KR20090083902A - 개질된 사이클로스포린의 용도 - Google Patents

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KR20090083902A
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모또유끼 고지마
마꼬또 나까무따
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노파르티스 아게
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Abstract

간 질환의 예방 또는 치료에서 유용한 특성을 갖는 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린을 기재한다.
사이클로스포린, 간 질환, 비면역억제성 사이클로필린-결합

Description

개질된 사이클로스포린의 용도{USE OF MODIFIED CYCLOSPORINS}
본 발명은 비면역억제성 사이클로스포린에 대한 신규한 용도에 관한 것이다.
사이클로스포린은 통상적으로 약리적, 특히 면역억제 또는 항염증 활성을 갖는 구조적으로 특유한 사이클릭 폴리-N-메틸화 운데카펩티드의 부류를 포함한다. 사이클로필린에 강하게 결합하지만, 면역억제성이 아닌 사이클로스포린이 확인되었다. WO2005021028 A1에는 비면역억제성 사이클로스포린의 사용이 C형 간염 바이러스(HCV)에 대해 저해 효과를 갖는다는 것이 개시되어 있다.
사이클로스포린은 이의 혼합 림프구 반응(MLR)에서의 활성이 사이클로스포린 A 활성의 5％ 이하, 바람직하게는 2％ 이하인 경우, 비면역억제성인 것으로 간주된다. 혼합 림프구 반응은 티. 메오(T. Meo)에 의해 문헌 ["Immunological Methods", L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979)]에 기재되어 있다. Balb/c 마우스 (암컷, 8-10주령)의 비장 세포 (0.5 x 106)를 CBA 마우스 (암컷, 8 내지 10주령)의 방사선조사 (2000 rad)되거나 또는 미토마이신 C 처리된 비장 세포 (0.5 x 105)와 함께 5일 동안 같이 인큐베이션하였다. 방사선조사된 동종 세포는 Balb/c 비장 세포에서 증식 반응을 유도하는데, 이는 DNA 내로의 표지된 전구체 혼입에 의해 측정할 수 있다. 자극인자 세포는 방사선조사 (또는 미토마이신 C로 처리)되기 때문에, 이들은 증식 중인 Balb/c 세포와는 반응하지 않지만, 그들의 항원성은 보유한다. MLR에서 시험 화합물에 대해 측정된 IC50을 병행 실험에서 사이클로스포린 A에 대해 측정된 것과 비교한다. 또한, 비면역억제성 사이클로스포린은 CN 및 하류 NF-AT 경로를 저해하는 능력이 결핍되어 있다.
섬유화는 수복성 또는 반응성 과정으로서 기관 또는 조직에서 과도한 섬유 결합 조직의 형성 또는 발생이다. 섬유화의 한 형태인 간경변은 간 조직을 섬유형 흉터 조직 뿐만 아니라, 재생 결절로 대체함으로써 간 기능을 점진적으로 손실시키는 것을 특징으로 하는 만성 간 질환의 결과이다. 간 성상세포(HSC)는 특징적인 별 모양의 형태를 가지며, 디세(Disse)의 동굴주위공간에 잔류하는 단실질(monparenchymal) 간세포이다. 간 손상 후, HSC는 활성화된 근육섬유모세포 표현형으로 교차분화하게 되고, α-평활근 액틴을 발현한다. 이어서, 활성화된 HSC는 증식하고, 예로서, 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질을 생산하게 된다. 예로서, 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 면역억제성 약물이 HSC에서의 세포 증식 및 콜라겐 생산에 미치는 효과에 관한 이전 평가에서 사이클로스포린은 세포 성장 및 콜라겐 생산을 억제시켰지만, 타크로리무스는 그러한 효과를 나타내지 못하는 것으로 밝혀졌고, 이는 사이클로스포린이 잠재적으로 항-섬유발생 효과를 갖는다는 것을 시사한다.
현재 이용가능한 항섬유화 치료법은 섬유화를 억제시킨다기 보다는 간 염증을 억제시키는 것이다. 유해한 자극을 제거하고, 간 염증을 억제시키고, 성상세포 활성화를 하향조절하고, 기질 분해를 촉진시키고자 하는 노력을 포함하는 것을 치료학적 개입의 주안점으로 하는 것이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 간 질환, 예로서, 이식-간경변, 만성 간염, 간경변, 간암, 예를 들면, 간세포 암종, 또는 그의 진행의 예방 또는 치료에서의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린의 용도를 제공한다. 추가로, 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린은 또한 예를 들어, 선천성 간 섬유화를 앓는 신생아, 또는 이식 수혜자, 예를 들면, 간 이식과 같은 기관 또는 조직 이식 수혜자에서 태어난 신생아의 예방적 치료로 이용될 수 있다.
문헌 [Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365]에 기술된 경쟁적 ELISA 시험에서, 해당 사이클로스포린이 인간 재조합 사이클로필린에 사이클로스포린 A가 결합하는 것의 5분의 1 이상으로 결합하는 경우 해당 사이클로스포린이 사이클로필린에 결합하는 것으로 간주된다. 이 시험에서는, 코팅된 BSA-사이클로스포린 A와 함께 사이클로필린의 인큐베이션 동안에 시험될 사이클로스포린을 첨가하고, 경쟁인자의 부재하에 대조 반응을 50％ 억제하는데 요구되는 농도를 계산한다(IC50). 그 결과는 결합 비(BR)로 표현되는데, 이는 시험 화합물의 IC50 및 사이클로스포린 A 그 자체의 동시 시험에서의 IC50의 비에 대한 상용 로그값이다. 따라서, 1.0의 BR은 사이클로스포린 A가 결합하는 것보다 시험 화합물이 인간 사이클로 필린에 10배 적게 결합하는 것을 나타내며, 음의 값은 사이클로스포린 A의 결합보다 더 강한 결합을 나타낸다. HCV에 대해 활성인 사이클로스포린은 0.7 미만, 바람직하게는 0 이하의 BR을 갖는다.
비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린의 예는, 예를 들어, 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함한다:
Figure 112009028006751-PCT00001
상기 식에서,
W는 MeBmt, 디하이드로-MeBmt, 8'-하이드록시-MeBmt 또는 O-아세틸-MeBmt1이고;
X는 αAbU, Val, Thr, Nva 또는 O-메틸 트레오닌(MeOThr)이고;
R은 Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla, 또는 (D)-MeSer(O아세틸)이고;
Y는 MeLeu, 티오MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle 또는 MeaThr; N-에틸Val, N-에틸Ile, N-에틸Thr, N-에틸Phe, N-에틸Tyr 또는 N-에틸Thr(O아세틸)이고;
Z는 Val, Leu, MeVal 또는 MeLeu이고;
Q는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeAla 또는 Pro이고;
T1은 (D)Ala 또는 Lys이고;
T2는 MeLeu 또는 γ-하이드록시-MeLeu이고;
T3은 MeLeu 또는 MeAla이다.
바람직한 화학식 (I)의 화합물은, 예를 들어, 하기 화학식 (Ia)의 화합물이다:
Figure 112009028006751-PCT00002
상기 식에서,
W'는 MeBmt, 디하이드로-MeBmt 또는 8'-하이드록시-MeBmt이고;
X는 αAbu, Val, Thr, Nva 또는 O-메틸 트레오닌(MeOThr)이고;
R'은 Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla, 또는 (D)-MeSer(O아세틸)이고;
Y'는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle 또는 MeaThr; N-에틸Val, N-에틸Ile, N-에틸Thr, N-에틸Phe, N-에틸Tyr 또는 N-에틸Thr(O아세틸)이고;
Z는 Val, Leu, MeVal 또는 MeLeu이고;
Q'는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu 또는 MeAla이다.
기 W', X, Y', Z, Q' 및 R'은 독립적으로 하기의 바람직한 의미를 갖는다:
W'는 바람직하게는 W"이고, 여기서, W"는 MeBmt 또는 디하이드로-MeBmt이고;
X는 바람직하게는 X'이고, 여기서, X'는 αAbu 또는 Nva이고, 보다 바람직하게는 X"이고, 여기서, X"는 αAbu이고;
R'은 바람직하게는 R"이고, 여기서, R"는 Sar이고;
Y'는 바람직하게는 Y"이고, 여기서, Y"는 γ-하이드록시-MeLeu, MeVal, MeThr, MeIle, N-에틸Ile 또는 N-에틸Val이고;
Z는 바람직하게는 Z'이고, 여기서, Z'는 Val 또는 MeVal이고;
Q'는 바람직하게는 Q"이고, 여기서, Q"는 MeLeu이다.
화학식 (Ia)의 화합물의 바람직한 군은 W'가 W"이고, X가 X'이고, Y'가 Y"이고, Z가 Z'이고, Q'가 Q"이고, R'이 R"인 화합물이다.
바람직한 화학식 (Ia)의 화합물의 예는 다음과 같다:
a) [디하이드로-MeBmt]1-[γ-하이드록시-MeLeu]4-사이클로스포린; BR* = 0.1; IR < 1％
b) [MeVal]4-사이클로스포린; BR = 0.1; IR < 1％
c) [MeIle]4-사이클로스포린; BR = -0.2; IR < 1％
d) [MeThr]4-사이클로스포린;
e) [γ-하이드록시-MeLeu]4-사이클로스포린; BR = 0.4; IR < 1％
f) [에틸-Ile]4-사이클로스포린; BR = 0.1; IR < 2％
g) [에틸-Val]4-사이클로스포린; BR = 0; IR < 2％
h) [Nva]2-[γ-하이드록시-MeLeu]4-사이클로스포린;
i) [γ-하이드록시-MeLeu]4-[γ-하이드록시-MeLeu]6-사이클로스포린;
j) [MeVal]5-사이클로스포린; BR = 0.4; IR = 5.3％
k) [Me0Thr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-사이클로스포린;
j) [8'-하이드록시-MeBmt]1-사이클로스포린; BR = 0.35; IR = 1.8％
k) [MeAla]6-사이클로스포린; BR = -0.4; IR = 3.2％
l) [γ-하이드록시-MeLeu]9-사이클로스포린; BR = 0.15; IR = 2.9％
IR = 사이클로스포린 A에 대한 활성의 백분율로 표현된 면역억제비.
비면역억제성 사이클로스포린의 추가의 예는 WO 98/28330, WO 98/28329 및 WO 98/28328 (그의 내용이 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 화합물, 예를 들어, 화학식 (II)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
Figure 112009028006751-PCT00003
상기 식에서,
Wa는
Figure 112009028006751-PCT00004
(여기서, Ra는 하기 화학식 (Ic):
Figure 112009028006751-PCT00005
또는 하기 화학식 (Id):
Figure 112009028006751-PCT00006
의 잔기이고,
여기서, R4는 C1-4알킬티오, 아미노C1-4알킬티오, C1-4알킬아미노C1-4알킬티오, 디C1-4알킬아미노-C1-4알킬티오, 피리미디닐티오, 티아졸릴티오, N-C1-4알킬이미다졸릴티오, 하이드록시C1-4알킬페닐티오, 하이드록시C1-4알킬페녹시, 니트로페닐아미노 또는 2-옥소피리미딘-1-일이고, R'4는 C1-4알킬임)이고;
Xa는 Abu이고;
Ra는 -NMe-CH(Rb)-CO-이고, 여기서, Rb는 H 또는 -S-Alk-R0이고, 여기서, Alk-R0는 메틸이거나; 또는 Alk는 직쇄 또는 분지형 C2-6알킬렌 또는 C3-6사이클로알킬렌이고, R0은 H; OH; COOH; C2-5알콕시 카르보닐; NR1R2 (여기서, 각각의 R1과 R2는 독립적으로 H, C1-4알킬, C2-4알케닐, C3-6사이클로알킬, 및 페닐 (각각 할로겐, C1-4알콕시, C2-5알콕시카르보닐, 아미노, C1-4알킬아미노 및/또는 디C1-4알킬-아미노로 임의로 치환됨), 및 벤질 및 헤테로사이클릭 라디칼 (상기 벤질 및 헤테로사이클릭 라디칼은 포화 또는 불포화되어 있고, 5 내지 6개의 고리원 및 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다)로부터 선택되거나, 또는 R1 및 R2는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 또다른 헤테로원자를 함유할 수 있고 C1-4알킬, 페닐 또는 벤질에 의해 임의로 치환되는 4 내지 6원 헤테로사이클을 형성하거나; 또는 각각의 R1과 R2는 독립적으로 하기 화학식 (Ib):
Figure 112009028006751-PCT00007
(여기서, R1 및 R2는 상기에 정의한 바와 같고, R3은 H 또는 C1-4알킬이고, n은 2 내지 4 범위의 정수이다)의 라디칼이고;
Ya는 MeLeu 또는 γ-하이드록시-MeLeu이고;
Za는 Val이고;
Qa는 MeLeu이되, 단, Ya가 MeLeu인 경우에 Rb는 H가 아니다.
화학식 (II)에서, R1 및/또는 R2가 헤테로사이클릭 잔기인 경우, 이는 피리 딜, 테트라하이드로-피리딜, 피페리딜, 이미다졸릴, 옥사졸릴 또는 티아졸릴일 수 있다. R1 및 R2가 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 잔기를 형성하는 경우, 예를 들면, 헤테로사이클릭 잔기는 아제티디닐, 피페리딜, 피페라지닐, N-메틸-피페라지닐, N-페닐피페라지닐, N-벤질피페라지닐, 피리딜, 이미다졸릴, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 테트라하이드로피리딜, 메틸테트라하이드로피리딜 (예를 들어, 4-메틸-테트라하이드로피리딜) 또는 페닐테트라하이드로피리딜 (예를 들어, 4-페닐테트라하이드로피리딜)로부터 선택될 수 있다.
화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물은 다양한 방법으로 수득될 수 있고, 이들 방법은 예를 들어, EP 0 484 281 A1, WO 00/01715, WO 98/28330, WO 98/28329 및 WO 98/28328 (그의 내용이 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 하기 방법으로 분류될 수 있다:
1) 발효법
2) 생물변환
3) 유도체화
4) 부분 합성
5) 전체 합성.
일련의 추가의 구체적 또는 대체적 실시태양에서, 본 발명은 또한 하기를 제공한다:
1.1 치료학적 유효량의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예 를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물을 간 질환과 관련된 병태의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 간 질환과 관련된 병태의 예방 또는 치료 방법.
본 발명에 따르면, 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린은 간 질환과 관련된, 하나 이상의 징후, 증상 또는 병태를 완화시키거나 제거하기에 유효한 양, 예를 들어, 대상체의 생검 샘플에서 측정된 콜라겐 생산을 억제시키는데 유효한 양으로 투여될 수 있다.
1.2 유효량의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물을 매개체에 적용시키는 것을 포함하는, 상기 매개체에서의 HSC 성장 억제 방법.
1.3 치료학적 유효량의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물을 간 질환과 관련된 병태 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 간 질환과 관련된 병태 억제 방법.
1.4 치료학적 유효량의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물을 간 질환과 관련된 병태 재발 예방 또는 치료가 필요한 이식 수혜자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 수혜자에서의 간 질환과 관련된 병태 재발 예방 또는 치료 방법.
2. 상기에 정의한 바와 같은 임의의 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물의 용도.
3. 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 또는 화학식 (II)의 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 상기에 정의한 바와 같은 임의의 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
상기에 명시된 질환 및 병태를 치료하는데 있어 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린 (이후 "본 발명의 사이클로스포린")의 효용은, 예를 들어, 하기에서 기술하는 방법에 따라서, 표준 동물 시험 또는 임상 시험에서 증명될 수 있다.
A. 시험관내 세포 배양법: 순차적으로 계내에서 콜라게나제로 관류시키고 프로나제로 분해한 후, 문헌 [Kato, et al, J. Hepatol (1999) 31:91-99]에 기재되어 있는 바와 같이, 이중으로 층이 형성되어 있는 (17％/11.5％) 메트리자마이드 용액 (미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼(Sigma Chemical)) 중에서 원심분리하여 HSC를 위스타(Wistar) 계 수컷 래트의 간으로부터 단리시킨다. 10％ 우태아 혈청(FCS)을 포함하는 둘베코스 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 HSC를 배양한다. 3차와 4차 계대접종 사이의 세포에서 실험을 실시한다. 마우스 기질 메탈로프로테이나제(MMP-1)와, 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP-1)를 측정하기 위해 문헌 [Shibata, et al, Cell Transplant (2003) 12:499-507]에 따라 생산된 HSC로부터 유래된 인간 세포주인 TWNT-4 세포를 사용하여 패수딜(Fasudil)이 MMP-1 및 TIMP-1에 미치는 효과를 평가한다. 앞서 보고된 바와 같이 (상기 동일 문헌) 10％ FCS을 포함하는 DMEM에서 TWNT-4 세포를 배양한다. NIM811 (스위스 바젤 소재의 노파르티스 파르마 아게(Novartis Pharma AG))을 DMEM에 용해시키고, 배양물에 첨가한다. 2 μM NIM811의 존재하에 24h 동안 무혈청 조건하에서 HSC의 세포 생육성은 90％를 초과한다.
1형 콜라겐 분석법 : 배양된 HSC를 24h 동안 NIM811 존재하에 또는 부재하에 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시킨다. I형 콜라겐은 문헌 [Iwamoto, et al, J. Hepatol (2000) 32:762-770]에 기재되어 있는 바와 같이, ELISA에 의해 배양 배지에서 측정한다. 항-래트 I형 콜라겐 항체 (일본 도쿄 소재의 LSL)가 1차 항체로서 사용될 수 있다. 퍼옥시다제-접합된 염소-항-토끼 IgG (노스캐롤라이나주 더럼에 소재하는 오가논 테크니카 코포레이션(Organon Teknika Corporation))가 2차 항체로서 사용된다. 토끼 꼬리 힘줄 I형 콜라겐 (뉴욕주 린브룩 소재의 어드밴스 바이오팩츄레스 코포레이션(Advance Biofactures Corporation))이 표준 대조군으로서 사용된다.
MMP-1, TIMP-1, 및 콜라게나제 분석법 : 배양된 TWNT-4 세포를 24h 동안 NIM811 존재하에 또는 부재하에 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시킨다. MMP-1 및 TIMP-1 생산은 문헌 [Fukushima, et al, Liver Int (2005) 25:829-838]에 기재되어 있는 방법에 따라 각각 인간 MMP-1용 바이오트랙(Biotrak) ELISA 시스템 (미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)) 및 hTIMP-1 키트(일본 토야마 소재의 다이이치 파인 케미칼 가부시키가이샤(Daiichi Fine Chemical Co. Ltd.))를 사용하여 ELISA에 의해 배양 배지에서 측정한다. 배 양 배지 중 활성 MMP-1 및 프로-MMP-1은 MMP-1 바이오트랙 액티비티 어세이 시스템(MMP-1 Biotrak Activity Assay System)(애머샴)을 사용하여 측정한다.
실시간 RT-PCR을 사용한 유전자 발현 분석 : 트리졸 시약 (미국 캘리포니아주 칼스베드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 TWNT-4 세포로부터 전체 RNA를 제조하고, 이를 24h 동안 10％ FCS 중 NIM811 존재하에 또는 부재하에 유지시킨다. 무작위 육량체를 사용하여 GeneAmp™ RNA PCR (미국 뉴저지주 브랜치버그 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))로 1.0 mg RNA로부터 cDNA를 합성한다. 문헌 [Nakamuta, et al, Int J. Mol Med (2005) 16(4):631-635]에 기재되어 있는 바와 같이, 라이트사이클러-패스트스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 1(LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1) (일본 도쿄 소재의 로셰(Roche))을 사용하여 실시간 PCR을 실시한다. 라이트사이클러-패스트스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 1, 4 mM MgCl2, 0.5 μM의 상류 및 하류 PCR 프라이머, 및 주형으로서의 2 ml의 제1 스트랜드 cDNA를 함유하는 반응 혼합물 (20 ㎕)을 사용한다. 반응에 있어서의 변화를 제어하기 위해 모든 PCR은 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAPDH) 발현에 대해 정규화시킨다. 사용될 수 있는 프라이머는 하기와 같다: 인간 I형 콜라겐 a1 쇄 (진뱅크™ 수탁 번호(GenBank™ accession number) NM-000088) (21)의 경우, 5'-AGGGTGAGACAGGCGAACAG-3' (정방향 프라이머) (서열 번호: 1) 및 5'-CTCTTGAGGTGGCTGGGGCA-3' (역방향 프라이머)(서열 번호: 2); 인간 a-SMA (진뱅크™ 수탁 번호 NM-000088)의 경우, 5'-AATGAGATGGCCACTGCCGC-3' (정방향 프라이머)(서열 번호: 3) 및 5'-CAGAGTATTTGCGCTCCGGA-3' (역방향 프라이머); MMP-1 (진뱅크™ 수탁 번호 NM002421)의 경우, 5'-GATCATCGGGACAACTCTCCT-3' (정방향 프라이머) 및 5'-TCCGGGTAGAAGGGATTTGTG-3' (역방향 프라이머); TIMP-1 (진뱅크™ 수탁 번호 NM003254)의 경우, 5'-TTCTGCAATTCCGACCTCGT-3' (정방향 프라이머) 및 5'-TCCGTCCACAAGCAATGAGT-3' (역방향 프라이머)(서열 번호: 4); Smad7의 경우, 5'-GGATCTCAGGCATTCCTCGG-3' (정방향 프라이머)(서열 번호: 5) 및 5'-CAGTATGCCACCACGCACCA-3' (역방향 프라이머)(서열 번호: 6) (문헌 [Quan, et al, J Biol Chem (2005) 80:8079-8085]); 전환 성장 인자 β 수용체 I (TGFβRI)의 경우, 5'-GGCCGTTTGTATGTGCACCCTC-3' (정방향 프라이머)(서열 번호: 7) 및 5'-GGGCGATCTAATGAAGGGTCC-3' (역방향 프라이머)(서열 번호: 8) (문헌 [Woszcyk et al, Med Sci Monit (2004) 10:C33-C37]).
BrdU 혼입 분석 : 문헌 [Higashi, et al, J. Lab Clin Med (2005) 145(6):316-322]에 기재되어 있는 바와 같이, 세포 증식 ELISA (독일 만하임 소재의 로셰 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))를 사용하여 BrdU의 HSC 혼입을 측정한다. 간략하면, 서브컨플루언트 HSC를 24h 동안 혈청 기아시킨다. 이어서, DMEM으로 세척하고, NIM811 존재하에 또는 부재하에 10％ FCS를 포함하는 DMEM 중 BrdU와 함께 24h 동안 인큐베이션시킨다. BrdU로 세포를 표지화시킨 후, 세포 DNA를 분해하고, 퍼옥시다제와 접합되어 있는 항-BrdU 항체와 함께 인큐베이션시킨다. BrdU 혼입은 450 nm (여기) 및 690 nm (방출)에서 상등액의 형광 밀도를 측정하여 예측한다.
아포프토시스 분석 : HSC를 24h 동안 무혈청 조건으로 NIM811 존재하에 또는 부재하에 유지시킨다. 세포를 실온에서 30분 동안 4％ 파라포름알데히드/PBS 중에서 고정시키고, 4℃에서 0.2％ 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 PBS 중에서 5분 동안 투과시킨다. 이어서, 세포를 훽스트(Hoechst) 33342로 염색하고, TUNEL 방법에 의해 인 시츄 셀 데쓰 디텍션 키트(In Situ Cell Death Detection Kit) (로셰)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 분석한다. 샘플을 LSM 510 공초점 레이저 주사 현미경 (자이스(Zeiss))으로 시각화한다. 3개의 독립 실험으로부터, 그리고 3개의 상이한 세포 시료로부터 적어도 100개의 세포를 각 조건에 대해 계수한다.
포스포노- 및 비포스포노(nonphospho)-MAPK에 대한 웨스턴 블롯 분석 : 문헌 [Uchimura, et al, Hepatology (2001) 33:91099]에 기재되어 있는 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 실시한다. HSC를 24h 동안 기아시킨 후, 2h 동안 NIM811로 처리하거나, NIM811없이 처리한다. 1 x 107개의 TWNT-4 세포를 함유하는 전 세포 용해물을 100 ㎕ SDS-PAGE 샘플 완충액 중에서 제조한다. 단백질 용해물을 12％ SDS-PAGE시키고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(매사추세츠주 베드퍼드 소재의 밀리포어(Millipore))으로 옮기고, ERK1/2 MAPK, 포스포-ERK1/2 MAPK (Thr202/Tyr204), JNK, 포스포-JNK (Thr183/Tyr185), p38 MAPK, 또는 포스포-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 대한 1차 항체로 프로빙한다. 2차 항체로서 퍼옥시다제 결합 항-토끼 IgG (뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 애머샴 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech))를 사용하여 항체 결합을 검출한다. 항체를 시각화하기 위해 ECL-플러스 (뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 애머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 블롯을 현상시킨다. 광학 스캐너 시스템을 사용하여 밀도측정법에 의해 ERK1/2 MAPK, 인산화된-ERK1/2 MAPK, JNK, 인산화된-JNK, p38 MAPK, 및 인산화된-p38 MAPK의 농도를 정량한다. 비교를 위해 각각 비인산화된 ERK1/2, JNK, 및 p38 MAPK에 대한 인산화된 ERK1/2, JNK, 및 p38 MAPK의 비율을 밀도측정 데이타로부터 계산한다.
포스포- 및 비포스포-Smad2 및 Smad3에 대한 웨스턴 블롯 분석 : MAPK 분석에 대해 상기 기술되어 있는 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 실시하고, Smad2, 포스포-Smad2 (Thr/Tyr), Smad3, 또는 포스포-Smad3 (Thr/Tyr) (매사추세츠주 댄버스 소재의 셀 시그날링 테크놀러지(Cell Signaling Technology))에 대한 1차 항체로 프로빙한다. 비교를 위해 각각 비인산화된 Smad2 및 Smad3에 대한 인산화된 Smad2 및 Smad3의 비율을 밀도측정 데이타로부터 계산한다.
통계학적 분석 : 모든 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 일원 ANOVA를 사용한 후, 이어서 쉐페의 검정(Scheffe's test) 또는 맨-위트니 검정(Mann whitney test)을 사용하여 비교한다.
실시예 1 NIM811이 I형 콜라겐 축적, MMP-1 및 TIMP-1 생산, 및 콜라게나제 활성에 미치는 효과
HSC에 의한 ECM 생산에 NIM811이 미치는 효과를 평가하는 것은 상기 기술된 바와 같이 래트 HSC의 수를 조정한 후, 배양 배지 중의 I형 콜라겐 농도를 측정함 으로써 이루어진다. NIM811 뿐만 아니라, 사이클로스포린의 농도를 증가시키면서 세포를 처리할 경우, 콜라겐 축적은 농도의 의존하는 방식으로 억제된다; 0.5 μM NIM811은 콜라겐 축적을 대략 50％ 만큼 감소시킨다. 이러한 억제는, NIM811 처리가 콜라겐 발현을 억제시키기 때문에 적어도 상류의 전사 수준까지 조절된다. 문헌 [Nakamuta, et al, Transplant Proc (2005) 37:4598-4602]에서 앞서 보고된 바와 같이, 임상적으로 관련된 농도인 0.125 μM (150 ng/ml)의 사이클로스포린은 콜라겐 농도를 대략 50％ 만큼 감소시키는 반면, 임상적으로 관련된 농도인 12.5 nM (10 ng/ml)의 타크로리무스는 콜라겐 생산을 유의적으로 감소시키지 못한다. 콜라겐 생산 속도에 의해 측정하는 것 이외에도, 콜라겐 축적은 콜라게나제 활성, 즉, MMP-1과 TMIP-1 사이의 균형에 의해 조절된다. NIM811은 콜라게나제 활성 (활성 MMP-1) 및 프로-MMP-1 수준을 농도에 의존하는 방식으로 증가시킨다; 0.5 μM NIM811 존재하에서 콜라게나제 활성은 대략 2배 증가한다. 그러나, NIM811은 오히려 2.0 μM 농도에서는 TIMP-1 생산을 유의적으로 감소시키지 못한다.
실시예 2 NIM811이 1형 콜라겐, MMP-1, 및 TIMP-1 유전자 발현에 미치는 효과
NIM811 또는 사이클로스포린이 I형 콜라겐, MMP-1, 및 TIMP-1의 mRNA 수준에 미치는 효과를 평가하기 위하여 본원에 기술되어 있는 바와 같이 RT-PCR을 실시한다. 0.5 μM NIM811 존재하에서 I형 콜라겐 발현은 대략 30％ 만큼 감소한다. 반대로, 0.5 μM NIM811은 MMP-1 발현을 거의 2배 증가시키지만, TIMP-1 발현을 변화시키지는 못했다. 이러한 결과는 NIM811이 유전자 발현에 미치는 효과가 단백질 생산에 미치는 효과와 유사하다는 것을 시사한다.
실시예 3 패수딜이 세포 증식 및 아포프토시스에 미치는 효과
이전 연구에서는 활성화된 HSC가 콜라겐 생산을 자극하는 것 이외에도, 예로서, MMP-1과 같은 간질 콜라게나제에 의해 간질 콜라겐의 분해를 저해한다고 입증된 바 있는데, 이는 기질 분해는 섬유화 진행시 저해된다는 것을 시사한다 (문헌 ([Benyon, et al, Gastroenterology (1996) 110:821-831], [Iredale, et al, Hepatology (1996) 24:17-184], [Iredale, et al, J. Clin Invest (1992) 90:282-287]) 참조). TIMP-1은 기질 분해 저해와는 독립적으로 세포 성장 및 아포프토시스를 조절하는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Murphy, et al, J. Biol Chem (2002) 277:11069-11076] 참조). NIM811은 아포프토시스없이 농도에 의존하는 방식으로 HSC의 세포 성장을 억제시킨다.
NIM811이 세포 증식에 미치는 효과를 조사하기 위하여 본원에 기술되어 있는 바와 같이 BrdU 혼입을 측정한다. 정략 분석을 통해, 2.0 μM보다 낮은 농도의 NIM811 처리는 새로운 DNA 합성을 감소시키지는 않았지만, 2.0 μM NIM811 처리는 새로운 DNA 합성을 거의 30％ 만큼 감소시키는 것으로 나타났다. 추가로, 2 μM NIM811 존재하에서는 어떤 아포프토시스도 관찰되지 않았다. 본 발명자들이 얻은 결과는, NIM이 콜라겐 생산 억제와 콜라게나제 활성 증진을 통해 간 섬유화에 대해 치료학적 효능을 갖고 있다는 것을 시사한다.
실시예 4 NIM811이 MAPK 신호전달 경로에 미치는 효과
어떤 기전에 의해 NIM811이 콜라겐 생산 및 세포 증식을 억제시키고, 콜라게 나제 활성을 증진시키는지를 조사하기 위하여, HSC에서의 콜라겐 생산 및 세포 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로서, 예를 들면, ERK1/2, JNK, 및 p38을 비롯한 MAPK와 같은 세포내 신호전달 캐스캐이드에 NIM811이 미치는 효과 (문헌 [Marr, et al, Hepatology (2000) 1:428-434])를 상기 기술된 바와 같이 평가한다. 농도 0.5 μM의 NIM811은 JNK 및 p38 MAPK의 인산화를 각각 거의 3.6배 및 2.3배 만큼 증진시킨다. NIM811 처리는 농도 방식으로 JNK 및 p38 MAPK의 인산화를 증진시키지만, ERK1/2은 억제시키지는 못한다. 사이클로스포린은 JNK 및 p38에 대한 칼시네우린-의존적 NFAT 경로 및 칼시네우린-독립적 활성화 경로, 이 둘 모두를 통해 그의 면역억제성 효과를 발휘하는 것으로 앞서 입증된 바 있다 (문헌 [Mastuda, et al, EMPO Reports (2000) 1:428-434]). 사이클로스포린의 유사체인 NIM811은 사이클로필린 A에 결합하지 못하기 때문에 NFAT 경로를 활성화시키지 못한다 (문헌 [Waldmeier, et al, MoI Pharmacol, (2002) 62(1):22-29]). JNK 및 p38에 미치는 효과에 있어 NIM811과 사이클로스포린 사이의 다른 효과는 NIM811에는 NFAT 경로가 없다는 것으로부터 유도된다고 볼 수 있다.
실시예 5 NIM811이 TGFβ 신호전달 경로에 미치는 효과
MAPK 이외에도, TGF-β 신호전달 캐스캐이드가 콜라겐 생산 HSC를 강하게 자극한다 (문헌 [Friedman, et al, J Biol Chem (1994) 269:10551-10558]). TGF-β는 세포막 상의 TGFβRII에 결합하고, TGFβRII는 글리신/세린이 풍부한 도메인에 위치하는 세린 및 트레오닌 잔기에서 TGFβRI를 인산화시킨다 (문헌 [Wrana, et al, Cytokine Growth-Factor Rev (2000) 11:5-13]). 인산화된 TGFβRI는 C-말단 SSXS 모티프에서 Smad2 및 Smad3을 인산화시키는데, 이는 공통의 파트너인 Smad4와 복합체를 형성한다. 이들 Smad 단백질은 핵으로 이동하고, 콜라겐과 같은 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다 (상기 동일 문헌). 문헌 [Friedman, et al , J Biol Chem (1994) 269:10551-10558]에 기술된 바와 같이, Smad2 및 Smad3을 통한 TGFβ 신호 캐스캐이드가 I형 콜라겐 유전자의 발현을 강하게 조절하기 때문에 NIM811이 Smad2 및 Smad3의 인산화에 미치는 효과를 평가한다. NIM811 처리가 Smad2 및 Smad3의 인산화를 농도 방식으로 억제시킨다; 0.5 μM NIM811은 Smad2 및 Smad3의 인산화를 각각 거의 70％ 및 60％ 만큼 억제시킨다. Smad7의 발현은 TGFβRII 인산화의 저해에 의해 TGFβ 신호전달 경로를 음성적으로 조절한다 (문헌 [Hayashi, et al, Cell (1997) 1165-1173]). 0.5 μM NIM 811은 Smad7의 발현을 거의 2배로 증진시키고, TGFβRI을 거의 50％ 만큼 억제시킨다. 이러한 결과는 NIM811이 키나제 활성 TGFβRII 및/또는 TGFβRI을 저해시킬 수 있다는 것을 제안한다. Smad7 (상기 동일 문헌), 이뮤노필린 FKBP (FK506-결합 단백질) 12 (40), 및 SARA (수용체 활성화를 위한 Smad 부착물) (41)는 TGFβR와 결합하고, TGFβ 신호전달을 조절한다. NIM811은 Smad7의 발현을 증진시키고, TGFβRI의 발현을 억제시키는데, 이는 NIM811이 적어도 부분적으로 수용체 수준을 차단함으로써 TGFβ 신호전달 경로를 저해한다는 것을 시사한다. 사이클로스포린 또한 Smad2, Smad3, Smad7, 및 TGFβRI에 대해 유사한 효과를 갖는다 (데이타는 공개되어 있지 않다).
앞서 기술된 바와 같이, NIM811 및 사이클로스포린, 둘 모두가 콜라겐 생산 및 세포 증식에 대해서는 유사한 효과를 보였지만, NIM811은 JNK 및 p38에 대해서 사이클로스포린과는 반대되는 효과를 갖는데, 이는 NIM811 및 사이클로스포린이 주로 TGFβ 신호전달 경로를 차단하는, 항-섬유발생 효과를 나타낸다는 것을 제안한다.
사이클로필린은 PPIase 계열로서, 이는 프롤린 잔기에 대한 아미노-말단의 펩티드를 결합의 시스-트랜스 상호전환을 촉매화시킴으로써 단백질 구조의 변화를 촉진시키는 것이다 (문헌 [Waldmeier, 상기 문헌]). 10개 초과의, 사이클로필린 서브타입이 존재하는데, 이들은 전사 조절, 면역 반응, 단백질 분비, 미토콘드리아 기능을 비롯한, 세포 프로세스에 관여한다 (문헌 ([Waldmeier 상기 문헌], [Duina, et al, Science (1996) 274:1713-1715])). 최근, 문헌 [Watashi et al., Hepatology (2003) 38:1282-1288]에서는 NIM811이 시험관내 HCV 복제를 억제시키는 반면, 타크로리무스는 이러한 효과를 나타내지 않는다는 것이 보고되었다. NIM811에는 사이클로필린 A에 결합할 수 있는 능력이 없기 때문에 (14), NIM811은 예로서, 사이클로필린 B 또는 D와 같은 다른 사이클로필린에 결합함으로써 그의 약리적 효과를 발휘하는 것으로 보인다. 특히, NIM811은 HCV RNA 폴리머라제의 기능적 조절 인자인 사이클로필린 B에 결합함으로써 항바이러스 효과를 나타낸다 (문헌 [Watashi, et al, Mol Cell (2005) 19:11 1-122]). NIM811은 미토콘드리아 투과성 전이를 조절하는 사이클로필린 D와의 상호작용에 대한 간섭에 의존하여 세포를 보호하는 성질을 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Waldmeier, et al, Mol Pharmacol (2002) 62:22-29]). 문헌 [Kon et al, Hepatology (2004) 40:1170-1179]에는 NIM811이 배양된 마우스 간세포의 아세트아미노펜-유도성 괴사 및 아포프토시스를 방해하는 것으로 보고되어 있다.
B. 임상 시험
간 섬유화/간경변을 앓는 환자 총 15명이 2주간의 연구에 참여하였다. 각 환자들은 본 발명의 사이클로스포린, 예를 들면, [MeIle]4-사이클로스포린을 7 내지 15 mg/kg의 투여량으로 p.o.로 받았다. 각 환자에서 C형 간염 항원의 혈청 수준을 0일째 및 14일째 측정하였다.
간 섬유화/간경변, 특히, 간 손상을 앓는 인간은 다음 징후 또는 증상 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: (a) 증가된 ALT, (b) 항-HCV 항체에 대한 양성 시험, (c) HCV-RNA에 대한 양성 시험에 의해 증명된 HCV의 존재, (d) 만성 간 질환의 임상 징후, (e) 간세포 손상. 이러한 기준은 간염 간 섬유화/간경변을 진단하는데 이용될 뿐만 아니라, 약물 치료를 위한 환자의 반응을 평가하는데도 사용될 수 있다.
증가된 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)는 비조절성 C형 간염에서 일어나는 것으로 공지되어 있고, 치료에 대한 완전 반응은 일반적으로 이들 혈청 효소, 특히 ALT의 정상화로 정의된다 (문헌 [Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501-1506]). ALT는 간 세포가 파괴될 때 방출되는 효소이고, HCV 감염의 징후이다.
약물 치료에 반응한 대상체에서 HCV 복제 과정을 추적하기 위하여, HCV RNA를, 예를 들어, HCV 게놈의 N53 및 N54의 비-구조 유전자 영역에서 유도된 2 세트의 프라이머를 사용한 네스티드 폴리머라제 연쇄 반응 분석에 의한 혈청 샘플에서 측정할 수 있다. 문헌 ([Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325: 98-104], [Ulrich et al., 1990, J. Clin. Invest., 86: 1609-1614]) 참조.
간 생검 샘플의 조직 검사는 평가에 대한 2차 기준으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Knodell et al., 1981, Hepatology 1: 431-435]을 참조하면, 조직 활성 지수 (문맥 염증, 단편적 또는 가교상 괴사, 소엽 손상 및 섬유화)는 질환 활성에 대한 점수화 방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어 요구되는 1일 투여량은, 예를 들어, 사용되는 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 숙주, 투여 방식, 치료될 병태의 중증도에 따라 달라질 것이다. 바람직한 1일 투여량 범위는 단일 투여 또는 분할 투여로 1일당 약 1 내지 50 mg/kg이다.
환자에게 적합한 1일 투여량은, 예를 들어, 약 1 내지 20 mg/kg p.o 또는 i.v이다. 경구 투여에 적합한 단위 투여 형태는 활성 성분, 예를 들어, [MeIle]4-사이클로스포린 약 0.25 내지 10 mg/kg을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함한다.
본 발명의 사이클로스포린은 임의의 통상적인 경로, 특히 장내, 예를 들어, 음용 용액제, 정제 또는 캡슐제 형태로 경구적으로 또는 주사액제 또는 현탁액제의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 바람직한 약제학적 조성물은, 예를 들면, UK 2,222,770 A에 기술된 바와 같은 미세에멀젼을 기재로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 사이클로스포린은 단독 성분으로서 또는 다른 약물, 예를 들어, 항-HCV 활성을 갖는 약물, 예컨대, 인터페론 (예를 들면, 인트론R(IntronR) A, 로페론R(RoferonR), 아보넥스R(AvonexR), 레비프R(RebifR) 또는 베타페론R(BetaferonR)과 같은 인터페론-α-2a 또는 인터페론-α-2b) 또는 수용성 중합체 또는 인간 알부민에 접합된 인터페론, 예를 들면, 알부페론, 항-바이러스제, 예컨대, 리바비린, 라미부딘, NV08 또는 NM283, NS3/4A 프로테아제, 헬리카제 또는 RNA 폴리머라제와 같은 HCV 코딩 인자의 저해제 또는 상기 억제제의 프로드럭, 항-섬유화제, 예를 들어, N-페닐-2-피리미딘 유도체, 예컨대, 이마티니브, 면역 조절제, 예를 들어, 미코페놀산, 그의 염 또는 프로드럭, 예컨대, 나트륨 미코페놀레이트 또는 미코페놀레이트 모페틸, 또는 S1P 수용체 효현제, 예를 들어, FTY720 또는 임의로 인산화된 그의 유사체 등과 함께 투여될 수 있는데, 이들은, 예를 들어, EP627406A1, EP778263A1, EP1002792A1, WO02/18395, WO02/76995, WO02/06268, JP2002316985, WO03/29184, WO03/29205, WO03/62252 및 WO03/62248에 기재되어 있다.
수용성 중합체와 인터페론의 접합체는 특히 폴리알킬렌 옥시드 동종중합체, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜들, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그의 공중합체 및 이들의 블럭 공중합체에의 접합체를 포함하는 것으로 한다. 폴리알킬렌 옥시드-기재 중합체의 대체물로서, 효과적으로 비-항원성인 물질, 예를 들어 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 카르보하이드레이트-기재 중합체 등을 사용할 수 있다. 상기 인터페론-중합체 접합체는 미국 특허 제4,766,106호, 제4,917,888호, 유럽 특허 공개 공보 제0 236 987호, 유럽 특허 공개 공보 제0 510 356호 및 국제 특허 출원 공보 WO 제95/13090호에 기술되어 있다. 중합체 개질은 항원성 반응을 충분히 감소시키기 때문에, 외래 인터페론은 완전히 자기 유래일 필요가 없다. 중합체 접합체를 제조하기 위해 사용되는 인터페론은 예로서, 인간, 반추 동물 또는 소의 인터페론과 같은 포유동물의 추출물로 제조될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있다. 페길화 인터페론으로도 공지된 폴리에틸렌 글리콜에의 인터페론의 접합체가 바람직하다.
인터페론의 특히 바람직한 접합체는 페길화 알파-인터페론, 예를 들어 페길화 인터페론-α-2a, 페길화 인터페론-α-2b이고; 페길화 컨센서스 인터페론 또는 페길화 정제 인터페론-α 생성물이다. 페길화 인터페론-α-2a는, 예를 들어 유럽 특허 제593,868호에 기술되어 있고, 상품명 페가수스(PEGASUS) (호프만-라 로셰(Hoffmann-La Roche))로서 시판되고 있다. 페길화 인터페론-α-2b는, 예를 들어 유럽 특허 제975,369호에 기술되어 있고, 상품명 페그-인트론 안(PEG-INTRON An) (쉐링 플로(Schering Plough))로서 시판되고 있다. 페길화 컨센서스 인터페론은 WO 96/11953에 기술되어 있다. 바람직한 페길화 α-인터페론은 페길화 인터페론-α-2a 및 페길화 인터페론-α-2b이다. 또한, 페길화 컨센서스 인터페론이 바람직하다.
사용된 공동-작용제에 대한 1일 투여량은, 예를 들어 사용되는 화합물, 숙주, 투여 방식 및 치료될 병태의 중증도에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 라미부딘은 100 mg의 1일 투여량으로 투여될 수 있다.
페길화 인터페론은 2 내지 10 백만 IU 범위의 총 1주 투여량으로, 더 바람직 하게는 5 내지 10 백만 IU, 가장 바람직하게는 8 내지 10 백만 IU의 1주 1회 내지 3회, 바람직하게는 1주 1회 비경구 투여될 수 있다.
상기에 따르면, 본 발명은 이외의 추가의 측면을 제공한다:
4. 예를 들어, 상기에 정의한 바와 같은 임의의 방법에서 사용하기 위한, a) 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어, 화학식 (I), 화학식 (Ia) 및 화학식 (II)의 화합물인 제1 작용제 및 b) 공동-작용제, 예를 들어, 상기에 정의한 바와 같은 제2 약물 작용제를 포함하는 약제학적 조합물.
5. 치료학적 유효량의 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린, 예를 들어 화학식 (I), 화학식 (Ia) 및 화학식 (II)의 화합물, 및 공동-작용제, 예를 들어, 상기에 정의한 바와 같은 제2 약물 작용제를 예를 들면, 동시에 또는 순차적으로 공동-투여하는 것을 포함하는 상기에 정의한 바와 같은 방법.
본원에서 사용된 용어 "공동-투여" 또는 "조합 투여" 등은 한 환자에게 선택된 치료제의 투여를 포함하는 것으로 하고, 작용제가 필수적으로 동일한 투여 경로 또는 동시 투여로 투여되지는 않는 치료 요법을 포함하는 것으로 한다.
본 발명의 약제학적 조합물의 투여는 그의 약제학적 활성 성분 중 단지 하나만 적용시키는 단독요법과 비교하여 유익한 효과, 예를 들어, 상승작용적 치료 효과를 가져온다. 바람직한 상승작용적 조합물은 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린과 중합체에 임의로 접합된 인터페론의 조합물이다.
추가의 바람직한 조합물은 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린과의 미코페놀산, 그의 염 또는 프로드럭, 또는 FTY720과 같은 S1P 수용체 효현제 의 조합물이다.
[MeIle]4-사이클로스포린 또는 [MeVal]4-사이클로스포린은 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 비면역억제성 사이클로필린-결합 사이클로스포린이다.

Claims (12)

  1. 간 질환과 관련된 병태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조에서, (i) 경쟁적 ELISA 시험에서 측정된 사이클로스포린의 IC50 대 사이클로스포린 A의 동시 시험에서의 IC50의 비에 대한 상용 로그값인 결합비(BR)가 0.7 미만인 값으로 인간 재조합 사이클로필린에 결합하며; (ii) 혼합 림프구 반응에서의 활성이 사이클로스포린 A의 활성의 5％ 이하인 사이클로스포린의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 간 질환을 억제하기 위한 약제학적 조성물의 제조에서의 사이클로스포린의 용도.
  3. 제1항에 있어서, 이식 수혜자에 있어 간 질환의 재발을 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조에서 사이클로스포린의 용도.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 사이클로스포린이 하기 화학식 (I)의 화합물, 하기 화학식 (Ia)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 용도.
    <화학식 I>
    Figure 112009028006751-PCT00008
    (상기 식에서,
    W는 MeBmt, 디하이드로-MeBmt, 8'-하이드록시-MeBmt 또는 O-아세틸-MeBmt1이고;
    X는 αAbU, Val, Thr, Nva 또는 O-메틸 트레오닌(MeOThr)이고;
    R은 Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla, 또는 (D)-MeSer(O아세틸)이고;
    Y는 MeLeu, 티오MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle 또는 MeaThr; N-에틸Val, N-에틸Ile, N-에틸Thr, N-에틸Phe, N-에틸Tyr 또는 N-에틸Thr(O아세틸)이고;
    Z는 Val, Leu, MeVal 또는 MeLeu이고;
    Q는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeAla 또는 Pro이고;
    T1은 (D)Ala 또는 Lys이고;
    T2는 MeLeu 또는 γ-하이드록시-MeLeu이고;
    T3은 MeLeu 또는 MeAla임);
    <화학식 Ia>
    Figure 112009028006751-PCT00009
    (상기 식에서,
    W'는 MeBmt, 디하이드로-MeBmt 또는 8'-하이드록시-MeBmt이고;
    X는 αAbu, Val, Thr, Nva 또는 O-메틸 트레오닌(MeOThr)이고;
    R'은 Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla, 또는 (D)-MeSer(O아세틸)이고;
    Y'는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle 또는 MeaThr; N-에틸Val, N-에틸Ile, N-에틸Thr, N-에틸Phe, N-에틸Tyr 또는 N-에틸Thr(O아세틸)이고;
    Z는 Val, Leu, MeVal 또는 MeLeu이고;
    Q'는 MeLeu, γ-하이드록시-MeLeu 또는 MeAla임);
    <화학식 II>
    Figure 112009028006751-PCT00010
    [상기 식에서,
    Wa는
    Figure 112009028006751-PCT00011
    (여기서, Ra는 하기 화학식 (Ic):
    Figure 112009028006751-PCT00012
    또는 하기 화학식 (Id):
    Figure 112009028006751-PCT00013
    의 잔기이고,
    여기서, R4는 C1-4알킬티오, 아미노C1-4알킬티오, C1-4알킬아미노C1-4알킬티오, 디C1-4알킬아미노-C1-4알킬티오, 피리미디닐티오, 티아졸릴티오, N-C1-4알킬이미다졸릴티오, 하이드록시C1-4알킬페닐티오, 하이드록시C1-4알킬페녹시, 니트로페닐아미노 또는 2-옥소피리미딘-1-일이고, R'4는 C1-4알킬임)이고;
    Xa는 Abu이고;
    Ra는 -NMe-CH(Rb)-CO-이고, 여기서, Rb는 H 또는 -S-Alk-R0이고, 여기서, Alk-R0는 메틸이거나; 또는 Alk는 직쇄 또는 분지형 C2-6알킬렌 또는 C3-6사이클로알킬렌이고, R0은 H; OH; COOH; C2-5알콕시 카르보닐; NR1R2 (여기서, 각각의 R1과 R2는 독립적으로 H, C1-4알킬, C2-4알케닐, C3-6사이클로알킬, 및 페닐 (각각 할로겐, C1-4알콕시, C2-5알콕시카르보닐, 아미노, C1-4알킬아미노 및/또는 디C1-4알킬-아미노로 임의로 치환됨), 및 벤질 및 헤테로사이클릭 라디칼 (상기 벤질 및 헤테로사이클릭 라디칼은 포화 또는 불포화되어 있고, 5 내지 6개의 고리원 및 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다)로부터 선택되거나, 또는 R1 및 R2는 그들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 또다른 헤테로원자를 함유할 수 있고 C1-4알킬, 페닐 또는 벤질에 의해 임의로 치환되는 4 내지 6원 헤테로사이클을 형성하거나; 또는 각각의 R1과 R2는 독립적으로 하기 화학식 (Ib):
    Figure 112009028006751-PCT00014
    (여기서, R1 및 R2는 상기에 정의한 바와 같고, R3은 H 또는 C1-4알킬이고, n은 2 내지 4 범위의 정수이다)의 라디칼이고;
    Ya는 MeLeu 또는 γ-하이드록시-MeLeu이고;
    Za는 Val이고;
    Qa는 MeLeu이되, 단, Ya가 MeLeu인 경우에 Rb는 H가 아니다].
  5. 제1항에 따른 사이클로스포린을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석 제 또는 담체와 함께 포함하는, 간 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. a) 제1항에 따른 사이클로스포린인 제1 작용제 및 b) 항-섬유발생 특성을 갖는 공동-작용제를 포함하는 약제학적 조합물.
  7. a) 제1항에 따른 사이클로스포린인 제1 작용제 및 b) 항-HCV 특성을 갖는 작용제, 항-섬유화제, 면역 조절제 또는 S1P 수용체 효현제-17로부터 선택된 공동-작용제를 포함하는, 간경변의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조합물.
  8. 치료학적 유효량의 제1항에 따른 사이클로스포린을 간 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 간 질환의 예방 또는 치료 방법.
  9. 유효량의 제1항에 따른 사이클로스포린을 매개체에 적용시키는 것을 포함하는, 상기 매개체에서의 HSC 성장 억제 방법.
  10. 치료학적 유효량의 제1항에 따른 사이클로스포린을 간 질환 억제가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 간 질환 억제 방법.
  11. 치료학적 유효량의 제1항에 따른 사이클로스포린을 간 질환 재발 예방이 필 요한 이식 수혜자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 수혜자에서의 간 질환 재발 예방 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 유효량의 제1항에서 정의한 바와 같은 사이클로스포린, 및 항-HCV 특성을 갖는 작용제, 항-섬유화제, 면역 조절제 또는 S1P 수용체 효현제로부터 선택된 공동-작용제를 동시에 또는 순차적으로 공동-투여하는 것을 포함하는 방법.
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