이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
"훈자수"라고도 불리우는 히말라야 빙하수는 물에 나노사이즈의 실리카가 콜로이드를 형성하고 있는 특이한 구조를 가지고 있고, 표면장력이 낮은 특징을 가지고 있어서 활성성분이 인체나 피부에 흡수되는 것을 용이하게 한다. 또한 히말라야 빙하수는 많은 양의 수소를 가두어 둘 수 있는 반구형 돔과 비슷한 새장 모양의 물 분자구조 내부에 갇힐 수 있는 구조로 되어 있으며, 이러한 물 분자들은 높은 제타 포텐셜을 갖는 소량의 콜로이드 무기화합물 입자들을 갖고 있다. 이 때 형성되는 물 분자의 모양은 생체조직에서 발견되는 물 분자의 모양과 상당히 닮은 모습을 보이는데, 일반적인 광천수나 수돗물에서 발견되는 물 분자의 모습과는 많이 다르다고 알려져 있다.
본 발명에서는 상기 빙하수를 이용하는 용매추출법을 제공한다. 본 발명에 의한 빙하수를 이용하는 용매추출법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 활성성분에 빙하수를 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하는 공정을 2회 이상 반복한 다음 이를 여과한 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 1차 수득물을 얻는 단계; 및
2) 상기 수득물에 다시 빙하수를 가하고 상온에서 2시간 이상 교반한 후 충분히 세척하고 여과한 다음 진공오븐에서 건조하여 추출물을 얻는 단계.
본 발명에서 사용하는 빙하수는 그 자체가 얼음이 녹아 물이 되면서 화강암, 자갈 및 미립자 등의 자연여과장치를 거치게 되며, 여과된 빙하수를 수 킬로미터 지하에서 뽑아내 지하 깊숙이 자리 잡은 대수층은 자연적 보호장치인 화강암층에 의하여 어떠한 물질에도 오염이 되지 않는 자연적인 여과를 통하여 얻어진 것으로 빙하수는 사전 여과가 되어 있는 상태이다. 따라서 종래의 유기용매를 사용한 용매추출법에서 1차 수득물을 유기용매로 층 분리하는 과정을 거치는 것과 달리 본 발명에 의한 빙하수를 이용하는 용매추출법에서는 여과하는 절차가 매우 간소화되어 추출물 수득이 용이한 것이 특징이다.
상기 빙하수를 이용한 용매추출법은 유효 미네랄 성분인 나트륨, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨 이외에도 아연, 구리, 바나듐 및 망간 등을 함유하는 빙하수를 바탕으로 한 미네랄의 빠른 피부 흡수력과 미생물이나 병원균이 번식하기 힘든 빙하수의 독소 제거 작용으로 인한 정화 작용을 장점으로 하기 때문에, 사용자의 피부타입에 상관없이 사용이 가능하며 나아가서는 유아 또는 아토피 등의 피부트러블이 있는 사람도 안심하고 사용할 수 있는 화장료용 조성물을 제공하는 것을 그 특징으 로 한다.
본 발명에 의한 용매추출법으로 추출할 수 있는 활성성분은 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는 베타-1,3-글루칸, 파파인 효소, 폴리페놀, 사포닌, 아데노신, 비타민C(ascorbic acid), 알부틴(arbutin), 니아신아미드(niacinamide) 및 아세틸글루코사민(acetylglucosamine) 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 용매추출법으로 추출한 베타-1,3-글루칸은 특히, 치마버섯(Schizopyllum commune) 균사체를 배양하여 얻은 순도 98% 이상의 고순도의 글루칸을 추출할 수 있으며, 이것은 피부 노화 방지, 손상된 피부치유 효과가 있다. 치마버섯 이외에도 영지버섯, 신령버섯, 표고버섯, 균핵균, 효모 및 보리 등으로부터 본 발명에 의한 빙하수를 이용한 용매추출법을 통하여 베타-1,3-글루칸을 획득할 수 있다.
또한 상기 활성성분 중 파파인 효소는 파파야의 과실 또는 나무로부터 추출할 수 있으며, 폴리페놀은 녹차, 커피, 딸기, 가지, 포도, 팥 등의 붉은 색이나 자색의 안토시아닌계 색소, 적포도주, 검은콩 또는 카카오로부터 추출할 수 있다.
사포닌은 콩, 인삼 또는 마로부터 추출할 수 있고, 아데노신은 돌미나리 등의 식물체로부터 추출할 수 있으며, 비타민 C(아스코르빈산)는 복분자, 감잎, 로즈힙, 자몽 또는 피망으로부터 추출할 수 있고, 알부틴은 월귤나무로부터 추출할 수 있으며, 니아신아미드는 감자 또는 아보카도로부터 추출할 수 있고, 아세틸글루코사민은 황벽나무(Phellodendron amurense RUPR)와 황피수(Phellodendron chinense SCHNEID)의 수피를 건조한 약재인 황백으로부터 추출할 수 있다.
또한 본 발명에서는 상기 빙하수를 이용하여 추출한 추출물(활성성분)에 나노유화기술을 적용하여 미세한 유화입자 또는 리포좀 내로 포집시킬 수 있으며, 이러한 과정을 통하여 빙하수에 포함되어 있던 미네랄의 경피흡수율을 높여줄 수 있게 된다. 상기 빙하수를 이용하여 추출한 추출물은 유화입자 또는 리포좀 총 중량에 대하여 0.001∼50 중량%의 양으로 함유된다. 추출물 함량이 0.001 중량% 미만일 경우는 제형 내에서 활성성분이 효과를 발휘하기 어려운 문제가 있고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 제형화가 어려운 문제가 있다. 본 발명에서는 나노유화기술로서 500∼1000bar의 압력에서 당업계에 잘 알려진 통상적인 고압유화방법을 사용하여 상기 추출물을 함유한 나노 유화 입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 유화입자는 그 입경이 1000nm 내지 30nm 정도이고, 바람직하게는 300nm 내지 50nm 정도가 적당하다. 본 발명의 나노 유화 입자 또는 리포좀은 피부와의 접촉면적이 상대적으로 증가함으로써 경피흡수 가능 면적도 증가하게 된다. 또한, 본 발명에 의한 유화입자는 피부 각질층의 세포간 지질 사이의 틈이 약 50nm 내외라는 점과 유화입자의 유화막이 유연성을 가진다는 점을 감안하여 세포간 지질 내로의 흡수 및 확산이 용이하도록 하였다. 즉, 나노유화기술에 의하여 제조된 평균입경 300nm 내지 50nm의 유화입자는 피부와의 접촉면적의 증가; 세포간 지질로의 침투 및 확산; 및 빙하수 용매추출법으로 추출된 추출물이라는 세가지 경로를 통해, 유화입자 자체 및 유화입자 내부의 추출물의 경피흡수율을 높여주게 된다.
한편, 본 발명에 의한 유화 입자는 상기 추출물과 함께 유화제로서 레시틴을 더 함유할 수 있으며, 상기 레시틴의 함량은 유화 입자 총 중량에 대하여 0.5∼5 중량%, 바람직하게는 2∼4 중량%이다. 상기 레시틴의 함량은 화장료 조성물을 제형화하는데 있어서 안정한 제형을 만들 수 있는 유효량이다. 상기 레시틴의 구성성분은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 라이조포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine) 및 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 등의 불포화 콜린계 화합물 및 이들의 수소첨가물 형태를 포함하고 있다.
또한, 본 발명에 의한 유화입자는 보조유화제로서 다양한 비이온성 계면활성제를 폭 넓게 사용할 수 있고, 바람직하게는 지방알콜 혼합형 계면활성제 또는 고분자형 계면활성제를 포함한다. 상기 보조유화제의 함량은 사용되는 레시틴의 중량 및 구성성분에 따라 레시틴 중량 대비 0.1∼5배, 바람직하게는 0.5∼2배의 비율로 사용한다.
또한 본 발명에서는 상기 빙하수를 이용하여 추출한 추출물을 포집한 유화 입자 또는 리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유화입자 또는 리포좀을 0.001∼50 중량%로 함유한다. 상기 유화입자 또는 리포좀 함량이 0.001 중량% 미만일 경우는 제형 내에서 활성성분이 효과를 발휘하기 어려운 문제가 있고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 제형화가 어려운 문제가 있다.
본 발명에 의한 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센 스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이크업 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 바디 세정제, 치약 및 구강청정액 등으로 제형화될 수 있으며, 피부 미백용 화장료 또는 연고 및 패치 등의 의약품으로 제형화될 수도 있다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 빙하수를 이용하여 베타-1,3-글루칸 추출물 제조
건조된 치마버섯 균사체 1kg에 히말라야 빙하수 4L를 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하였다. 위 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 수득물 400g을 얻었다. 수득물 400g에 빙하수 1L를 가하고 상온에서 2시간 이상 교반한 다음 충분히 세척하고 여과한 후 여과물을 진공오븐에서 치마버섯(Schizophyllum commune)이 70% 이상 함유된 베타-1,3-글루칸 추출물 약 30g을 건조하여 원하는 추출물을 얻었다.
[비교예 1]
건조된 치마버섯 균사체 1kg에 에탄올 4L를 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하는 공정을 2회 이상 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 1차 수득물 400g을 얻었다. 상기 수득물에 물 과 에탄올을 각각 1L씩 가하고 상온에서 2시간 이상 교반한 후 정치하여 층 분리시킨 다음 물 층을 제거한 후 에탄올 1L를 추가로 첨가하였다. 위의 공정을 2회 이상 반복하여 충분히 세척하고 여과한 다음 여과물을 진공오븐에서 건조하여 베타-1,3-글루칸 추출물을 얻었다.
[실시예 2] 나노유화입자 제조
수첨레시틴 4g, PEG-5 레이프씨드(rapeseed) 스테롤 4g, 폴리에틸렌글리콜 5g 및 펜틸렌글리콜 5g을 혼합한 후 실시예 1에서 제조한 베타-1,3-글루칸 추출물 1g을 에탄올 10g에 용해한 용액을 상기 혼합액에 넣고 70∼75℃까지 가열하여 완전히 용해한 다음, 이를 미리 가열된 수상파트(증류수 65.95g, 글리세린 5g 및 EDTA 0.05g)와 혼합하여 일반 호모믹서로 선-유화시키고(3분간, 3,000∼6,000rpm), 고압유화기를 사용하여 800Bar/3cycles 로 유화하였다.
[비교예 2]
수첨레시틴 4g, PEG-5 레이프씨드(rapeseed) 스테롤 4g, 폴리에틸렌글리콜 5g, 펜틸렌글리콜 5g 및 에탄올 10g을 70∼75℃까지 가열하여 완전히 용해한 다음, 미리 가열된 수상파트(증류수 66.95g, 글리세린 5 및 EDTA 0.05g)와 혼합하여 일반 호모믹서로 선-유화시키고(3분간, 3,000∼6,000rpm), 고압유화기를 사용하여 800Bar/3cycles 로 유화하였다.
[비교예 3]
상기 실시예 1에서 제조한 베타-1,3-글루칸 추출물 대신에 비교예 1에서 제조한 베타-1,3-글루칸 추출물을 사용한 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
[시험예 1] 인간 피부세포에 대한 콜라겐 생합성 효능
인간 섬유아세포를 24공 평판배양기에서 배양한 다음 하기 표 2에 기재된 농도를 갖는 각각의 조성물을 포함하는 배지로 교체하여 3일간 배양하고 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지를 각 웰당 0.5㎖씩 첨가한 후 L[2, 3, 4, 5-3H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다. 24시간 경과 후, 각 웰에 들어있는 배지와 세포들을 긁어모아 5% 트리클로로아세트산(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후, 각각 2개의 시험관에 분주하고 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1 유닛/㎕를 넣고 37℃에서 90분간 배양하였으며 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그 후, 모든 시험관에 50% 트리클로로아세트산을 0.05㎖씩 첨가하고 4에서 20분간 방치한 다음 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 씨피엠(CPM; counts per minute) 값을 얻어, 하기 수학식 1에 의거하여 대조군과 실험군에 대해 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하였다. 그 결과는 대조군을 100으로 하여 비교치를 구한 다음 하기 표 1에 나타내었다.
RCB=[콜라겐 CPM/{(전체 콜라겐-콜라겐 CPM)×5.4 + 콜라겐 CPM}]×100
경과시간에 따른 콜라겐 생합성 비율(RCB)(%)
농도(ppm) |
대조군 |
실시예 1 |
실시예 2 |
10 |
100 |
120 |
106 |
1 |
100 |
105 |
101 |
상기 표 1의 결과로부터, 히말라야 빙하수로 추출한 베타-1,3-글루칸 추출물을 나노유화기술을 이용하여 제조할 경우 콜라겐 생합성을 농도 의존적으로 증가시킴을 알 수 있다.
[제형예 1 및 비교제형예 1∼3]
하기 표 2에 나타낸 바와 같이 제형예 1 및 비교제형예 1∼3의 영양화장수를 제조하였다.
조성 |
제형예 1 |
비교제형예 1 |
비교제형예 2 |
비교제형예 3 |
실시예 2 |
10.0 |
- |
- |
- |
비교예 2 |
- |
10.0 |
- |
- |
비교예 3 |
- |
- |
10.0 |
- |
세틸에틸헥사노에이트 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
세토스테아릴알콜 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
친유형모노스테아린산 스테아레이트 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
스쿠알란 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
폴리에틸렌글리콜 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
방부제 |
미량 |
미량 |
미량 |
미량 |
색소 |
미량 |
미량 |
미량 |
미량 |
향료 |
미량 |
미량 |
미량 |
미량 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
[시험예 2] 동물에서의 콜라겐 생합성 효능
본 발명에 따른 빙하수로 추출한 베타-1,3-글루칸을 첨가하였을 때 피부 콜라겐 생합성 효능 증진 여부를 확인하기 위하여 무모생쥐의 등 부위에 상기 제형예 1 및 비교제형예 1∼3의 조성을 갖는 영양화장수를 일주일 동안 도포한 후 생검하여 콜라겐 면역조직염색을 실시하였다. 그 결과는 비처리군인 비교제형예 3을 100으로 한 비교치로 구하여 표 3에 나타내었다.
시험 물질 |
콜라겐 생합성(%) |
제형예 1 |
135 |
비교제형예 1 |
105 |
비교제형예 2 |
128 |
비교제형예 3 |
100 |
상기 표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 제형예 1을 도포한 군이 비교 제형예 1∼2를 도포한 군보다 각각 28.6% 및 5.5% 정도 콜라겐 생합성이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통하여, 본 발명은 히말라야 빙하수를 이용한 베타-1,3-글루칸 추출물을 사용하였을 때 경피흡수율을 높여서 콜라겐 생합성 효과가 증가함을 확인하였다.
[시험예 3] 인체에서의 피부 탄력 개선 효과 측정
상기 표 2에서 제조한 영양화장수의 피부 탄력 개선 효과를 측정하였다. 온도 24∼26℃, 습도 75% 조건에서 30세 이상의 건강한 여성 20명을 2개 군으로 나누고, 각 군 여성의 안면에 제형예 1과 비교제형예 2의 화장수를 매일 2회씩 12주간 도포한 후 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다.
그 결과는 Cutometer SEM 575의 R8[R8(왼쪽)-R8(오른쪽)] 값으로 구하여 하기 표 4에 나타내었다. 상기 R8값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.
시험물질 |
피부탄력 효과 |
제형예 1 |
0.33 |
비교제형예 2 |
0.10 |
상기 표 4의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 가 함유된 제형예 1의 물질을 도포한 군은 비교제형예 2를 도포한 군에 비해 피부 탄력성이 더 증가하였다.
이와 별도로, 시험을 종료한 시점에 시험 대상자들로 하여금 설문지를 작성하게 하여 기기적인 평가와 동시에 주관적인 효능 평가도 실시하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
도포군 |
응답자 수 (인) |
매우 양호 |
양호 |
보통 |
미흡 |
제형예 1 |
3 |
6 |
1 |
0 |
비교제형예 2 |
1 |
3 |
3 |
3 |
또한, 설문조사를 통해서도 본 발명에 따른 히말라야 빙하수 용매추출법으로 추출한 베타-1,3-글루칸 추출물을 함유한 제형예 1을 도포한 경우 피부탄력성이 개선됨을 확인할 수 있었다.