KR20090053921A

KR20090053921A - 티오펜 피라졸로피리미딘 화합물

Info

Publication number: KR20090053921A
Application number: KR1020097005694A
Authority: KR
Inventors: 자오겐 첸; 차피크 함도우치 함도우치; 에릭 제임스 헴브레; 필립 아써 힙스킨드; 샤오쥬안 지아; 제임스 리 토쓰
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2009-05-28
Also published as: EA200970302A1; JP2010504343A; US20100022560A1; KR101088196B1; AU2007297481B2; CN101516886B; MX2009003098A; ES2428543T3; AU2007297481A1; WO2008036541A1; US8110580B2; EP2076515A1; EA016056B1; JP5184536B2; CN101516886A; CA2662000C; CA2662000A1; EP2076515B1; BRPI0717070A2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 그의 제약 조성물, 및 정신의학 및 신경내분비 장애, 신경계 질환 및 대사 증후군의 치료에 있어서 코르티코트로핀 방출 인자 1 (CRF1) 수용체 길항제로서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다:

<화학식 I>

.

코르티코트로핀 방출 인자 1 수용체 길항제, CRF1, 정신의학 장애, 신경내분비 장애, 신경계 질환, 대사 증후군

Description

티오펜 피라졸로피리미딘 화합물 {THIOPHENE PYRAZOLOPYRIMIDINE COMPOUNDS}

본 발명은 신규한 티오펜 피라졸로피리미딘 화합물, 그의 제약 조성물, 및 정신의학 및 신경내분비 장애, 신경계 질환 및 대사 증후군의 치료에 있어서 CRF1 수용체 길항제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

코르티코트로핀 방출 인자 (CRF)는 뇌하수체 전엽으로부터의 프로오피오멜라노코르틴 (POMC) 유래의 펩티드 분비에 대한 주요 생리적 조절자인 41개 아미노산 펩티드이다. CRF의 면역조직화학적 국소화는, CRF의 뇌하수체 전엽에서의 내분비 역할 이외에도 상기 호르몬이 중추 신경계에서 폭넓은 시상하부외 분포를 가지며 뇌에서 신경전달물질 또는 신경조절물질의 역할과 일치하는 광범위한 스펙트럼의 자율적, 전기생리적 및 거동적 효과를 나타낸다는 것이 입증된 바 있다. 또한, CRF가 면역계에서 생리적, 심리적 및 면역학적 스트레스 인자에 대한 반응을 통합하는데 유의한 역할을 수행한다는 증거가 있다.

CRF는 우울증 및 불안증, 및 또한 하기 상태를 포함하는 정신의학 장애 및 신경계 질환과 관련이 있다: 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 진행성 핵상 마비, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 간질, 편두통, 알콜 및 물질 남용 및 관련 금단 증상, 비 만, 대사 증후군, 선천성 부신 과형성, 쿠싱병, 고혈압, 졸중. 과민성 대장 증후군, 스트레스-유도된 위 궤양화, 월경전 증후군, 성 기능장애, 조산, 염증 장애, 알러지, 다발성 경화증, 내장통, 수면 장애, 뇌하수체 종양 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양, 만성 피로 증후군 및 근섬유통(fibromyalgia).

CRF 수용체 아형인 CRF1 및 CRF2가 동정된 바 있고, 이것들은 뇌에서 불균일하게 분포되어 잠재적인 기능적 다양성을 암시한다. 예를 들어, 폭넓게 분포된 뇌 CRF1 수용체는 환경적인 스트레스 인자에 노출될 때 수반되는 정서와 밀접한 관련이 있다. 유의하게, CRF1 수용체는 선택적인 불안유발(anxiogenic) 유사 거동을 매개한다고 여겨지지만 CRF2 수용체는 그렇지 않다. 보다 불연속적인 중격/시상하부 분포 및 별법의 내인성 리간드의 이용가능성은 CRF2 수용체의 다양한 기능적 역할을 암시한다. 예를 들어, CRF1 수용체보다 CRF2에 우선적인 친화성을 갖는 신규의 CRF-부류 신경펩티드가, 선택적 CRF1 작동시에 관찰되는 거동 활성화의 프로파일을 생성하지 않으면서 식욕을 저해한다는 것이 보고되었다. 다른 사례에서는, CRF2 작동이 CRF1 길항제 또는 CRF1 유전자 결실에 대해 보고된 것과 유사한 효과를 생성한다. 예를 들어, CRF2 효능제는 항-비만제로 제안되었고, CRF1 길항제 역시 중요한 비만 치료제일 수 있다.

CRF 길항제로서 유용한 특정의 피롤로[2,3-d]피리미딘, 피롤로[3,2-d]피리미딘, 피라졸로[1,5-a]피리미딘, 1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘 및 피라졸로[1,5-a]-1,3,5-트리아진은 WO 94/13676, WO 97/29109, WO 98/08847 및 WO 98/03510에 기재되어 있다.

본 발명은 CRF1 수용체 길항제로서 유용한 신규 티오펜 피라졸로피리미딘을 제공한다. 이러한 견지에서, 정신의학 및 신경내분비 장애, 신경계 질환 및 대사 증후군 치료에 있어서 잠재적으로 가치있는 치료제로서 CRF1의 효능있고 선택적인 신규 길항제를 찾아내는 것이 바람직하다. 추가로, 대다수의 시판되는 CNS 및 심혈관계 약물이 바람직하지 못한 생체이용률 프로파일을 나타내고 있기 때문에, CP154526 및 NBI30775와 같은 공지의 CRF 길항제에 비해 생체이용률 프로파일이 우수한 신규 화합물을 찾아내는 것도 바람직하다.

발명의 요약

한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다:

상기 식에서,

R¹ 및 R²는 독립적으로 수소 또는 C₁-C₃알킬이고,

R³은

이고,

R⁴는 Cl 또는 메틸이고,

R⁵는 수소, Br, 니트로, 메톡시, 메톡시메틸, 디메틸아미노, 에톡시카르보닐, 아세트아미도, 아세톡시,

이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 우울증 또는 주요 우울 장애, 불안증, 알콜 또는 물질 남용, 비만, 고혈압, 대사 증후군, 과민성 대장 증후군, 간질, 졸중, 수면 장애, 알러지, 편두통, 월경전 증후군 (PMS), 불임, 성 기능장애, 선천성 부신 과형성, 쿠싱병, 조산, 스트레스-유도된 위 궤양화, 염증 장애, 뇌하수체 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양, 만성 피로 증후군, 근섬유통, 내장통 또는 다발성 경화증의 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기한 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 우울증 또는 주요 우울 장애, 불안증, 알콜 또는 물질 남용, 비만, 고혈압, 대사 증후군, 과민성 대장 증후군, 간질, 졸중, 수면 장애, 알러지, 편두통, 월경전 증후군 (PMS), 불임, 성 기능장애, 선천성 부신 과형성, 쿠싱병, 조산, 스트레스-유도된 위 궤양화, 염증 장애, 뇌하수체 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양, 만성 피로 증후군, 근섬유통, 내장통 또는 다발성 경화증의 치료용 약제의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.

상기 및 본 발명의 기재 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 나타내지 않는다면 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다:

"알킬"은 쇄 내에 1개 내지 5개의 탄소 원자를 가지며 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 포화 지방족 탄화수소기를 의미한다.

"제약상 허용가능한 부형제"는 제제 특성을 향상시키기 위한 제약상 허용가능한 제제 담체, 용액 또는 첨가제를 지칭한다. 이러한 부형제는 해당 제제의 다른 성분과 상용가능해야 하고, 이의 수용자에게 해롭지 않아야 하며, 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19^th Edition, Mack Publishing Company, 1995] 참조).

"제약상 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비-독성의 무기 및 유기 산 부가 염 및 염기 부가 염을 지칭한다. 이들 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안에 계내(in situ) 제조될 수 있다. 특히, 산 부가 염은 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기 산 또는 무기 산과 따로 반응시키고, 이로써 형성된 염을 단리하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19^th Edition, Mack Publishing Company, 1995] 참조).

"치료 유효량" 또는 "유효량"은 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 조사자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 알아볼 수 있는 생물학적 또는 의학적 반응 또는 원하는 치료 효과를 유발하는 본 발명의 화학식 I의 화합물의 양 또는 본 발명의 화학식 I의 화합물을 함유하는 제약 조성물의 양을 의미한다.

용어 "치료", "치료하다", "치료하는" 등은 장애의 진행을 느리게 하고 역전시키는 것을 둘다 포함하는 의미이다. 이들 용어는 또한 장애 또는 상태가 실제로 없어지는 것도 아니고 상기 장애 또는 상태의 진행이 그 자체가 느려지거나 역전되는 것이 아니라 하더라도 상기 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 완화시키거나 감쇠시키거나 없애거나 감소시키는 것을 포함한다. 용어 "치료" 등의 용어는 또한 방지적 (예를 들어 예방적) 및 완화적 치료를 포함한다. 질환의 방지는 그 질환의 증상 발현이 연기되거나 지연되어 나타난다.

분자 구조에서의 부호 "

"는 특정 치환체에 대한 부착 위치를 나타낸다.

임의의 변수가 임의의 구성요소 또는 화학식 I에서 1회 초과로 나타나는 경우, 각 경우에서의 그의 정의는 모든 다른 경우에서의 정의와 무관하다. 또한, 치환체 및/또는 변수의 조합은 그러한 조합으로 안정적인 화합물이 생성되는 경우에만 허용가능하다. 본 발명의 화합물을 선택하는데 있어서, 당업자는 다양한 치환체, 즉 R¹, R² 등이 화학 구조 연결성에 대해 공지된 원리에 따라 선택된다는 것을 알 것이다.

본 개시내용 전반에 걸쳐서 사용되는 표준 명명법에서, 명시된 측쇄의 말단 부분이 먼저 기재되고 부착 지점쪽에 인접한 관능기가 뒤에 기재된다. 예를 들어, 아릴카르보닐아미노알킬 치환체는 아릴-C(O)-NH-알킬-과 동등하다.

본 발명은 예를 들어 다음과 같이 본 발명의 특정 부류를 고려한다:

(a) R¹ 및 R²가 독립적으로 에틸 또는 n-프로필인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(b) R³이

인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(c) R⁵가 메톡시, 메톡시메틸, 디메틸아미노 또는

인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(d) 우울증 또는 불안증의 치료에 있어서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도,

(e) 알콜 또는 물질 남용의 치료에 있어서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도,

(f) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 500 nM 이하를 나타내는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(g) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 50 nM 이하를 나타내는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(h) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 5 nM 이하를 나타내는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(i) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 500 nM 이하를 나타내고, CRF2에 비해 CRF1에 선택적으로 결합하는 (즉, Ki가 더 낮음) 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(j) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 50 nM 이하를 나타내고, CRF2에 비해 CRF1에 선택적으로 결합하는 (즉, Ki가 더 낮음) 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(k) CRF1 결합에 대한 Ki 값이 5 nM 이하를 나타내고, CRF2에 비해 CRF1에 선택적으로 결합하는 (즉, Ki가 더 낮음) 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염,

(l) 공지된 CRF 길항제 (예를 들어 CP154526 및 NBI30775)에 비해 우수한 생체이용률 프로파일을 갖는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.

본 발명의 화합물은 다양한 경로로 투여되는 제약 조성물로 제제화되는 것이 바람직하다. 이러한 조성물은 경구 투여용인 것이 바람직하다. 이러한 제약 조성물 및 이의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)] 참조).

화학식 I의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐서 효과적이다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상적으로 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 약 30 mg의 범위 내이다. 몇몇 예에서는 상기한 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 더 적절할 수도 있고, 다른 예에서는 훨씬 더 많은 용량이 어떠한 해로운 부작용도 일으키지 않으면서 사용될 수 있으며, 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 실제로 투여되는 화합물의 양은, 치료할 상태, 선택한 투여 경로, 실제 투여되는 화합물(들), 개개의 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 비롯한 관련 상황들에 비추어 의사가 결정한다는 것을 이해할 것이다.

화학식 I의 화합물은 CRF-1 길항제이고, 따라서 CRF1 수용체 자극을 감소시켜 치료할 수 있는 상태를 치료하는데 유용하다. 코르티코트로핀 방출 인자 (CRF)는 뇌하수체 전엽으로부터의 프로오피오멜라노코르틴 (POMC) 유래의 펩티드 분비에 대한 주요 생리적 조절자인 41개 아미노산 펩티드이고 ([J. Rivier et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 80:4851 (1983)], [W. Vale et al., Science 213:1394 (1981)]), 수많은 의학적 상태와 관련이 있다. 예를 들어, CRF의 면역조직화학적 국소화는, CRF의 뇌하수체 전엽에서의 내분비 역할 이외에도 상기 호르몬이 중추 신경계에서 폭넓은 시상하부외 분포를 가지며 뇌에서 신경전달물질 또는 신경조절물질의 역할과 일치하는 광범위한 스펙트럼의 자율적, 전기생리적 및 거동적 효과를 나타낸다는 것이 입증된 바 있다 ([W. Vale et al., Rec. Prog. Horm. Res. 39:245 (1983)], [G. F. Koob, Persp. Behav. Med. 2:39 (1985)], [E. B. De Souza et al., J. Neurosci. 5:3189 (1985)]). 또한, CRF가 면역계에서 생리적, 심리적 및 면역학적 스트레스 인자에 대한 반응을 통합하는데 유의한 역할을 수행한다는 증거가 있다 (예를 들어, 문헌 ([J. E. Blalock, Physiological Reviews 69:1 (1989)], [J. E. Morley, Life Sci. 41:527 (1987)]) 참조).

CRF는 우울증 및 불안증 ([D. M. Nielsen, Life Sci. 78:909-919], [H. E. Kunzel et al., J. Psychiatr. Res. 37:525-533], [D. R. Gehlert et al., Eur. J. Pharmacol. 509:145-153])을 비롯한 정신의학 장애 및 신경계 질환과 관련이 있다. 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 진행성 핵상 마비 및 근위축성 측삭 경화증의 병인 및 병태생리에서도 CRF의 역할이 추정되어 왔는데, 이는 이것들이 중추 신경계에서 CRF 뉴론의 기능장애와 관련이 있기 때문이다 (검토를 위해서는 문헌 [E. B. De Souze, Hosp. Practice 23:59 (1988)] 참조). CRF의 만성 투여는 도파민 시스템의 손상을 일으키는 것으로 밝혀졌는데, 이는 파킨슨병에 있어서의 역할을 암시한다 [E. Izzo et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 81:701-708 (2005)]. CRF가 관여하는 다른 신경계 장애는 간질 [T. Z. Baram et al., Brain Res. 770:89-95 (1997)] 및 편두통 [T. C. Theoharides et al., Endocrinology 136:5745-5750 (1995)]을 포함한다. CRF는 알콜 및 물질 남용 및 관련 금단 증상 ([D. H. Overstreet et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 77:405-413], [Y. Shaham et al., Psychopharmacology (Berl) 137:184-190])과 관련이 있다. 추가로, 여러가지 내분비성 장애 및 심혈관계 질환, 예컨대 비만 [E. Timofeeva and D. Richard, Neuroendocrinology 66:327-340 (1997)], 대사 증후군 [A. M. Ward et al., Metabolism 53:720-726 (2004)], 선천성 부신 과형성 [D. P. Merke and G. B. Cutler Jr., Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 30:121-135 (2001)], 쿠싱병 [M. Labeur et al., Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 4:335-342 (2004)], 고혈압 [R. J. Briscoe, et al., Brain Res. 881:204-207 (2000)] 및 졸중 [S. L. Stevens et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 23:1151-1159 (2003)]에 있어서도 CRF가 역할을 수행한다는 증거가 있다. 위 장애, 예컨대 과민성 대장 증후군 [Y. Tache et al., Eur J. Surg. Suppl:16-22 (2002)] 및 스트레스-유도된 위 궤양화 [K. E. Gabry et al., Mol. Psychiatry 7:474-483, 433 (2002)]는 CRF와 관련이 있다고 밝혀졌다. 추가로, CRF는 다양한 영역의 인간 여성 건강, 예를 들어 월경전 증후군 [F. Facchinetti et al., Psychosom. Med. 56:418-422 (1994)], 불임 [L. Ghizzoni et al., Endocrinology 138:4806-4811 (1997)], 성 기능장애 [J. E. Jones et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 283:R591-597 (2002)] 및 조산 [P. D. Wadhwa et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 191:1063-1069 (2004)]에서도 역할을 수행한다는 암시가 있다. 또한, 염증 장애 [A. Gravanis and A. N. Margioris, Curr. Med. Chem. 12:1503-1512 (2005)], 알러지 [L. K. Singh et. al., Brain Behav. Immun. 13:225-239 (1999)], 다발성 경화증 및 다른 자가면역 장애 [C. Benou et al., J. Immunol. 174:5407-5413 (2005)]을 치료하는 치료 잠재력을 나타내는, CRF가 면역계에서도 유의한 역할을 갖는다는 증거가 있다. 이 뿐만이 아니라, CRF는 내장통 [M. Nijsen et al., Neurogastroenterol. Motil. 17:423-432 (2005)], 수면 장애 [T. M. Buckley and A. F. Schatzberg, J. Clin. Endocrinol. Metab. 90:3106-3114 (2005)], 뇌하수체 종양 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양 [K. D. Dieterich et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83:3327-3331 (1998)], 만성 피로 증후군 및 근섬유통 [G. Neeck and L. J. Crofford, Rheum. Dis. Clin. North Am. 26:989-1002 (2000)]과도 관련이 있다.

CRF 수용체 아형인 CRF1 및 CRF2가 동정된 바 있고, 이것들은 뇌에서 불균일하게 분포되어 [D. T. Chalmers et al., TIPS 17:166-72 (1996)] 잠재적인 기능적 다양성을 암시한다 [S. C. Heinrichs et al., Regul. Peptides 71:15 (1997)]. 예를 들어, 폭넓게 분포된 뇌 CRF1 수용체는 환경적인 스트레스 인자에 노출될 때 수반되는 정서와 밀접한 관련이 있다 ([G. Liebsch et al., Regul. Peptides 59:229-39 (1995)], [D. W. Schulz, PNAS 93:10477-82 (1996)]). 유의하게, CRF1 수용체는 선택적인 불안유발 유사 거동을 매개한다고 여겨지지만 CRF2 수용체는 그렇지 않다 [Heinrichs et al., 1997]. 보다 불연속적인 중격/시상하부 분포 [D. T. Chalmers et al., J. Neurosci. 15(10):6340-50 (1995)] 및 별법의 내인성 리간드의 이용가능성 [J. Vaughan et al., Nature 378:287-92 (1995)]은 CRF2 수용체의 다양한 기능적 역할을 암시한다 [Heinrichs et al., 1997]. 예를 들어, CRF1 수용체보다 CRF2에 우선적인 친화성을 갖는 신규의 CRF-부류 신경펩티드가, 선택적 CRF1 작동시에 관찰되는 거동 활성화의 프로파일을 생성하지 않으면서 식욕을 저해한다는 것이 보고되었다 [H. Tezval et al., PNAS 101(25):9468-9473 (2004)]. 다른 사례에서, CRF2 작동은 CRF1 길항제 또는 CRF1 유전자 결실에 대해 보고된 것과 유사한 효과를 생성한다 [S. C. Heinrichs, Trends in Pharmacological Sciences 20(8):311-5 (1999)]. 예를 들어, CRF2 효능제는 항-비만제로 제안되었고, CRF1 길항제 역시 중요한 비만 치료제일 수 있다 [C. Contoreggi et al., Neuroendocrinology 80(2):111-23 (2004)].

본 발명의 화합물의 제조

본 발명의 모든 화합물은 예를 들어 하기 반응식에 나타낸 합성 경로를 따라 화학적으로 제조될 수 있다. 그러나, 하기 논의는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것이 아니다. 예를 들어, 기재된 각 경로에서 특정 합성 단계들이 상이한 방식으로 합해지거나 또는 다른 반응식의 단계들과 합해져서 화학식 I의 추가의 화합물이 제조될 수 있다. 각 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리(trituration), 결정화 등을 비롯한 통상의 방법으로 회수될 수 있다. 달리 나타내지 않는다면, 하기 반응식에서의 모든 치환체는 앞서 정의한 바와 같고, 적합한 시약은 당업계에 공지되어 있고 인식된다.

화학식 I의 화합물의 형성은 반응식 1에 나타낸 바와 같은 반응에 따라 수행할 수 있다. 화학식 I의 적절한 화합물은 R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵가 화학식 I에 대해 정의한 바와 같은 것이다.

단계 1에서, 에틸 아세토아세테이트 및 5-메틸-2H-피라졸-3-일아민을 축합시켜 환류 아세트산 중의 2,5-디메틸-4H-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-온 (1)을 형성한다.

이후에는 단계 2에서 화학식 1의 피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-온을 톨루엔과 같은 불활성 용매 중 옥시염화인 및 디메틸아닐린을 사용하여 용매의 환류 온도에서 7-클로로-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘으로 전환시킨다.

반응식 1의 단계 3에서, 화학식 3의 그리그나드(Grignard) 시약 (X = Cl 또는 Br)을 톨루엔과 같은 불활성 용매 중 화학식 2의 클로라이드와 환류 온도에서 반응시켜서 화학식 4의 7-알킬 피라졸로피리미딘을 수득한다. 별법으로, 단계 4에 나타낸 바와 같이 디케톤을 5-메틸-2H-피라졸-3-일아민과 축합시켜 화학식 4의 7-알킬 피라졸로피리미딘을 수득한다. 상기 반응은 촉매량의 피페리딘을 함유하는 에탄올 중에서 60℃ 내지 80℃의 온도에서 수행된다 [Novinson, T., et. al. J. Med. Chem. 1975, 18, 460]. R¹ = H인 경우에는 위치이성질체들의 혼합물이 수득되며, 예를 들어 R² = 프로필인 경우에는 이것들을 단계 5의 요오드화 이후에 분리한다.

화학식 4의 피라졸로피리미딘은 단계 5에서 아세토니트릴 중 과량의 N-요오도숙신이미드를 사용하여 화학식 5의 요오도 피라졸로피리미딘으로 관능화된다.

반응식 1의 단계 6에서, 화학식 5의 요오도 피라졸로피리미딘을 헤테로시클 릭 아연 할라이드 (R³ZnX) (X = Cl 또는 Br)와 네기시(Negishi) 교차-커플링 반응으로 반응시킨다. 헤테로시클릭 아연 할라이드는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 유기아연 시약은 헤테로시클릭 브로마이드를 아연 금속과 반응시키거나, 또는 별법으로 비-할로겐화 헤테로사이클을 사용하여 n-, sec- 또는 tert-부틸 리튬을 갖는 헤테로시클릭 리튬 시약을 형성한 후에 ZnCl₂를 사용한 리튬-아연 교환을 실시하여 수득된다. 유기아연 시약을 THF와 같은 불활성 용매 중 팔라듐 촉매, 예를 들어 디클로로[1,1'-비스(디페닐-포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄의 존재하에 환류 온도에서 약 12시간 내지 36시간 동안 화학식 5의 요오도 피라졸로피리미딘과 커플링시켜 화학식 I의 피라졸로피리미딘을 수득한다.

별법으로, 단계 7에서는 헤테로시클릭 보론산 (R³B(OH)₂)을 화학식 5의 요오도 화합물과 함께 스즈끼(Suzuki) 커플링 반응에 사용한다. 이러한 커플링 절차에 대하여는 수많은 반응 조건이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 조건은 팔라듐 촉매, 예를 들어 비스(트리-t-부틸포스핀)팔라듐(O)의 존재하에 60℃ 내지 환류 온도에서 약 12시간 내지 36시간 동안 톨루엔/에탄올/2 M 탄산나트륨의 용매 혼합물을 사용하는 것이다.

쉽게 이해되듯이, 헤테로아릴 보론산은 당업계에 공지된 절차를 이용하여 본원에 기재한 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 티오펜 및 벤조티 오펜을 N-브로모숙신이미드를 사용하여 브롬화시킨 후에 알킬 리튬 시약과의 할로겐 금속 교환을 이용하여 보론산으로 전환시키고, 그 후에는 트리메틸보레이트로 처리하고 후처리시에 가수분해할 수 있다.

당업자가 알고 있듯이, 예를 들어 화학식 Ic의 화합물에서와 같은 티에노피리딘은 시판되는 티에노[3,2-b]피리딘-7-올을 브로마이드로 전환시킨 후에 할로겐 금속 교환을 실시하고 메탄올/물과 같은 양성자 공급원으로 켄칭(quenching)시켜 쉽게 수득된다. 이후, 브롬을 사용한 3-위치에서의 브롬화를 실시한 후에 메틸보론산을 사용한 스즈끼 커플링을 실시하여 3-메틸-티에노[3,2-b]피리딘을 수득하고, 이것을 상기한 바와 같이 ZnCl₂를 사용하여 화학식 5의 요오도 피라졸로피리미딘과 커플링시킨다.

화학식 7, 8 또는 9의 화합물의 형성은 반응식 2에 나타낸 바와 같은 반응에 따라 수행할 수 있다. 화학식 7, 8 또는 9의 적절한 화합물은 R¹, R² 및 R⁴가 화학 식 I에 대해 정의한 바와 같고 "Het"가 나타낸 바와 같이 정의되는 것이다.

반응식 2의 단계 1에서, 화학식 6의 티오펜을 디클로로메탄 또는 클로로포름과 같은 불활성 용매 중 N-브로모숙신이미드를 사용하여 브롬화한다.

단계 2에서, 화학식 7의 브로모티오펜을 헤테로시클릭 아연 시약과 커플링시켜 화학식 8의 티오펜 헤테로사이클을 수득한다. 브로모헤테로사이클 및 아연 금속으로부터 헤테로시클릭 아연 시약을 형성하고, 이것을 화학식 7의 브로모티오펜과 계내 반응시킨다. 상기 반응은 THF와 같은 불활성 용매 중에 용매의 환류 온도에서 수행된다. 별법으로, 헤테로시클릭 리튬 시약은, 예를 들어 n-, sec- 또는 tert-부틸 리튬 및 1-메틸-1,2,4-트리아졸을 사용한 후에 ZnCl₂를 사용한 리튬-아연 교환을 실시하여 헤테로시클릭 아연 시약을 수득함으로써 형성할 수 있다.

반응식 2의 단계 3에서, 화학식 6의 티오펜을 니트로화시켜 화학식 9의 니트로티오펜을 수득한다. 바람직한 조건은 디클로로메탄 및 TFA와 70％ 질산의 용매 혼합물을 사용하는 것이다. 당업자는 화학식 9의 니트로티오펜이 추가의 관능화를 위한 중간체로 기능할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 니트로기를 환원시키고 아실화하여 아세트아미드를 수득하거나, 알킬화하여 디알킬아민을 수득할 수 있다.

또한, 화학식 8의 화합물을 제조하는데 필요한 단계들을 임의의 순서로 수행하여 당업계에 공지된 방법으로 2-헤테로사이클 티오펜을 제조할 수 있고, 이후에 이것을 브로모티오펜 또는 티오페닐 보론산으로 관능화한 후에 화학식 5의 요오도 피라졸로피리미딘과 커플링시킬 수 있다는 것을 알 것이다.

화학식 10의 화합물의 형성은 반응식 3에 나타낸 바와 같은 반응에 따라 수행할 수 있다. 화학식 10의 적절한 화합물은 R¹, R² 및 R⁴가 화학식 I에 대해 정의한 바와 같고 R^5a = -OCH₃, -OC(O)CH₃, -CH₂OCH₃ 또는 -CO₂CH₂CH₃인 것이다.

쉽게 이해되듯이, 화학식 7의 브로모티오펜은 당업자에 의해 각종 치환된 티오펜으로 쉽게 변환될 수 있는 유용한 중간체를 대표한다. 예를 들어, 티에닐 그리그나드 시약의 형성 이후에 산소로 처리하면 [Hurd, C. D. and Kreuz, K. JACS 1950, 72, 5543] 2-히드록시 티오펜이 수득되고, 이것을 아실화하여 아세톡시 유도체를 수득한다. 상기 그리그나드 시약을 에틸시아노포르메이트와 같은 친전자체로 처리하여 에톡시카르보닐 치환된 티오펜을 수득할 수도 있다. n-, sec- 또는 tert-부틸 리튬을 사용한 할로겐-리튬 교환은 티에닐 리튬 시약을 제공할 수 있고, 이후에는 이것을 알킬할라이드, 예컨대 요오도메틸 메틸에테르와 같은 친전자체와 반응시킬 수 있다. 추가로, 산화구리, 요오드화나트륨 및 나트륨 메톡시드로 처리하면 2-메톡시 티오펜이 수득된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "TLC"는 박층 크로마토그래피를 지칭하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고, "δ"는 테트라메틸실란으로부터의 백만분율 낮은 장(down-field)을 지칭하고, "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고, "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고, "HOAc"는 아세트산을 지칭하고, "MeOH"는 메탄올을 지칭하며, "DME"는 디메톡시에탄을 지칭한다.

보다 상세하게 기술하지 않더라도, 당업자는 전술한 기재에 비추어 본 발명을 완벽하게 실시할 수 있다고 여겨진다. 하기하는 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이다. 이것들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 당업자는 시약 및 출발 물질을 쉽게 구할 수도 있고, 또는 쉽게 합성할 수도 있다. 실시예 1 내지 27은 대표적인 화합물을 제공하며, 그의 제조법을 예시한다. 실시예 A 내지 C는 본 발명의 화합물의 생물학적 성질을 결정하는데 이용될 수 있는 여러가지 생물학적 검정법을 예시한다. 당업자는 하기 예에 기재된 절차에 적절한 변동을 바로 인지할 것이다. 본 발명의 화합물의 명칭은 켐드로우 울트라(ChemDraw Ultra)^® 버전 7.0.1에 따른 것이다.

제조예 1

2,5-디메틸-4H- 피라졸로[1,5-a]피리미딘 -7-온

에틸 아세토아세테이트 (128 g, 0.98 mol)를 5-메틸-2H-피라졸-3-일아민 (100 g, 0.95 mol)의 아세트산 용액 (500 mL)에 적가하면서, 온도를 25℃ 내지 28 ℃로 유지하였다. 상기 혼합물을 환류하에 10시간 동안 가열한 후에 실온으로 냉각시켰다. 상기 반응물을 5℃로 냉각시킨 tert-부틸 메틸 에테르 (5 L)에 첨가하면서, 온도를 10℃ 미만으로 유지하였다. 1시간 동안 5℃에서 교반하고 여과하였다. 생성된 물질을 진공하에 밤새 건조시켜 백색 고체 (158 g, 96％)를 수득하였다.

제조예 2

7- 클로로 -2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘

톨루엔 (150 mL) 중 2,5-디메틸-4H-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-온 (10.0 g, 61.3 mmol)의 현탁액에 N,N-디메틸아닐린 (9.7 mL, 76.7 mmol)을 첨가하였다. 상기 백색 현탁액에 옥시염화인 (11.2 mL, 122.6 mmol)을 적가하였다. 3시간 동안 불활성 대기하에 환류시켜 실온으로 냉각시키고, 감압을 이용하여 상기 반응물을 갈색 오일로 농축시켰다. 상기 오일을 에틸 아세테이트 (250 mL) 중에 용해하고, 1 N NaOH로 염기성화시켰다. 염기성 수성 상을 분리하여 추가의 에틸 아세테이트 (2×100 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고, 감압하에 농축시켜 갈색 고체를 수득하였다. 상기 물질을 80％ 헥산/20％ (30％ THF/헥산) → 0％ 헥산/100％ (30％ THF/헥산)을 20％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬(flash) 크로마토그래피로 정제하여 밝은 녹색의 고체 (6.65 g, 59％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 182.3 (M+1)⁺.

제조예 3

7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘

환류 응축기가 장착된 오븐 건조된 플라스크에 촉매량의 요오드 및 리케(Rieke)^® 마그네슘 (THF 중 1.0 M, 52 mL, 52 mmol)을 불활성 대기하에 충전하였다. 상기 반응물을 45℃로 가열하여 3-브로모펜탄 (5.3 mL, 42.9 mmol)을 첨가하였다. 그리그나드 반응이 개시됨에 따라 온도가 스파이크(spike)되었다. 상기 반응물을 4시간 더 50℃에서 교반하고 실온으로 냉각시켰다. 마그네슘 금속이 침강되도록 하고, 그리그나드 시약을 아르곤 양압하에서 무수 톨루엔 (50 mL) 중 7-클로로-2,5-디메틸피라졸로[1,5-a]피리미딘 (5.19 g, 28.6 mmol)을 함유하는 플라스크에 캐뉼라로 주입시켰다. 불활성 대기하에 48시간 동안 환류시까지 가열하였다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 물로 켄칭시켰다. 상기 반응물을 에틸 아세테이트 (150 mL)로 희석하고, 물 (50 mL)을 첨가하였다. 수성 상을 분리하여 에틸 아세테이트 (75 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 80％ 펜탄/20％ (30％ THF/펜탄) → 0％ 펜탄/100％ (30％ THF/펜탄)을 20％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 오일 (2.59 g, 42％)을 수득하였다. ES/MS m/z 218.1 (M+1)⁺.

하기 화합물을 본질적으로 제조예 3에 기재한 바와 같이 하여 제조하였고, 이때 시판되는 그리그나드 시약을 사용하거나 그리그나드 시약을 상기와 같이 제조하여 사용하였다:

제조예 번호	화학적 명칭	물리적 데이타 : NMR 또는 MS (m/z)
4	7-(1-프로필-부틸)-2,5- 디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	246.3 (M+1)⁺
5	7-이소프로필-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5a]피리미딘

제조예 6

7-부틸-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘

5-메틸-2H-피라졸-3-일아민 (217 mg, 2.17 mmol), 노난-2,4-디온 (339 mg, 2.39 mmol) 및 피페리딘 (1 방울)을 에탄올 (10 mL)에 첨가하고, 80℃에서 밤새 가열하였다. 실온으로 냉각시키고 건조될 때까지 농축시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 0％ → 20％ 에틸 아세테이트)로 정제하여 2종의 이성질체의 혼합물 (2 g)을 수득하였다.

제조예 7

7-(1-에틸-프로필)-3- 요오도 -2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘

7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (2.14 g, 9.84 mmol)을 무수 아세토니트릴 (25 mL) 중에 용해하고, N-요오도숙신이미드 (3.0 g, 13.3 mmol)를 10분 간격으로 6번에 나누어 (각각 0.5 g씩) 첨가하였다. 상기 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴을 제거(strip off)하고, 생성된 오일을 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하였다. 상기 오렌지색 용액을 포화 염화암모늄 용액 (2×50 mL)으로 세척하였다. 유기 상을 수집하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고, 감압하에 농축시켜 짙은 적색 오일을 수득하였다. 100％ 펜탄/0％ (20％ 에틸 아세테이트/펜탄) → 0％ 펜탄/100％ (20％ 에틸 아세테이트/펜탄)을 50％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 오렌지색 오일 (3.28 g, 97％)을 수득하였다.

하기 화합물을 본질적으로 제조예 7에 기재한 바와 같이 하여 제조하였다:

제조예 번호	화학적 명칭	물리적 데이타: NMR 또는 MS (m/z)
8	7-(1-프로필-부틸)-3-요오도-2,5- 디메틸-피라졸로[1,5-a] 피리미딘
9	7-이소프로필-3-요오도-2,5- 디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	316.0 (M+1)⁺
10 ^*	7-부틸-3-요오도-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘	330 (M+1)⁺

^* 후처리: 유기물을 Na₂S₂O₃ 수용액으로 세척하였다. 제조예 6의 이성질체들의 혼합물에 대해 반응을 수행하였다. 2종의 이성질체를 실리카겔 (0％ → 20％ EtOAc/헥산)에서 분리하였다.

실시예 1

3-(3- 클로로 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로 [1,5-a]피리미딘

리케^® 아연 (5 g/100 mL THF, 20 mL, 15.0 mmol)을 무수 THF (10 mL) 중에 현탁하고, 2-브로모-3-클로로티오펜 (1.98 g, 10.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 불활성 대기하에서 오일조 (85℃)에서 3시간 동안 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고, 남아있는 아연 금속을 원심분리하였다. 상기 시약 용액을 아르곤 양압하에서 새로운 용기에 캐뉼라로 주입시키고, 7-(1-에틸-프로필)-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (1.72 g, 5.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 아르곤 양압으로 10분 내지 15분 동안 탈기시키고, 디클로로[1,1'-비스(디페닐-포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.225 g, 0.275 mmol)을 첨가하였다. 환류 온도에서 밤새 불활성 대기하에 교반하였다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하고, 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (15％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (15％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체 (1.35 g, 40％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 334.4 (M+1)⁺.

하기 화합물을 본질적으로 실시예 1에 기재한 바와 같이 하여 제조하였다:

실시예 번호	화학적 명칭	MS (m/z)
2	3-(3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-프로필-부틸)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(³⁵Cl) 362.0 (M+1)⁺
3	3-(3-클로로-티오펜-2-일)-7-이소프로필-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(³⁵Cl) 306.0 (M+1)⁺

실시예 4

3-(3- 메틸 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[ 1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 3-메틸-2-티에닐아연 브로마이드 (11.0 mL, 5.5 mmol), 무수 THF (6.0 mL) 및 7-(1-에틸-프로필)-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.536 g, 1.56 mmol)을 충전하였다. 아르곤 양압으로 10분 내지 15분 동안 탈기시키고, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.12 g, 0.15 mmol)을 첨가하였다. 오일조 (100℃)에서 불활성 대기하에 밤새 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 펜탄/0％ (25％ 에틸 아세테이트/펜탄) → 0％ 펜탄/100％ (25％ 에틸 아세테이트/펜탄)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 발포 체를 수득하였다. 헥산으로 연화처리하고 여과하였다 (0.432 g, 8％).

실시예 5

3-(5- 브로모 -3- 클로로 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로 [1,5-a]피리미딘

3-(3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (1.16 g, 3.5 mmol)을 디클로로메탄 (15 mL) 중에 용해하고, N-브로모숙신이미드 (0.69 g, 3.85 mmol)를 한번에 첨가하였다. 2시간 동안 불활성 대기하에 교반하고, TLC를 사용하여 반응이 완료된 것을 확인하였다. 상기 반응물을 디클로로메탄 (50 mL)으로 희석하여 물 (75 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고, 감압하에 농축시켜 황색 고체 (1.56 g, 정량적인 수득량)를 수득하였다.

하기 화합물을 본질적으로 실시예 5에 기재한 바와 같이 하여 제조하였다:

실시예 번호	화학적 명칭	MS (m/z)
6	3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-프로필- 부틸)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(³⁵Cl⁸¹Br) 441.7 (M+)
7 ^*	3-(5-브로모-3-메틸-티오펜-2-일)-7-(1-에틸- 프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(⁸¹Br) 393.8 (M+1)⁺
8 ^*	3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-이소프로필- 2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(³⁵Cl⁸¹Br) 385.0 (M+)

^* 헥산/에틸 아세테이트로 용출시키는 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

실시예 9

3-[3- 클로로 -5-(2- 메틸 -2H-[1,2,4] 트리아졸 -3-일)-티오펜-2-일]-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘

리케^® 아연 (5 g/100 mL THF, 5.5 mL, 4.2 mmol)을 무수 THF (5 mL) 중에 현탁하고, 1-메틸-5-브로모-1,2,4-트리아졸 (0.4 g, 2.5 mmol)을 첨가하였다. 불활성 대기하에서 오일조 (85℃)에서 3시간 동안 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고, 남아있는 아연 금속을 원심분리하였다. 상기 시약 용액을 아르곤 양압하에 새로운 용기에 캐뉼라로 주입시키고, 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.64 g, 1.45 mmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 아르곤 양압으로 10분 내지 15분 동안 탈기시키고, 디클로로[1,1-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.136 g, 0.167 mmol)을 첨가하였다. 밤새 불활성 대기하에 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (30％ THF/헥산) → 0％ 헥산/100％ (30％ THF/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체 (0.298 g, 50％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 415.0 (M+1)⁺.

하기 화합물을 본질적으로 실시예 9에 기재한 바와 같이 하여 제조하였고, 이때 시판되는 6-메틸-2-피리딜아연 브로마이드를 사용하였다:

실시예 번호	화학적 명칭	MS (m/z)
10	3-[3-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-티오펜-2-일]-7-(1-에틸- 프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘	(³⁵Cl) 424.8 (M+1)⁺

실시예 11

3-(3- 클로로 -5- 메톡시 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[ 1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.46 g, 1.1 mmol), 산화구리 (0.045 g, 0.56 mmol), 요오드화나트륨 (0.020 g, 0.11 mmol), 25％ 나트륨 메톡시드/메탄올 용액 (10 mL) 및 무수 메탄올 (10 mL)을 충전하였다. 상기 반응물을 오일조 (90℃)에서 주말에 걸쳐 불활성 대기하에 환류시켰다. 빙수를 사용하여 상기 반응물을 켄칭시키고, 에테르 (3×100 mL)로 추출하였다. 유기 부분들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (35％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (35％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 발포체 (0.086 g, 21％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 363.7 (M+1)⁺.

실시예 12

아세트산 4- 클로로 -5-[7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘 -3-일]에스테르

이소프로필 브로마이드 (0.25 mL, 2.7 mmol)를 리케^® 마그네슘 (THF 중 1.0 M, 2.7 mL, 2.7 mmol) 및 무수 THF (3 mL) 중 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.74, 1.8 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 불활성 대기하에 1시간 동안 환류시키고, 상기 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 상기 발열 반응물에 양압하에 실온에서 90분 동안 산소를 버블링하였다. 상기 반응물을 포화 염화암모늄 (30 mL)으로 켄칭시켜 에틸 아세테이트 (2×100 mL)로 추출하고 감압하에 농축시켰다. 상기 오일을 에테르 (150 mL) 중에 용해하여 0.1 N 수산화나트륨 (3×75 mL)로 세척하고, 염기성 수성 상을 에테르 (50 mL)로 역추출하였다. 상기 수성 상을 포화 염화암모늄으로 산성화하여 디클로로메탄 (4×75 mL)으로 추출하였다. 디클로로메탄 부분들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 오일 (0.138 g, 0.39 mmol)을 트리에틸아민 (0.23 mL, 1.6 mmol) 및 아세틸 클로라이드 (0.034 mL, 0.47 mmol)를 함유하는 디클로로메탄 (2 mL) 중에 용해하였다. 불활성 대기하에 1시간 동안 교반하고, 디클로로메탄 (50 mL)으로 희석하여 물 (50 mL)로 세척하였다. 유기 상을 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 발포체 (0.084 g, 21％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 392.0 (M+1)⁺.

실시예 13

3-(3- 클로로 -5- 메톡시메틸 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.41, 1.0 mmol) 및 무수 THF (5 mL)를 충전하였다. 불활성 대기하에 -70℃로 냉각시키고, n-부틸 리튬 (2.5 M 헥산 용액, 0.42 mL, 1.05 mmol)을 첨가하였다. 황색 반응물이 짙은 적색이 되었다. 요오도메틸 메틸에테르 (0.09 mL, 1.10 mmol)를 첨가하고, 상기 반응물이 실온으로 가온되도록 하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL)로 희석하여 물 (75 mL) 및 염수 (75 mL)로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산마그네슘에서 건조시키고, 감압하에 오렌지색 오일로 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체 (0.107 g, 28％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 378.3 (M+1)⁺.

실시예 14

4- 클로로 -5-[7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로[ 1,5-a]피리미딘-3-일]-티오펜-2-카르복실산 에틸 에스테르

무수 THF (5 mL) 중 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸 피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.62 g, 1.5 mmol)의 혼합물을 불활성 대기하에 0℃로 냉각시키고, 염화 에틸 마그네슘 (2 M THF 용액, 0.83 mL, 1.65 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분 동안 교반하여 실온으로 가온하고, 15분 동안 더 교반한 후에 반응 온도를 0℃로 낮추었다. 무수 THF (1 mL) 중에 희석한 에틸시아노포르메이트 (0.16 mL, 1.58 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응물을 실온으로 가온시켜 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 포화 중탄산나트륨 (20 mL)으로 켄칭시켜 에테르 (2×75 mL)로 추출하였다. 유기 부분들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 100％ 헥산/0％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 생성된 물질을 진공하에 건조시켜 백색 고체 (0.114 g, 19％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 406.3 (M+1)⁺.

제조예 11

2-(5- 브로모 -4- 메틸 -티오펜-2-일)-6- 메틸 -피리딘

2.0 M 리튬 디이소프로필아미드 (9.76 mL, 19.52 mmol)를 2-브로모-3-메틸-티오펜 (2.0 mL, 17.75 mmol) 및 THF (30 mL)의 -78℃ 용액에 첨가하였다. 45분 후에 ZnCl₂ (THF 중 0.5 M, 39.0 mL, 19.50 mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 30분 동안 교반하였다. 2-브로모-6-메틸-피리딘 (2.4 mL, 21.29 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄ (0.50 g, 0.44 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 주위 온도로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 포화 NH₄Cl 용액 (20 mL)으로 세척하였다. 수성 층을 CH₂Cl₂ (30 mL)로 세척하였다. 유기 층들을 합하여 포화 NH₄Cl 용액 (20 mL)으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시켜 여과하고 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (10％ → 20％ EtOAc/헥산 구배)로 정제하여 표제 화합물 (2.34 g, 49％)을 수득하였다. LC-ES/MS m/z (⁷⁹Br/⁸¹Br) 267.7/269.5 (M+H)⁺.

제조예 12

3- 메틸 -5-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-티오펜-2- 보론산

2-(5-브로모-4-메틸-티오펜-2-일)-6-메틸-피리딘 (37.6 g, 0.14 mol) 및 트 리이소프로필 보레이트 (34.2 g, 0.182 mol, 42.3 mL)를 톨루엔 (100 mL) 및 THF (160 mL) 중에 질소 대기하에 용해하였다. 상기 용액을 -40℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (헥산 중 2.5 M, 70 mL, 0.175 mol)을 첨가 깔때기를 사용하여 40분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 용액 내부 온도를 -40℃에서 -35℃로 변화시켰다. 첨가 완료후에 상기 혼합물을 -40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 0℃로 가온시키고, THF (40 mL)를 첨가한 후에 2 N 수성 HCl (120 mL)을 첨가하여 백색 고체를 형성시켰다. pH = 7이 될 때까지 1 N NaOH를 첨가하고, 모든 염을 용해시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 디에틸 에테르 (3×)로 추출하였다. 유기 층들을 합하여 MgSO₄에서 건조시켜 여과하고 농축시켰다. 잔류물에 THF를 첨가한 후에 헥산을 첨가하였다. 생성된 황색 침전물을 여과하였고, 침전 단계를 여러회 반복하여 표제 화합물 (19.7 g, 60％)을 수득하였다.

실시예 15

7-(1-에틸-프로필-2,5-디메틸-3-[3- 메틸 -5-(6- 메틸 -피리딘-2-일)티오펜-2-일]-피라졸로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 2-(5-보론산-4-메틸-티오펜-2-일)-6-메틸-피리딘 (0.29 g, 1.24 mmol), 무수 톨루엔 (4 mL), 무수 에탄올 (1 mL), 2 M 탄산나트륨 (1.1 mL, 2.2 mmol) 및 7-(1-에틸-프로필)-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.25 g, 0.73 mmol)을 충전하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 아르곤 양압으로 탈기시키고, 비스(트리-t-부틸포스핀)팔라듐(O) (0.10 g, 0.086 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 밤새 오일조 (100℃)에서 불활성 대기하에 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고 에틸 아세테이트 (75 mL) 및 물 (25 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 회백색 발포체 (0.215 g, 73％)를 수득하였다. ES/MS m/z 405.4 (M+1)⁺.

제조예 13

7- 브로모 - 티에노[3,2-b]피리딘

티에노[3,2-b]피리딘-7-올 (5.00 g, 33 mmol) 및 옥시브롬화인 (50 g, 174 mmol)을 함께 110℃에서 3시간 동안 가열하였다. 상기 고온의 반응 혼합물을 얼음과 5 N NaOH의 혼합물에 붓고 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄에서 건조시키고 증발시켰다. 생성된 조 물질을 실리카겔 크로마토그래피 컬럼 (헥산:EtOAc = 3:1)으로 정제하여 표제 화합물 (4.19 g, 59％)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁸¹Br) 215 (M+).

제조예 14

티에노 [3,2-b]피리딘

7-브로모-티에노[3,2-b]피리딘 (3.69 g, 17 mmol)을 무수 THF (20 mL) 중에 용해하고 -78℃로 냉각시켰다. n-BuLi (헥산 중 1.6 M, 21.2 mL, 34 mmol)을 상기 혼합물에 -78℃에서 서서히 첨가하고, -78℃에서 20분 동안 교반하였다. MeOH/H₂O = 1/1 (20 mL)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 부분을 포화 NaCl 용액으로 세척하여 Na₂SO₄에서 건조시키고 증발시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산 → 헥산:에틸 아세테이트 = 10:1로 용출시키는 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (1.44 g, 62％)을 수득하였다. ES/MS m/z 136 (M+1)⁺.

제조예 15

3- 브로모 - 티에노 [3,2-b]피리딘

티에노[3,2-b]피리딘 (3.45 g, 25.6 mmol), 중탄산나트륨 (2.15 g, 25.6 mmol), K₂HPO₄ (6.69 g, 38.4 mmol) 및 MgSO₄ (4.01 g, 33.3 mmol)를 CHCl₃ (60 mL) 중에서 합하였다. 상기 혼합물을 환류하에 교반하고, Br₂ (1.57 mL, 30.7 mmol)를 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 밤새 환류하에 교반하였다. 브롬 (0.7 mL)을 더 첨가하고, 상기 반응물을 환류하에 4시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시켜 물을 첨가하고, CHCl₃으로 추출하였다. 유기 부분을 포화 Na₂S₂O₃ 용액 및 포화 염수로 세척하였다. Na₂SO₄에서 건조시키고 증발시켰다. 상기 물질을 헥산/CH₂Cl₂로부터 재결정화하여 표제 화합물 (3.94 g, 72％)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁸¹Br) 215 (M+).

제조예 16

3- 메틸 - 티에노 [3,2-b]피리딘

DME/물/EtOH = 7/3/1 (4 mL) 중 3-브로모-티에노[3,2-b]피리딘 (214 mg, 1.0 mmol) 및 메틸보론산 (180 mg, 3.0 mmol)을 함유하는, 극초단파에서 사용가능한 3개의 반응 바이알을 제조하였다. 2 M Na₂CO₃ (1.5 mL, 3.0 mmol)을 첨가하고, 질소 기체 중에서 15분 동안 버블링하였다. Pd(PPh₃)₄ (58 mg, 0.05 mmol)를 첨가하고, 상기 바이알을 밀폐하였다. 상기 바이알을 130℃에서 30분 동안 극초단파에서 가열하였다. 모든 반응 혼합물을 합하여 물 및 CH₂Cl₂를 첨가하고 추출하였다. CH₂Cl₂ 층을 분리하여 Na₂SO₄에서 건조시켜 여과하고 증발시켰다. 생성된 물질을 헥산:에틸 아세테이트:MeOH 중 2 M NH₃ = 20:4:1로 용출시키는 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (193 mg, 43％)을 수득하였다. ES/MS m/z 150 (M+1)⁺.

실시예 16

7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-3-(3- 메틸 - 티에노[3,2-b]피리딘 -2-일)- 피라졸 로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 슈렌크(schrenk) 플라스크에 3-메틸티에노[3,2-b]피리딘 (0.213 g, 1.42 mmol) 및 무수 THF (5 mL)를 충전하고, 불활성 대기하에 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (2.5 M 헥산, 0.72 mL, 1.78 mmol)을 첨가하고, 온도를 낮추어 30분 동안 교반하였다. 무수 염화아연 (0.58 g, 4.26 mmol)을 한번에 첨가하고, 온도를 낮추어 15분 동안 교반하였다. 상기 반응물이 실온으로 가온되도록 하고, 30분 더 교반하였다. 상기 반응물을 무수 THF (5 mL)로 희석하고, 7-(1-에틸-프로필)-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.406 g, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 15분 동안 아르곤 양압으로 탈기시켜 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.093 g, 0.114 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 밤새 오일조 (90℃)에서 불활성 대기하에 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 100％ 헥산/0％ (15％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (15％ 에틸 아세테이트/ 헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 백색 발포체 (0.059 g, 14％)를 수득하였다. ES/MS m/z 365.0 (M+1)⁺.

실시예 17

3-[3- 메틸 -5-(2- 메틸 -2H-[1,2,4] 트리아졸 -3-일)-티오펜-2-일]-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 1-메틸-1,2,4-트리아졸 (0.320, 3.81 mmol), 무수 THF (10 mL)를 충전하고, 불활성 대기하에 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (2.5 M 헥산, 1.52 mL, 3.81 mmol)을 첨가하고, 온도를 낮추어 30분 동안 교반하였다. 무수 염화아연 (1.06 g, 7.75 mmol)을 한번에 첨가하고, 온도를 낮추어 15분 동안 교반하였다. 상기 반응물이 실온으로 가온되도록 하고, 30분 더 교반하였다. 상기 반응물에 무수 THF (5 mL) 중 3-(5-브로모-3-메틸-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.50 g, 1.27 mmol)을 첨가하였다. 15분 동안 아르곤 양압으로 탈기시키고, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.147 g, 0.127 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 밤새 오일조 (90℃)에서 불활성 대기하에 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 100％ 헥산/0％ (40％ THF/헥산) → 0％ 헥산/100％ (40％ THF/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구 배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 생성된 물질을 헥산/에테르 (3:1)로 연화처리하여 백색 고체 (0.371 g, 74％)를 수득하였다. ES/MS m/z 395.0 (M+1)⁺.

실시예 18

3-(5-니트로-3- 메틸 -티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5- 디메틸피라졸로[ 1,5-a]피리미딘

3-(3-메틸-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.419 g, 1.33 mmol)을 디클로로메탄 (2.5 mL) 중에 용해하여 불활성 대기하에 교반하고, 빙조에서 0℃로 냉각시켜 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 첨가하였다. 상기 반응물에 진한 (70％) 질산 (0.132 g, 1.47 mmol)을 적가하였다. 상기 용액은 색상이 황색에서 짙은 녹색으로 변하였다. 빙조에서 1시간 동안 불활성 대기하에 교반하고, TLC를 사용하여 반응이 완료된 것을 확인하였다. 상기 반응물을 디클로로메탄 (80 mL)으로 희석하여 포화 중탄산나트륨으로 켄칭시켰다. 수성 염기성 상을 분리하여 디클로로메탄 (50 mL)으로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (30％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (30％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체 (0.363 g, 76％)를 수득하였다.

실시예 19

N-{5-[7-(1-에틸-프로필)-2,5- 디메틸피라졸로 [1,5-a]피리미딘-3-일]-4- 메틸 -티오펜-2-일}아세트아미드

3-(5-니트로-3-메틸-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (0.33 g, 0.92 mmol)을 10％ 팔라듐/탄소 (0.10 g)을 함유하는 THF (10 mL) 중에 용해하고, 진공/수소 대기 플러시(flush) (3×)로 탈기시켜 수소 대기 (55 psi)하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC를 사용하여 반응이 완료된 것을 확인하였다. 상기 반응물을 THF (50 mL)로 희석하고, 규조토로 여과한 후에 조 오렌지색 오일 (0.328 g)로 농축시켰다. 상기 오일을 디클로로메탄 (4 mL) 및 1.0 M NaOH (1 mL) 중에 용해하였다. 상기 반응물에 아세틸 클로라이드 (0.038 mL, 0.52 mmol)를 첨가하고, 밀폐된 반응 용기에서 실온에서 주말에 걸쳐 교반하였다. 상기 반응물을 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하여 물로 세척하였다. 유기 상을 수집하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고, 감압하에 적색 오일로 농축시켰다. 상기 오일을 100％ 헥산/0％ (15％ 에틸 아세테이트/10％ 7 N 암모니화 메탄올/75％ 헥산) → 0％ 헥산/100％ (15％ 에틸 아세테이트/10％ 7 N 암모니화 메탄올/75％ 헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 갈색 발포체 (0.048 g, 26％)를 수득하였다. ES/MS m/z 371.0 (M+1)⁺.

실시예 20

3-[3- 클로로 -5-(2- 메틸 -2H-[1,2,4] 트리아졸 -3-일)-티오펜-2-일]-7-(1-프로필-부틸)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 1-메틸-1,2,4-트리아졸 (0.120, 1.43 mmol) 및 무수 THF (5 mL)를 충전하고, 불활성 대기하에 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (2.5 M 헥산, 0.60 mL, 1.43 mmol)을 첨가하고, 온도를 낮추어 30분 동안 교반하였다. 무수 염화아연 (0.400 g, 2.90 mmol)을 한번에 첨가하고, 온도를 낮추어 15분 동안 교반하였다. 상기 반응물이 실온으로 가온되도록 하고, 30분 더 교반하였다. 상기 반응물에 무수 THF (5 mL) 중 3-(5-브로모-3-클로로-티오펜-2-일)-7-(1-프로필-부틸)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5a]피리미딘 (0.500 g, 1.27 mmol)을 첨가하였다. 15분 동안 아르곤 양압으로 탈기시켜 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O) (0.060 g, 0.052 mmol)을 첨가하였다. 밤새 오일조 (90℃)에서 불활성 대기하에 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감 압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (25％ THF/헥산) → 0％ 헥산/100％ (25％ THF/헥산)을 20％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체 (0.140 g, 66％)를 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 441.7 (M+1)⁺.

하기 화합물을 본질적으로 실시예 20에 기재한 바와 같이 하여 제조하였다:

실시예 번호	화학적 명칭	MS (m/z)
21	3-[3-클로로-5-(2-메틸-2H-[1,2,4]트리아졸-3-일)-티오펜- 2-일]-7-이소프로필-2,5-디메틸-피라졸로[1,5a]피리미딘	387.0 (M+1)⁺

제조예 17

2- 브로모 -5- 플루오로 -3- 메틸벤조[b]티오펜

아세토니트릴 (350 mL) 중 5-플루오로-3-메틸벤조[b]티오펜 (50.32 g, 0.303 mol)의 자성 교반된 용액에 N-브로모숙신이미드 (56.32 g, 0.318 mol, 1.05 당량)를 처리하였다. 초기 흡열로 반응 온도가 17℃로 감소되었다. 이후의 발열로 반응 온도가 10분의 기간에 걸쳐 40℃로 증가되었고, 이 시점에 상기 반응물을 빙수조에 넣어 18℃ 내지 20℃로 냉각시켰다. 상기 반응물을 실온에서 35분 더 교반하고, 생성된 슬러리를 물 (350 mL)로 서서히 희석하였다. 상기 슬러리를 10분 동안 교반하였다. 생성물을 여과하여 50:50 아세토니트릴:물 (100 mL)로 세척하고, 무색의 결정질 고체 (65.56 g, 88％)가 수득될 때까지 건조시켰다.

실시예 22

3-(5- 플루오로- 3- 메틸 - 벤조[b]티오펜 -2-일)-7-이소프로필-2,5- 디메틸피라졸 로[1,5-a]피리미딘

오븐 건조된 플라스크에 2-브로모-5-플루오로-3-메틸-벤조[b]티오펜 (0.490, 2.00 mmol) 및 무수 THF (5 mL)를 충전하고, 불활성 대기하에 -50℃로 냉각시켰다. n-부틸 리튬 (2.5 M 헥산, 0.80 mL, 2.0 mmol)을 적가하고, 30분 동안 교반하였다. 무수 염화아연 (0.550 g, 4.00 mmol)을 한번에 첨가하고, 30분 동안 온도를 낮추어 교반하였다. 상기 반응물이 실온으로 가온되도록 하고, 30분 더 교반하였다. 무수 THF (5 mL) 중 7-이소프로필-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5a]피리미딘 (0.316 g, 1.00 mmol)을 첨가하였다. 아르곤 양압으로 15분 동안 탈기시키고, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로로메탄 (0.082 g, 0.1 mmol)을 첨가하였다. 오일조 (90℃)에서 불활성 대기하에 밤새 환류시켰다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시켜 포화 염화암모늄으로 켄칭시키고, 에틸 아세테이트 (75 mL)로 희석하였다. 수성 부분을 분리하여 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출하였다. 유기 상들을 합하여 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (20％ 에틸 아세테이트/헥산)을 20％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 회백색 발포체 (0.206 g, 58％)를 수득하였다. ES/MS m/z 354.0 (M+1)⁺.

하기 화합물을 본질적으로 실시예 22에 기재한 바와 같이 하여 제조하였다:

실시예 번호	화학적 명칭	MS (m/z)
23	7-(1-에틸-프로필)-3-(5-플루오로-3-메틸- 벤조[b]티오펜-2-일)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5- a]피리미딘	(APCI) 382.2 (M+1)⁺
24	7-(1-프로필-부틸)-3-(5-플루오로-3-메틸- 벤조[b]티오펜-2-일)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5- a]피리미딘	(APCI) 410.0 (M+1)⁺

제조예 18

보론산 , 5- 플루오로 -3- 메틸 - 벤조[b]티오펜 -2-일

건조 플라스크에서 5-플루오로-3-메틸-벤조[b]티오펜 (312 mg, 1.88 mmol)을 무수 THF (4 mL)와 합하였다. -78℃로 냉각시켜 n-부틸리튬 (헥산 중 1.6 N, 1.18 mL, 1.90 mmol)을 첨가하였다. 1.5시간 동안 -78℃에서 교반한 후에 트리메틸보레이트 (0.23 mL, 2.02 mmol)를 첨가하였다. 3시간 동안 교반하고, 상기 조가 -20℃에 이르게 하였다. 상기 반응물이 산성 (pH = 4)이 될 때까지 5 N 염산을 첨가하였다. 물로 희석하고 에틸 아세테이트 (3×)로 추출하였다. 유기 부분들을 합하여 황산나트륨에서 건조시켜 여과하고 증발시켰다. 염화메틸렌 중에서 연화처리하여 백색 고체 (258 mg, 65％)를 수득하였다. ES/MS m/z 209 (M-1)^-.

실시예 25

7-부틸-3-(5- 플루오로 -3- 메틸 -벤조[b]티오펜-2-일)-2,5-디메틸- 피라졸로 [1,5-a]피리미딘

테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O) (31 mg, 0.03 mmol) 및 7-부틸-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (174 mg, 0.53 mmol)을 탈기된 무수 THF (10 mL)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 2-보론산-5-플루오로-3-메틸-벤조[b]티오펜 (111 mg, 0.53 mmol) 및 수성 탄산나트륨 용액 (112 mg, 물 5 mL 중 1.06 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃로 24시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시켰다. 에테르로 희석한 후에 물 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴/물/TFA로 용출시키는 HPLC로 정제하여 표제 화합물 (55 mg, 28％)을 수득하였다. ES/MS m/z 368 (M+1)⁺.

제조예 19

4- 클로로 -티오펜-2-카르보니트릴

22-L 반응 플라스크에 냉각조, 공기 교반기, 기체 주입 튜브 및 온도계 프로브를 장착하였다. 상기 플라스크를 질소로 퍼징(purging)한 후에 AlCl₃ (1025 g, 7.69 mol) 및 CHCl₃ (6.6 L, 16.5 vol.)을 충전하였다. 상기 혼합물을 0℃ 내지 5℃로 냉각시키고, 2-티오펜 카르보니트릴 (400 g, 3.66 mol)을 첨가 깔때기를 사용하여 10분 내지 15분에 걸쳐 적가하면서 온도를 10℃ 이하로 유지시켰다. 상기 혼합물에 Cl₂ 기체 (300 g, 4.23 mol, 1.16 당량)를 10℃ 이하에서 표면 아래로 흘려(subsurface) 1.25시간에 걸쳐 충전하였다. 상기 반응의 진행을 GC로 모니터링하 였다. 반응 혼합물의 분취액을 6 N HCl로 켄칭시켜 EtOAc로 추출하고 Na₂SO₄에서 건조시켜 여과하고, 여액을 주입하였다.

GC 분석에서 상기 반응이 완료된 것으로 나타났을 때 ((출발 물질:생성물:디클로로 물질)의 비율이 대략 (1:5.8:1) 면적％ GC가 되면, 상기 반응이 완료된 것으로 간주함), 6 N HCl (8.0 L)을 첨가 깔때기를 사용하여 1.5시간에 걸쳐 적가하면서 온도를 20℃ 이하로 유지하였다. HCl 첨가로 강력한 발열이 일어났고, 기체가 발생하였다. 상기 반응물을 분별 깔때기로 옮겨서 층들을 분리하였다. 수성 층을 CHCl₃ (4.0 L)으로 추출하여 클로로포름 층들을 합하고, 물 (6.0 L)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄에서 건조시켜 여과하고, 진공하에 농축시켜 옅은 황색 반-고체 (575 g, 109％)를 수득하였다. GC (60℃ → 280℃ 온도 구배) 면적％ 분석에서는, 다량의 불순물을 갖는 대략 68％ 생성물 (t_체류시간(t_ret) = 6.5분)이 미반응 출발 물질 (t_체류시간 = 5.1분) 및 이염소화 생성물 (t_체류시간 = 7.4분)인 것으로 나타났다. GC 방법: 컬럼: DB1, T_주입 = 300℃, T_초기 = 60℃, t = 2.0분, T_최종 = 280℃, 속도 = 18℃/분.

제조예 20

4- 클로로 -2-티오펜 카르복스아미드

12-L 반응 플라스크에 냉각조, 공기 교반기 및 온도계 프로브를 장착하고, KOH (288.6 g, 5.143 mol) 및 물 (6.04 L)로 충전하여 약 31℃로 발열하는 용액을 형성하였다. 상기 용액이 약 28℃로 냉각되도록 하고, 상기 혼합물에 4-클로로-2-티오펜 카르보니트릴 (671.3 g, 4.675 mol)을 충전하였다 (소량의 고체는 용해되지 않았음). EtOH (675 mL)를 첨가하고, 이 시점에 점진적인 발열이 일어나 1시간 내지 1.5시간에 걸쳐 약 38℃까지 계속되었다. 상기 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공하에 여과하여 물로 세척하고 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 상기 고체를 EtOAc (10.0 L) 중에 용해하고 Na₂SO₄ 및 활성 목탄으로 1시간 내지 2시간 동안 처리한 후에 여과하고 EtOAc로 세척하였다. 여액을 45℃의 회전 증발기에서 고체가 침전되기 시작할 때까지 농축시켰다. 진공을 해제하고, 온도를 60℃ 내지 65℃로 증가시켜 고체를 재용해했다. 60℃에서 교반하면서 헵탄 (3.5 L)을 서서히 첨가하여 고체를 침전시켰다. 15분 내지 20분 동안 60℃에서 교반한 후에 상기 혼합물을 30℃ 내지 40℃로 냉각시켜 여과하였다. 상기 고체를 헵탄 (2×0.75 L)으로 세척하고 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (235.4 g, 31％)로서 수득하였다. 여액으로부터 2번째 수확물 (67.8 g, 9％)을 수득하였다.

제조예 21

4- 클로로 -N- 디메틸아미노메틸렌 -2-티오펜 카르복스아미드

5-L 반응 플라스크에 가열 맨틀, 공기 교반기, 딘-스타르크(Dean-Stark) 장치 및 온도계 프로브를 장착하였다. 4-클로로-2-티오펜 카르복스아미드 (300 g, 1.856 mol) 및 디메틸포름아미드 디메틸아세탈 (872 mL)을 충전하여 슬러리를 형성 시켰다. 상기 혼합물을 점차 96℃가 되도록 가열하면서, 증류물 (대개가 MeOH)을 수집하였다. 가열 맨틀을 치우고, 25℃ 이하로 냉각시켰다. 물 (3.0 L)을 첨가 깔때기를 사용하여 첨가하고, 온도를 35℃ 이하로 유지시켰다. 상기 반응 혼합물을 EtOAc (3.0 L, 1.5 L)로 추출하였다. 유기물을 합하여 물 (1.5 L)로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄에서 건조시켜 여과하고, 진공하에 농축시켜 조 생성물 (400 g)을 수득하였다.

상기 물질을 50℃ 내지 60℃에서 EtOAc (320 mL, 0.8 vol.) 중에 용해하였다. 헵탄 (1700 mL, 4.25 vol.)을 서서히 첨가하면서, 온도를 점차 70℃로 증가시켰다. 상기 탁한 용액에 시드(seed) 결정을 첨가하여 침전이 개시되도록 하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후에 여과하고, 헵탄으로 세척하였다. 상기 고체를 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (329.8 g, 82％)로서 수득하였다.

제조예 22

5-(4- 클로로 -티오펜-2-일)-1- 메틸 -1H-[1,2,4] 트리아졸

3-L 반응 플라스크에 냉각조, 공기 교반기 및 온도계 프로브를 장착하고, 4-클로로-N-디메틸아미노메틸렌-2-티오펜 카르복스아미드 (155 g, 0.715 mol) 및 HOAc (1500 mL)를 충전하여 용액을 형성시켰다. 빙수 냉각조를 사용하여 온도를 30℃ 이하로 유지하고, 메틸히드라진 (33.2 g, 0.721 mol)을 첨가 깔때기를 사용하여 15분 내지 20분에 걸쳐 적가하여 밝은 황색 슬러리를 형성시켰다. 상기 반응물을 점차 90℃가 되도록 가열하고, 90℃에서 30분 동안 유지시켰다. 상기 혼합물을 GC로 분석한 후에 상기 반응물을 약 70℃로 냉각시켜 농후한 오일/슬러리로 농축시켰다. 물 (1.67 L)을 서서히 첨가하여 고체가 침전되도록 하였고, 상기 혼합물을 30℃ 미만으로 냉각시켜 여과하고, 물 (1.67 L)로 세척하였다. 습윤 고체 (125.8 g)를 따뜻한 t-부틸 메틸 에테르 (1.64 L) 중에 용해하여 Na₂SO₄에서 건조시켜 여과하고 건조될 때까지 농축시켜 표제 화합물을 옅은 황색 고체 (85.8 g, 60％)로서 수득하였다.

제조예 23

5-(5- 브로모 -4- 클로로 -티오펜-2-일)-1- 메틸 -1H-[1,2,4] 트리아졸

3-L 반응 플라스크에 냉각조, 공기 교반기 및 온도계 프로브를 장착하고, 5-(4-클로로-티오펜-2-일)-1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸 (105.3 g, 0.527 mol), 아세토니트릴 (1053 mL) 및 HOAc (105 mL)를 충전하여 용액을 형성시켰다. N-브로모숙신이미드 (103.2 g, 0.580 mol)를 30분 내지 60분에 걸쳐 조금씩 첨가하면서, 온도를 31℃ 이하로 유지하였다. 1시간 동안 교반하였고, 이 시점에 GC 분석에서는 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 물 (2.1 L, 20 vol.)에 부어 30분 동안 교반하여 여과하고 물 (2×1 L)로 세척하였다. 상기 물질을 45℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 옅은 황색 고체 (123.0 g, 84％)로서 수득하였다.

실시예 26

7-부틸-3-[3- 클로로 -5-(2- 메틸 -2H-[1,2,4] 트리아졸 -3-일)-티오펜-2-일]-2,5- 디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘

5-(5-브로모-4-클로로-티오펜-2-일)-1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸 (169 mg, 0.61 mmol)을 무수 THF (5 mL)에 첨가하였다. -78℃로 냉각시켰다. tert-부틸 리튬 (0.81 mL, 1.37 mmol, 펜탄 중 1.7 M)을 첨가하였다. 45분 동안 교반한 후에 염화아연 (1.5 mL, 1.76 mmol, THF 중 0.5 M)을 서서히 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후에 실온으로 가온하고, 15분 동안 교반하였다. 비스(트리-t-부틸포스핀)팔라듐(O) (62 mg, 0.12 mmol) 및 7-부틸-3-요오도-2,5-디메틸-피라졸로[1,5-a]피리미딘 (200 mg, 0.61 mmol)을 첨가하였다. 환류시까지 밤새 가열하였다. 상기 반응물을 셀라이트(Celite)^®로 여과하고, 건조될 때까지 농축시켰다. 헥산 중 0％ → 50％ 에틸 아세테이트로 용출시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (36 mg, 15％)을 수득하였다. ES/MS m/z (³⁵Cl) 401 (M+1)⁺.

실시예 27

{5-[7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸- 피라졸로 [1,5-a]피리미딘-3-일]-4- 메틸 -티오펜-2-일}-디메틸-아민 히드로클로라이드

3-(5-니트로-3-메틸-티오펜-2-일)-7-(1-에틸-프로필)-2,5-디메틸-피라졸로[1,5a]피리미딘 (0.36 g, 1.0 mmol)을 10％ 팔라듐/탄소 (0.20 g)를 함유하는 THF (5 mL) 중에 용해하고, 진공/수소 대기 플러시 (3×)로 탈기시켜 수소 대기 (55 psi)하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC를 사용하여 반응이 완료된 것을 확인하였다. 상기 반응물을 THF (50 mL)로 희석하고, 셀라이트^®로 여과하였다. 수소화나트륨을 60％ 오일 분산액 (0.10 g, 2.25 mmol)으로서 첨가하고, 20분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응물에 요오도메탄 (0.140 mL, 2.25 mmol)을 첨가하고, 밀폐된 반응 용기에서 밤새 50℃에서 교반하였다. 상기 반응물을 물로 켄칭시켜 에틸 아세테이트 (100 mL)로 희석하였다. 유기 부분을 물, 포화 염화암모늄 및 염수로 세척하였다. 무수 황산마그네슘에서 건조시켜 여과하고, 감압하에 오일로 농축시켰다. 생성된 잔류물을 100％ 헥산/0％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산) → 0％ 헥산/100％ (25％ 에틸 아세테이트/헥산)을 10％ 증가분의 단계 구배로 사용하여 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 발포체 (0.145 g, 41％)를 수득하였다. 상기 물질 (0.13 g, 0.365 mmol)을 메탄올 (3 mL) 중에 용해하여 4.0 M HCl-디옥산 (3 mL)을 첨가하였다. 상기 반응물을 30분 동안 교반하고, 상기 반응물에 질소 양압을 가하였다. 진공 오븐에서 건조시켜 백색 고체 (0.125 g)를 수득하였다. ES/MS m/z 357.2 (M+1)⁺.

실시예 A

생체외 결합을 이용한 생체내 역가 평가

생체내 역가를 평가하기 위해서, 본 발명의 화합물을 생체외 결합을 이용하여 평가하였다. 문헌 [D. R. Gehlert et al., EJP 509:145-153 (2005)]에서 제공 되는 바와 같은 절차를 이용하여, 화합물을 경구 경로로 래트에게 투여하였다. 이어서, ¹²⁵I-소바긴(sauvagine)이 소뇌에 결합하는 것을 상기 문헌 [Gehlert et al.]에 기재된 바와 같이 생체외로 평가하였다. 예를 들어, 실시예 20의 화합물은 10 mg/kg에서 74％ 억제를 제공하였다.

실시예 B

CRF1 여과 결합 검정

결합 검정을 수행하기에 충분한 수용체 밀도를 갖는 재조합 세포주를 생성한다는 측면에 있어서 플라스미드-기재의 인간 CRF1 발현이 갖는 한계점은, 스탠포드(Stanford)에 라이센스가 있는 포에닉스(Phoenix) 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 해결하였다. 안정적인 HEK-hCRF1 세포주를 사용하여 막을 제조하였고, 결합 반응 (200 ㎕)은 다음과 같이 셋업하였다: ¹²⁵I-소바긴 50 ㎕ (최종 농도: 0.2 nM), 화합물 50 ㎕ 및 CRF1 막 100 ㎕ (25 ㎍/반응). 상기 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에 전처리된 FB 밀리포어(Millipore) 유리 섬유 여과 플레이트 (96웰)에 여과하여 종결시켰다. 상기 플레이트를 빙냉 검정 완충제 (50 mM tris, 12.5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl_2,0.05％ BSA, pH 7.2)로 2회 세척하여 밤새 공기 건조시키고, 마이크로신트(Microscint) 40을 100 ㎕ 사용하여 마이크로베타(MicroBeta) 계수기에서 계수하였다. 비-특이적 결합 (NSB)을 0.5 μM의 표지되지 않은 소바긴의 존재하에 결정하였다. 전형적으로 3벌 측정을 수행하였고, 중앙(median) 데이타 값을 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)으로 플롯팅하였다.

상기 검정을 이용하여, 본 발명의 예시된 화합물 (실시예 2, 실시예 3, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8의 화합물은 제외함 - 이것들은 다른 실시예 화합물을 위한 중간체로 사용되며 시험하지 않았음)은 롤러/부착(roller/adherent) 세포에서 ¹²⁵I-소바긴 (4 nM)의 결합을 억제하였고, 이때의 Ki (억제 상수)는 500 nM 이하였다. 예를 들어, 실시예 20의 화합물은 Ki가 4.4 nM로 나타났다.

실시예 C

CRF2 여과 결합 검정

결합 검정을 수행하기에 충분한 수용체 밀도를 갖는 재조합 세포주를 생성한다는 측면에 있어서 플라스미드-기재의 인간 CRF2 발현이 갖는 한계점은, 스탠포드에 라이센스가 있는 포에닉스 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 해결하였다. 안정적인 HEK-hCRF2 세포주를 사용하여 막을 제조하였고, 결합 반응 (200 ㎕)은 다음과 같이 셋업하였다: ¹²⁵I-소바긴 50 ㎕ (최종 농도: 0.2 nM), 화합물 50 ㎕ 및 CRF2 막 100 ㎕ (25 ㎍/반응). 상기 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에 전처리된 FB 밀리포어 유리 섬유 여과 플레이트 (96웰)에 여과하여 종결시켰다. 상기 플레이트를 빙냉 검정 완충제 (50 mM tris, 12.5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl_2,0.05％ BSA, pH 7.2)로 2회 세척하여 밤새 공기 건조시키고, 마이크로신트 40을 100 ㎕ 사용하여 마이크로베타 계수기에서 계수하였다. 비-특이적 결합 (NSB)을 0.5 μM의 표지되지 않은 소바긴의 존재하에 결정하였다. 별법으로, 화합물을 섬광 근접(Scintillation Proximity) 검정을 이용하여 평가하였다. 본 검정 은 다음과 같이 셋업하였다: ¹²⁵I-소바긴 50 ㎕ (최종 농도: 0.2 nM), 화합물 50 ㎕ 또는 표지되지 않은 소바긴 (NSB) 및 맥아 응집소 (WGA) SPA 비드 250 ㎍과 CRF2 막 (1.5 ㎍/반응)을 함유하는 100 ㎕. 상기 플레이트를 4시간 내지 5시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에 200×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 결합된 방사능을 월락 트릴룩스(Wallac Trilux) 섬광 계수기로 평가하였다. 결합은 전형적으로 3벌 측정을 수행하였고, 중앙 데이타 값을 그래프 패드 프리즘으로 플롯팅하였다. 처음에는 화합물들을 고정된 농도에서 스크리닝하였고, 충분한 활성이 나타난 경우에는 그후에 농도-반응 곡선을 생성하였다.

바람직하게, 본 발명의 화합물은 CRF2 수용체에 대하여 (CRF1에 비해) 약한 친화도를 나타내었다. 예를 들어, 실시예 20의 화합물은 50 μM의 농도에서 39％ 억제를 나타냈다.

실시예 D

생체이용률 및 약력학 성질

분포 용적 (volume of distribution, Vdist)은 신체 내 약물의 양을 혈액 또는 혈장 중 약물의 농도와 관련시킨다. 분포 용적은 약물의 총량이 혈액 또는 혈장 중의 농도와 동일한 농도로 신체 내에 함유되는데 필요한 유체 부피를 지칭한다: Vdist = 신체 내 약물의 양/혈액 또는 혈장 중 약물의 농도 [Goodman and Gillman's]. 10 mg의 투여량 및 10 mg/L의 혈장 농도의 경우에, 분포 용적은 1 리터가 된다. 분포 용적은 약물이 혈관외 조직에 존재하는 정도를 반영한다. 많은 분포 용적은 화합물이 조직 성분에 결합하는 경향을 혈장 단백질 결합과 비교하여 반영한다. 임상 셋팅에서, Vdist는 항정 상태 농도를 달성하기 위한 로딩(loading) 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다.

분포 용적에 대해 시험하기 위해서, 수컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트 (N = 3)에게 1 mg/kg의 화합물을 정맥내 단일 투여로 투여하였다. 투여후 제0.08시간 내지 제24시간 범위의 시점에서 여러개의 혈장 샘플을 수집하였다. 혈장 샘플을 LC/MS/MS로 분석하여 혈장 농도를 결정하였다. 혈장 약력학 계산을 수행하여 Vdist 및 혈장 청소율(plasma clearance) (Clp)을 비롯한 약력학 파라미터를 결정하였다.

바람직하게, 본 발명의 화합물은 CP154526 [Schulz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 93:10477 (1996)] 및 NBI30775 [Chen et al., Drug Development Research, 65:216 (2005)]와 같은 다른 CRF 길항제에 비해 유리한 생체이용률 프로파일을 가졌다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염:

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹ 및 R²는 독립적으로 수소 또는 C₁-C₃알킬이고,

R³은
이고,

R⁴는 Cl 또는 메틸이고,

R⁵는 수소, Br, 니트로, 메톡시, 메톡시메틸, 디메틸아미노, 에톡시카르보닐, 아세트아미도, 아세톡시,
이다.
제1항에 있어서, R¹ 및 R²가 독립적으로 에틸 또는 n-프로필인 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, R³이
인 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵가 메톡시, 메톡시메틸, 디메틸아미노 또는
인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
우울증, 불안증, 알콜 또는 물질 남용, 비만, 고혈압, 대사 증후군, 과민성 대장 증후군, 간질, 졸중, 수면 장애, 알러지, 편두통, 월경전 증후군, 불임, 성 기능장애, 선천성 부신 과형성, 쿠싱병, 조산, 스트레스-유도된 위 궤양화, 염증 장애, 뇌하수체 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양, 만성 피로 증후군, 근섬유통(fibromyalgia), 내장통 또는 다발성 경화증의 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기한 장애를 치료하는 방법.
불안증 또는 우울증의 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 불안증 또는 우울증을 치료하는 방법.
알콜 또는 물질 남용의 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 알콜 또는 물질 남용을 치료하는 방법.
우울증, 불안증, 알콜 또는 물질 남용, 비만, 고혈압, 대사 증후군, 과민성 대장 증후군, 간질, 졸중, 수면 장애, 알러지, 편두통, 월경전 증후군, 불임, 성 기능장애, 선천성 부신 과형성, 쿠싱병, 조산, 스트레스-유도된 위 궤양화, 염증 장애, 뇌하수체 또는 이소성 뇌하수체-유래의 종양, 만성 피로 증후군, 근섬유통, 내장통 또는 다발성 경화증의 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도.
불안증 또는 우울증의 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도.
알콜 또는 물질 남용의 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염의 용도.
의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.