(pH7)每30分钟清洗4次，去除乙醇，过滤并回收载体。其后，使1质量份市售的脂肪酶(脂肪酶AY，AMANO天野制药株式会社)与溶解于9质量份50mM磷酸缓冲液(pH7)中的酶液相接触5小时而进行固定化。过滤回收固定化酶并通过用10质量份50mM磷酸缓冲液(pH7)进行清洗，从而去除没有被固定化的酶或者蛋白质。其后，添加4质量份实际进行分解的菜籽油并搅拌12小时。以上的操作均在20℃下进行。之后，过滤并与油脂相分离从而制得固定化酶。其结果是获得了显示2700U/g(干燥质量)的水解活性(表观活性)的固定化脂肪酶。固定化酶的质量标准的平均粒径为311μm。 
<参考例1> 
将所述固定化脂肪酶27.0g(干燥质量)充填(充填高度为1200mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为10mm，高度为1400mm)，并由夹套保温在35℃。以1.57mL/分钟的送液速度从塔柱上部将菜籽油和蒸馏水以质量比为10∶6混合而成的液体进行送液，并进行水解反应。其结果示于表1中。 
<参考例2> 
除了将以干重计为4.83g的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为10mm，高度为1950mm)而形成充填部(充填高度为200mm)，并将6段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为150mm)的方式进行层叠之外，以与参考例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表1中。 
按表1所示可知，在酶塔径为 
Figure 896277DEST_PATH_G2007800462899D00091
程度的情况下，固定化酶的充填高度不管是哪一种程度，都有效地表达固定化酶的(表观)活性。 
<实施例1> 
将所述固定化脂肪酶0.16kg(干燥质量)充填(充填高度为150mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为150mm)，并由夹套保温在35℃。以77mL/分钟的送液速度从塔柱上部将以菜籽油和蒸馏水以质量比为10∶6混合而成液体进行送液，并进行水解反应。其结果示于表1中。还有，表中的分解率是通过用皂化值除以根据分析而求得的酸值来计算的。酸值是由American Oil Chemists.SocietyOfficial Method Ca 5a-40中所记载的方法进行测定的，另外，皂化值是由American Oil Chemists.Society Official Method Cd 3a-94中所记载的方法进行测定的。 
<实施例2> 
除了将以干重计为0.17825kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为150mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为150mm)之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。接着，在将从塔柱通 过的反应液一旦进行油水分离并分馏油相之后，添加新的水进行混合并且再次供给至同一形状的别的塔柱，从而以相同的程序进行总共4次水解反应。其结果示于表1中。 
<实施例3> 
除了将以干重计为0.21kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为170mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为76.4mm，高度为250mm)并将送液速度调整至92mL/分钟之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。接着，在将从塔柱通过的反应液一旦进行油水分离并分馏油相之后，添加新的水进行混合并且再次供给至同一形状的别的塔柱，从而以相同的程序进行总共8次水解反应。其结果示于表1中。 
<实施例4> 
除了将以干重计为0.178kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为1050mm)而形成充填部(充填高度为150mm)，并将4段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为150mm)的方式进行层叠之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表1中。 
<实施例5> 
除了将以干重计为13.37kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为150mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为600mm，高度为150mm)并将送液速度调整至5655mL/分钟之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表2中。 
<实施例6> 
除了将以干重计为13.37kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为600mm，高度为1050mm)而形成充填部(充填高度为150mm)，并将4段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为150mm)的方式进行层叠，并将送液速度调整至5655mL/分钟之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表2中。 
<实施例7> 
除了将以干重计为13.37kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为600mm，高度为2250mm)而形成充填层(充填高度为150mm)，并将8段该充填层以其间夹持空层叠部(高度为150mm)的方式进行层叠，并将送液速度调整至5655mL/分钟之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表2中。 
<实施例8> 
除了将以干重计为0.085kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为1125mm)而形成充填部(充填高度为75mm)，并将8段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为75mm)的方式进行层叠之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表2中。 
<实施例9> 
除了将以干重计为0.1725kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为645mm)而形成充填部(充填高度为150mm)，并将4段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为15mm)的方式进行层叠之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表2中。 
表1 
      参考例1   参考例2   实施例1   实施例2   实施例3   实施例4
  塔径  酶充填部厚度  空层叠部厚度  充填部段数  通过次数  总充填部厚度  多段/逐次混合  液体供给流量  酶充填量  空隙率  充填部滞留时间  酸值  分解率  固定化酶的表观  活性(表达活性)   mm  mm  mm  段  次   mL/min  kg-干   min   (％)   U/g   10  1200  0  1  1  1200   1.57  0.027  0.541  32.438  169.4  84.7   791.7   10  200  150  6  1  1200  多段  1.57  0.029  0.511  30.661  171.1  85.6   807.7   70  150  0  1  1  150   77  0.16  0.552  4.142  82  41   744.6   70  150  0  1  4  600  逐次多段  77  0.713  0.501  15.031  157  78.5   838   76.4  170  0  1  8  1360  逐次多段  92  1.68  0.564  38.319  169.1  84.6   724.8   70  150  150  4  1  600  多段  77  0.712  0.502  15.056  157.2  78.6   875
表2 
      实施例5   实施例6   实施例7   实施例8   实施例9
  塔径  酶充填部厚度  空层叠部厚度  充填部段数  通过次数  总充填部厚度  多段/逐次混合  液体供给流量  酶充填量  空隙率  充填部滞留时间  酸值  分解率  固定化酶的表观  活性(表达活性)   mm  mm  mm  段  次   mL/min  kg-干   min   (％)   U/g   600  150  0  1  1  150   5655  13.37  0.491  3.681  90.7  45.4   767.9   600  150  150  4  1  600  多段  5655  53.48  0.491  14.723  154  77.0   767.9   600  150  150  8  1  1200  多段  5655  106.96  0.491  29.445  170.9  85.5   767.9   70  75  75  8  1  600  多段  77  0.68  0.524  15.727  160.3  80.2   1041.488   70  150  15  4  1  600  多段  77  0.69  0.517  15.518  160.4  80.2   1017.781
<比较例1> 
除了将以干重计为0.36kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为300mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为300mm)之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表3中。 
<比较例2> 
除了将以干重计为0.35kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为 300mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为300mm)之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。接着，在将从塔柱通过的反应液一旦进行油水分离并分馏油相之后，添加新的水进行混合并再次供给至同一形状的别的塔柱，从而以相同的程序进行总共2次水解反应。其结果示于表3中。 
<比较例3> 
除了将以干重计为0.35kg的所述固定化脂肪酶充填于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为1650mm)而形成充填部(充填高度为300mm)，并将4段该充填部以其间夹持空层叠部(高度为150mm)的方式进行层叠之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表3中。 
<比较例4> 
除了将以干重计为1.2kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为1177mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为70mm，高度为1300mm)之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表3中。 
<比较例5> 
除了将以干重计为103.0kg的所述固定化脂肪酶充填(充填高度为1300mm)于附有夹套的不锈钢制塔柱(内径为600mm，高度为1500mm)，并将送液速度调整至5655mL/分钟之外，以与实施例1相同的程序进行水解反应。其结果示于表3中。 
表3 
      比较例1   比较例2   比较例3   比较例4   比较例5
  塔径  酶充填部厚度  空层叠部厚度  充填部段数  通过次数  总充填部厚度  多段/逐次混合  液体供给流量  酶充填量  空隙率  滞留时间  酸值  分解率  固定化酶的表观  活性(表达活性)   mm  mm  mm  段  次   mL/min  kg-干   min   (％)   U/g   70  300  0  1  1  300   77  0.36  0.496  7.444  98.6  49.3   457.5   70  300  0  1  2  600  逐次多段  77  0.7  0.496  14.888  135.4  67.7   470.4   70  300  150  4  1  1200  多段  77  1.4  0.496  29.776  1563  78.15   419.2   70  1177  0  1  1  1177   77  1.2  0.57  33.453  149.8  74.9   407.4   600  1300  0  1  1  1300   5655  103  0.547  35.574  125  62.5   222.3
从表1～表3所示结果可知：通过规定固定床型反应塔的每一段的固定化酶的充填厚度，从而有效地表达固定化酶的(表观)活性。另外，可知：作为反应塔通过使用交替具有充填部和空层叠部的多段式固定床型反应塔，从而能够更加有效地表达固定化酶的(表观)活性，提高油脂类的水解率。 

Claims (5)

1.一种脂肪酸类的制造方法，其特征在于：
所述制造方法是将由油相基质和水相基质构成的形成2个液相的液体混合物供给至充填有固定化脂肪酶的固定床型反应塔中并使之在同一个方向上并流而进行水解反应，并且使用的固定床型反应塔是将至少2段以上的充填部以在其间夹持空层叠部的方式进行层叠而成的多段式固定床型反应塔，其中，所述充填部是圆当量直径为35以上的固定床型反应塔的每一段的固定化脂肪酶的充填厚度为10～200mm的充填有固定化脂肪酶的充填部。
2.如权利要求1所述的脂肪酸类的制造方法，其特征在于：
所述空层叠部具有固定化脂肪酶的充填厚度以下的厚度。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于：
所述空层叠部的厚度为1～200mm。
4.如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于：
所述空层叠部的厚度为5～200mm。
5.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：
所述固定床型反应塔的圆当量直径为35～10,000
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