KR20090039801A - 항-ｉｌ-6 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-6에 특이적으로 결합하는 신규한 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본원에 기술된 VH 영역으로부터 선택된 중쇄 가변 (VH) 영역 및 이의 아미노산 변이체, 및/또는 본원에 기술된 VL 영역으로부터 선택된 경쇄 가변 (VL) 영역 및 이의 아미노산 변이체를 포함한다. 본 발명은 또한, IL-6 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 및 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

항-ＩＬ-6 모노클로날 항체 및 이의 용도 {ANTI-IL-6 MONOCLONAL ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 모노클로날 항체 및 질환 및 질병 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 사이토킨 IL-6에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 및 IL-6 활성 또는 발현과 관련된 질환 및 질병 치료를 위한 이들 항체의 용도에 관한 것이다.

인터류킨-6 (IL-6)은 성장 자극 및 전염증 활성을 나타내는 22 내지 27kDa의 분비 당단백질이다. IL-6은 인터페론-β2 (IFN-β2), IL-1 유도성 26-kDa 단백질, 간세포-자극 인자, 세포독성 T-세포 분화 인자, 및 B-세포 자극 인자로서 공지되어 있다 (Trikha et al., Clin. Cancer Res. 9:4653-4665 (2003)). IL-6는 다양한 세포 유형에 의해 분비된다. IL-6는 두개의 막 당단백질로 이루어진 고친화도 수용체 복합물에 결합함으로써 이의 활성을 발휘하게 된다: 낮은 친화도로 IL-6에 결합하는 80kDa 성분 수용체 (IL-6R) 및 그 자체로는 IL-6에 결합하지 못하나 복합물에 의한 IL-6의 고친화도 결합에 요구되는 130kDa의 시그널-변환 성분 (gp130) (도 11 참조; BioCarta). IL-6R은 트랜스멤브레인 금속단백질분해효소에 의해 절단되어 가용성 IL-6R을 생성시킬 수 있다.

IL-6 혈액 수준은 다양한 감염, 염증 및 자가면역 질환, 및 감염, 외상 및 면역학적 자극에 의해 자극된 다른 사이토킨의 증가된 합성과 관련된 암에서 증가된다 (Trikha et al., Clin. Cancer Res. 9:4653-4665 (2003)).

IL-6는 다발골수종 (Rossi et al., Bone Marrow Transplantation 36:771-779 (2005)), 림프종 (Emilie et al., Blood 84:2472-2479 (1994)), 신경학적 질병 예컨대, 신경퇴행, 성상교세포증 및 뇌혈관신생 (Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10061-10065 (1993)), 자가면역 질환 (예컨대, 류마티스 관절염), 염증 질환, 알츠하이머병, 심근경색증, 파제트병, 골다공증 (osteoporosis), 고체 종양, 전립선 및 방광 암 (Trikha et al., Clin. Cancer Res. 9:4653-4664 (2003)), 패혈성 쇼크, 이식 (transplant), 중추신경계의 급성 감염, 심점액종 (cardiac myxoma) (Wijdenes et al., Mol. Immunol. 28:1183-1192 (1991)), 종양-유도된 악액질 (tumor-induced cachexia) (Cahlin et al., Cancer Res. 60:5488-5489 (2000)), 암-관련 우울증 (cancer-associated depression), 및 뇌 종양에 이차적인 뇌부종 (cancer edema secondary to brain tumor) (Musselman et al., Am.J.Psychiatry 158:1252-1257 (2001))과 같은 다양한 질환 및 질병에 관련되었다.

또한, 항-IL-6 항체는 수개의 질환 및 질병을 치료하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 항-IL-6 모노클로날 항체는 생체내 및 실험관내 둘 모두에서 골수종 세포의 증식을 차단하는 것으로 입증되었다 (Rossi et al., Bone Marrow Transplantation 36:771-779 (2005)). 만성 류마티스 관절염 환자로의 항- IL-6 항체의 투여는 질환의 징후를 완화시키는 것으로 밝혀졌다 (Wendling et al., J.Rheumatol. 20:259-262 (1993)). 항-IL-6 항체는 AIDS-관련 림프종 (Emilie et al., Blool 84:2472-2479 (1994)), 및 전이성 신장세포 암종 (Blay et al., Int.J.Cancer 72:424-430 (1997))를 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다양한 다른 질환 및 질병을 치료하는데 항-IL-6 항체를 투여하는 것을 포함하는 임상 결과는 문헌 [Trikha et al., Clin. Cancer Res. 9:4653-4665 (2003)]에 요약되어 있다.

항-IL-6 항체는 당해분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터 유래된 리세이핑된 (reshaped) 인간 (즉, 인간화된) 항-IL6 모노클로날 항체 (SK2)는 U.S. 특허 5,618,700 및 5,856,135에 기술되어 있다. 기타 항-IL-6 항체는 CLB-6/8 (Brakenhoff et al., J. Immunol. 145:561-568 (1990))으로서 공지된 항체 및 CLB8로서 공지된 이의 키메라 형태 (Van Zaanen et al., J.Clin. Invest. 98:1441-1448 (1996))를 포함한다. B-E8로 불리는 뮤린 항-IL-6 모노클로날 항체 (mAb)는 다양한 IL-6-관련 질환 및 질병을 치료하는데 임상적으로 사용되었다 (예를 들어, 문헌 [Bataille et al., Blood 86:685-691 (1995), Rossi et al., Bone Marrow Transplantation 36:771-779 (2005), Haddad et al., Blood 15:1590-1597 (2001) 및 Emilie et al., Blood 84:2472-2479 (1994)] 참조).

뮤린 항-IL-6 항체를 포함하는 뮤린 항체의 사용은 표적 항원에 대한 일정치 않은 선택도, 짧은 혈청 수명, 및 인간 항-뮤린 항체 (HAMA)의 발생과 같은 문제를 갖는다. 이러한 문제는 키메라 항체 (여기서, 설치류 불변 영역은 이들의 인간 대 응물로 치환됨) 또는 인간화된/CDR-이식된/리세이핑된 항체 (여기서, 단지 CDR만이 비-인간 기원 (origin)이다)의 개발에 의해 어느 정도 축소될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Vaughan et al., Nat. Biotech. 16:535-539 (1998)] 참조). 그럼에도 불구하고, 많은 실제적인 제한 예컨대, (1) 인간화된 mAb의 효과적인 작제를 위한 경로에 대한 제한된 수의 옵션, (2) 항체 구조 또는 모델링의 더욱 tkd세한 지식에 대한 필요성, (3) 친화도 보유와 유입된 이종 아미노산 사이의 절충으로 인한 예측불가능한 면역원성, 및 (4) 원종 mAb가 기원되는 동물에 대한 항체 레퍼토리의 한계가 인간화된 항체와 관련된다 (Vaughan et al., Nat. Biotehcnol. 16:535-539 (1998)). 이들 제한은 인간 모노클로날 항체의 사용에 의해 다루어 질 수 있다 (Lonberg, Nat. Biotehcnol. 23:1117-1125 (2005)).

따라서, 인간 항-IL-6 mAb를 포함하는, 임상 적용을 위한 추가적인 항-IL-6 모노클로날 항체가 요구된다. 본 발명은 당해분야에 이러한 요구에 대해 다루고 있다.

발명의 요약

본 발명은 IL-6에 특이적으로 결합하는 신규한 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본원에 기술된 VH 영역으로부터 선택된 가변 중쇄 (VH) 영역 및 이의 아미노산 변이체, 및/또는 본원에 기술된 VL 영역으로부터 선택된 가변 경쇄 (VL) 영역 및 이의 아미노산 변이체를 포함한다.

본 발명의 일 예시적인 구체예에서, 다중 VH 및 VL 영역은 인간 VH 및 VL 유 전자의 라이브러리로부터 수득하였다. 라이브러리로부터 수득된 인간 VH 영역을 함유하는 항체 중쇄는 공지된 뮤린 항-IL-6 mAb (즉, B-E8)로부터의 경쇄와 쌍을 이루었다. 마찬가지로, 라이브러리로부터 수득된 인간 VL 영역을 함유하는 항체 경쇄는 공지된 뮤린 항-IL-6 mAb (즉, B-E8)로부터의 중쇄와 쌍을 이루었다. 생성된 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 이들의 능력에 대해 스크리닝되었다. 이러한 과정으로부터, 18개 인간 VL (SEQ ID NO:1 내지 18로 나타냄) 및 7개 인간 VH (SEQ ID NO: 19 내지 25)를 확인하였다.

확인된 VL 모두는 확인된 VH 모두와 교차 쌍을 이루었다. 생성된 항체를 ELISA에 의해 IL-6로의 결합 친화도 및 IL-6 유도된 세포 증식을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 이러한 과정으로부터, 33개 인간 VH/VL 쌍이 실질적인 결합 친화도 및 차단 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

아미노산 치환기가 상기-기술된 공정에 의해 확인된 특정 인간 VH 및 VL로 유입되었다. 변이체 VH 및 VL이 각각 인간 VL 및 VH와 쌍을 이루었고, 생성된 항체를 IL-6 결합 친화도 및 차단 활성에 대해 다시 시험하였다. 이러한 실험으로부터, 수개의 항체가 원래의 뮤린 B-E8 항체 (또는 이의 키메라)의 활성에 필적하는 결합 및 차단 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명은 상기 개략되고, 하기 실시예에 더욱 상세히 기술된 공정에 의해 수득된 변이체 VH 및 VL의 임의의 조합을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 임의의 VH 및/또는 VL 영역을 엔코딩하는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 인간 IL-6에 대한 종 특이성, 인간 IL-6로의 결합성 또는 인간 IL-6의 검출에서의 보조성을 입증하였다. 일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 인간 및 원숭이 IL-6에 결합하거나 인간 및 원숭이 IL-6의 검출을 보조하지만, 뮤린 또는 래트 IL-6에 대해서는 이와 같은 기능을 갖지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 세포, 예컨대, 뮤린 B9 (ECACC) 골수종 세포 또는 인간 U266 골수종 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 IL-6에 결합하지만, 다른 IL-6 슈퍼패밀리 (superfamily) 멤버에는 결합하지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여, IL-6의 이의 수용체로의 결합을 억제한다.

본 발명은 또한, (i) 본 발명의 항체를 엔코딩하는 하나 또는 그 초과의 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포를 배양하고, (ii) 배양 배지로부터 항체를 회수하는 것을 포함하여, 본 발명의 항체를 생성하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체를 포함하는 약제 조성물을 포함한다. 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, IL-6 활성 또는 발현과 관련된 질환 및/또는 질병을 치료하거나 예방하 는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 본 방법은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료학적 또는 예방학적 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 질환 또는 질병은 IL-6에 의해 매개되거나, IL-6와 관련되거나, IL-6의 작용에 의해 초래되는 질환 또는 질병을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료하려는 질환 또는 질병은 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생 (aberrant or inappropriate angiogenesis)과 관련된 질환, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염 (idiopathic juvenille arthritis), 및 섬유증 (fibrotic conditions)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한, IL-6에 의해 매개되거나, IL-6과 관련되거나, IL-6의 작용에 의해 초래되는 질환 또는 질병 치료를 위한 의약 제조시 본 발명의 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환 또는 질병, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 및 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병의 치료를 위한 의약 제조시 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, IL-6에 의해 매개되거나, IL-6과 관련되거나, IL-6의 작용에 의해 초래되는 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환 또는 질병, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 및 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병의 치료를 위한 의약 제조시 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 항체내에 포함될 수 있는 SEQ ID NO: 19-25로 나타낸 예시적인 인간 VH 영역의 정렬을 나타낸다.

도 2는 IL-6 결합 억제 분석의 결과를 나타내며, 여기서, 바이오티닐화된 인간 재조합체 IL-6를 다양한 항-IL-6 항체와 인큐베이션하고, IL-6 수용체 함유 U266 세포를 첨가하였다. 유세포분석기 분석 (flow cytometry analysis)을 이용하여 다양한 항-IL-6 항체 농도에서 IL-6 결합의 억제율을 정량화하였다.

도 3은 점돌연변이유발에 의해 생성된 라이브러리로부터 mAb의 친화도 선택에 이용된 일반적 공정을 나타낸다.

도 4는 IL-6 결합 억제 분석 결과를 나타내며, 여기서, 인간 재조합제 IL-6를 다양한 항-IL-6 항체와 인큐베이션한 후, IL-6 수용체 함유 U266 세포를 첨가하였다. 그 후, 정제된 마우스 IL-6 항체 및 APC-컨쥬게이팅된 폴리클로날 염소-항-마우스 이차 항체를 첨가하였다. 유세포분석기 분석을 이용하여 다양한 항-IL-6 항체 농도에서 IL-6 차단 활성을 정량화하였다.

도 5A 및 5B는 결합 특이성 실험 결과를 나타내며, 여기서 대조군 mAb 88 (키메라 B-E8) (도 5A), 또는 후보물 즉, 친화도-증진된 인간 mAb 1339 (도 5B)를 IL-6 슈퍼패밀리 멤버 패널로의 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다.

도 6A 및 7A는 유세포분석기에 분석된 바와 같은, U266 세포상에 발현된 IL- 6 수용체와 IL-6간의 상호작용을 억제하는 IL-6-특이적 mAb의 능력에 대해 시험한 실험 결과를 나타낸다. 각각의 칼럼은 세 실험 +/- 표준 편차의 평균을 나타낸다.

도 6A에서, mAb의 농도는 0.5㎍/ml이다. 각각의 mAb에 있어서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 4개의 칼럼은 각각 100.0, 50.0, 25.0 및 12.5ng/ml의 IL-6 농도에서 IL-6 수용체로의 IL-6 결합 억제율을 나타낸다.

도 7A에서, IL-6의 농도는 500ng/ml이다. 도 7A의 각 mAb에 있어서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 8개 칼럼은 각각 5000, 2500, 1250, 625.0, 156.3, 78.1 및 39.1ng/ml의 mAb 농도에서 IL-6 수용체로의 IL-6 결합의 억제율을 나타낸다.

도 6B 및 7B는 100ng/ml IL-6에서 단일의 대표적인 실험 결과를 나타내며, 이는 유세포분석기에 의해 분석된 바와 같은, U266 세포에서 발현된 IL-6 수용체와 IL-6간의 상호 작용에 대한 다양한 항-IL-6 mAb의 억제 효과를 설명해준다. 진한 실선은 mAb의 부재하의 100ng/ml IL-6 단독을 나타내며; 밝은 실선은 mAb의 존재하의 100ng/ml IL-6를 나타내며; 파선은 IL-6의 부재하의 mAb 단독을 나타낸다. 도 6B에서, 존재하는 경우, mAb의 농도는 0.5㎍/ml mAb이다. 도 7B에서, 존재하는 경우, mAb의 농도는 0.3㎍/ml mAb이다.

도 8은 3개의 별도의 IL-6 결합 억제 분석 결과를 나타내는 요약 차트이다.

도 9는 mAb 1339 이중 유전자 벡터의 맵이다 (H1579 중쇄 가변 영역을 함유하는 중쇄 및 L298 경쇄 가변 영역을 함유하는 경쇄를 발현).

도 10은 mAb 1339 이중 유전자 벡터를 발현하는 다양한 CHO-기재 세포주 분리물로 수득된 mAb 수득량을 나타낸다.

도 11은 IL-6 시그널 경로의 개략적 대표도이다 (바이오카르타 (BioCarta)에서 입수가능).

도 12는 뮤린 B9 (ECACC) 골수종 세포주의 IL-6 독립적 증식을 억제하는 IL-6-특이적 mAb의 능력을 시험한 실험 결과를 나타낸다. IgG1 카파 및 mB-Z1은 각각 인간 및 마우스 IgG1 이소형 대조군 항체이다. 각각의 mAb에 있어서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 7개의 칼럼은 각각 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0.0001ng/ml의 mAb 농도에서 IL-6 (10pg/ml)-유도된 B9 세포 증식의 억제율을 나타낸다. 각각의 칼럼은 3개의 실험적 +/- 표준 편차의 평균을 나타낸다.

도 13은 인간 U266 골수종 세포주의 IL-6-독립적 증식을 억제하는 IL-6-특이적 mAb의 능력을 시험한 실험 결과를 나타낸다. 각각의 mAb에 있어서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 6개 칼럼은 각각 1000, 333, 111, 37, 12 및 4 ng/ml의 mAb 농도에서 IL-6 (500pg/ml)-유도된 U266 세포 증식의 억제율을 나타낸다. 각각의 칼럼은 3개의 실험적 +/- 표준 편차의 평균을 나타낸다.

도 14 및 15는 ELISA에 의해 뮤린 IL-6 (도 14) 또는 래트 IL-6 (도 15)를 검출하는 IL-6-특이적 mAb의 능력을 시험한 실험 결과를 나타낸다. 바이오티닐화된 폴리클로날 항체 (pAb) 대조군은 항-인간 IL-6, 항-마우스 IL-6, 항-래트 IL-6, 및 항-인간 IL-2이다. 샘플 "O"에 있어서는, 어떠한 항체도 첨가하지 않은 것이다. 각각의 샘플에 있어서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 4개의 칼럼은 각각 100, 50, 25 및 12.5ng/ml의 항체 농도에서 100ng/ml 뮤린 또는 래트 IL-6로의 결합과 관련된 광밀도를 나타낸다. 각각의 칼럼은 두개의 실험적 +/- 표준 편차의 평균을 나타낸다.

도 16은 LPS로 24시간 동안 활성화된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)로부터의 인간 단핵구에서 천연 세포질내 IL-6를 검출하는 IL-6-특이적 mAb의 능력을 시험한 실험 결과를 나타낸다. 더 굵은 선은 LPS-자극된 단핵구로부터의 IL-6의 mAb 검출을 나타내는 반면, 더 얇은 선은 첨가된 항체의 부재를 나타낸다.

도 17 및 18은 혈장으로부터의 IL-6를 검출하는 IL-6-특이적 mAb의 능력을 시험한 실험 결과를 나타낸다. mAb가 첨가되지 않은 "혈청 단독" 샘플은 기준으로 작용한다. "혈청 단독" 샘플과 비교하여 IL-6-특이적 항체 샘플에서 광밀도 시그널의 저하는 항체와 혈청 IL-6의 상호작용을 나타낸다. 항체는 5㎍/ml에서 시험하였다.

도 17에서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 4개의 칼럼은 1, 1/2, 1/4 및 1/8의 혈청 희석으로 인간 혈청중의 인간 IL-6 검출과 관련된 광밀도를 나타낸다. 각각의 칼럼은 두개의 실험적 +/- 표준 편차의 평균을 나타낸다.

도 18에서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 4개의 칼럼은, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640의 혈청 희석으로 붉은털 원숭이 혈청에서 원숭이 IL-6의 검출과 관련된 광밀도를 나타낸다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해분야에서 통상의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.

항체

본 발명은 IL-6에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩티드 사슬 즉, 두개의 중쇄 (H) 및 두개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (약어로서, VH) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (약어로서, VL) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 두개의 명백하게 구별되는 유형 소위, 카파 (κ) 및 람파 (λ)중 하나로 설정된다. 카파 경쇄의 가변 영역은 본원에서 VK로서 불려진다. 본원에 사용된 바와 같은 표현 VL은 카파형 경쇄 (VK) 및 람다형 경쇄로부터의 두 가변 영역을 포함하는 것으로 의도된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 더욱 보존된 영역인 소위 프레임워크 영역 (FR)이 산재된 과변이 영역 소위, 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 네개의 FR로 이루어진다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 설정된다. 5개 주요 부류의 본래의 항체가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이들 일부는 추가로 하위부류 (이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, ν 및 μ이다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 삼차원 형태는 널리 공지되어 있다. 본 발명은 상기 언급된 부류 또는 하위부류 (이소형)중 임의의 부류의 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항체, 이의 분해 단편, 특정 부분 및, 항체 미메틱 (mimetic)을 포함하거나, 단일쇄 항체 및 이의 단편을 포함하는 항체의 특정 단편 또는 일부, 또는 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 일부를 포함하는 항체의 변이체를 포함하는 것으로 의도되며, 이들 각각은 하나 이상의 CDR을 함유한다. 작용 단편은 IL-6 항원에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab (예를 들어, 파파인 (papain) 분해에 의한), facb (예를 들어, 플라스민 (plasmin) 분해에 의한), pFc' (예를 들어, 펩신 (pepsin) 또는 플라스민 분해에 의한), Fd (예를 들어, 펩신 분해, 부분 환원 및 재응집화에 의한), Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자생물학 기법에 의해) 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 IL-6에 결합할 수 있는 항체 단편 또는 이의 일부가 본 발명에 포함된다. 항체 단편은 또한, 예를 들어, 도메인 결실된 항체, 디아바디 (diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질 항체의 군집으로부터 수득된 항체를 나타내며, 예를 들어, 이러한 군집을 포함하는 개별 항체는 존재할 수 있는, 가능한 천연 발생 돌연변이 또는 약간의 번역후 변이를 제외하고는 실질적으로 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 전형적으로 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제조물과 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질의 항체 군집으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의해 항체를 생성할 것을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 본 발명의 모노클로날 항체는 바람직하게는, 재조합 DNA 방법에 의해 제조되거나, 본원에 기술된 바와 같은 스크리닝 방법에 의해 얻어진다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체중의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종 (예를 들어, 마우스 또는 래트)으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 및 요구되는 생물학적 활성을 나타낼 정도의 길이를 갖는 이러한 항체의 단편중의 상응하는 서열과 동일하거나 상응하는 "키메라" 항체 (면역글로불린)을 포함한다 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 주목되는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 예컨대, 비비원숭이 (baboon), 붉은털 원숭이 (rhesus) 또는 시아몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 일간 불변 영역 서열 (US 특허 제 5,693,780호)을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.

따라서, 본 발명은 예를 들어, 키메라 중쇄 및/또는 키메라 경쇄를 포함하는 키메라 모노클로날 항체를 포함한다. 키메라 중쇄는 비-인간 항체의 중쇄 불변 영역에 융합된 본원에 기술된 중쇄 가변 (VH) 영역 또는 이의 돌연변이 또는 변이체를 포함할 수 있다. 키메라 경쇄는 비-인간 항체의 경쇄 불변 영역에 융합된 본원에 기술된 경쇄 가변 (VL) 영역 또는 이의 돌연변이 또는 변이체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 카밧 (Kabat) 등의 문헌에 기술된 바와 같은 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다 (문헌 [Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, CDR 및 특히, CDR3에서 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 엔코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 실험관내에서의 무작위 또는 점 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 변이에 의해 유입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 엔코딩되지 않는 아미노산 잔기 예를 들어, 활성 증강 아미노산 잔기로 치환된 하나 이상의 위치를 가질 수 있다. 본 발명의 문맥상, 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 치환된 20개 이하의 위치를 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 위치가 치환된다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종 예컨대, 마우스의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 (framewordk) 서열로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

문구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포로 트랜스펙션 (transfection)된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체, 재조합성 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자가 이식된 동물로부터 유래된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱 (splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다 (문헌 [Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Protiens of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 본 발명에 있어서, 재조합 인간 항체는 실험관내 돌연변이유발 처리된 인간 생식세포 면역글로불린 서열 (또는, 인간 Ig 서열이 이식된 동물이 사용되는 경우, 생채내 체세포 돌연변이유발)을 포함하며, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이들에 관련된 것이나, 생체내 인간 항체 생식세포 레퍼토리내에 천연으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 그러나, 특정 구체예에서, 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이유발법, 복귀돌연변이 또는 이 둘 모두의 결과이다.

본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 포함한다. 또한, 단리된 항체에는 실질적으로, 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 존재하지 않을 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는, IL-6 항원에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, "IL-6 항원"은 예를 들어, 완전한 IL-6 단백질 또는 IL-6 단백질의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "IL-6 항원"은 천연 발생 IL-6 (예를 들어, 일반적인 조건하에서 IL-6을 발현하는 세포로부터 정제된 IL-6) 및 재조합 IL-6 및 이의 변이체 및 돌연변이를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, IL-6 항원은 IL-6 수용체에 결합할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 항체가 IL-6에 결합하면, 이러한 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합하며, 비-IL-6 분자로의 현저한 결합을 나타내지 않을 것이다. 특정 구체예에서, 항체가 IL-6 항원 이외의 항원에 결합하는 친화도보다 1000배 이상, 500배 이상, 200배 이상, 100배 이상, 90배 이상, 80배 이상, 70배 이상, 60배 이상, 50배 이상, 40배 이상, 30배 이상, 20배 이상, 10배 이상 또는 2배 이상 더 높은 친화도로 IL-6 항원에 결합하는 경우, 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한 것이다.

본 발명의 항체가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는지의 여부는 예를 들어, IL-6 항원을 포함하는 항원의 패널 및 하나 이상의 다른 비-IL-6 항원을 이용한 ELISA와 같은 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 특이성을 평하기 위한 예시적 방법은 하기 실시예 5에 기술되어 있다. 여기서, 본 발명의 인간 항-IL-6 항체 (mAb 1339)를 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 인간 헤모글로빈 및 소 혈청 알부민과 같은 비관련된 항원으로의 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 비 IL-6 항원으로의 결합이 관찰되지 않았기 때문에, mAb 1339는 IL-6에 특이적으로 결합하는 것으로 간주되었다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하며, 다른 IL-6 슈퍼패밀리 멤버에는 결합하지 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체가 IL-6 슈퍼패밀리 멤버 예컨대, CNFT, 온코스타틴 (oncostatin) M, IL-11 또는 NNT-1에 결합하는 친화도 보다 1000배 이상, 500배 이상, 200배 이상, 100배 이상, 90배 이상, 80배 이상, 70배 이상, 60배 이상, 50배 이상, 40배 이상, 30배 이상, 20배 이상, 10배 이상 또는 2배 이상 더 높은 친화도로 IL-6에 결합하는 경우, 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, IL-6에 결합하는 mAb 1339는 ELISA에 의해 입증되고, CNFT, 온코스타틴 M, IL-11 또는 NNT-1으로의 무의미한 수준의 결합을 나타내었다 (실시예 5 및 도 5B 참조). 이러한 검정 또는 유사한 검정을 이용하여 임의의 항체가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는지의 여부를 평가할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 해리 상수 (K_d)가 약 10^-8M인 경우 IL-6에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 항체는 K_d가 약 5x10^-9M인 경우, "높은 친화도"로 IL-6에 특이적으로 결합하고, K_d가 약 5x10^-10M인 경우, "매우 높은 친화도"로 IL-6에 특이적으로 결합한다고 할 수 있다.

본 발명의 문맥상 항체가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는지의 여부는 기능 검정에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, IL-6 수용체를 발현하는 세포를 시험 항체의 존재하에 IL-6와 인큐베이션시키는 검정법이 수행될 수 있다. 병렬 검정에서, 다른 수용체를 발현하는 세포가 시험 항체의 존재하에 수용체에 대한 리간드와 함께 인큐베이션된다. 첫번째 검정 (IL-6 및 IL-6 수용체를 발현하는 세포 포함)에서 항체가 억제 효과를 나타내나, 두번째 검정 (상이한 리간드 및 이러한 리간드에 대한 수용체를 발현하는 세포 포함)에서는 억제 효과를 나타내지 않는 경우, 항체가 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다고 결론내릴 수 있다. 항체가 세포상의 IL-6 수용체로의 IL-6 결합의 생물학적 효과를 억제하는지의 여부를 결정하기 위한 검정은 본원의 다른 부분에서 논의된다. 예를 들어, 실시예 5는 본 발명의 인간 항-IL-6 항체의 IL-6 유도된 인간 골수종 세포 증식 억제 능력을 입증한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 100% (즉, 완전한) 억제 수준으로 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 90% 또는 그 초과의 억제 수준으로 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 80% 또는 그 초과의 억제 수준으로 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 70% 또는 그 초과, 60% 또는 그 초과, 50% 또는 그 초과, 40% 또는 그 초과, 30% 또는 그 초과, 20% 또는 그 초과, 10% 또는 그 초과, 5% 또는 그 초과, 또는 1% 또는 그 초과의 억제 수준으로 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 억제한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여 IL-6의 이의 수용체로의 결합을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여, IL-6의 이의 수용체로의 결합을 100% (즉, 완전한) 억제 수준으로 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여, IL-6의 이의 수용체로의 결합을 90% 또는 그 초과의 억제 수준으로 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여, IL-6의 이의 수용체로의 결합을 80% 또는 그 초과의 억제 수준으로 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하여, IL-6의 이의 수용체로의 결합을 70% 또는 그 초과, 60% 또는 그 초과, 50% 또는 그 초과, 40% 또는 그 초과, 30% 또는 그 초과, 20% 또는 그 초과, 10% 또는 그 초과, 5% 또는 그 초과, 또는 1% 또는 그 초과의 억제 수준으로 억제한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 IL-6에 대한 종 특이성, 인간 IL-6로의 결합성 또는 인간 IL-6 검출에 있어서의 보조 특성을 입증한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 신규한 모노클로날 항체는 인간 또는 원숭이 IL-6에 결합하거나 이의 검출을 보조하나, 뮤린 또는 래트 IL-6에는 그렇지 못하다.

본 발명의 인간 항체는 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, IL-6에 결합하는 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 하나 또는 그 초과의 인간 VL 및 VH cDNA 라이브러리를 IL-6 또는 이의 일부로 예컨대, 파아지 디스플레이 기법 (phase display techniques)으로 스크리닝함으로써 선택될 수 있다 (McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)). 본 발명의 인간 항체는 유전자이식 동물 예컨대, 유전자이식 마우스로부터 수득될 수 있다 (Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6:561-566 (1995)). 본 발명은 인간 항체를 제조하는데 있어서 당해분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득되는 인간 항-IL-6 항체를 포함한다.

본 발명의 항체를 생성시키는데 이용될 수 있는 예시적 방법은 그 전체 내용이 본원에 통합된 예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 번호 2005/0196755에 공개되어 있다.

따라서, 본 발명은, 인간 중쇄 가변 영역 (VH)이, 비-인간 항-IL-6 모노클로날 항체 (예컨대, B-E8)의 가변 경쇄 영역 (VL)과 쌍을 이루는 경우 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키는 인간 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다.

또한, 본 발명은, 인간 경쇄 영역 (VL)이 비-인간 항-IL-6 모노클로날 항체 (예컨대, B-E8)의 가변 중쇄 영역 (VH)과 쌍을 이루는 경우 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키는 인간 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 VL은 카타 서브타입 (즉, VK)이다.

본 발명은 또한, 인간 중쇄 가변 영역 (VH)이 비-인간 항-IL-6 모노클로날 항체 (예컨대, B-E8)의 가변 경쇄 영역 (VL)과 쌍을 이루는 경우 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키고, 인간 경쇄 가변 영역 (VL)이 비-인간 항-IL-6 모노클로날 항체 (예컨대, B-E8)의 가변 중쇄 영역 (VH)과 쌍을 이루는 경우 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키는, 인간 중쇄 가변 영역 (VH) 및 인간 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 H415 (SEQ ID NO:19), H884 (SEQ ID NO:20), H1077 (SEQ ID NO:21), H1078 (SEQ ID NO:22), H1079 (SEQ ID NO:23), H1081 (SEQ ID NO:24), H1089 (SEQ ID NO:25), H1511 (SEQ ID NO:26), H1420 (SEQ ID NO:27), H1432 (SEQ ID NO:28), H1515 (SEQ ID NO:29), H1362 (SEQ ID NO:30), H1437 (SEQ ID NO:31), H1461 (SEQ ID NO:32), H1519 (SEQ ID NO:38), H1520 (SEQ ID NO:39), H1521 (SEQ ID NO:40), H1522 (SEQ ID NO:41), H1553 (SEQ ID NO:42), 및 H1579 (SEQ ID NO:43)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 (VH)을 포함하며, 여기서 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 L112 (SEQ ID NO:1), L151 (SEQ ID NQ:2), L158 (SEQ ID NO:3), L159 (SEQ ID NO:4), L164 (SEQ ID NO:5), L165 (SEQ ID NO:6), L166 (SEQ ID NO:7), L167 (SEQ ID NO:8), L168 (SEQ ID NO:9), L169 (SEQ ID NO:10), L170 (SEQ ID NO:11), L171 (SEQ ID NO:12), L172 (SEQ ID NO:13), L173 (SEQ ID NO:14), L174 (SEQ ID NO:15), L175 (SEQ ID NO:16), L189 (SEQ ID NO:17), L198 (SEQ ID NO: 18), L314 (SEQ ID NO:33), L305 (SEQ ID NO:34), L303 (SEQ ID NO:35), L298 (SEQ ID NO:36), 및 L321 (SEQ ID NO:37)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역 (VL 또는 VK)을 포함하며, 여기서 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

본원 발명의 문맥상에 기술된 "가변 중쇄 영역 (VH)을 포함하는 항체" 및 "가변 경쇄 영역 (VL 또는 VK)을 포함하는 항체"는 항체 분자에서 일반적으로 발견되는 하나 또는 그 초과의 추가 영역 (또는 "도메인") 예컨대, 하나 또는 그 초과의 불변 중쇄 영역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3), 및/또는 불변 경쇄 영역 (CL)을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 19 내지 32 또는 38 내지 43중 어느 하나와 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 (VH)을 포함할 수 있으며, 여기서, 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 18 또는 33 내지 37중 어느 하나와 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역 (VL 또는 VK)을 포함할 수 있으며, 여기서, 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일한"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정된 바와 같은 두개 또는 그 초과의 폴리펩티드 분자의 서열 간의 관계를 나타낸다. "동일율"은 비교되는 분자의 아미노산 서열간의 동일한 잔기의 %를 의미하며, 비교되는 분자중 가장 작은 크기의 분자에 기초하여 계산된다. 이러한 계산을 위해서, (존재하는 경우) 정렬의 갭 (gap)이 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리되어야 한다. 정렬된 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 이용될 수 있는 방법은 문헌 [Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073]에 기술된 방법을 포함한다.

동일율을 계산하는데 있어서, 비교되는 서열은 서열간의 가장 큰 정합을 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일율을 결정하는데 이용된 컴퓨터 프로그램은 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지일 수 있다 ((Devereux et al., 1984, Nucl Acid Res 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wise). 컴퓨터 알고리즘 GAP은 서열 동일율을 결정하기 위한 두개의 폴리펩티드를 정렬시키는데 사용된다. 서열은 이들 각각의 아미노산의 최적의 정합을 위해 정렬된다 (알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "정합된 스팬 (matched span)"). 갭 오프닝 페널티 (gap opening penalty) (이는 3 x 평균 대각선 (average diagonal)로서 계산되며, 여기서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이며; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각 완전한 아미노산 정합으로 정렬된 스코어 또는 수이다) 및 갭 확장 페널티 (gap extension penalty) (이는 일반적으로, 갭 오프닝 페널티의 1/10배이다)와 비교 매트릭스 예컨대, PAM 250 또는 BLOSUM 62가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 구체예에서, 표준 비교 매트릭스 (PAM 250 비교 매트릭스에 있어서는, 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352] 참조; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 있어서는, 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919] 참조)가 알고리즘에 의해 사용된다.

GAP 프로그램을 사용한 폴리펩티드에 대한 동일율을 결정하기 위한 권고되는 파라미터는 다음과 같다:

알고리즘: Needleman et al., 1970, J. MoL Biol. 48:443-453;

비교 매트릭스 BLOSUM 62 (Henikoff et al., 1992, supra);

갭 페널티: 12 (단, 말단 갭에 있어서는 페널티가 없음);

갭 길이 페널티: 4;

유사도 임계치 (Threshold of Similarity): 0.

두개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 기법은 두 서열의 단지 짧은 영역의 정합을 유도할 수 있으며, 이러한 작은 정렬된 영역은 두개의 전장 서열간의 유의한 관련성이 존재하지 않음에도 불구하고 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 필요에 따라, 표적 폴리펩티드의 50개 이상의 연속 아미노산에 걸친 정렬을 유도하도록 조절될 수 있다.

본원에 기술된 항-IL-6 항체의 아미노산 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항-IL-6 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다.

항-IL-6 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩하는 핵산으로 적합한 뉴클레오티드 변화부를 유입시키거나 펩티드 합성함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 변형 방법은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 변화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역의 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 변화시키는 변형 방법이 특히 바람직하다.

예시적인 변형 방법은 예를 들어, 항-IL-6 항체의 아미노산 서열의 잔기로부터의 결실, 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환이 임의로 조합되어 최종 작제물에 도달하며, 단 최종 작제물은 요구되는 특징을 갖는다 (예를 들어, IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 항체 부분을 형성시키는 능력). 아미노산 변화는 또한, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 항-IL-6 항체의 번역후 과정을 변화시킬 수 있다.

아미노산 변화부를 본 발명의 항체의 VH 및 VL 영역에 유입시키는 한 예시적인 방법은 하기 실시예 2에 예시되어 있다. 이러한 방법에 따르면, NNK는 예를 들어, VH 또는 VL의 CDR 내의 특정 위치로 유입되며, 여기서, N은 A, T, G 또는 C일 수 있으며, K는 T 또는 G이다. NNK를 이용하여, 모두 20개 아미노산 및 1개의 정지 코돈이 각 위치에 유입될 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인 항-IL-6 항체 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 또 다른 유용한 방법은 소위 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (alanine scanning mutagenesis)"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환된다. 추가의 또는 다른 변이체를 치환 부위에 유입함으로써, 치환에 대한 작용 민감성을 입증하는 이들 아미노산 위치는 다듬어진다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 유도하기 위한 부위가 미리 결정되는 반면, 필요한 그 자체의 돌연변이의 특성은 미리 결정되지 않는다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 VH 변이체 및/또는 VL 변이체는 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 각각과 조합되는 경우 요망되는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입물은 하나의 잔기 내지 백개 또는 그 초과의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이에 걸친 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입물을 포함한다. 말단 삽입물의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-IL-6 VH 또는 항-IL-6 VL, 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항-IL-6 VH 또는 항-IL-6 VL을 포함한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로 대체된 VH 또는 VL 분자에서의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 본 발명의 항-IL-6 항체의 VH 및 VL 영역의 치환적 돌연변이유발에 대한 가장 관심을 끄는 부위는 극가변 (hypervariable) 영역을 포함하나, FR 변화부 또한 고려된다.

보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 1에 기재되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 유도한다면, 표 1에서 "예시적 치환"으로 일컬어지거나 아미노산 부류에 관하여 하기 추가로 기술된 바와 같이 더욱 실질적인 변화가 유입되어, 생성물이 스크리닝될 수 있다.

표 1

본 발명의 항-IL-6 항체의 생물학적 특성에서의 실질적 변화는 (a) 예를 들어, 시이트형 또는 나선형 구조와 같은, 치환 영역에서 폴리펩티드 백본 (backbone)의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 이들의 효과에서 현저하게 상이한 치환체를 선택함으로써 달성될 수 있다. 천연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성에 기초하여 하기 그룹으로 나누어질 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친지성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 끼치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 멤버를 또 다른 부류로 변화시키는 것을 수반할 것이다.

항-IL-6 항체의 적당한 형태를 유지하는데 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로, 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 이상 가교 (aberrant corsslinking)를 억제할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 항-IL-6 항체에 부가되어 이의 안정도를 향상시킬 수 있다 (특히, 항-IL-6 항체는 Fv 단편과 같은 항체 단편이다).

치환 변이체의 특히 바람직한 유형은 모 항체 (parent antibody)의 하나 또는 그 초과의 극가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체와 비교하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다 (예를 들어, IL-6 항원에 대한 증가된 친화도). 이러한 치환 변이체를 생성시키는 한 예시적인 방법이 파아지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙법 (affinity maturation)이다. 간단하게는, 수개의 극가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환체를 생성하도록 변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 융합물로서 섬유상 파아지 입자로부터 각각의 입자내로 패키징된 M13의 유전자 III 생성물까지 일가 형태로 디스플레이된다. 그 후, 파아지-디스플레이된 변이체는 본원에 기술된 바와 같은 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형에 대한 후보 극가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 항원 결합에 현저하게 기여하는 극가변 영역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항원-항체 복합물의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원간의 접촉 지점을 확인하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에 상세히 설명된 기법에 따른 치환에 대한 후보물이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝 처리되고, 하나 또는 그 초과의 관련 분석법에서 우수한 특성을 갖는 항체가 추가의 연구를 위해 선택될 수 있다.

본원에 제시된 항-IL-6 항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항-IL-6 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. 이러한 변화는 항-IL-6 항체에서 발견된 하나 또는 그 초과의 카르보히드레이트 부분의 결실, 및/또는 항-IL-6 항체에 존재하지 않는 하나 또는 그 초과의 글리코실화 부위의 삽입을 포함한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로, N-링크 (linked)되거나 O-링크된다. N-링크된은 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 카르보히드레이트 부분의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린은 제외한 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄로의 카르보히드레이트 부분의 효소 부착을 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드중의 이들 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-링크된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 크실로스중 하나의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는, 세린 또는 트레오닌으로의 부착을 나타내며, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신도 이용될 수 있다.

항-IL-6 항체로의 글리코실화 부위의 첨가는 (N-링크된 글리코실화 부위에 대한) 상기 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 또는 그 초과를 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 달성된다. 변형은 (O-링크된 글리코실화 부위에 대한) 원래의 항-IL-6 항체의 서열로의 하나 또는 그 초과의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체중에 포함된 VH 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산의 치환체를 제외하고는, SEQ ID NO: 19 내지 32 또는 38 내지 43과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 치환체(들)는 SEQ ID NO:19 내지 32 또는 38 내지 43에서 발견된 서열내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 치환체(들)은 VH 도메인의 하나 또는 그 초과의 CDR내에 위치한다. 예를 들어, 치환체(들)은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3내에 위치할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명의 항체내에 포함된 VL 도메인은 1 내지 20개의 아미노산의 치환체를 제외하고는, SEQ ID NO :1 내지 18 또는 33 내지 37중 임의의 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산의 치환체를 제외하고는, SEQ ID NO: 1 내지 18 또는 33 내지 37과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 치환체(들)은 SEQ ID NO:1 내지 18 또는 33 내지 37에서 발견된 서열내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 치환체(들)은 VL 도메인의 하나 또는 그 초과의 CDR내에 위치한다. 예를 들어, 치환체(들)은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3내에 있을 수 있다.

하나 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 SEQ ID NO:19 내지 32 또는 38 내지 43와 상이한 VH 영역 및/또는 하나 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 SEQ ID NO: 1 내지 18 또는 33 내지 37과 상이한 VL 영역을 포함하는 본 발명의 항-IL-6 항체는 바람직하게는, IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이다.

본 발명은 VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 하기 표 2에 기술된 CDR1중 임의의 하나를 포함한다:

표 2: 예시적인 VH CDR1 서열

본 발명은 VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 SEQ ID NO: 51 내지 55로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 51 내지 55중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR1을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR1을 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

본 발명은 또한, VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 표 3에 제시된 CDR2중 어느 하나를 포함한다:

표 3: 예시적인 VH CDR2 서열

본 발명은 VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 SEQ ID NO: 56 내지 61 또는 97로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 56 내지 61 또는 97중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR2를 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR2를 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

본 발명은 또한, VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 표 4에 제시된 CDR3중 어느 하나를 포함한다:

표 4: 예시적인 VH CDR3 서열

본 발명은 VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 SEQ ID NO: 62 내지 73 또는 98로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 62 내지 73 또는 98중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR3을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR3을 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

또한, 본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 하기 표 5에 기술된 CDR1중 어느 하나를 포함한다:

표 5: 예시적인 VL CDR1 서열

본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 SEQ ID NO: 74 내지 79로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 74 내지 79중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR1을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR1을 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

또한, 본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 하기 표 6에 기술된 CDR2중 임의의 하나를 포함한다:

표 6: 예시적인 VL CDR2 서열

본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 SEQ ID NO: 80 내지 85로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 80 내지 85중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR2를 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR2를 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

또한, 본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 하기 표 7에 기술된 CDR3중 어느 하나를 포함한다:

표 7: 예시적인 VL CDR3 서열

본 발명은 VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 SEQ ID NO: 86 내지 96으로부터의 아미노산중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 86 내지 96중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 변이체 CDR3을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 CDR3을 포함하는 항-IL-6 항체는 특이적으로, IL-6 항원에 결합할 것이다.

실시예 1에 도시된 바와 같이, 인간 VH의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인된 제 1세대 인간 가변 중쇄 영역 (VH)은 서로 중요한 서열 동일부를 공유한다. 인간 VH간의 아미노 서열 동일성은 표 10에 기재되어 있으며, 도 1에 설명되어 있다. 예를 들어, 확인된 인간 VH의 CDR1은 모두 아미노산 서열 T-S-G-X₁-X₂-V-X₃ (SEQ ID NO:99)을 공유한다. 추가적으로, 확인된 인간 VH의 CDR2는 모두 아미노산 서열 X₁-X₂-X₃-W-D-D-D-X₄-X₅-Y-X₆-P-S-L-X₇-X₈ (SEQ ID NO:100)을 공유한다.

따라서, 본 발명은 아미노산 서열 T-S-G-X₁-X₂-V-X₃ (SEQ ID NO:99)을 갖는 가변 중쇄 CDR1 (VH-CDR1)을 포함하는 모노클로날 항체를 포함하며, 여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 아미노산일 수 있다. 예를 들어, X₁, X₂ 또는 X₃는 이소류신 (I), 류신 (L), 발린 (V), 페닐알라닌 (P), 메티오닌 (M), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 글리신 (G), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 세린 (S), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 글루타민 (Q), 아스파라긴 (N), 히스티딘 (H), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (K), 또는 아르기닌 (R)일 수 있다. 일 예시적 구체예에서, X₁은 메티오닌 (M) 또는 발린 (V)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₁은 발린 (V)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₂는 시스테인 (C), 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 글리신 (G)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₃은 세린 (S) 또는 글리신 (G)이다. 바람직하게는, 아미노산 서열 T-S-G-X₁-X₂-V-X₃ (SEQ ID NO:99)을 갖는 VH-CDR1을 포함하는 본 발명의 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 또한, 아미노산 서열 X₁-X₂-X₃-W-D-D-D-X₄-X₅-Y-X₆-P-S-L-X₇-X₈ (SEQ ID NO:1OO)을 갖는 중쇄 가변 CDR2 (VH-CDR2)를 포함하는 모노클로날 항체를 포함하며, 여기서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇ 및 X₈은 임의의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇ 및/또는 X₈은 이소류신 (I), 류신 (L), 발린 (V), 페닐알라닌 (P), 메티오닌 (M), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 글리신 (G), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 세린 (S), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 글루타민 (Q), 아스파라긴 (N), 히스티딘 (H), 글루탐산 (E), 아스파르트산 (D), 리신 (EC), 또는 아르기닌 (R)이다. 일 예시적 구체예에서, X₁은 류신 (L), 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₁은 류신 (L)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₂는 이소류신 (I) 또는 발린 (V)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₂는 이소류신 (I)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₃은 티로신 (Y) 또는 페닐알라닌 (F)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₄는 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₅는 아르기닌 (R), 티로신 (Y), 또는 히스티딘 (H)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₆은 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₆은 세린 (S)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₇은 아르기닌 (R), 리신 (K), 글루탐산 (E) 또는 세린 (S)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₇은 리신 (K)이다. 또 다른 예시적 구체예에서, X₈은 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)이다. 바람직하게는, 아미노산 서열 X₁-X₂-X₃-W-D-D-D-X₄-X₅-Y-X₆-P-S-L-X₇-X₈ (SEQ ID NO:1OO)을 갖는 VH-CDR2를 포함하는 본 발명의 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 또한, VL 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VL은 SEQ ID NO: 1 내지 18 또는 33 내지 37로부터의 비-CDR (예를 들어, 프레임워크 영역) 아미노산중 하나 이상이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1 내지 18 또는 33 내지 37중 어느 하나와 동일하다. 본 발명은 또한, VH 도메인을 포함하는 항-IL-6 항체를 포함하며, 여기서, VH는 SEQ ID NO: 19 내지 32 또는 38 내지 43로부터의 비-CDR (예를 들어, 프레임워크 영역) 아미노산중 하나 이상이 임의의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 19 내지 32 또는 38 내지 43중 어느 하나와 동일하다. 바람직하게는, VH 및/또는 VK 서열의 프레임워크 영역에서 하나 또는 그 초과의 아미노산 변화를 포함하는 항-IL-6 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합할 것이다.

본 발명은 하기의 임의의 조합을 포함하는 항체를 포함한다:

(1) 본원에 제시된 가변 중쇄 영역 (VH), 또는 본원에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함하는 VH; 및

(2) 본원에 제시된 가변 경쇄 영역 (VL) 또는 본원에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함하는 VL.

예를 들어, 본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H415 (SEQ ID NO: 19) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H415 (SEQ ID NO: 19) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H415 (SEQ ID NO:19) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H415 (SEQ ID NO:19) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H884 (SEQ ID NO:20) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H884 (SEQ ID NO:20) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H884 (SEQ ID NO:20) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1077 (SEQ ID NO:21) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1078 (SEQ ID NO:22) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 Ll59 (SEQ ID NO:4); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1079 (SEQ ID NO:23) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 Hl079 (SEQ ID NO:23) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: Hl081 (SEQ ID NO:24) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L3O3 (SEQ ID NO:35); Hl081 (SEQ ID NO:24) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1081 (SEQ ID NO:24) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 또한, 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1O89 (SEQ ID NO:25) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L3O3 (SEQ ID NO:35); H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1089 (SEQ ID NO:25) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1511 (SEQ ID NO:26) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1420 (SEQ ID NO:27) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L3O5 (SEQ ID NO:34); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1432 (SEQ ID NO:28) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1515 (SEQ ID NO:29) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1362 (SEQ ID NO:30) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1437 (SEQ ID NO:31) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1461 (SEQ ID NO:32) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1519 (SEQ ID NO:38) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1520 (SEQ ID NQ:39) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1520 (SEQ ID NO:39) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1521 (SEQ ID NO:40) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1522 (SEQ 3D NO:41) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1522 (SEQ ID NO:41) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L159 (SEQ ID NO:4); Hl 553 (SEQ ID NO:42) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1553 (SEQ ID NO:42) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

본 발명은 하기의 VH 영역과 VL 영역의 조합중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체를 포함한다: H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L112 (SEQ ID NO:1); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L151 (SEQ ID NO:2); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L158 (SEQ ID NO:3); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L159 (SEQ ID NO:4); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L164 (SEQ ID NO:5); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L165 (SEQ ID NO:6); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L166 (SEQ ID NO:7); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L167 (SEQ ID NO:8); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L168 (SEQ ID NO:9); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L169 (SEQ ID NO:10); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L170 (SEQ ID NO:11); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L171 (SEQ ID NO:12); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L172 (SEQ ID NO:13); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L173 (SEQ ID NO:14); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L174 (SEQ ID NO:15); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L175 (SEQ ID NO:16); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L189 (SEQ ID NO:17); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L198 (SEQ ID NO:18); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L314 (SEQ ID NO:33); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L305 (SEQ ID NO:34); H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L303 (SEQ ID NO:35); H 1579 (SEQ ID NO:43) 및 L298 (SEQ ID NO:36); 또는 H1579 (SEQ ID NO:43) 및 L321 (SEQ ID NO:37).

VH 영역 및 VL 영역의 조합을 포함하는 상기 언급된 항체는 항체 분자에서 일반적으로 발견되는 하나 또는 그 초과의 추가 영역 (또는 "도메인") 예컨대, 하나 또는 그 초과의 불변 중쇄 영역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3), 및/또는 불변 경쇄 영역 (CL)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제시된 바와 같은 VH 영역 및 VL 영역의 조합을 포함하는 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합할 것이다.

핵산 분자, 벡터 및 세포

본 발명은 VH 영역의 임의의 아미노산 변이체를 포함하는 본원에 제시된 VH 영역중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체 중쇄를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, VL 영역의 임의의 아미노산 변이체를 포함하는 본원에 제시된 VL 영역중 어느 하나를 포함하는 항-IL-6 항체 경쇄를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 핵산 분자는 항-IL-6 항체 중쇄의 일부 또는 항-IL-6 항체 경쇄의 일부를 엔코딩한다. 예를 들어, 본 발명은 SEQ ID NO:51 내지 73으로 나타낸 CDR중 어느 하나를 포함하는 본원에 제시된 항-IL-6 VH의 하나 또는 그 초과의 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO:74 내지 96으로 나타낸 CDR중 어느 하나를 포함하는 본원에 제시된 항-IL-6 VL의 하나 또는 그 초과의 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 또한, SEQ ID NO:19 내지 32 및 38 내지 43으로 나타낸 VH 영역중 어느 하나를 포함하는, 본원에 제시된 VH 영역을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 SEQ ID NO:19 내지 32 및 38 내지 43중 어느 하나와 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서, VH 영역을 포함하는 항체는 IL-6에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 내지 18 및 33 내지 37로 나타낸 VL 영역중 어느 하나를 포함하는, 본원에 제시된 VL 영역을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 SEQ ID NO:1 내지 18 및 33 내지 37중 어느 하나와 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서, VL 영역을 포함하는 항체는 IL-6에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 예시적인 벡터는 플라스미드, 파아지미드 (phagemid), 코스미드 (cosmid), 바이러스 및 파아지 핵산 또는 자율적으로 복제되거나 원핵세포 또는 진핵세포내로 복제될 수 있는 다른 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 벡터는 포유동물 세포에서 복제될 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 본 발명의 핵산 분자의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종료인자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다. 벡터는 또한, 하나 이상의 독립적인 종료 서열, 진핵생물 및 원핵생물 모두에서 벡터 즉, 셔틀 벡터의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵 및 진핵 시스템 모두에 대한 선택 마커를 포함할 수 있다. 벡터는 바람직하게는, 예를 들어, 암피실린 또는 네오마이신과 같은 항생물질에 대한 저항성을 부여하는 것과 같이, 마커를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성을 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 하나 또는 그 초과의 프로모터의 조정하에 있을 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 구조적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조정하에 있을 수 있다. 예시적 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 메탈로티오닌 프로모터 (metallothionine promoter), SV-40 조기 프로모터 (early promoter), SV-40 후기 프로모터 (later promoter), 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터 (murine mammary tumor virus promoter), 로우스 사르코마 바이러스 프로모터 (Rous sarcoma virus promoter), 폴리헤드린 프로모터 (polyhedrin promoter), 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 입증된 기타 프로모터를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터가 유입되는 세포 또는 세포의 군집을 의미한다. 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는, 진핵 세포 또는 세포주, 바람직하게는, 식물, 동물, 척추동물, 포유동물, 설치류, 마우스, 영장류 또는 인간 세포 또는 세포주이다. "숙주 세포의 군집"은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터가 유입되고 발현될 수 있는 배양된 세포의 군을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터로부터의 발현을 지지하는 모든 숙주 세포를 의미한다. 숙주 세포의 군집은 단일배양된 것 즉, 군집내의 각 세포가 동일한 세포 유형을 갖는 것이 바람직하지만, 혼합된 세포 배양물 또한 고려된다. 본 발명의 숙주 세포는 유착성이거나, 즉, 숙주 세포는 고형 지지체에 부착된채 성장하거나, 대안적으로, 숙주 세포는 부유 상태로 존재할 수 있다. 숙주 세포는 일차 종양으로부터 유래된 세포, 전이 종양으로부터 유래된 세포, 일차 세포 (primary cell), 접촉 저항이 손실된 세포, 형질전환된 일차 세포, 불멸화된 일차 세포, 아폽토시스 (apoptosis)될 수 있는 세포, 및 이들로부터 유래된 세포주일 수 있다.

본 발명은 또한, (i) 본 발명의 항체를 엔코딩하는 하나 또는 그 초과의 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포를 배양하고, (ii) 배양 배지로부터 항체를 회수하는 것을 포함하여, 본 발명의 항체를 생성하는 방법을 포함한다.

약제 조성물

본 발명의 항-IL-6 항체는 피검체로의 투여에 적합한 약제 조성물중에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하며, 이들은 생리학적으로 양립가능하다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합물중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물중의 등장제 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한, 소량의 보조제 예컨대, 습윤제 또는 에멀션화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 항체 또는 항체 일부의 수명 또는 효율을 증강시킨다.

본 발명의 약제 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태 예컨대, 액체 용액 (예를 들어, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 분산물 또는 현탁물, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 모드 및 치료학적 적용에 의존적이다. 전형적인 바람직한 조성물은 다른 항체로 인간의 수동적 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물과 같이, 주사가능한 또는 주입가능한 용액 형태로 존재한다. 바람직한 투여 모드는 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하내, 복강내, 근내) 투여이다. 바람직한 구체예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 근내 또는 피하내 주입에 의해 투여된다.

치료학적 조성물은 전형적으로, 멸균되어야 하며, 제작 및 저장의 조건하에 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산물, 리포좀 또는 기타 고농도 약물에 적합한 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 적합한 용매중에 요구되는 양의 활성 화합물 (즉, 항체 또는 항체 일부)과 필요에 따라 상기 열거된 성분중 하나 또는 이들의 조합물을 섞고, 멸균 여과시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 이외의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조되며, 이는 활성 성분과 이전의 멸균 여과된 용액으로부터의 추가적인 요구되는 성분의 분말을 생성시킨다. 용액의 적합한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 조성물중에 흡수를 지연시키는 제제 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유도될 수 있다.

본 발명의 항-IL-6 항체는 많은 치료학적 적용을 위한 당해분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있으며, 바람직한 투여 경로/모드는 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자에 의해 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드는 요구되는 결과에 따라 변화될 것이다. 특정 구체예에서, 활성 화합물은 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 신속한 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체 예컨대, 조정된 방출 제형과 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되었거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).

특정 구체예에서, 본 발명의 항-IL-6 항체는 예를 들어, 불활성의 희석제 또는 융합가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물 (및 필요에 따라, 다른 성분)이 경질 또는 연질 셀 젤라틴 캡슐 (shell gelatin capsule)에 넣어져서, 정제로 압축되거나 피검체 음식물에 직접적으로 혼입될 수 있다. 치료학적 경구 투여에 있어서, 화합물은 부형제와 혼합되어, 섭취용 정제 (ingestible tablet), 구강 정제 (buccal tablet), 트로키 (troche), 캡슐, 엘릭시르 (elixirs), 현탁액, 시럽, 웨이퍼 (wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 경로로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는, 화합물을 이의 활성을 보호하는 물질로 코팅시키거나, 이러한 물질과 함께 공동 투여해야 할 수 있다.

보조 활성 화합물이 또한 조성물중에 혼합될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 하나 또는 그 초과의 추가적인 치료제와 공동제형화되고/거나 공동투여된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 초과의 추가적 치료제는 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 질병 특히, "본 발명의 항-IL-6 항체의 치료학적 용도"의 섹션에 기술된 바와 같은 질환 또는 질병의 치료를 위한 제제 또는 제제들이다. 예를 들어, 본 발명의 항-IL-6 항체는 IL-6 또는 다른 표적물에 결합하는 하나 또는 그 초과의 추가적인 항체 예를 들어, IL-6 수용체에 결합하는 항체와 공동제형화되고/거나 공동투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 (treat and treatment)"는 예방학적 조치를 포함하는 치료학적 치료를 포함하며, 여기서 목적은 질환 또는 질병과 관련된 원하지 않는 생리학적 변화를 예방하거나 저하 (경감)시키는 것이다. 이롭거나 요구되는 임상학적 결과는 비제한적으로, 검출되는지의 여부에 상관없이, 증상의 완화, 질환 또는 질병의 정도의 감소, 질환 또는 질병의 안정화 (즉, 여기서, 질환 또는 질병은 악화되지 않음), 질환 또는 질병의 진행의 지연 또는 감속, 질환 또는 질병의 개선 또는 완화, 및 질환 또는 질병의 경감 (부분적이든 전체적이든)을 포함한다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않을 경우 예상된 생존 기간과 비교하여 연장된 생존 기간을 의미할 수 있다. 치료가 요구되는 대상은 질환 또는 질병을 이미 갖고 있는 대상과 질환 또는 질병을 가질 경향이 있는 대상 또는 질환 또는 질병을 예방하고자 하는 대상을 포함한다.

본 발명의 약제 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 본 발명의 항-IL-6 항체를 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 필요한 투여량 및 기간에 요구되는 치료학적 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 항체의 치료학적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 항체 또는 항체 일부의 개체에서 요구되는 반응을 유도해내는 능력과 같은 인자에 따라 변화될 수 있다. 치료학적 유효량은, 항체 또는 항체 일부의 치료학적으로 유익한 효과가 이의 독성 또는 유해 효과 보다 클 경우의 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량 및 기간에 요구되는 예방학적 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환 전에 또는 질환 초기에 피검체에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.

투여 요법은 최적의 요구되는 반응 (예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스 (bolus)가 투여될 수 있거나, 수개의 나누어진 용량으로 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 투여량이 치료학적 상황의 급박성에 의해 지시대는 바에 따라 비례적으로 증가하거나 감소될 수 있다. 각각의 투여 및 균일한 투여량을 위해 단위 투여 형태로 비경구 조성물을 제형화시키는 것이 특히 이롭다. 본원에 사용된 바와 같은 단위 투여 형태는 치료할 포유동물 대상에 대한 단일의 투여량으로서 적당한 물리적으로 구별된 단위를 의미한다; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 요구되는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 특정화는 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 민감도의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 혼합하는데 있어서 당해분야의 고유의 제약에 의해 지시되며, 이들에 직접적으로 의존적이다.

본 발명의 치료학적 또는 예방학적 유효량의 예시적인 비제한적 범위는 0.1-20mg/kg, 더욱 바람직하게는, 1-10mg/kg이다. 투여 값은 경감시킬 상태의 유형 및 중증도에 따라 변화될 수 있다. 또한, 임의의 특정 피검체에 있어서, 특이적 투여 요법은 개별 필요 및 조성물을 투여하거나 조성물 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하며, 본원에 제시된 투여 범위는 단지 예시적인 것이며, 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것은 아니다.

본 발명의 항-IL-6 항체의 치료학적 용도

본 발명의 항체는 IL-6의 작용에 의해 매개되거나, 이와 관련되거나, 이로 인해 초래되는 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 IL-6이 IL-6 수용체와 결합함으로써 초래된 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유도된 세포내 시그널링에 의해 초래된 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 예시적인 세포내 IL-6 시그널링 경로는 도 11에 예시되어 있다. 본 발명의 항체는 도 11에 예시된 임의의 분자의 활성에 의해 초래되거나 이와 관련된 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이의 활성은 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합에 의해 영향을 받는다.

이와 같이, 본 발명은 IL-6의 작용에 의해 매개되거나, 이와 관련되거나 이로 인해 초래된 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-6 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다. 표현 "본원에 기술된 바와 같은 항-IL-6 항체"는 본원에 제시된 VH 영역 및/또는 VL 영역을 포함하는 임의의 항-IL-6 항체 및 본원에 제시된 임의의 VH 영역의 변이체 및/또는 본원에 제시된 임의의 VL 영역의 변이체를 포함하는 항-IL-6 항체를 의미한다: "본원에 기재된 항-IL-6 항체"는 또한, 본원에 기재된 하나 또는 그 초과의 VH CDR (예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3) 및/또는 하나 또는 그 초과의 VL CDR (예를 들어, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)을 포함하는 임의의 항-IL-6 항체를 의미한다. 바람직하게는, 항체는 IL-6 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 구체예에서, 치료할 질환 또는 질병은 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환 또는 질병, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 및 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일 예시적인 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-6 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-IL-6 항체로 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환 및 질병은 예를 들어, 동종이식 거부 (allograft rejection), 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브병 (Graves' disease) 및 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis)), 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveoretinitis), 거대세포 동맥염 (giant cell arteritis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel diseases) (예를 들어, 크론병 (Crohn's disease), 궤양성 장염 (ulcerative colitis), 국소성 장염 (regional enteritis), 육아종성 장염 (granulomatous enteritis), 원위 회장염 (distal ileitis), 국한성 회장염 (regional ileitis), 및 말단 회장염 (terminal ileitis)을 포함), 인슐린 의존성 당뇨병 (insulin-dependent diabetes mellitus), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 건선 (psoriasis), 관절염 (arthritis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 사르코이도시스 (sarcoidosis), 경피증 (scleroderma), 및 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus)를 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-6 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환 및 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-IL-6 항체로 치료될 수 있는 예시적인 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환 및 질병은 예를 들어, 심혈관 질환 (cardiovascular diseases) 예컨대, 혈관종 (angioma), 맥관섬유종 (angiofibroma), 혈관 변형 (vascular deformity), 죽상경화증 (atherosclerosis), 유착성 및 부종성 경화증 (synechia and edemic sclerosis), 및 안과 질환 (opthalmological diseases) 예컨대, 각막 이식 후 신혈관신생 (neovascularization after cornea implantation), 관신생 녹내장 (neovascular glaucoma), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 신혈관신생성 각막 질환 (angiogenic corneal disease), 황반변성 (macular degeneration), 익상편 (pterygium), 망막변성 (retinal degeneration), 수정체후부 섬유증식증(retrolental fibroplasias), 및 과립성 결막염 (granular conjunctivitis)을 포함한다. 본 발명의 항-IL-6 항체로 치료될 수 있는 부적합한 혈관신생과 관련된 염증 질환은 예를 들어, 관절염, 피부 질환 (dermatological diseases) 예컨대, 건선, 모세혈관확장증 (telangiectasis), 화농성 육아종 (pyogenic granuloma), 지루성 피부염 (seborrheic dermatitis), 정맥성 궤양 (venous ulcers), 좌창 (acne), 적면증 (rosacea) (좌창성 적면증 (acne rosacea) 또는 홍반 (erythematosa)), 와츠 (warts) (사마귀 (verrucas)), 습진 (eczema), 혈관종 (hemangiomas), 및 림프관신생 (lymphangiogenesis)을 포함한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항-IL-6 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-IL-6 항체로 치료될 수 있는 예시적인 암은 예를 들어, 골수종 암 예컨대, 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 골수성 백혈병 (myelogenous leukemia) (CML) 및 림프성 백혈병 (lymphocytic leukemia) (CLL 및 ALL) 및 림프종 (Lymphomas), 특히, 비호지킨 림프종 (Non-Hodgkin's Lymphoma) (NHL)을 포함하는 면역 세포 이상으로부터 초래된 암을 포함한다. 본 발명의 항체는 또한, 예를 들어, 신장 암종 (renal carcinoma), 유방암 (breast cancer), 전립선암 (prostate cancer), 림프종 (lymphoma), 이식후 림프종 (post-transplant lymphoma), 및 이식후 림프증식성 질환 (post-transplant lymphoproliferative disease) (또한, 이식후 림프증식성 질병 (posttransplantation lymphoproliferative disorder)으로 불림)을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항-IL-6 항체로 치료될 수 있는 추가적인 상태는 예를 들어, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 류마티스 관절염 및 섬유증 (예컨대, 내부 및 외부 기관 상처)을 포함한다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 질병 치료를 위한 의약 제조시 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.

본원에 기술된 조성물, 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 적합화가 자명하며, 본 발명의 범위 또는 이의 구체예로부터 벗어나지 않으면서 수행될 수 있음이 관련 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 더욱 상세하게 기술되었으며, 하기 실시예를 참조로 하여 당업자는 이를 더욱 명확히 이해할 수 있을 것이며, 이는 단지 예시를 위한 목적으로 포함되며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

IL-6에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 제 1 세대

본 실시예의 목적은 B-E8 (또한, 엘실리모맵 (Elsilimomab)으로 공지됨)로서 공지된 뮤린 IL-6 항체로부터 출발하여 인간 항-IL-6 모노클로날 항체를 제조하는 것이다.

스크니링 공정은, 뮤린 B-E8 항체의 VK 또는 VH 영역과 쌍을 이루는 경우, IL-6에 특이적으로 결합하는 항체를 형성하는, 인간 VH 및 VK 영역을 확인하기 위해, 백시니아 (vaccinia) 바이러스 기재 항체 선택 플랫폼을 이용하여 수행되었다. 그 후, 선택된 인간 VH 및 VK를 각각 IL-6에 특이적으로 결합하는 인간 VK 및 VH를 선택하는데 이용하였다. 백시니아 바이러스 기재 스크리닝 플랫폼의 더욱 상세한 내용은 예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 번호 2005/0196755호에 기술되어 있다. 이러한 스크리닝 공정으로부터, 뮤린 B-E8 또는 인간 VH를 사용하여, 18개의 상이한 인간 VK 유전자를 확인하였다. 확인된 인간 VK 유전자의 핵산 서열 및 이의 상응하는 아미노산 서열을 결정하였다. 확인된 인간 VK 유전자의 아미노산 서열은 하기 표 8에 제시되어 있다:

표 8: 확인된 인간 VK 영역의 아미노산 서열

밑줄친 서열은 각각 CDR1-3을 나타낸다.

또한, 뮤린 B-E8 또는 인간 VK를 사용하여, 상이한 인간 VH 유전자를 확인하였다. 확인된 인간 VH 유전자의 핵산 서열 및 이의 상응하는 아미노산 서열을 결정하였다. 확인된 인간 VH 유전자의 아미노산 서열은 하기 표 9에 제시되어 있다:

표 9: 확인된 인간 VH 영역의 아미노산 서열

밑줄친 서열은 각각 CDR 1-3을 나타낸다.

확인된 인간 VH 영역의 아미노산 서열은 하기 표 10에 예시된 바와 같이 서로 현저한 서열 동일성을 나타내었다:

표 10: 인간 VH중의 아미노산 서열 동일성

확인된 인간 VH 영역의 정렬은 도 1에 기술되어 있다.

확인된 인간 VK 모두는 확인된 모든 인간 VH와 쌍을 이루었다. 이러한 쌍으로부터 생성된 항체를 이들의 IL-6에 결합하는 능력에 대해 ELISA로 시험하였다. 또한, 항체를 IL-6 유도된 세포 증식 또는 IL-6R에 결합하는 IL-6의 차단 검정에 있어서의 작용 활성에 대해 시험하였다.

IL-6에 대해 선택된 항체의 친화도는 문헌 [J. of Immunology Methods 77 (1985) 305-319]에 기술된 공정에 기초하여 ELISA에 의해 측정하였다. 간단하게는, 플레이트를 코팅 완충제 (coating buffer)중의 2㎍/ml의 mBE4 포획 항체로 웰당 100㎕로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 3회 세척하고, 탭핑 건조 (tapped dry)시켰다. 그 후, 플레이트를 웰당 200㎕의 PBS중의 10% FBS 또는 검정 희석물 (Assay Diluent)로 차단시키고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 차단하면서, 약 2ng/ml 농도의 65㎕의 Ab를 다양한 농도 (IL-6을 함유하지 않는 것을 포함하여, 총 12개의 상이한 농도에 대한 1:2 일련의 희석비로 5.12㎍/ml 내지 5ng/ml)의 65㎕의 rhIL6와 사전인큐베이션시킴으로써 용액중에서 경쟁 반응을 준비하였다. 반응을 실온에서 3-4시간 동안 방치되게 하였다. 따라서, 경쟁 용액중의 최종 rhIL6은 단량체로서 IL-6에 따라 98.46, 49.23, 24.62, 12.31, 6.15, 3.08, 1.54, 0.77, 0.38, 0.19, 0.10 및 0 nM이다. 그 후, 플레이트를 3회 세척하고, 탭핑 건조시켰다. 50ng/ml의 재조합 인간 IL-6 100㎕를 BE4 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 탭핑 건조시켰다. 그 후, 상기로부터 100㎕의 mAb 샘플을 IL-6 포획된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1-2시간 동 안 인큐베이션하였다. (따라서, 이 시점에서 임의의 비결합된 mAb는 ELISA에 의해 측정될 것이다). 그 후, 플레이트를 5회 세척하고 탭핑 건조시켰다. 100㎕의 검출 Ab 염소 항-인간 IgG F(ab)'2-HRP (잭슨 랩 (Jackson lab))을 1:20,000 희석비 또는 1:40,000 희석비로 첨가하고 (롯 (lot)에 따라), 플레이트를 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 7회 세척하고, 탭핑 건조시켰다. 그 후, 디벨로퍼 서브스트레이트 (Developer Substrate) (키트중의 각 시약의 동일한 부분)를 사전-혼합하고, 사용전에 실온으로 가온시켰다. 그 후, 100㎕의 디벨로퍼를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암실내 서랍속에서 밀봉되지 않은 채 15분 동안 현상시켰다. 최종적으로, 각 웰에 100㎕의 2N H₂SO₄를 첨가함으로써 현상을 중단시키고, 플레이트를 450nm-570nm에서 종점 (Endpoint)으로서 해독하였다.

차단 검정을 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 수행하였다.

VH/VK 쌍으로부터, 33개의 제 1 세대 mAb가 확인되었다. 이러한 제 1 세대 mAb는 하기 표 11에 기술되어 있다:

표 11: 제 1 세대 인간 항-IL-6 항체의 요약

*mAb 88은 키메라 B-E8 대조군 항체이다.

상기 표에 기술된 바와 같이, 수득된 모든 제 1 세대 인간 항-IL-6 항체는 IL-6에 대한 어느 정도의 친화도 및 차단 검정에 있어서의 작용 활성을 나타내었다. 간단하게는, 12.5ng/ml의 바이오티닐화된 인간 재조합 IL-6을 지시된 농도에서 항-IL-6 항체와 20분 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 그 후, FcR-차단된 U266 세포 (약 250,000 세포)를 첨가하고, 얼음상에서 추가로 30분 동안 공동인큐베이션하였다. 세척 후, 스트렙타비딘-PE를 첨가하여, 세포 표면에 결합된 IL-6을 드러내었다. 세척 후, 세포를 유세포 분석기 (flow cytometry)에 의해 분석하였다.

U266 세포상의 IL-6 수용체에 결합하는 IL-6을 차단하는 특정한 예시적인 제 1 세대 mAb의 능력은 도 2에 기술되어 있다.

따라서, 본 실시예는 수개의 생물학적 작용성 인간 항-IL-6 모노클로날 항체의 생성을 입증한다.

실시예 2

인간 항-IL-6 항체의 친화도 개선

돌연변이 유발을 이용하여 실시예 1에서 확인된 제 1 세대 인간 mAb의 작용 활성을 추가로 개선하였다. 특히, PCR-기초 돌연변이유발을 이용하여 mAb 416의 VH (H1079) 및 VK (L198)의 CDR3에 아미노산 서열 변화부를 도입하였다.

변이를 유도하기 위해, 서열 NNK를 VH 및 VK 유전자중의 특정 위치에 도입시켰으며, 여기서, N은 A, T, G 또는 C일 수 있으며, K는 T 또는 G이다. NNK를 이용하여, 모두 20개 아미노산 및 1개의 종료 코돈을 각 위치에 도입시킬 수 있다 (NNK 서열로의 4 x 4 x 2, 즉 32개의 가능한 조합이 존재한다).

H1079 및 L198 둘 모두에서의 CDR3 잔기 모두를 한번에 하나의 잔기씩 변화시켰다. 경쇄 (VK) CDR3는 9개의 아미노산을 가지며, 중쇄 (VH) CDR3는 12개의 아미노산을 갖는다. H1079의 CDR1 및 CDR2중의 선택된 잔기를 이러한 과정을 이용하여 또한 변화시켰다.

돌연변이를 생성시키기 위해, NNK로 대체된 하나의 아미노산을 엔코딩하며, CDR3 및 프레임워크 영역 4를 증폭시키는 안티-센스 (anti-sense) 프라이머를, PCR 반응을 위한 대상 사슬의 프레임워크 영역 1에서 하이브리디제이션 (hybridization)되는 센스 프라이머와 쌍을 이루게 하였다. 각각의 PCR 생성물은 전체 VK 또는 VH 사슬을 엔코딩하며, NNK로 전환된 하나의 아미노산 위치를 갖는 다.

PCR 생성물을 인간 감마 I (VH 돌연변이체에 있어서) 또는 카파 (VK 돌연변이체에 있어서)의 불변 도메인을 함유하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝시켜, 전장의 중쇄 또는 경쇄를 생성시켰다.

웰당 1개의 클론을 갖도록 96웰 플레이트 포맷에 클론을 도입하였다. 플라스미드 DNA를 각 클론으로부터 정제하고, 각 클론을 CHO 세포에서 트랜스펙션에 의해 상보적 사슬과 발현시켰다 (예를 들어, 변이된 VK는 VH와 발현될 것임). 더 높은 친화도의 결합제가 선택되고 특징화되었다. 이러한 과정의 요약은 도 3에 도시되어 있다.

더 높은 친화도의 변이체가 확인되면, 변이체를 시퀀싱하고, 생성된 mAb를 CHO 세포에서의 트랜스펙션에 의해 생성시킨 후, 유세포 분석기-기초 IL-6 차단 검정으로 특이성, 친화도 및 작용을 시험하였다.

이러한 과정에 의해, 하기 H1079 및 L198 변이체를 수득하였다:

표 12:: PCR-기초 돌연변이유발에 의해 수득된 H1079 변이체

* 아미노산 번호는 Kabat 번호를 나타낸다.

§ 박스친 잔기는 H1079의 서열과 비교하여 변화된 잔기이다.

밑줄친 서열은 각각 CDR 1-3을 나타낸다.

표 13: PCR-기초 돌연변이유발에 의해 수득된 L198 변이체

* 아미노산 번호는 Kabat 번호를 나타낸다.

§ 박스친 잔기는 L198의 서열과 비교하여 변화된 잔기이다.

밑줄친 서열은 각각 CDR 1-3을 나타낸다.

하기 항체는 L198과 쌍을 이룬 표 12에 제시된 H1079 변이체를 이용하여 제조되었다:

표 14: H1079 변이체를 L198과 쌍을 이루게 하여 제조된 mAb

모노클로날 항체 416, 926, 810, 963, 968 및 992를 대조군 mAb 88과 함께 IL-6R-발현 세포로의 IL-6 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 간단하게는, 1nM의 인간 재조합체 IL-6을 얼음상에서 1㎍/ml - 0.1㎍/ml - 10ng/ml - 0ng/ml의 항-IL-6 항체와 인큐베이션하였다. 그 후, FcR-차단된 U266 세포 (약 250,000 세포)를 첨가하고, 30분 동안 얼음상에서 공동인큐베이션하였다. 세척 후, 정제된 IL-6-특이적 마우스 항체 (B-F6)를 첨가하고, 30분 동안 얼음상에서 세포와 인큐베이션하였다. 최종적으로, APC-컨쥬게이팅된 폴리클로날 염소-항-마우스 Fc 감마를 첨가하고, 30분 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 단지 살아있는 세포의 군집만 게이팅 (gating)함으로써 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 각각의 샘플은 250,000개 세포로 시작하였다. 모든 유세포 분석기 데이타는 최소 10,000개의 생존 (PI-네거티브) 세포에 기초한다. 이들 실험의 결과는 도 4에 제시되어 있다.

하기 항체는 H1079와 쌍을 이룬 표 13에 제시된 L198 변이체를 이용하여 제조하였다:

표 15: L198 변이체를 H1079와 쌍을 이루게 하여 제조된 mAb

H1079중의 다중 돌연변이를 상기 개략된 과정에 의해 제조하였다.

표 16: PCR-기초 돌연변이유발에 의해 수득된 H1079 다중 돌연변이

* 아미노산 번호는 Kabat 번호를 나타낸다.

§ 박스친 잔기는 H1079의 서열과 비교하여 변화된 잔기이다.

밑줄친 서열은 각각 CDR 1-3을 나타낸다.

또한, 변이체 중쇄 H1553을 H1079의 CDR2중의 단일 아미노산 변화 (F52W)에 의해 생성시켰다. H1553은 하기 아미노산 서열을 갖는다:

또한, H1553의 CDR2중에서 발현된 아미노산 변화를 H1522중의 4개의 CDR3 아미노산 치환기와 조합하여 H1579를 생성시켰으며, 이는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

하기 mAb를 하기 표 17에 도시된 바와 같이 VH 및 VK 변이체를 조합시켜 수득하였다:

표 17: VH 및 VK 변이체를 조합하여 생성된 mAb

IL-6에 대한 예시적인 mAb의 친화도를 하기 표 18에 도시된 바와 같이 IC50 ELISA 및 바이아코어 (Biacore)에 의해 결정하였다. IC50 ELISA를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 바이아코어에 의한 친화도 분석은 HBS-EP 완충제 (바이아코어 AB)를 사용하여 제조업자 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단하게는, 100㎍/ml 염소 항-인간 IgG (Sigma-Aldrich Co.)를 5㎕/min의 유속으로 5㎍/ml의 mAb를 15㎕ 주입함으로써 결정된 각 IL-6 mAb에 대한 친화도로 CM5 센서 칩 (Biacore AB)의 표면상에 고정화시킨 후, 100㎕의 40nM 내지 1.25nM 인간 IL-6 (Strathmann Biotech GmbH & Co.KG)을 바이아코어 2000 시스템 (Biacore AB)상에서 30㎕/min의 유속으로 주입하였다.

표 18: IC50 ELISA 및 바이아코어에 의한 mAb의 친화도

모노클로날 항체 1259, 1337, 1338, 1339 및 1340은 IgG1 카파이다. 불변 도메인 모두는 동일하다. 불변 도메인은 발현 플라스미드중에 존재하고, 따라서, mAb 마다 변화되지 않는다. 단지 VH 및 VK 도메인만 라이브러리로부터 선택하였다.

따라서, 본 실시예는 PCR-기초 돌연변이유발에 의해 수득된 변이체 VH 및 VK 사슬을 포함하는 수개의 추가적인 인간 항-IL-6 모노클로날 항체의 생성을 설명한다.

실시예 3

서열 및 벡터

예시적인 중쇄 및 경쇄 서열

뮤린 mAb B-E8 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 표 19에 기술되어 있다:

표 19: B-E8의 중쇄 및 경쇄 서열

인간 mAb 926 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 20에 기술되어 있다:

표 20: mAb 926의 중쇄 및 경쇄 서열

인간 mAb 1339 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 21에 기술되어 있다:

표 21: mAb 1339의 중쇄 및 경쇄 서열

mAb 1339의 중쇄 및 경쇄를 발현하는 이중 유전자 벡터의 작제

중쇄 H1579의 pCONG1으로의 클로닝

H1579를, 오리지날 발현 벡터로부터 BssHII 및 BstEII 제한 효소로 가변 영역을 분해하여 pACeL 중쇄 벡터로 서브클로닝하였다. H1579pAcEL-H를 HindIII/ApaI로 분해하고, HindIII/ApaI-컷 pConG1으로 결찰시켰다. H1579.pConG1 클론을 서열 입증하였다.

경쇄 L298의 pCONK2로의 클로닝

L298을, 오리지날 발현 벡터로부터 가변 영역을 ApaL1/XhoI로 분해하고, 백시니아 트랜스퍼 벡터 (vaccinia transfer vector) VKE로 결찰시킴으로써 서브클로닝하여, 후속 이중 유전자 클로닝에 필요한 제한 부위를 엔코딩하는 양립성 서열 (compatible sequence)을 제공하였다. 가변 서열을 PCR 증폭하여 5' 말단의 HindIII 부위 및 3' 말단의 BsiWI 부위로 첨가하였다. PCR 생성물을 TOPO로 클로닝하여, 후속 클로닝 반응에서 HindIII 및 BsiWI로의 완전 분해를 촉진하였다. L298.TOPO를 서열 입증하고, HindIII/BsiWI로 분해하고, HindIII/BsiWI-컷 pConK2로 결찰시켰다. L298.pConK2를 서열 입증하였다.

이중 유전자 벡터의 생성

중쇄 발현 카세트를, H1579.pConG1을 24시간 분해하여 NotI/PvuI 단편으로서 방출시켰다. L298.pConK2를 AviII로 분해하여 모 클론 (parental clone)의 재형성을 방지하고, L298 가변 영역 카세트를 PvuI 및 NotI 분해로 방출시켰다. 겔 정제 후, 중쇄 및 경쇄 카세트를 14℃에서의 밤새 결찰 반응에서 1:1 비로 결찰시켰다. 클론을 전체 세포 PCR에 의해 중쇄 및 경쇄 삽입물의 존재에 대해 스크리닝하고, 파지티브 클론을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이중 유전자 벡터의 맵은 도 9에 기술되어 있다. 이중 유전자 벡터의 서열은 표 22에 제시되어 있다:

표 22: mAb 1339 이중 유전자 벡터의 뉴클레오티드 서열

실시예 4

mAb 1339를 발현하는 CHO 세포주의 생성

고밀도 현탁 배양액중에서 성장시키기에 적합한 세포주인 CHO-K1 HD를 mAb 1339 이중 유전자 벡터 (상기 실시예 3에 기술된 바와 같음)로 트랜스펙션시켰다. CHO-K1 HD 세포를 현탁 상태로 트랜스펙션 시간까지 이르게 하였다. 트랜스펙션 전날, 현탁 세포주를, 세포의 부착을 허용하는 혈청의 존재하에 6-웰 플레이트에 시딩하였다.

4개의 별도의 트랜스펙션을 각각 7일 간격을 두고 CHO-K1 HD 세포의 계대 배양을 이용하여 수행하고, 새로 정제하고, 분리된 플라스미드 DNA 제조물로부터 DNA를 분해하였다. 매주, 세포를 두개의 6-웰 플레이트에 시딩하고, 하나의 플레이트는 2.5:1의 DNA:리포펙트아민 비이고, 다른 하나는 3.0:1의 비이다. 따라서, 총 48개 풀 (pool)을 4주에 걸쳐 트랜스펙션하였다. 성장 및 항체 생성 수준에 대한 각 풀은 다음과 같으며; 모든 풀이 약물 선택에서 생존한 것은 아니다. 풀을 하기 명명법으로 나타내고; mAb 명칭/트랜스펙션 수, DNA:리포펙트아민 비; 트랜스펙션된 웰의 칭호 및 디쉬 번호 (예를 들어, mAb 1339/1 2.5 B2 풀).

생산성을 3-일 분비 검정을 이용하여 측정하였다. 데이타는 mAb 역가 (㎍/ml) 및 특정 생산도 (㎍/백만 세포/일)로 나타내었다. 항체 역가 및 특이성을 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 시험된 1339 풀로부터의 분비 검정 결과를 표 23에 나타내었다.

표 23: 트랜스펙션된 CHO 세포의 생산성

소규모 분비 실험으로부터의 mAb 수율은 도 10에 나타내었다.

실시예 5

항체 특이성 및 생물학적 활성

항체 특이성

정제된 mAb 1339를 IL-6에 대한 특이성을 확인하게 위해 시험하였다. 정제된 mAb 1339를 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 인간 헤모글로빈 및 소 혈청 알부민을 포함하는 대조군 항원의 패널로의 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 이들 항원에 대해서는 비-특이적 결합이 관찰되지 않았다 (데이타 미도시).

또한, 정제된 mAb 1339 및 대조군 mAb 88을 IL-6 슈퍼패밀리 멤버의 패널로의 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다: CNFT, 온코스타틴 M, IL-11 및 NNT-1. 도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, mAb 1339 또는 mAb 88 어느 것도 ELISA에서 이들 사이토카인에 결합하지 않았다.

IL-6 유도된 뮤린 및 인간 세포 증식의 억제

인간 항-IL-6 mAb의 생물학적 활성을 평가하기 위해, IL-6 유도된 뮤린 B9 골수종 세포 증식 (도 12) 및 IL-6 유도된 인간 U266 세포 증식 (도 13)을 억제하는 이들의 능력을 평가하였다. 뮤린 B9 세포주는 인간 IL-6 민감성이다.

도 12에 도시된 바와 같이, mAb 926, 1259, 1337, 1338, 1339 및 1340 모두는 IL-6-유도된 뮤린 골수종 세포 증식에 대한 용량-의존적 억제 효과를 나타낸다. 예를 들어, 100ng/ml의 mAb 농도에서, mAb 926, 1337, 1338 및 1339로 관찰된 억제 수준은 뮤린 mAb B-E8로 관찰된 억제 수준과 매우 밀접하였다.

도 13에 도시된 바와 같이, mAb 416, 926 및 1339는 IL-6-유도된 인간 골수 종 세포 증식에 대한 용량-의존적 억제 효과를 나타낸다.

IL-6과 IL-6R 사이의 상호작용의 억제

인간 항-IL-6 mAb의 생물학적 활성을 추가로 평가하기 위해, IL-6과 IL-6 수용체간의 상호작용을 억제하는 이들의 능력을 유세포 분석기를 사용하여 평가하였다.

유세포 분석기를 표준 방법을 이용하여 사용하였다. 먼저, U266 세포상의 Fc-수용체 차단을 수행하였다. U266은 IgE 및 IL-6 생성 인간 형질세포종 세포주이다. U266 세포를 채취하고 스핀 다운시켰다. 세포를 계수하고, 흐르는 완충제 (FB)중에 2회 세척하고, 검정에 필요한 최종 세포 수의 약 120%로 조절하였으며, 이는 96 웰 플레이트의 웰 당 150,000개 세포로 산정된다. 세포를 FB중에 5x10e6개의 세포/ml로 재현탁시키고, 0.1mg huIgG/ml로 조절하였다. 세포를 혼합하고, 얼음상에서 20-30분 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 15부피의 FB를 첨가하고, 세포를 스핀 다운시켰다. 상청액을 따라내고, 세포를 20ml FB로 2회 넘게 세척하였다. 그 후, 세포를 1.5x10e6개의 세포/ml의 밀도로 재현탁시키고, 100㎕를 사전인큐베이션 플레이트에 웰당 첨가하였다. 그 후, 재조합체 인간 IL-6 및 항-인간 IL-6 mAb를 공동인큐베이션하였다. FB중의 mAb 및 IL-6의 모든 필요한 희석물을 먼저 제조하였다. 다음으로, 50㎕의 mAb를 중간 파워에서 30s 동안 플레이트 볼텍스상에서 플레이트를 혼합한 후 얼음상에서 30분 동안 50㎕의 IL-6 (바람직하게는, 최종 1nM)과 사전인큐베이션하였다. 각 mAb에 대한 대조군 웰을 항체의 부재하에 IL-6 없이 또는 IL-6과 함께 공동인큐베이션하였다. 그 후, U266 세포를 IL-6 및 항-IL-6 mAb와 공동인큐베이션하였다. 차단되고 세척된 세포를 100㎕ FB중에서 상기로부터의 IL6/MAb 혼합물에 첨가하였다. 최종 인큐베이션 부피는 200㎕이었다. 세포를 30분 동안 얼음위에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 사이의 세척 단계를 하기와 같이 수행하였다: 초기에는, 인큐베이션 플레이트를 4℃로 설정된 원심분리기에서 4분 동안 250xg로 스피닝하였다. 플레이트를 조심스럽게 톡톡 쳐서, 펠렛이 떨어지지 않게 닦아내었다. 그 후, 세포를 가장 높은 파워에서 10s 동안 플레이트를 볼텍싱함으로써 재현탁시켰다. 220㎕ FB를 첨가하고, 플레이트를 다시 스피닝하였다. 이러한 세척 단계를 1회 더 반복하고, 볼텍싱된 세포 펠렛을 최종적으로 각각의 항체 희석물 100㎕중에 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 마우스 항 IL-6 항체 B-F6과 인큐베이션하였다. 100㎕의 항체 [FB중 5㎍/ml]를 상기로부터의 세척된 세포 펠렛에 직접 첨가하고, 이를 짧은 볼텍스에 의해 흩어지게 한 후, 15s 동안 중간 파워에서 다시 조심스럽게 볼텍싱하였다. 세포를 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션하고 세척하였다. 그 후, 세포를 APC 결합된 염소 항-마우스 IgG1과 인큐베이션하였다. 흩어지고, 세척된 세포 펠렛을 100㎕의 라벨링된 항체 [2.5㎍ 알로피코시아닌/ml]에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 유지시키고, 볼텍싱하고, 30분 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 200 내지 400㎕ FB중에 재현탁시켰다. 유세포 분석기에 의해 분석을 수행하였다. 먼저, 프로피듐 요오다이드 (PI) 스톡의 150배 희석을 이용하여 PI를 첨가하였다. FSC에 대하여 F1-3에서 관찰시 PI의 배제에 기초한 라이브 게이트를 지정하였다. PI를 세포의 다음 샘플에 대해서만 첨가하여 PI를 갖는 세포의 연장된 인큐베이션을 회피하였다.

도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이, mAb 926, 1259, 1337, 1338, 1339 및 1340 모두는 0.5㎍/ml의 일정하게 유지된 항체 농도로 IL-6 농도의 증가하에서 U266 세포상의 IL-6 수용체로의 IL-6 결합의 억제 효과를 나타내었다. 현저하게 높은 수준의 억제는 mAb 1339에서 관찰되었다. 유사하게는, 도 7A 및 7B는 500ng/ml의 일정하게 유지된 IL-6 농도에서 mAb의 농도의 증가하에서 U266 세포상의 IL-6 수용체로의 IL-6의 결합에 대한 mAb 242, 416, 926 및 1339의 억제 효과를 나타낸다.

mAb의 억제 효과는 바이오티닐화된 IL-6을 사용하는 경우에도 입증되었다 (데이타 미도시됨).

이들 결과는 mAb 242, 416, 926, 1259, 1337, 1338, 1339 및 1340이 IL-6과 이의 수용체간의 상호작용을 억제할 수 있음을 보여주며, 따라서, 이들 mAb의 생물학적 활성을 확인시켜 준다.

최종적으로, 도 4에 있어서 실시예 2에 기술된 바와 같은 경쟁 검정을 대조군 mAb 88과 함께 mAb 416, 926, 1259, 1337, 1338, 1339 및 1340을 사용하여 수행하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 모든 시험된 mAb는 IL-6 수용체로의 재조합체 인간 IL-6 결합에 대한 용량-의존적 억제 효과를 나타내었다.

실시예 6

mAb 926 및 1339의 mAb 특이성

뮤린 및 래트 IL-6과의 상호-반응성을 상기 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 mAb 926 및 1339에 대해 결정하였다. 웰을 100ng/ml의 뮤린 또는 래트 IL-6 (R&D Systems)으로 100㎕/웰로 코팅하였다. 인간 모노클로날 항체를 이용한 실험에 있 어서, IgG1 카파 (인간 골수종 IgG1; Sigma-Aldrich Co.) mAb를 대조군으로서 사용하였다. mAb 검출을 위해 래빗 항-인간 IgG-HRP (Dako)를 100㎕/웰로 1/10,000 희석비로 첨가하였다. 폴리클로날 항체 (pAb) 대조군은 바이오티닐화된 염소 항-인간 IL-6 (Peprotech), 바이오티닐화된 염소 항-뮤린 IL-6 (Peprotech), 및 바이오티닐화된 염소 항-인간 IL-2 (Peprotech)를 포함하였다. pAb에 있어서, 스트렙타비딘-HRP (Prozyme)을 100㎕/웰에서의 검출을 위해 첨가하였다. 항체를 12.5, 25, 50 및 100ng/ml의 농도로 적용하였다. 도 14 및 15에 각각 도시된 바와 같이, mAb 926 및 1339는 ELISA에 의해 코팅된 재조합 뮤린 또는 래트 IL-6을 검출하지 못하였다.

실시예 7

천연 인간 및 원숭이 IL-6의 검출

천연 인간 IL-6을 검출하는 mAb 926 및 1339의 능력을 활성화된 인간 단핵구에서 분석하였다. IL-6의 세포질내 발현을 유도하기 위해 말초혈 단핵 세포로부터의 단핵구를 24시간 동안 리포폴리사카라이드 (LPS; 20㎍/ml; Sigma-Aldrich Co.)로 활성화시켰다. IL-6의 상청액으로의 이동을 억제시키기 위해 LPS 처리 종료 6시간 전에 세포를 1㎍/ml 브레펠딘 A (Brefeldin A) (Sigma-Aldrich Co.)로 처리하였다. 활성화된 세포를 이전에 기술된 바와 같이 0.8㎍/ml 바이오티닐화된 mAb 88, 1339, 926, B-E8 (항-뮤린-IL-6; Diaclone), B-Z1 (마우스; Diaclone) 및 인간 IgG1 카파 (Sigma-Aldrich Co.)로 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 3개의 독립된 실험을 각 항체에 대해 수행하였다. 대표적인 실험은 도 16에 도시되어 있으 며, 이는 mAb 926 및 1339가 천연 세포질내 IL-6을 인지함을 보여준다.

추가적으로, 인간 혈청으로부터 천연 인간 IL-6을 검출하는 mAb 926 및 1339의 능력을 제조업자의 프로토콜에 따라 디아클론 하이 센서티버티 인간 IL-6 ELISA 키트 (Diaclone High Sensitivity human IL-6 ELISA kit)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 후자 키트를 사용하여, 인간 IL-6의 검출을 ELISA 플레이트 웰상에 코팅된 IL-6 항체와의 mAb 경쟁 (5㎍/ml)에 의해 결정하였다. 경쟁자 항체의 부재하에 IL-6 함유 혈청 (혈청 AB 배치 (Serum AB batch) 5; Blood Center, Besancon, France)의 첨가는 ELISA 키트에 의해 IL-6의 검출을 유도하였다. 경쟁자 항체의 존재하에 IL-6을 함유하는 혈청의 첨가는 혈청중의 IL-6을 검출하는 ELISA 키트의 능력에 있어서의 저하를 유도하였다. 대조군 항체는 B-E8 (항-뮤린-IL-6; Diaclone), B-Z1 (마우스; Diaclone) 및 인간 IgG1 카파 (Sigma-Aldrich Co.)를 포함하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, mAb 926 및 1339는 건강한 공여체 혈청으로부터의 천연 IL-6을 검출하였다.

붉은털 원숭이 혈청 (BPRC, The Netherlands)으로부터의 천연 원숭이 IL-6을 검출하는 mAb 1339의 능력을 제조업자의 프로토콜에 따라 U-사이텍 멍키 IL-6 ELISA 키트 (U-Cytech Monkey IL-6 ELISA kit) (U-Cytech biosciences)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 후속 키트를 사용하여, 원숭이 IL-6의 검출은 ELISA 플레이트 웰상에 코팅된 IL-6 항체와의 mAb 경쟁 (5㎍/ml)에 의해 결정하였다. 경쟁자 항체의 부재하의 IL-6을 함유하는 혈청의 첨가는 ELISA 키트에 의한 IL-6의 검출을 유도하였다. 경쟁자 항체의 존재하에 IL-6을 함유하는 혈청의 첨가는 혈청중 의 IL-6을 검출하는 ELISA 키트의 능력을 저하시켰다. 원숭이 IgG1 카파는 대조군 항체로서 작용하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, mAb 1339는 원숭이 혈청으로부터 천연 IL-6을 검출하였다.

명확한 이해를 위해 설명 및 예시적으로 상세하게 본 발명을 기술하였으므로, 본 발명의 범위 또는 이의 특정 구체예에 영향을 끼치지 않으면서, 조건, 제형 및 기타 파라미터의 넓고 동등한 범위내에서 본 발명을 변형 또는 변화시키고, 이러한 변형 또는 변화가 첨부된 청구 범위내에 포함된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 나타내며, 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 참조로 통합되었음이 특정하게 및 개별적으로 언급된 경우 이는 본원에 참조로서 통합되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Vaccinex, Inc. <120> Anti-IL-6 Monoclonal Antibodies and Uses Thereof <130> 2521.001PC01 <150> US 60/835,107 <151> 2006-08-03 <160> 100 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Ser Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 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<223> Human VL CDR3 <400> 90 Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Leu Gly Thr 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 91 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 92 Gln Ser Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 93 Gln His Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 94 Gln Leu Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 95 Gln Asn Ala His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VL CDR3 <400> 96 Gln Asn Gly Trp Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH CDR2 <400> 97 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Glu Thr 1 5 10 15 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH CDR3 <400> 98 Ser His Asp Asp Tyr Leu Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..7 <223> CDR1 of identified human VH consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 4,5,7 <223> Positions with consensus residues, meaning any amino acid <400> 99 Thr Ser Gly Xaa Xaa Val Xaa 1 5 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..16 <223> CDR2 of identified human VH consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1,2,3,8,9,11,15,16 <223> Positions with consensus residues, meaning any amino acid <400> 100 Xaa Xaa Xaa Trp Asp Asp Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Pro Ser Leu Xaa Xaa 1 5 10 15

Claims (93)

1. (a) (i) SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:51-55중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1;

   (ii) SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:97, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:56-61 또는 97중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2;

   (iii) SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO-.68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:98, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:62-73 또는 98중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및

   (b) (i) SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:74-79중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1;

   (ii) SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:80-85중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2;

   (iii) SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:86-96중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, IL-항원에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
2. 아미노산 서열 T-S-G-X₁-X₂-V-X₃ (SEQ ID NO:99) (여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 임의의 아미노산일 수 있음)을 갖는 가변 중쇄 CDR1 (VH-CDR1)을 포함하며, IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
3. 제 2항에 있어서, X₁이 메티오닌 (M) 또는 발린 (V)인 항체.
4. 제 3항에 있어서, X₁이 발린 (V)인 항체.
5. 제 2항에 있어서, X₂가 시스테인 (C), 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 글리신 (G)인 항체.
6. 제 2항에 있어서, X₃이 세린 (S) 또는 글리신 (G)인 항체.
7. 아미노산 서열 X₁-X₂-X₃-W-D-D-D-X₄-X₅-Y-X₆-P-S-L-X₇-X₈ (SEQ ID NO:100) (여기서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇ 및 X₈은 임의의 아미노산일 수 있음)을 갖는 가변 중쇄 CDR2 (VH-CDR2)을 포함하며, IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
8. 제 7항에 있어서, X₁이 류신 (L), 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)인 항체.
9. 제 8항에 있어서, X₁이 류신 (L)인 항체.
10. 제 7항에 있어서, X₂가 이소류신 (I) 또는 발린 (V)인 항체.
11. 제 10항에 있어서, X₂가 이소류신 (I)인 항체.
12. 제 7항에 있어서, X₃가 티로신 (Y) 또는 페닐알라닌 (F)인 항체.
13. 제 7항에 있어서, X₄가 리신 (K) 또는 아르기닌 (F)인 항체.
14. 제 7항에 있어서, X₅가 아르기닌 (R), 티로신 (Y) 또는 히스티딘 (F)인 항체.
15. 제 7항에 있어서, X₆이 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)인 항체.
16. 제 15항에 있어서, X₆이 세린 (S) 항체.
17. 제 7항에 있어서, X₇이 아르기닌 (R), 리신 (K), 글루탐산 (E) 또는 세린 (S)인 항체.
18. 제 17항에 있어서, X₇이 리신 (K)인 항체.
19. 제 7항에 있어서, X₈이 세린 (S) 또는 아스파라긴 (N)인 항체.
20. SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:51-55중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR1 (VH-CDR1)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VH-CDR1을 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
21. SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:97, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:56-61 또는 97중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR2 (VH-CDR2)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VH-CDR2를 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
22. SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:98, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:62-73 또는 98중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR3 (VH-CDR3)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VH-CDR3을 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
23. SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:74-79중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR1 (VL-CDR1)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VL-CDR1을 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
24. SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:80-85중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR2 (VL-CDR2)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VL-CDR2를 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
25. SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 1 내지 5개의 아미노산 치환기를 제외하고는 SEQ ID NO:86-96중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR3 (VL-CDR3)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 상기 VL-CDR3을 포함하는 항체 분자가 IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 핵산 분자.
26. (a) (1) H415 (SEQ ID NO:19);

    (2) H884 (SEQ ID NO:20);

    (3) H1077 (SEQ ID NO:21);

    (4) H1078 (SEQ ID NO:22);

    (5) H1079 (SEQ ID NO:23);

    (6) H1081 (SEQ ID NO:24);

    (7) H1089 (SEQ ID NO:25); 및

    (8) SEQ ID NO:19 내지 25중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH); 및

    (b) (9) L112 (SEQ ID NO:1);

    (10) L151 (SEQ ID NO:2);

    (11) L158 (SEQ ID NO:3);

    (12) L159 (SEQ ID NO:4);

    (13) L164 (SEQ ID NO:5);

    (14) L165 (SEQ ID NO:6);

    (15) L166 (SEQ ID NO:7);

    (16) L167 (SEQ ID NO:8);

    (17) L168 (SEQ ID NO:9);

    (18) L169 (SEQ ID NO:10);

    (19) L170 (SEQ ID NO:11);

    (20) L171 (SEQ ID NO:12);

    (21) L172 (SEQ ID NO:13);

    (22) L173 (SEQ ID NO:14);

    (23) L174 (SEQ ID NO:15);

    (24) L175 (SEQ ID NO:16);

    (25) L189 (SEQ ID NO:17);

    (26) L198 (SEQ ID NO:18); 및

    (27) SEQ ID NO:1 내지 18중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며,

    IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
27. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H415 (SEQ ID NO:19) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
28. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H884 (SEQ ID NO:20) 또는 이와 80% 이상 동일 한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
29. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1077 (SEQ ID NO:21) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
30. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1078 (SEQ ID NO:22) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
31. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1079 (SEQ ID NO:23) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
32. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1081 (SEQ ID NO:24) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
33. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1089 (SEQ ID NO:25) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
34. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H415 (SEQ ID NO:19)을 포함하며, 상기 VL이 L112 (SEQ ID NO:1)을 포함하는 항체.
35. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H415 (SEQ ID NO:19)을 포함하며, 상기 VL이 L165 (SEQ ID NO:6)을 포함하는 항체.
36. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H415 (SEQ ID NO:19)을 포함하며, 상기 VL이 L172 (SEQ ID NO:13)을 포함하는 항체.
37. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1079 (SEQ ID NO:23)을 포함하며, 상기 VL이 L159 (SEQ ID NO:4)을 포함하는 항체.
38. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H415 (SEQ ID NO:19)을 포함하며, 상기 VL이 L198 (SEQ ID NO:18)을 포함하는 항체.
39. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1079 (SEQ ID NO:23)을 포함하며, 상기 VL이 L198 (SEQ ID NO:18)을 포함하는 항체.
40. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1081 (SEQ ID NO:24)을 포함하며, 상기 VL이 L172 (SEQ ID NO:13)을 포함하는 항체.
41. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1077 (SEQ ID NO:21)을 포함하며, 상기 VL이 L158 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 항체.
42. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1078 (SEQ ID NO:22)을 포함하며, 상기 VL이 L158 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 항체.
43. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1081 (SEQ ID NO:24)을 포함하며, 상기 VL이 L159 (SEQ ID NO:4)을 포함하는 항체.
44. 제 26항에 있어서, 상기 VH가 H1079의 변이체인 항체.
45. 제 44항에 있어서, H1079의 상기 변이체가 H1079의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 하나 또는 그 초과의 상이한 아미노산을 포함하는 항체.
46. 제 45항에 있어서, H1079의 상기 변이체는 H1079의 CDR3에서 하나 또는 그 초과의 상이한 아미노산을 포함하는 항체.
47. 제 46항에 있어서, H1079의 상기 변이체가 H1511 (SEQ ID NO:26); H1420 (SEQ ID NO:27); H1432 (SEQ ID NO:28); H1515 (SEQ ID NO:29); H1362 (SEQ ID NO:30); H1437 (SEQ ID NO:31); 및 H1461 (SEQ ID NO:32)로 구성된 군으로부터 선택되는 항체.
48. 제 46항에 있어서, H1079의 상기 변이체가 H1519 (SEQ ID NO:38); H1520 (SEQ ID NO:39); H1521 (SEQ ID NO:40); 및 H1522 (SEQ ID NO:41)로 구성된 군으로부터 선택되는 항체.
49. 제 26항에 있어서, 상기 VL이 L198의 변이체인 항체.
50. 제 49항에 있어서, L198의 상기 변이체가 L198의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 하나 또는 그 초과의 상이한 아미노산을 포함하는 항체.
51. 제 50항에 있어서, L198의 상기 변이체가 L198의 CDR3에서 하나 또는 그 초과의 상이한 아미노산을 포함하는 항체.
52. 제 51항에 있어서, L198의 상기 변이체가 L314 (SEQ ID NO:33); L305 (SEQ ID NO:34); L303 (SEQ ID NO:35); L298 (SEQ ID NO:36); 및 L321 (SEQ ID NO:37)로 구성된 군으로부터 선택되는 항체.
53. 제 44항에 있어서, H1079의 상기 변이체가 H1553 (SEQ ID NO:42) 또는 H1579 (SEQ ID NO:43)인 항체.
54. (a) (1) H1522 (SEQ ID NO:41);

    (2) H1553 (SEQ ID NO:42);

    (3) H1579 (SEQ ID NO:43); 및

    (4) SEQ ID NO:41 내지 43중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및

    (b) (5) L198 (SEQ ID NO:18);

    (6) L305 (SEQ ID NO:34);

    (7) L314 (SEQ ID NO:33);

    (8) L298 (SEQ ID NO:36);

    (9) L321 (SEQ ID NO:37); 및

    (10) SEQ ID NO:18, 33, 34, 36 또는 37중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, IL-6 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
55. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1522 (SEQ ID NO:41) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
56. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1553 (SEQ ID NO:42) 또는 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
57. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43) 또는 이와 80% 이상 동 일한 아미노산 서열을 포함하는 항체.
58. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1522 (SEQ ID NO:41)를 포함하고, 상기 VL이 L198 (SEQ ID NO:18)을 포함하는 항체.
59. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1522 (SEQ ID NO:41)를 포함하고, 상기 VL이 L305 (SEQ ID NO:34)을 포함하는 항체.
60. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1522 (SEQ ID NO:41)를 포함하고, 상기 VL이 L134 (SEQ ID NO:33)을 포함하는 항체.
61. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1553 (SEQ ID NO:42)를 포함하고, 상기 VL이 L198 (SEQ ID NO:18)을 포함하는 항체.
62. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43)를 포함하고, 상기 VL이 L198 (SEQ ID NO:18)을 포함하는 항체.
63. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43)를 포함하고, 상기 VL이 L305 (SEQ ID NO:34)을 포함하는 항체.
64. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43)를 포함하고, 상기 VL이 L314 (SEQ ID NO:33)을 포함하는 항체.
65. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43)를 포함하고, 상기 VL이 L298 (SEQ ID NO:36)을 포함하는 항체.
66. 제 54항에 있어서, 상기 VH가 H1579 (SEQ ID NO:43)를 포함하고, 상기 VL이 L321 (SEQ ID NO:37)을 포함하는 항체.
67. (1) H415 (SEQ ID NO:19);

    (2) H884 (SEQ ID NO:20);

    (3) H1077 (SEQ ID NO:21);

    (4) H1078 (SEQ ID NO:22);

    (5) H1079 (SEQ ID NO:23);

    (6) H1081 (SEQ ID NO:24);

    (7) H1089 (SEQ ID NO:25); 및

    (8) SEQ ID NO:19 내지 25중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-6 항체 가변 중쇄 영역 (VH)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
68. (1) L112 (SEQ ID NO:1);

    (2) L151 (SEQ ID NO:2);

    (3) L158 (SEQ ID NO:3);

    (4) L159 (SEQ ID NO:4);

    (5) L164 (SEQ ID NO:5);

    (6) L165 (SEQ ID NO:6);

    (7) Ll66 (SEQ ID NO:7);

    (8) L167 (SEQ ID NO:8);

    (9) L168 (SEQ ID NO:9);

    (10) L169 (SEQ ID NO:10);

    (11) L170 (SEQ ID NO:11);

    (12) L171 (SEQ ID NO:12);

    (13) L172 (SEQ ID NO:13);

    (14) L173 (SEQ ID NO:14);

    (15) L174 (SEQ ID NO:15);

    (16) L175 (SEQ ID NO:16);

    (17) L189 (SEQ ID NO:17);

    (18) L198 (SEQ ID NO:18); 및

    (19) SEQ ID NO:1 내지 18중 어느 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-6 항체 가변 경쇄 영역 (VL)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
69. (1) H415 (SEQ ID NO:19);

    (2) H884 (SEQ ID NO:20);

    (3) H1077 (SEQ ID NO:21);

    (4) H1078 (SEQ ID NO:22);

    (5) H1079 (SEQ ID NO:23);

    (6) H1081 (SEQ ID NO:24); 및

    (7) H1089 (SEQ ID NO:25)로 구성된 군으로부터 선택된 항-IL-6 항체 가변 중쇄 영역 (VH)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
70. 제 69항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이

    (1) H415 (SEQ ID NO:19);

    (2) H884 (SEQ ID NO:20);

    (3) H1077 (SEQ ID NO:21);

    (4) H1078 (SEQ ID NO:22);

    (5) H1079 (SEQ ID NO:23);

    (6) H1081 (SEQ ID NO:24); 및

    (7) H1089 (SEQ ID NO:25)로 구성된 군으로부터 선택된 항-IL-6 항체 가변 중쇄 영역 (VH)의 CDR3를 엔코딩하는 단리된 핵산 분자.
71. (1) L112 (SEQ ID NO:1);

    (2) L151 (SEQ ID NO:2);

    (3) L158 (SEQ ID NO:3);

    (4) L159 (SEQ ID NO:4);

    (5) L164 (SEQ ID NO:5);

    (6) L165 (SEQ ID NO:6);

    (7) L166 (SEQ ID NO:7);

    (8) L167 (SEQ ID NO:8);

    (9) L168 (SEQ ID NO:9);

    (10) L169 (SEQ ID NO:10);

    (11) L170 (SEQ ID NO:11);

    (12) L171 (SEQ ID NO:12);

    (13) L172 (SEQ ID NO:13);

    (14) L173 (SEQ ID NO:14);

    (15) L174 (SEQ ID NO:15);

    (16) L175 (SEQ ID NO:16);

    (17) L189 (SEQ ID NO:17); 및

    (18) L198 (SEQ ID NO:18)로 구성된 군으로부터 선택된 항-IL-6 항체 가변 경쇄 영역 (VL)의 상보성 결정 영역 (CDR)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
72. 제 71항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이

    (1) L112 (SEQ ID NO:1);

    (2) L151 (SEQ ID NO:2);

    (3) L158 (SEQ ID NO:3);

    (4) L159 (SEQ ID NO:4);

    (5) L164 (SEQ ID NO:5);

    (6) L165 (SEQ ID NO:6);

    (7) L166 (SEQ ID NO:7);

    (8) L167 (SEQ ID NO:8);

    (9) L168 (SEQ ID NO:9);

    (10) L169 (SEQ ID NO:10);

    (11) L170 (SEQ ID NO:11);

    (12) L171 (SEQ ID NO:12);

    (13) L172 (SEQ ID NO:13);

    (14) L173(SEQ ID NO:14);

    (15) L174 (SEQ ID NO:15);

    (16) L175 (SEQ ID NO:16);

    (17) L189 (SEQ ID NO:17); 및

    (18) L198 (SEQ ID NO:18)로 구성된 군으로부터 선택된 항-IL-6 항체 가변 경쇄 영역 (VL)의 CDR3를 엔코딩하는 단리된 핵산 분자.
73. 제 67항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
74. 제 68항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
75. 제 69항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
76. 제 71항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
77. 제 73항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
78. 제 74항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
79. 제 75항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
80. 제 76항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
81. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 염증 질환을 치료하는 방법.
82. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
83. 제 82항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 방법.
84. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 암을 치료하는 방법.
85. 제 84항에 있어서, 상기 암이 다발성 골수종인 방법.
86. 제 84항에 있어서, 상기 암이 신장 암종 (renal carcinoma), 유방암 (breast cancer), 전립선암 (prostate cancer), 림프종 (lymphoma) 및 이식후 림프종 (post-transplant lymphoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
87. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 항체를 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하여, 자발성 유년성 관절염 (idiopathic juvenile arthritis)을 치료하는 방법.
88. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 단리된 모노클로날 항체를 생성하는 방법으로서,

    (i) 상기 항체를 엔코딩하는 하나 또는 그 초과의 핵산을 발현하는 숙주 세포를 배양하고,

    (ii) 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법.
89. 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생 (aberrant or inappropriate angiogenesis)과 관련된 질환, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 및 섬유증 (fibrotic conditions)으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 의약 제조시 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 단리된 모노클로날 항체의 용도.
90. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 단리된 모노클로날 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물.
91. 자가면역 질환 또는 질병, 비정상 또는 부적합한 혈관신생과 관련된 질환, 암, 골관절염, 자발성 유년성 관절염, 및 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 질병 치료시 의약으로서 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26 항 내지 제 66항중의 어느 한 항의 단리된 모노클로날 항체.
92. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항에 있어서, 뮤린 B9 (ECACC) 또는 인간 U266 골수종 세포와 같은 세포의 IL-6 유도된 증식을 80% 또는 그 초과의 억제 수준으로 억제하는 단리된 모노클로날 항체.
93. 제 1항 내지 제 19항 또는 제 26항 내지 제 66항중의 어느 한 항에 있어서, IL-6에 특이적으로 결합하여 IL-6의 이의 수용체로의 결합을 80% 또는 그 초과의 억제 수준으로 억제하는 단리된 모노클로날 항체.

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