KR20090038732A

KR20090038732A - 박과 식물 감염성 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR20090038732A
Application number: KR1020070104185A
Authority: KR
Inventors: 천종윤; 김종기; 김태산; 류기현; 김욱
Original assignee: 주식회사 씨젠
Priority date: 2007-10-16
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2009-04-21

Abstract

본 발명은 박과 식물의 종자에 감염되는 바이러스를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오트이드는 매우 높은 특이성으로 박과 식물의 종자감염 바이러스의 타깃 서열을 증폭할 수 있으며, 특히 멀티플렉스 PCR에서 우수한 작동성 (workability)을 나타내어, 하나의 PCR 반응 세트에서 박과 식물의 종자감염 바이러스 여러 종을 동시에 검출할 수 있다.

종자 감염바이러스, 증폭, 혼성화, 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오타이드, 박과 작물

Description

박과 식물 감염성 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드{Oligonucleotides for Detection of Cucurbit－infecting Viral Species}

본 발명은 박과 식물의 종자에 감염되는 바이러스를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

박과류 채소에 전세계적으로 감염되는 종자감염성 바이러스는 오이 녹반 모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus: CGMMV), 쥬키니 녹반 모자이크바이러스(Zucchini green mottle mosaic virus: ZGMMV), 귀리 녹반 모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus: KGMMV), 멜론 괴사반점 바이러스(Melon necrotic spot virus: MNSV), 호박 모자이크 바이러스(Squash mosaic virus: SqMV), 오이열매 녹반 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus: CFMMV) 등이 보고 되어 있다.

CGMMV는 오이 바이러스 4 (CV4)로 처음 보고되었으며, 그 후 독일, 오스트레일리아, 덴마크, 인도에서 발생하였고 일본에서는 1971년 발병이 확인된 병이다 (Hollings, M., Komuro, Y. and Tochihara, H. (1975). CMI / AAB Descr . Pl . Viruses No. 154). 우리나라에서는 1989년 함안, 진주지역에서 발생이 확인되었고, 수박에서 처음으로 보고된 병으로(이기운, 이봉춘, 박호철, 이용수 (1990) 한국식물병리학회 6(2):250-255), 1998년에 전국적으로 5개도, 25개 시군, 949농가, 408 ha에서 발병되어 피해가 매우 심하였고 현재도 일부 수박단지에서 발병되고 있다. 1998년 일부 충남, 경북지역에서의 알려진 수박 피해 면적은 450ha이며, 이는 전 수박 재배지의 약 5%에 해당된다. KGMMV는 일본에서 오이에 발병이 처음 보고되었으며, 과거에는 CGMMV-C계통으로 분리하다가 1982년 KGMMV로 새로운 종으로 재분류되었다. ZGMMV는 국내에서 1999년 처음 보고된 신종 바이러스로서 수입된 쥬키니호박 종자로부터 유래하여 전주지방을 중심으로 매년 그 피해가 지속적인 병이다.MNSV는 온실에서 재배되는 멜론이나 오이에 가장 일반적으로 발생하는 병원체일뿐만 아니라 밭에서도 많은 문제를 일으키는 바이러스로, 특히 수경재배 멜론에 심각한 피해를 준다. 이유는 MNSV가 오염된 종자나 딱정벌레에 의해 쉽게 전파될 뿐만 아니라 Olpidium bornovanus라는 물곰팡이류에 의해 전반되기 때문이다. SqMV 는 코모바일스(comovirus) 과에 속하는 바이러스로서, 종자 및 즙액, 잎벌레류에 의한 매개체로 전염되며 KGMMV는 종자 및 토 양, 즙액 전염된다. 종자전염 바이러스는 대상 기주가 종자류로서 수량이 타 품목에 비해 월등히 많으며, 검역대상 바이러스가 수입되는 종자를 통하여 국내에 유입될 경우 농민들의 재배과정을 통하여 주변의 건전한 식물체에 대량으로 2차 감염되어 그 경제적인 피해는 실로 막대할 수 있으며, 사회적 영향에도 지대한 특성을 지니고 있다. 현재까지의 박과 감염 종자전염성 바이러스의 검정방법은 기본적으로 RT-PCR이나 ELISA가 이용 가능하다. 그러나 혈청학적인 검정법인 ELISA의 경우 이들 5종 바이러스 간에 상호 반응이 있으며, 종자감염된 극소수의 바이러스 검정은 불가능하다. 또한, RT-PCR의 경우에도 다양한 프라이머를 제작하여 사용할 경우 일부 비특이 반응이 일어나고 종자에 오염된 극소량의 바이러스 검출에 한계가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 간편하고 신속하면서도 매우 정확하게 박과 식물의 종자감염성 바이러스를 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명자에 의하여 발명된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide) 형태를 갖는 바이러스 혼성화용 서열을 사용하면, PCR과 전기영동만으로 간편하고 신속하면서도 매우 정확하게 검출할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 박과 식물의 종자감염성 바이러스를 검출하는 데 이용되는 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 박과 식물의 종자감염 바이러스를 검출하는 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 박과 식물의 종자 감염바이러스 핵산과 특이적으로 혼성화(hybridization)되는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 다음의 일반식으로 표시되는 박과 식물의 종자감염성 바이러스 핵산과 특이적으로 혼성화 되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:

5'-Xp-Yq-Zr-3'

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-제1차 프라이밍 부위(5'-first priming portion)이고, Yq는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-제2차 프라이밍 부위 (3'-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 이고, 5'-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3'-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5'-제1차 프라이밍 부위가 3'-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-제1차 프라이밍 부위와 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키며, 상기 타깃 서열은 상기 박과 식물의 종자감염성 바이러스의 지놈 서열이다.

본 발명은 박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산과 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.

박과 식물은 호박, 오이, 수박, 멜론 및 수세미 등을 포함하는 식물의 한 패밀리를 포함한다.

본 명세서에서 용어 “바이러스 핵산”은 바이러스 지놈 자체뿐만 아니라 바이러스 지놈으로부터 유래되는 모든 RNA 또는 DNA(예컨대, cDNA)를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어 “바이러스 지놈”도 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 바이러스 핵산과 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어“혼성화”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특 히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면, 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면, 일부 미스매치가 존재하더라고 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 가지는 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고, 이중 프라이밍(dual priming) 구조라 명명할 수 있고, 이러한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide: DPO)라 명명된다. DPO는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 올리고뉴클레오타이드로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-제1차 프라이밍 부위과 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포 리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함한다.

바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위은 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위은 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위은 40-80℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위은 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.

본 발명의 목적 중 하나는, 박과 식물의 종자감염 바이러스의 유전자를 증폭 및 검출하는 것이다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 종자 감염 바이러스-특이 올리고뉴클레오타이드는, (1) 각각의 박과 식물의 종자감염 바이러스 유전형 특이적인 서열을 기본으로 하여 (2) 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide: DPO) 형태로 디자인된다. 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드의 제조에 기본이 되는 서열은 공지된 박과 식물의 종자감염 바이러스 서열을 참조하여 선택된 것이다. 우선, 박과 식물의 종자감염 바이러스의 유전자 변이에 관계없이 모든 종자감염바이러스에 혼성화 될 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 선택하는데 기존의 공지된 여러 종자전염 바이러스들의 유전자 염기서열을 바탕으로 하였다. 상기 박과 식물의 종자감염성 바이러스 지놈 타깃 서열은 GenBank 접근번호 AB015146, AJ748353 또는 DQ767633에 기재된 오이 녹반 모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus: CGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AJ295949, AB015145 또는 AB162006에 기재된 쥬키니 녹반 모자이크바이러스(Zucchini green mottle mosaic virus: ZGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호AJ295948 또는 AF321057에 기재된 귀리 녹반 모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus: KGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AB044292, AB044703, AB044704, AB044708, AB044706, AB250686, AB189943, AB189944, AB250687, AB250684, AB044705, AF488692, AY330700, M29671, D00562, D12536 또는 DQ339157에 기재된 멜론 괴사반점 바이러스(Melon necrotic spot virus: MNSV))의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AB054689 또는 M96148에 기재된 호박 모자이크 바이러스(Squash mosaic virus: SqMV)의 지놈 서열 및 18S rRNA의 경우 AF206894, AF206895, AY030241을 참조하여, 박과 식물의 종자감염바이러스에 특이적이면서도 상기 5종의 박과 식물 종자감염 바이러스를 다 포괄할 수 있는 서열을 선택하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 디자인하였다.

서열목록 제1서열 내지 13서열과 그 타깃 병원체는 표 1과 같다.

SEQ ID NO	병원체 (virus)	명 칭	프라이머 서열 ( 5’-> 3’)	이용서열
1	CGMMV	CGMMV-F1	TTG TTG CGT GGT GTT GAT CTT AC IIIII ACC TTT ATG TC	무브먼트 단백질
2	CGMMV	CGMMV-R1	AAG GAT CGC GAA GGG CAT C IIIII CCA CGA CAG	무브먼트 단백질
3	ZGMMV	ZGMMV-F1	CTG TTA CTG AGC TAT GCG AGC G IIIII CGG GTA TTG AG	레플리카아제 유전자
4	ZGMMV	ZGMMV-R1	TGC ATC TTG AAG CTC GAC AA IIIII TCC TCT TTT AC	레플리카아제 유전자
5	KGMMV	KGMMV-F1	GGA CAC ACA AGA CAA ACG CC IIIII GTG AAC TTT TC	레플리카아제 유전자
6	KGMMV	KGMMV-R1	TCC ATT TGC CAG GAA GGC AG IIIII CAA ATT TCG	레플리카아제 유전자
7	MNSV	MNSV-F1	GGA GTT TAT TGC CTC TGT TCT TCC IIII AAT GAT CTC AC	코트 단백질
8		MNSV-R1	GAT CAA ACA TAC AMA CCA TTC CAG C IIIII GCT GGG GAT C
9		MNSV-R2	GAT CAA ACA TAC ATA CCA TCC CAG C IIIII GCT GGG GGT C
10	SqMV	SqMV-F1	GCA AAA TAC GCT GTG TTG CTT IIIII AAT GTT CCA G	폴리단백질
11	SqMV	SqMV-R1	GCC CCT GAA TTT CAG CAA ACT IIIII AGC TTG TGG	폴리단백질
12	18S rRNA	18S rRNA-F1	GAC GGA GAA TTA GGG TTC GAT T IIIII GAG GGA GCC	rRNA
13	18S rRNA	18S rRNA-R1	CTC CAC TCC TGG TGG TGC C IIIII GTC AAT TCC	rRNA

^*I : 디옥시이노신

이와 같이, 발굴된 특이 서열을 DPO 형태로 디자인한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 종래의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 박과 식물의 종자감염 바이러스 검출 시에 문제가 되는 위음성, 위양성 및 배경 산물(backgrounds)의 문제를 크게 개선할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 DPO의 특성 및 장점이 적용된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위과 3'-제2차 프라이밍 부위은 상기 박과 식물의 종자감염 바이러스 지놈의 특이 서열과 혼성화된다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상기한 박과 식물의 종자감염 바이러스 타깃 핵산에 특이적으로 혼성화되는 것으로 서열목록 제1서열부터 제11서열로 구성된 군으로부터 일치되는 부위로부터 선택되어지는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열부터 제13서열까지 뿐만 아니라 상기 서열과 상보적인 서열 및 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “실질적으로 동일한 서열”은 올리고뉴클레오타이드가 상기한 DPO의 구조를 가지면서 타깃 서열에 특이적으로 혼성화되는 능력을 보유하는 범위 내에서, 서열목록 제1서열부터 제13서열에 기재된 서열의 일부 염기가 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 의미한다. 이러한 실질적으로 동일한 서열이 본 발명의 청구범위에 속한다는 것은 균등론의 원칙 하에 명확하게 인식된다.

본 발명에 있어서, 용어 “타깃 서열(target sequence)”은 주어진 혼성화 조건 하에서 사용되는 프라이머 또는 프로브와 혼성화되는 것이 소망되는 서열을 의미한다.

한편, 용어 “비-타깃 서열(non-target sequence)”은 상기 “타깃 서열” 이외의 서열을 말한다.

예를 들어, 프라이머 또는 프로브의 서열과 완벽하게 일치하는 서열에만 혼성화시키는 것을 소망하여, 고엄격조건 하에서 혼성화를 실시하는 경우, 프라이머 또는 프로브의 서열과 완벽하게 일치하는 서열은 “타깃 서열”이 되지만, 프라이머 또는 프로브의 서열과 하나의 염기라도 다른 서열은 “비-타깃 서열” 또는 “비-특이적 서열 (non-specific sequence)”이 된다. 그리고, 비-타깃 서열과 혼성화의 결과로 얻어지는 산물은 “비-타깃 산물’또는 ‘비-특이적 산물’이 된다.

한편, 프라이머 또는 프로브의 서열과 완벽하게 일치하는 서열뿐만 아니라 일부 미스매치가 있는 서열에도 혼성화시키는 것을 소망하여, 낮은 엄격조건 하에서 혼성화를 실시하는 경우, 프라이머 또는 프로브의 서열과 완벽하게 일치하지 않더라도 주어진 조건에서 사용되는 프라이머 또는 프로브와 혼성화되는 것이 소망되는 서열은 “타깃 서열”이 되지만, 그 이외의 서열은 “비 타깃-서열”이 된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프로브 (probe)로서 타깃 바이러스 핵산과의 혼성화를 통하여 타깃 바이러스 핵산을 검출하는데 사용된다. 본 명세서에서 용어 “프로브”는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소, 매스 표지, 전자밀집입자, 효소, 조인자, 효소에 대한 기질, 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5’-말단, 3’-말단 또는 내부에 표지된다. 표지는 직접 표지 즉, 염료 또는 간접 표지 즉, 바이오틴, 디곡신(digoxin), 알칼리 포스파타아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 등일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 (primer)로서 타깃 바이러스 핵산과의 혼성화를 통하여 타깃 바이러스 핵산을 증폭하는데 사용된다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 타깃 바이러스 핵산의 증폭은 타깃 바이러스의 검출을 위한 것이다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는,박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산에 매우 높은 특이성으로 혼성화되어 박과 식물의 종자감염바이러스를 검출하는 데 매우 유용하다. 더욱이, 본 발명의 다양한 올리고뉴클레오타이드들은 하나의 반응물에 포함되어, 증폭 반응을 통해 박과 식물의 종자감염 바이러스의 변이종 타입을 동시에 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 상술한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트가 PCR에 사용되는 경우, 선택적으로 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 저해제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 포지티브 및 네가티브 대조군 반응을 수행하는 데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 키트는 서열목록 제1서열에서부터 제13서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드를 모두 포함하며, 키트는 박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산을 멀티플렉스(multiplex) 증폭할 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 박과 식물의 종자 감염 바이러스 핵산에 혼성화시키는 단계를 포함하는 바이러스 핵산 검출방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 박과 식물의 종자감염 바이러스 핵산에 혼성화시키는 단계를 포함하는 바이러스 핵산의 증폭방법을 제공한다.

본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화 온도는 50℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 55℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 63℃이다.

종자감염 바이러스의 핵산 서열을 증폭하는 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관련 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다.

핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 박과 식물의 종자감염 바이러스의 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.

RNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건(즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 50℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 55℃ 내지 68℃이고, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 63℃이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.

본 발명의 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리(또는 정제)는 증폭과정에 후속될 수 있다. 상기 과정은 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 발현 벡터를 가지는 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 증폭 산물을 발현하기 위하여, 프로모터의 조절하 또는 프로모터에 작동적으로 연결된 증폭 산물을 운반하는 발현 벡터를 제조한다. 다양한 숙주-발현 시스템에서 단백질 또는 펩타이드 발현을 하기 위하여, 증폭산물 및 전사/번역/조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하는 많은 표준 기술들이 알려져 있다. 원핵세포 숙주용 프로모터는 pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 및 T7 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 진핵세포 숙주용 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 그리고 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 또는 시토메갈로 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵세포 숙주의 예는 E. coli, 바실러스 서브틸리스, 그리고, 살로넬라 티피무리움, 세라티아 마르세센스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내세균을 포함한다. 미생물뿐만 아니라, 다세포 유기체로부터 유래된 세포 배양물도 숙주로서 이용할 수 있다. 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 세포배양물이 이용될 수 있다. 포유동물 세포뿐만 아니라, 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 하나 또는 그 이상의 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물도 이용될 수 있다. 증폭산물로부터 발현된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다.

한편, 본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, 본 발명은 멀티플렉스 PCR 과정에 따라 실시된다. 멀티플렉스 PCR은 PCR의 다른 변형 형태로서, 동일한 반응물에서 둘 이상의 프라이머쌍을 이용하여 하나 이상의 타깃 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 그러나, 멀티플렉스 PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나오며, 이러한 오류의 결과는 반응 실패에 의한 위음 결과 그리고 가짜 생성물의 증폭과 같은 위양 결과를 포함한다. 따라서 이러한 오류를 줄이기 위하여 멀티플렉스 PCR 반응 조건을 최적화하는 데 인력과 시간을 많이 소비하지만, 만족할만한 결과를 얻기는 극히 힘들다. 본 발명의 방법은 이러한 종래의 멀티플렉스 PCR의 문제점을 극복하여, 하나의 PCR 반응 세트에서 다양한 종류의 박과 식물의 종자감염성 바이러스를 동시에 오류 없이 증폭할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오트이드는 매우 높은 특이성으로 박과 식물의 종자감염 바이러스의 타깃 서열을 증폭할 수 있으며, 특히 멀티플렉스 PCR에서 우수한 작동성 (workability)을 나타내어, 하나의 PCR 반응 세트에서 박과 식물의 종자감염 바이 러스 여러 종을 동시에 검출할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예I : 프라이머 디자인 및 제조

공지된 바이러스의 핵산 서열을 참조하여, 타깃 바이러스의 종 (species)에 특이적인 서열로서 분리종 (isolates or strain)간에는 공통적으로 존재하는 보존서열 부위를 발굴 하였다.

실시예 I-1: CGMMV(Cucumber green mottle mosaic virus) 핵산 증폭용 프라이머

오이 녹반 모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus: CGMMV) 의 무브먼트 단백질(movement protein) 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO(dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

CGMMV-F1 TTG TTG CGT GGT GTT GAT CTT AC IIIII ACC TTT ATG TC (SEQ ID NO : 1)

CGMMV-R1 AAG GAT CGC GAA GGG CAT C IIIII CCA CGA CAG (SEQ ID NO : 2)

실시예 I-2: ZGMMV(Zucchini green mottle mosaic virus) 핵산 증폭용 프라이머

쥬키니 녹반 모자이크바이러스(Zucchini green mottle mosaic virus: ZGMMV)의 레플리카아제(replicase) 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO (dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

ZGMMV-F1 CTG TTA CTG AGC TAT GCG AGC G IIIII CGG GTA TTG AG (SEQ ID NO : 3)

ZGMMV-R1 TGC ATC TTG AAG CTC GAC AA IIIII TCC TCT TTT AC (SEQ ID NO : 4)

실시예 I-3: KGMMV(Kyuri green mottle mosaic virus) 핵산 증폭용 프라이머

귀리 녹반 모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus: KGMMV)의 레플리카아제(replicase) 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO (dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

KGMMV-F1 GGA CAC ACA AGA CAA ACG CC IIIII GTG AAC TTT TC (SEQ ID NO : 5)

KGMMV-R1 TCC ATT TGC CAG GAA GGC AG IIIII CAA ATT TCG (SEQ ID NO : 6)

실시예 I-4: MNSV(Melon necrotic spot virus) 핵산 증폭용 프라이머

멜론 괴사반점 바이러스(Melon necrotic spot virus: MNSV)의 42K 코트 단백질 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO (dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

MNSV-F1 GGA GTT TAT TGC CTC TGT TCT TCC IIII AAT GAT CTC AC (SEQ ID NO : 7)

MNSV-R1 GAT CAA ACA TAC AMA CCA TTC CAG C IIIII GCT GGG GAT C (SEQ ID NO : 8)

MNSV-R2 GAT CAA ACA TAC ATA CCA TCC CAG C IIIII GCT GGG GGT C (SEQ ID NO : 9)

실시예 I-5: SqMV ( Squash mosaic virus ) 핵산 증폭용 프라이머

호박 모자이크 바이러스(Squash mosaic virus: SqMV)의 폴리단백질 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO (dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

SqMV-F1 GCA AAA TAC GCT GTG TTG CTT IIIII AAT GTT CCA G (SEQ ID NO : 10)

SqMV-R1 GCC CCT GAA TTT CAG CAA ACT IIIII AGC TTG TGG (SEQ ID NO : 11)

실시예 I-6: 식물의 18S 라이보좀 RNA (18S rRNA) 핵산 증폭용 프라이머

식물의 18S 라이보좀 RNA (18S rRNA) 유전자 서열에서 발굴된 서열 중 본 발명의 DPO (dual priming oligonucleotide) 개념의 프라이머를 디자인하는데 적합한 서열을 사용하여 전방향 (forward) 및 역방향 (reverse) 프라이머를 디자인하였다. 서열에서 I은 디옥시이노신을 나타낸다.

18S rRNA-F1 GAC GGA GAA TTA GGG TTC GAT T IIIII GAG GGA GCC (SEQ ID NO : 12)

18S rRNA-R2 CTC CAC TCC TGG TGG TGC C IIIII GTC AAT TCC (SEQ ID NO : 13)

실시예 I-7: 종래 형태의 프라이머의 제조

상기 본 발명의 프라이머를 종래 형태의 프라이머 즉, DPO 구조를 가지지 않는 프라이머 형태로 제조하고 대조용 프라이머 세트로 사용하였다. 종래 형태의 프라이머 서열 및 대응하는 본 발명의 프라이머 명칭은 다음과 같다.

종래 형태의 프라이머 서열 (5'-> 3')	대응하는 본 발명의 프라이머 명칭
TTGTTGCGTGGTGTTGATCTTAC AAAAC ACCTTTATGTC	CGMMV-F1
AAGGATCGCGAAGGGCATC CGCAG CCACGACAG	CGMMV-R1
CTGTTACTGAGCTATGCGAGCG CTATT CGGGTATTGAG	ZGMMV-F1
TGCATCTTGAAGCTCGACAA AGGAA TCCTCTTTTAC	ZGMMV-R1
GGACACACAAGACAAACGCC CTAAA GTGAACTTTTC	KGMMV-F1
TCCATTTGCCAGGAAGGCAG TCCGG CAAATTTCG	KGMMV-R1
GGAGTTTATTGCCTCTGTTCTTCC GTCG AATGATCTCAC	MNSV-F1
GATCAAACATACAMACCATTCCAGC AATAG GCTGGGGAT C	MNSV-R1
GATCAAACATACATACCATCCCAGC GATAG GCTGGGGGTC	MNSV-R2
GCAAAATACGCTGTGTTGCTT CTATC AATGTTCCAG	SqMV-F1
GCCCCTGAATTTCAGCAAACT GCACA AGCTTGTGG	SqMV-R1
GACGGAGAATTAGGGTTCGATT CCGGA GAGGGAGCC	18S rRNA-F1
CTCCACTCCTGGTGGTGCC CTTCC GTCAATTCC	18S rRNA-R1

실시예 Ⅱ: 바이러스 감염 시료의 준비

박과 식물의 바이러스가 감염된 종자 (seed) 또는 감염 잎 등으로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. 효율적인 RNA 추출을 위하여 Viral Gene-spin^TM viral DNA/RNA 추출 키트 (intronbiotechnology, 한국)를 사용하였다.

실시예 Ⅲ: 내부 대조군 ( internal control )

식물의 18S 라이보좀 RNA 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다. 18S rRNA 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열은 다음과 같으며, 증폭산물의 크기는 813 bp 이다.

명 칭	서열(5'→3')
18S RNA-F1	GACGGAGAATTAGGGTTCGATTIIIIIGAGGGAGCC
18S RNA-R1	CTCCACTCCTGGTGGTGCCIIIIIGTCAATTCC

실시예 IV : 멀티플렉스 PCR

실시예 I에서 제조된 프라이머 중에서 다음과 같이 프라이머 세트 I 을 준비하였다. 상기 프라이머 세트 I 그리고 실시예 Ⅱ에서 얻은 바이러스 감염 시료 RNA를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다(각 프라이머 세트는 실시예 Ⅲ의 대조군 증폭용 프라이머를 포함한다).

프라이머 세트 I
바이러스	프라이머쌍	PCR 산물 크기 (bp)
CGMMV	CGMMV-F1/CGMMV-R1	247
ZGMMV	ZGMMV-F1/ZGMMV-R1	338
KGMMV	KGMMV-F1/KGMMV-R1	429
MNSV	MNSV-F1/MNSV-R1, MNSV-R2	509
SqMV	SqMV-F1/SqMv-R1	672
18S rRNA	18S rRNA-F1/18S rRNA-R1	813

RNA 시료 (8㎕), 랜덤 헥사머 (0.2㎍/㎕) 1 ㎕, DEPC 물 3㎕를 혼합하여 80℃에서 3분간 가열하였다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브에 5X RT 완충액 (Fermentas) 4㎕ , 10mM dNTP 2㎕, RNase 억제제 (Promega, USA) 1㎕, 역전사 효소 (Promega, USA) 1㎕ 를 넣고 37℃에서 90분간 반응시킨 후, 94℃에서 2분간 변성반응을 하여 cDNA를 합성하였다.

이어, 3㎕의 cDNA , Taq 중합효소를 포함하는 10㎕의 2X PCR 마스터 혼합물(Seegene, 한국) 및 4㎕의 프라이머 세트 I을 포함하는 최종 20㎕의 혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다.

반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열 (94℃)된 온도 사이클러 (thermal cycler)에 넣고, 94℃ 15분에서 변성반응시킨 후, 94℃ 30초, 63℃ 1.5분, 72℃ 1.5분의 40 사이클 처리하고 이어 72℃에서 10분 반응시켰다.

PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로즈 겔에 전기영동하고, 나타난 밴드를 용출하고 서열을 확인하였다.

도 1은 박과 식물의 바이러스 감염 시료에 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 실시한 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 도 1에서 각각의 바이러스 유전자에 대한 증폭 산물의 크기는 다음과 같다.

바이러스	증폭산물 크기(bp)
내부 대조군	813
SqMV	672
MNSV	509
KGMMV	429
ZGMMV	338
CGMMV	247

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 DPO 프라이머 세트는 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위-양성 오류 없이 바이러스 감염시료가 어떤 바이러스에 감염되어 있는 지를 정확히 검출해 내었다.

식물 병원성 바이러스의 검출에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 PCR 기반기술의 프라이머로서 뿐만 아니라, 마이크로어레이 기반 기술에서 식물 바이러스를 검출하는 프로브로도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 박과 식물의 종자감염 바이러스에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드, 이를 포함하는 키트 및 이를 사용한 박과 식물의 종자감염 바이러스의 검출 및 증폭 방법을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드 (dual priming oligonucleotide ; DPO) 형태로 디자인된다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 박과 식물의 종자감염 바이러스에 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)에 매우 유용하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 바이러스에 감염된 식물 종자 시료에 대하여 본 발명의 DPO 프라이머 세트를 이용하여 실시한 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸다. 레인 1-8: 바이러스에 감염된 종자 시료, N: 음성대조군, P: 양성 마커, M: 100 bp 래더.

<110> Seegene, Inc. <120> Oligonucleotides for Detection of Cucurbit-infecting Viral Species <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CGMMV-F1 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 ttgttgcgtg gtgttgatct tacnnnnnac ctttatgtc 39 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CGMMV-R1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 aaggatcgcg aagggcatcn nnnnccacga cag 33 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZGMMV-F1 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 ctgttactga gctatgcgag cgnnnnncgg gtattgag 38 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZGMMV-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 tgcatcttga agctcgacaa nnnnntcctc ttttac 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGMMV-F1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 ggacacacaa gacaaacgcc nnnnngtgaa cttttc 36 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGMMV-R1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 tccatttgcc aggaaggcag nnnnncaaat ttcg 34 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MNSV-F1 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(28) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 ggagtttatt gcctctgttc ttccnnnnaa tgatctcac 39 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MNSV-R1 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 gatcaaacat acamaccatt ccagcnnnnn gctggggatc 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MNSV-R2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 9 gatcaaacat acataccatc ccagcnnnnn gctgggggtc 40 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMV-F1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 gcaaaatacg ctgtgttgct tnnnnnaatg ttccag 36 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SqMV-R1 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 gcccctgaat ttcagcaaac tnnnnnagct tgtgg 35 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-F1 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 12 gacggagaat tagggttcga ttnnnnngag ggagcc 36 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-R2 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 13 ctccactcct ggtggtgccn nnnngtcaat tcc 33

Claims

다음의 일반식으로 표시되는 박과 식물의 종자감염성 바이러스 핵산과 특이적으로 혼성화 되는 올리고뉴클레오타이드:

5'-Xp-Yq-Zr-3'

상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5'-제1차 프라이밍 부위(5'-first priming portion)이고, Yq는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-제2차 프라이밍 부위 (3'-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5'-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3'-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5'-제1차 프라이밍 부위가 3'-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5'-제1차 프라이밍 부위와 3'-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시키며, 상기 타깃 서열은 상기 박과 식물의 종자감염성 바이러스의 지놈 서열이다.
제 1 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 2 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 3 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 분할 부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 긴 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 분할 부위는 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 분할 부위는 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 박과 식물의 종자감염성 바이러스 지놈 타깃 서열은 GenBank 접근번호 AB015146, AJ748353 또는 DQ767633에 기재된 오이 녹반 모자이크 바이러스(Cucumber green mottle mosaic virus: CGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AJ295949, AB015145 또는 AB162006에 기재된 쥬키니 녹반 모자이크바이러스(Zucchini green mottle mosaic virus: ZGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호AJ295948 또는 AF321057에 기재된 귀리 녹반 모자이크바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus: KGMMV)의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AB044292, AB044703, AB044704, AB044708, AB044706, AB250686, AB189943, AB189944, AB250687, AB250684, AB044705, AF488692, AY330700, M29671, D00562, D12536 또는 DQ339157에 기재된 멜론 괴사반점 바이러스(Melon necrotic spot virus: MNSV))의 지놈 서열; GenBank 접근번호 AB054689 또는 M96148에 기재된 호박 모자이크 바이러스(Squash mosaic virus: SqMV)의 지놈 서열인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 13 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
서열목록 제1서열 및 제2서열, 서열목록 제3서열 및 제4서열, 제5서열 및 제6서열, 서열목록 제7서열 및 제8서열, 서열목록 제7서열 및 제9서열, 그리고 서열목록 제10서열 및 제 11서열로 구성된 군으로부터 선택되며, 박과 작물의 종자감염 바이러스 핵산과 혼성화 되는 올리고뉴클레오타이드 쌍(pair).
상기 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는, 상기 제 15 항의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함하는 박과 식물의 종자감염성 바이러스 핵산 증폭용 키트.
상기 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드 또는, 상기 제 15 항의 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함하는 박과 식물의 종자감염성 바이러스 핵산 검출용 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제10서열 및 제11서열에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
서열목록 제1서열 및 제2서열, 서열목록 제3서열 및 제4서열, 제5서열 및 제6서열, 서열목록 제7서열 및 제8서열, 서열목록 제7서열 및 제9서열, 그리고 서열목록 제10서열 및 제 11서열의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 박과 식물의 종자 감염성 바이러스 5종의 핵산분자를 멀티플렉스(multiplex) 증폭하기 위한 키트.
제 19 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제12서열 및 제13서열에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.